CN112630422A - 一种提高抗体与荧光蛋白定向偶联标记信噪比的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高抗体与荧光蛋白定向偶联标记信噪比的方法，该方法包括如下步骤：步骤1）将PE与第一交联剂反应；步骤2）将抗体与第二交联剂反应；步骤3）将步骤1）交联后的PE和与步骤2）交联后的抗体进行交联反应；其中，所述第一交联剂为Sulfo‑S‑HyNic或S‑HyNic，所述的第二交联剂为Sulfo‑S‑4FB或S‑4FB；或所述第一交联剂为Sulfo‑S‑4FB或S‑4FB，所述的第二交联剂为Sulfo‑S‑HyNic或S‑HyNic；该方法在进行免疫检测时，阳性信号强、信噪比高。
Description
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种藻红蛋白等免疫荧光蛋白标记的方法。
背景技术
藻红蛋白(P-phycoerythrin，简称PE)是从红藻中分离纯化获得的、目前普遍使用的一种新型荧光标记试剂。在特定波长激发下，藻胆蛋白能发射强烈的荧光，其荧光强度是荧光素的30-100倍，具有很好的吸光性能和很高的量子产率，在可见光谱区有很宽的激发及发射范围。
将藻红蛋白用于荧光分析，具有传统化学荧光染料无法比拟的优越性。比如：(1)在较宽的pH范围内具有较宽的吸收光谱，比较容易选择合适的激发波长，从而得到高效荧光发射，且激发时有特异的荧光发射峰；(2)吸光度和荧光量子产率很高，荧光强而稳定，灵敏度高；(3)具有较小的荧光背景，不易淬灭，荧光保存期较长；(4)水溶性极佳，易与其他分子交联结合，非特异性吸附少；(5)纯天然海洋生物提取，无任何毒副作用，不含放射性，操作使用非常安全。
现有技术中常常采用PE标记法，将藻红蛋白与抗体、生物素、亲合素、免疫蛋白等物质结合，制成荧光探针。通过检测其发出的荧光，可以用于荧光显微检测、荧光免疫测定、双色或多色荧光分析、癌细胞表面抗原检测、蛋白质和核酸等生物大分子的分析；还可以用于免疫检测、荧光显微技术和流式细胞荧光测定等临床诊断及生物工程技术。
传统的PE标记法(如AnaTagTM R-PE Labeling Kit)的实施步骤大致是：(1)将目标蛋白巯基化；(2) 采用SMCC对PE进行活化；(3)将巯基化后的目标蛋白与活化后的PE交联。
本发明开发的PE标记法(其他应该蛋白标记方法类似)的实施步骤大致是:(1)将PE与Sulfo-S-4FB 反应；(2)将抗体与Sulfo-S-HyNic反应；(3)将与Sulfo-S-4FB反应的PE和与Sulfo-S-HyNic反应的抗体进行交联反应。(也可以(1)将PE与Sulfo-S-HyNic反应；(2)将抗体与Sulfo-S-4FB反应；(3)将与 Sulfo-S-HyNic反应的PE和与Sulfo-S-4FB反应的抗体进行交联反应。)
由于目标蛋白和藻红蛋白上既携带氨基，又携带巯基，当采用传统的SMCC等胺-巯基交联剂进行活化时，胺-巯基交联剂不仅会与氨基结合，也会与巯基结合，这就导致当被胺-巯基交联剂活化的蛋白与巯基化蛋白交联时，被胺-巯基交联剂活化的蛋白上那些已与巯基结合的交联剂难以与巯基化蛋白再发生交联，导致目标蛋白上结合的藻红蛋白少、标记效果差，获得的免疫荧光探针产生的阳性信号弱、背景信号强，检测时信噪比低。正熙生物开发的方法实现了抗体和荧光蛋白的定向偶连，不存在抗体之间的复合物以及荧光蛋白之间的复合物。
发明内容
本发明提供一种提高抗体与荧光蛋白定向偶联标记信噪比的方法，该方法包括如下步骤：步骤1)将 PE与第一交联剂反应；步骤2)将抗体与第二交联剂反应；步骤3)将步骤1)交联后的PE和与步骤2) 交联后的抗体进行交联反应；
其中，所述第一交联剂为Sulfo-S-HyNic或S-HyNic，所述的第二交联剂为Sulfo-S-4FB或S-4FB；或所述第一交联剂为Sulfo-S-4FB或S-4FB，所述的第二交联剂为Sulfo-S-HyNic或S-HyNic；该方法在进行免疫检测时，阳性信号强、信噪比高。
在一些实施方式中，所述步骤2)中，第二交联剂与抗体分子中的游离氨基结合。
在一些实施方式中，所述步骤1)中的PE上的氨基与第一交联剂反应。
在一些实施方式中，所述步骤3)中，在步骤1)交联后的PE和与步骤2)交联后的抗体中加入亲核催化剂进行交联反应；优选地，所述亲核催化剂为腙基催化剂；在一些实施例中，所述的腙基催化剂选自 2,4-二甲氧基苯胺、苯胺、苯胺衍生物，5-氨基吲哚，苯二胺衍生物,3,5-二氨基苯甲酸,邻氨基苯甲酸衍生物。
在一些实施方式中，所述的步骤3)中在反应混合物加入了过量的第二交联剂，用来封闭过剩的与第一交联剂反应的PE，封闭后加入过量的半胱氨酸并用超滤管去除未反应的PE；通过上述方法，该方法降低了反应的阴性信号，提高了信噪比。
在一些实施方式中，所述步骤1)和步骤2)中通过脱盐处理除去未参与反应的第一交联剂和第二交联剂。
在一些实施方式中，步骤2)的具体方法为：向抗体中加入第二交联剂溶液，混匀后反应，在本步骤中，第二交联剂分子与抗体分子中的游离氨基结合，制备第二交联剂-抗体；将获得的反应液移至超滤离心管内，再加入磷酸钠缓冲液，离心并除去滤液，再加入磷酸钠缓冲液混匀离心，重复此操作多次并将抗体定容。
在一些实施方式中，步骤1)的具体方法为：向PE中加入第一交联剂溶液，混匀后反应,在本步骤中，第一交联剂分子与藻红蛋白分子中的游离氨基结合，制备第一交联剂-PE；将获得的反应液移至超滤离心管内，再加入磷酸钠缓冲液，离心并除去滤液，再加入磷酸钠缓冲液混匀离心，重复此操作多次并将PE 定容。
在一些实施方式中，步骤3)中，取步骤2)获得的交联后的抗体与步骤1)获得的交联后的PE混匀反应即制备的抗体-PE，其中，所述抗体和PE的摩尔比为1：1～5，优选为1:3。
本发明还提供一种荧光蛋白探针的制备方法，该方法包括将PE与Sulfo-S-4FB或Sulfo-S-HyNic或 -S-4FB或S-HyNic反应。
在一些实施方式中，向PE中加入Sulfo-S-4FB或Sulfo-S-HyNic或-S-4FB或S-HyNic溶液，混匀后反应,在本步骤中，Sulfo-S-4FB或Sulfo-S-HyNic或-S-4FB或S-HyNic分子与藻红蛋白分子中的游离氨基结合；将获得的反应液移至超滤离心管内，再加入磷酸钠缓冲液，离心并除去滤液，再加入磷酸钠缓冲液混匀离心，重复此操作多次并将PE定容。
本发明根据上述方法获得一种荧光蛋白探针。
本发明PE-抗体具有比传统标记标记方法更高的阳性信号，且进一步地降低了阴性信号，提高了信噪比。
附图说明
图1-图3为实施例1制备的藻红蛋白免疫荧光探针CD4-PE与CD8-FITC共染小鼠脾细胞的流式检测散点图和PE荧光信号强度检测结果直方图；
图4-6为实施例2制备的藻红蛋白免疫荧光探针CD4-PE与CD8-FITC共染小鼠脾细胞的流式检测散点图和PE荧光信号强度检测结果直方图；
图7-9为实验例3制备的藻红蛋白免疫荧光探针CD4-PE与CD8-FITC共染小鼠脾细胞的流式检测散点图和PE荧光信号强度检测结果直方图；
图10-12为对比例1制备的藻红蛋白免疫荧光探针CD4-PE与CD8-FITC共染小鼠脾细胞的流式检测散点图和PE荧光信号强度检测结果直方图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
在本发明中，Sulfo-S-4FB的结构如下式所示：
Sulfo-S-HyNic的结构如下式所示：
实施例1
本实施例以抗小鼠CD4单克隆抗体[GK1.5](以下简称CD4抗体)作为目标蛋白，介绍一种藻红蛋白免疫荧光探针制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)对目标蛋白上的氨基与Sulfo-S-HyNic反应；
具体包括：
向200ug CD4抗体中加入0.7ul 60mM Sulfo-S-HyNic溶液，混匀后，置于25℃以上室温反应1.5h；
在本步骤中，Sulfo-S-HyNic分子与CD4抗体分子中的游离氨基结合，制备Sulfo-S-HyNic-CD4；
将步骤(1.1)获得的反应液移至超滤离心管内，再加入500ul磷酸钠(PH 6.0)缓冲液，12000g 离心5min并除去滤液，再加入500ul磷酸钠(PH 6.0)缓冲液缓冲液混匀离心，重复此操作5次并将抗体定容至46ul；
本步骤通过脱盐处理以尽可能地除去反应液中未参与反应的Sulfo-S-HyNic残余，确保脱盐后获得的反应液中，Sulfo-S-HyNic残余量至少为抗体总量的10-3倍以上；
(2)对荧光蛋白(藻红蛋白)上的氨基与Sulfo-S-4FB反应；
具体包括：
(2.1)向600ug藻红蛋白中加入2.3ul 60mM Sulfo-S-4FB溶液，混匀后，置于25℃以上室温反应 1.5h；
在本步骤中，Sulfo-S-4FB分子与藻红蛋白分子中的游离氨基结合，制备Sulfo-S-HyNic-PE；
(2.2)将步骤(2.1)获得的反应液移至超滤离心管内，再加入500ul磷酸钠(PH6.0)缓冲液， 12000g离心5min并除去滤液，再加入500ul磷酸钠(PH 6.0)缓冲液缓冲液混匀离心，重复此操作5 次并将PE定容至30ul；
本步骤通过脱盐处理以尽可能地除去反应液中未参与反应的Sulfo-S-4FB残余，确保脱盐后获得的反应液中，Sulfo-S-4FB残余量至少为抗体总量的10-3倍以上；
(3)将步骤(1)获得的Sulfo-S-HyNic-CD4与步骤(2)获得的Sulfo-S-HyNic-PE交联，获得本实施例的CD4-PE；
具体包括：
(3.1)取步骤(1)获得的46ul Sulfo-S-HyNic-CD4抗体与步骤(2)获得的30ulSulfo-S-HyNic-PE 混匀(n(Ab)：n(PE)＝1：3)，而后置于25℃以上室温下避光反应3h后将抗体浓度稀释至0.25mg/ml,置于 4度保存，即制备的CD4-PE。
(3.2)标记的CD4-PE按相同的浓度分别与CD8-FITC对1百万小鼠脾细胞进行共染(每个反应体系中加入0.25μg标记的iFluor标记抗体与0.125μg PE标记抗体)，染色15min后通过流式细胞仪检测荧光信号。
图1-图3为实施例1制备的藻红蛋白免疫荧光探针CD4-PE与CD8-FITC共染小鼠脾细胞的流式检测散点图和PE荧光信号强度检测结果直方图。
实施例2
本实施例以抗小鼠CD4单克隆抗体[GK1.5](以下简称CD4抗体)作为目标蛋白，介绍一种藻红蛋白免疫荧光探针制备方法(在实施例1的基础上进行封闭)，该制备方法包括以下步骤：
(1)对目标蛋白上的氨基与Sulfo-S-HyNic反应；
具体包括：
(1.1)向200ug CD4抗体中加入0.7ul 60mM Sulfo-S-HyNic溶液，混匀后，置于25℃以上室温反应1.5h；
在本步骤中，Sulfo-S-HyNic分子与CD4抗体分子中的游离氨基结合，制备Sulfo-S-HyNic-CD4；
(1.2)将步骤(1.1)获得的反应液移至超滤离心管内，再加入500ul磷酸钠(PH6.0)缓冲液，12000g离心5min并除去滤液，再加入500ul磷酸钠(PH 6.0)缓冲液混匀离心，重复此操作5次并将抗体定容至46ul；
本步骤通过脱盐处理以尽可能地除去反应液中未参与反应的Sulfo-S-HyNic残余，确保脱盐后获得的反应液中，Sulfo-S-HyNic残余量至少为抗体总量的10-3倍以上；
(2)对荧光蛋白(藻红蛋白)上的氨基与Sulfo-S-4FB反应；
具体包括：
(2.1)向600ug藻红蛋白中加入2.3ul 60mM Sulfo-S-4FB溶液，混匀后，置于25℃以上室温反应 1.5h；
在本步骤中，Sulfo-S-4FB分子与藻红蛋白分子中的游离氨基结合，制备Sulfo-S-HyNic-PE；
(2.2)将步骤(2.1)获得的反应液移至超滤离心管内，再加入500ul磷酸钠(PH6.0)缓冲液， 12000g离心5min并除去滤液，再加入500ul磷酸钠(PH 6.0)缓冲液缓冲液混匀离心，重复此操作5 次并将PE定容至30ul；
本步骤通过脱盐处理以尽可能地除去反应液中未参与反应的Sulfo-S-4FB残余，确保脱盐后获得的反应液中，Sulfo-S-4FB残余量至少为抗体总量的10-3倍以上；
(3)将步骤(1)获得的Sulfo-S-HyNic-CD4与步骤(2)获得的Sulfo-S-HyNic-PE交联，获得本实施例的CD4-PE；
具体包括：
(3.1)取步骤(1)获得的46ul Sulfo-S-HyNic-CD4抗体与步骤(2)获得的30ulSulfo-S-HyNic-PE 混匀(n(Ab)：n(PE)＝1：3)，与此同时向反应加入10mM催化剂2,4-二甲氧基苯胺(2,4-DMA)后置于25℃以上室温下避光反应3h后将抗体浓度稀释至0.25mg/ml,置于4度保存，即制备的CD4-PE。
(3.2)标记的CD4-PE按相同的浓度分别与CD8-FITC对1百万小鼠脾细胞进行共染(每个反应体系中加入0.25μg标记的iFluor标记抗体与0.125μg PE标记抗体)，染色15min后通过流式细胞仪检测荧光信号。
图4-图6为实施例1制备的藻红蛋白免疫荧光探针CD4-PE与CD8-FITC共染小鼠脾细胞的流式检测散点图和PE荧光信号强度检测结果直方图。
实施例3
本实施例以抗小鼠CD4单克隆抗体[GK1.5](以下简称CD4抗体)作为目标蛋白，介绍一种藻红蛋白免疫荧光探针制备方法(在实施例1的基础上进行封闭)，该制备方法包括以下步骤：
(1)对目标蛋白上的氨基与Sulfo-S-HyNic反应；
具体包括：
(1.1)向200ug CD4抗体中加入0.7ul 60mM Sulfo-S-HyNic溶液，混匀后，置于25℃以上室温反应1.5h；
在本步骤中，Sulfo-S-HyNic分子与CD4抗体分子中的游离氨基结合，制备Sulfo-S-HyNic-CD4；
(1.2)将步骤(1.1)获得的反应液移至超滤离心管内，再加入500ul磷酸钠(PH6.0)缓冲液，12000g离心5min并除去滤液，再加入500ul磷酸钠(PH 6.0)缓冲液缓冲液混匀离心，重复此操作5 次并将抗体定容至46ul；
本步骤通过脱盐处理以尽可能地除去反应液中未参与反应的Sulfo-S-HyNic残余，确保脱盐后获得的反应液中，Sulfo-S-HyNic残余量至少为抗体总量的10-3倍以上；
(2)对荧光蛋白(藻红蛋白)上的氨基与Sulfo-S-4FB反应；
具体包括：
(2.1)向600ug藻红蛋白中加入2.3ul 60mM Sulfo-S-4FB溶液，混匀后，置于25℃以上室温反应 1.5h；
在本步骤中，Sulfo-S-4FB分子与藻红蛋白分子中的游离氨基结合，制备Sulfo-S-HyNic-PE；
(2.2)将步骤(2.1)获得的反应液移至超滤离心管内，再加入500ul磷酸钠(PH6.0)缓冲液， 12000g离心5min并除去滤液，再加入500ul磷酸钠(PH 6.0)缓冲液缓冲液混匀离心，重复此操作5 次并将PE定容至30ul；
本步骤通过脱盐处理以尽可能地除去反应液中未参与反应的Sulfo-S-4FB残余，确保脱盐后获得的反应液中，Sulfo-S-4FB残余量至少为抗体总量的10-3倍以上；
(3)将步骤(1)获得的Sulfo-S-HyNic-CD4与步骤(2)获得的Sulfo-S-HyNic-PE交联，获得本实施例的CD4-PE；
具体包括：
(3.1)取步骤(1)获得的46ul Sulfo-S-HyNic-CD4抗体与步骤(2)获得的30ulSulfo-S-HyNic-PE 混匀(n(Ab)：n(PE)＝1：3)，与此同时向反应加入10mM催化剂2,4-dimethoxyaniline(2,4-DMA)后置于25℃以上室温下避光反应3h后加入2.3ul Sulfo-S-HyNic，对未反应的Sulfo-S-HyNic-PE进行封闭，置于室温1.5h 后加入10ul 1M半胱氨酸，封闭过量Sulfo-S-HyNic上与半胱氨酸反应的基团1.5h，反应后将混合液通过 200kDa超滤管进行超滤，去除未交联PE，并且将抗体溶液稀释至0.25mg/ml的浓度，置于4度保存，即制备的CD4-PE。
图7-图9为实施例1制备的藻红蛋白免疫荧光探针CD4-PE与CD8-FITC共染小鼠脾细胞的流式检测散点图和PE荧光信号强度检测结果直方图；
对比例1
采用与藻红蛋白免疫荧光探针标记方法(专利号202010087828.0)相同的方法制备藻红蛋白免疫荧光探针CD4-PE。
标记的CD4-PE按相同的浓度分别与CD8-FITC对1百万小鼠脾细胞进行共染(每个反应体系中加入0.25μg标记的iFluor标记抗体与0.125μg PE标记抗体)，染色15min后通过流式细胞仪检测荧光信号。
图10-图12为实施例1制备的藻红蛋白免疫荧光探针CD4-PE与CD8-FITC共染小鼠脾细胞的流式检测散点图和PE荧光信号强度检测结果直方图。
结果分析:
CD4流式阳性信号:根据PE荧光信号强度检测结果直方图，实施例1阳性信号:19200(图3),实施例2阳性信号:27319(图6),实验例3阳性信号:26486(图9),大于对比例1阳性信号(图12):17846
与传统SMCC标记的方法相比(对比例1),实施例1具有较为接近的PE阳性信号，在加了交联反应的催化剂后，PE标记的阳性信号有了明显的提高,见实施例2和实施例3的阳性信号。
流式阴性信号:
实施例3阴性信号:167(图9),对比例1阴性信号:216(图12),实施例1阴性信号:259(图3)实施例2 阴性信号:429(图6)
与传统SMCC标记的方法相比(对比例1),实施例1与实施例3具有较高的PE阴性信号，表明新的交联方法产生了较多的PE非特异性信号。在加了交联封闭剂，半胱氨酸以及超滤处理后，实施例3的PE阴性信号有了明显的下降，低于对比例1。
综上所述，实施例3具有较高的PE阳性信号，最低的PE阴性信号，因此实施例3具有最高的信噪比，优于传统的标记方法。
Claims (10)
1.一种提高抗体与荧光蛋白定向偶联标记信噪比的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤1）将PE与第一交联剂反应；步骤2）将抗体与第二交联剂反应；步骤3）将步骤1）交联后的PE和与步骤2）交联后的抗体进行交联反应；
其中，所述第一交联剂为Sulfo-S-HyNic或S-HyNic，所述的第二交联剂为Sulfo-S-4FB或S-4FB；或
所述第一交联剂为Sulfo-S-4FB或S-4FB，所述的第二交联剂为Sulfo-S-HyNic或S-HyNic。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中，第二交联剂与抗体分子中的氨基结合；所述步骤1）中的PE上的氨基与第一交联剂反应。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过脱盐处理除去所述步骤1）和步骤2）中未参与反应的第一交联剂和第二交联剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3）中在反应混合物加入过量的第二交联剂，用来封闭过剩的与第一交联剂反应的PE，封闭后加入过量的半胱氨酸并用超滤管去除未反应的PE。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，在步骤1）交联后的PE和与步骤2）交联后的抗体中加入亲核催化剂进行交联反应；优选地，所述亲核催化剂为腙基催化剂；在一些实施例中，所述的腙基催化剂选自2, 4-二甲氧基苯胺、苯胺、苯胺衍生物，5-氨基吲哚，苯二胺衍生物, 3,5-二氨基苯甲酸, 邻氨基苯甲酸衍生物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）的具体方法为：向抗体中加入第二交联剂溶液，混匀后反应，在本步骤中，第二交联剂分子与抗体分子中的游离氨基结合，制备第二交联剂-抗体；将获得的反应液移至超滤离心管内，再加入磷酸钠缓冲液，离心并除去滤液，再加入磷酸钠缓冲液混匀离心，重复此操作多次并将抗体定容。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)的具体方法为：向PE中加入第一交联剂溶液，混匀后反应,在本步骤中，第一交联剂分子与藻红蛋白分子中的游离氨基结合，制备第一交联剂-PE；将获得的反应液移至超滤离心管内，再加入磷酸钠缓冲液，离心并除去滤液，再加入磷酸钠缓冲液混匀离心，重复此操作多次并将PE定容。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，取步骤2）获得的封闭后的抗体与步骤1）获得的封闭后的PE混匀反应即制备的抗体-PE，其中，所述抗体和PE的摩尔比为1：1~5，优选为1:3；加入第二封闭剂，对未反应的第一封闭剂-PE进行封闭反应后后加入半胱氨酸，封闭过量第二封闭剂，反应后将混合液通过超滤管进行超滤，去除未交联PE。
9.一种荧光蛋白探针的制备方法，其特征在于，该方法包括将PE与Sulfo-S-4FB或Sulfo-S-HyNic或-S-4FB或S-HyNic反应；优选地，向PE中加入Sulfo-S-4FB或Sulfo-S-HyNic或-S-4FB或S-HyNic溶液，混匀后反应,在本步骤中，Sulfo-S-4FB或Sulfo-S-4FB或Sulfo-S-HyNic或-S-4FB或S-HyNic分子与藻红蛋白分子中的游离氨基结合；将获得的反应液移至超滤离心管内，再加入磷酸钠缓冲液，离心并除去滤液，再加入磷酸钠缓冲液混匀离心，重复此操作多次并将PE定容。
10.根据权利要求9方法制备获得的荧光蛋白探针。
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| US20120258881A1 (en) * | 2010-11-22 | 2012-10-11 | The University Of Chicago | Methods and/or Use of Oligonucleotide Conjugates for Assays and Microscopy/Imaging Detections |
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| CN107531778A (zh) * | 2015-02-06 | 2018-01-02 | 赛尔伊迪克斯公司 | 抗原偶联的免疫试剂 |
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2020
- 2020-11-30 CN CN202011368522.9A patent/CN112630422A/zh active Pending
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