CN111308063B - 藻红蛋白免疫荧光探针标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，该标记方法包括以下步骤：(1)采用胺‑巯基交联剂活化目标蛋白；(2)对藻红蛋白作巯基化处理，获得巯基化的藻红蛋白；(3)将巯基化的藻红蛋白与活化后的目标蛋白交联，获得所述的藻红蛋白免疫荧光探针。本发明的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法中，藻红蛋白无需预先活化，直接对其作巯基化处理，而后与预先活化的目标蛋白交联即可。不仅省略了操作步骤，而且获得的免疫荧光探针在检测时，阳性信号强，背景信号与现有技术相当或较现有技术弱，信噪比高。
Description
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种藻红蛋白免疫荧光探针标记方法。
背景技术
藻红蛋白(P-phycoerythrin，简称PE)是从红藻中分离纯化获得的、目前普遍使用的一种新型荧光标记试剂。在特定波长激发下，藻胆蛋白能发射强烈的荧光，其荧光强度是荧光素的30-100倍，具有很好的吸光性能和很高的量子产率，在可见光谱区有很宽的激发及发射范围。
将藻红蛋白用于荧光分析，具有传统化学荧光染料无法比拟的优越性。比如：(1)在较宽的pH范围内具有较宽的吸收光谱，比较容易选择合适的激发波长，从而得到高效荧光发射，且激发时有特异的荧光发射峰；(2)吸光度和荧光量子产率很高，荧光强而稳定，灵敏度高；(3)具有较小的荧光背景，不易淬灭，荧光保存期较长；(4)水溶性极佳，易与其他分子交联结合，非特异性吸附少；(5)纯天然海洋生物提取，无任何毒副作用，不含放射性，操作使用非常安全。
现有技术中常常采用PE标记法，将藻红蛋白与抗体、生物素、亲合素、免疫蛋白等物质结合，制成荧光探针。通过检测其发出的荧光，可以用于荧光显微检测、荧光免疫测定、双色或多色荧光分析、癌细胞表面抗原检测、蛋白质和核酸等生物大分子的分析；还可以用于免疫检测、荧光显微技术和流式细胞荧光测定等临床诊断及生物工程技术。
传统的PE标记法(如AnaTagTM R-PE Labeling Kit)的实施步骤大致是：(1) 将目标蛋白巯基化；(2)采用SMCC对PE进行活化；(3)将巯基化后的目标蛋白与活化后的PE交联。
现有技术中还有一种实施步骤(参见文献：赵亚杰，闭兰，孙可芳，端义坤，詹骞，金玉玲，吕兰君，张爱华.荧光染料R-藻红蛋白标记小鼠抗人CD4 单克隆抗体.微生物学免疫学进展[J].2006，34(2)：32-34.)为：(1)采用SPDP 和SMCC分别活化PE和目标蛋白；(2)将经SPDP活化后的PE巯基化；(3) 将巯基化的PE与经SMCC活化的目标蛋白交联。
无论是哪种PE标记法，在将PE与目标蛋白交联之前，现有技术中都需要活化PE，这就导致在进行荧光检测时，最终获得的目标蛋白PE标记物的阴阳信号信噪比较差，背景信号较强。
为提高标记抗体的阴阳信噪比，正熙生物采用了巯基化PE，SMCC活化抗体的方法，该方法产生的PE标记抗体具有较高的阳性信号值与较强的信噪比。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种操作简便、检测时信噪比高的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法。
为实现上述发明目的，本申请的技术方案如下：
一种藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，包括以下步骤：
(1)采用胺-巯基交联剂活化目标蛋白；
(2)对藻红蛋白作巯基化处理，获得巯基化的藻红蛋白；
(3)将巯基化的藻红蛋白与活化后的目标蛋白交联，获得所述的藻红蛋白免疫荧光探针。
本发明的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法中，藻红蛋白无需预先活化，直接对其作巯基化处理，而后与预先活化的目标蛋白交联即可。不仅省略了操作步骤，而且获得的免疫荧光探针在检测时，阳性信号较强，背景信号与现有技术相当或较现有技术弱，信噪比高。
在上述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法的，步骤(1)中，所述的胺-巯基交联剂包括SMCC、Sulfo-SMCC、SPDP或SMPH。
在上述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法中，目标蛋白与SMCC的摩尔比为1：10～1：100。
在上述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法的步骤(1)中，按预设摩尔比向目标蛋白溶液中加入胺-巯基交联剂溶液后，置于25℃以上的室温下反应1.5h。
在上述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法的步骤(2)中，在巯基化处理前，先对藻红蛋白悬浊液作脱盐处理。脱盐处理是为了将藻红蛋白置换到含有EDTA 的PBS缓冲液中，防止藻红蛋白悬浊液中含有的游离氨基干扰反应。
在上述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法中，所述的脱盐处理包括：
(2-1-1)将藻红蛋白悬浊液震荡均匀，而后离心、去上清；
(2-1-2)向沉淀中加入含有EDTA的PBS缓冲液，待充分溶解后离心，取藻红蛋白上清液；
(2-1-3)将藻红蛋白上清液置于超滤管内，采用含有EDTA的PBS缓冲液对藻红蛋白上清液作超滤处理，获得脱盐后的藻红蛋白。
在上述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法的步骤(2)中，采用2-亚氨基硫烷盐酸盐对脱盐后的藻红蛋白作巯基化处理。
在上述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法中，藻红蛋白与2-亚氨基硫烷盐酸盐之间的摩尔比为1:10～1:50。
在上述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法中，所述的巯基化处理包括：将脱盐后的藻红蛋白与2-亚氨基硫烷盐酸盐按预设摩尔比混合后，置于25℃以上的室温下避光反应1.5h。
在上述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法的步骤(3)中，将巯基化的藻红蛋白与活化后的目标蛋白按摩尔比3：1混匀后，置于25℃以上室温下避光反应 3h。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法中，藻红蛋白无需预先活化，直接对其作巯基化处理，而后与预先活化的目标蛋白交联即可。不仅省略了操作步骤，而且获得的免疫荧光探针在检测时，阳性信号较强，与现有技术相当或较现有技术弱，信噪比高。
附图说明
图1为采用本发明的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法制备的免疫荧光探针 CD4-PE[GK1.5]与CD3-ifluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测散点图；
图2为采用现有的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法制备的免疫荧光探针 CD4-PE[GK1.5]与CD3-ifluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测散点图；
图3为本发明与现有技术的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法制备的免疫荧光探针CD4-PE[GK1.5]与CD3-ifluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测对比图；
其中，灰色阴影覆盖区域为采用现有技术制备的免疫荧光探针CD4-PE[GK1.5]的流式检测出峰图，而无阴影覆盖区域为采用本发明方法制备的免疫荧光探针CD4-PE[GK1.5]的流式检测出峰图；
图4为采用本发明的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法制备的免疫荧光探针 IgD-PE[11-26C]与CD3-ifluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测散点图；
图5为采用现有的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法制备的免疫荧光探针IgD-PE[11-26C]与CD3-ifluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测散点图；
图6为本发明与现有技术的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法制备的免疫荧光探针IgD-PE[11-26C]与CD3-ifluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测对比图；
其中，灰色阴影覆盖区域为采用现有技术制备的免疫荧光探针 IgD-PE[11-26C]的流式检测出峰图，而无阴影覆盖区域为采用本发明方法制备的免疫荧光探针IgD-PE[11-26C]的流式检测出峰图；
图7为采用本发明的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法制备的免疫荧光探针 CD19-PE[1D3]与CD3-ifluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测散点图；
图8为采用现有的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法制备的免疫荧光探针 CD19-PE[1D3]与CD3-ifluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测散点图；
图9为本发明与现有技术的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法制备的免疫荧光探针CD19-PE[1D3]与CD3-ifluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测对比图；
其中，灰色阴影覆盖区域为采用现有技术制备的免疫荧光探针 CD19-PE[1D3]的流式检测出峰图，而无阴影覆盖区域为采用本发明方法制备的免疫荧光探针CD19-PE[1D3]的流式检测出峰图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1
本实施例以小鼠CD4抗体[GK1.5]作为目标蛋白，介绍一种藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，该标记方法包括以下步骤：
(1)采用胺-巯基交联剂活化CD4抗体；
具体包括：(1-1)将SMCC从低温状态下拿出后放置于室温环境中，待瓶子温度平衡至室温时再将瓶盖打开，以免瓶子内出现冷凝水；
(1-2)称取适量SMCC溶解于适量DMSO内，配置成10mg/ml母液；母液按5μl/管分装，并保存于-20℃下，每次使用时新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余的试剂请丢弃。
(1-3)配置浓度为4mg/mL的CD4抗体溶液，向每50μl CD4抗体溶液中加入1.6μl10mg/ml SMCC溶液，混匀后，置于25℃以上室温下反应1.5h，使 SMCC分子中琥珀酰酯与CD4分子中伯氨基反应结合；
(1-4)反应完成后，将反应液移至超滤离心管内，再加入500μl PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液，于5min、12000g下离心并除去滤液，再加入500μl PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心；重复此操作1-5次，使反应液中未反应SMCC的参与量降至至少为抗体总量的10-3倍以上，尽可能较多稀释；
(1-5)收集脱盐后的高浓度活化抗体蛋白溶液，测量CD4抗体浓度，将活化CD4抗体溶液的体积进行定容，将其浓度调整至2mg/ml。
(2)对藻红蛋白作巯基化处理，获得巯基化的藻红蛋白；
具体包括：
(2-1)对藻红蛋白作脱盐处理；
具体为：
(2-1-1)将试剂管中的藻红蛋白悬浊液(浓度为5mg/ml)用涡旋振荡器震荡均匀，而后取出0.5g(约100μl)置于1.5mL离心管内，在12000g下离心5min，并用移液枪完全吸走上清液，注意不要吸走藻红蛋白沉淀；
(2-1-2)取100μl PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液，加入离心管内充分溶解离心管底部的藻红蛋白沉淀，在12000g下离心5min，吸取藻红蛋白上清液；
(2-1-3)将藻红蛋白上清液置于50kd超滤离心管内，再加入400μl PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀，在12000g下离心5min，除去滤出液；再加入 500μl PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次后，收集脱盐后的藻红蛋白溶液定容到50μl，得到浓度为10mg/mL的藻红蛋白溶液。
(2-2)对脱盐后的藻红蛋白作巯基化处理；
具体为：
(2-2-1)称取适量traut’s regent，溶解于适量去离子水中，配置成2mg/ml(14mM)母液；将母液按5μl/管分装并保存于-20℃下，每次使用时新融化一支，不要反复冻融使用，使用后的剩余试剂请丢弃。
(2-2-2)向每50μl藻红蛋白溶液(10mg/mL)中加入4.6μl的traut’s溶液，混匀后置于25℃以上室温下，避光反应1.5h；
(2-2-3)反应完成后，将反应液移至超滤离心管内，再加入500μl PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液，于5min、12000g下离心并除去滤液，再加入500μl PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心；重复此操作1-5次；
(2-2-4)收集脱盐后的巯基化藻红蛋白溶液，检测藻红蛋白浓度，巯基化藻红蛋白溶液体积定容，使其浓度为10mg/ml。
(3)将巯基化的藻红蛋白与活化后的目标蛋白交联，获得所述的藻红蛋白免疫荧光探针；
具体包括：
将步骤(1)获得的活化CD4抗体溶液与步骤(2)获得的巯基化藻红蛋白溶液按照摩尔比1:3混匀，即在5μl(2mg/ml)活化CD4抗体溶液中加入3μl (10mg/ml)巯基化藻红蛋白溶液，而后置于25℃以上室温下避光反应3h，反应完成后向反应体系内加入28μl PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液，使经藻红蛋白标记的CD4抗体(即CD4-PE[GK1.5])终浓度为0.25mg/ml，操作完成后将反应液放置于4℃长期保存。
在进行流式检测时，按照1:100将经藻红蛋白标记的CD4抗体溶液稀释后使用，流式检测反应体系为：流式缓冲液(PBS+0.5％FBS+0.2％EDTA)100μl， CD4-PE[GK1.5]终浓度2.5μg/ml，CD3-ifluor488[145-2C11]终浓度5μg/ml，小鼠 (C57)脾细胞10万cells；反应条件为：25℃水浴避光反应15min，流式缓冲液1ml清洗3次，定容500μl；设门方法：lymph+。
检测结果如图1所示。
由图1可见，采用本实施例制备的CD4-PE[GK1.5]与CD3-ifluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞时，出现了明显的细胞分群，且阳性细胞群CD4+CD3+ 淋巴细胞(Q2区域)占比8.23％，占比正常。
对比例1
本对比例的标记方法与AnaTagTM R-PE Labeling Kit试剂盒相同，标记完成后采用与实施例1相同的方法进行流式检测，检测结果如图2所示。
由图2可见，本对比例制备的CD4-PE[GK1.5]与CD3-ifluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞时，虽然也出现了较为明显的细胞分群，但分群较图1 差；并且，阳性细胞群CD4+CD3+淋巴细胞(Q2区域)占比2.72％，占比偏低。
进一步对实施例1和对比例1的流式检测结果进行比对，比对结果如图3 所示。
由图3可见，本发明的标记方法与现有技术的标记方法所获得的荧光探针的双阴性信号(即信号值较小的峰，对应图1和图2中的Q4区域)强度相当，但本发明的标记方法所获得的荧光探针的阳性信号(即信号值较大的峰，对应图1和图2中的Q2区域)明显强于现有技术的标记方法，最终使得本发明的标记方法所获得的荧光探针的信噪比明显优于现有技术的标记方法。
实施例2
以抗小鼠IgD单克隆抗体[11-26C]作为目标蛋白，采用与实施例1相同的方法进行荧光标记，并采用与实施例1相同的方法进行流式检测，检测结果见图4 和图6。
由图4所示，采用本实施例制备的IgD-PE[11-26C]与CD3-iFluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞，出现了明显的细胞分群。阳性细胞群IgD+CD3-淋巴细胞(Q7区域)占比75.0％，占比正常。
对比例2
以抗小鼠IgD单克隆抗体[11-26C]作为目标蛋白，采用与对比例1相同的方法进行荧光标记，并采用与实施例1相同的方法进行流式检测，检测结果见图5 和图6。
由图5所示，采用本对比例制备的IgD-PE[11-26C]与CD3-iFluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞，虽然出现了较为明显的细胞分群，但分群效果较差。阳性细胞群IgD+CD3-淋巴细胞(Q7区域)占比79.4％，占比正常。
由图6所示，与现有技术相比，本发明的标记方法所获得的荧光探针的双阴性信号(即信号值较小的峰，对应图4和图5中的Q8区域)相当，但阳性信号(即信号值较大的峰，对应图4和图5中的Q7区域)较强，最终使得本发明的标记方法所获得的荧光探针的信噪比优于现有技术的标记方法。
实施例3
以抗小鼠CD19单克隆抗体[1D3]作为目标蛋白，采用与实施例1相同的方法进行荧光标记，并采用与实施例1相同的方法进行流式检测，检测结果见图7 和图9。
由图7所示，采用本实施例制备的CD19-PE[1D3]与CD3-iFluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞，出现了明显的细胞分群；且阳性细胞群CD19+CD3- 淋巴细胞(Q1区域)占比83.5％，占比正常。
对比例3
以抗小鼠CD19单克隆抗体[1D3]作为目标蛋白，采用与对比例1相同的方法进行荧光标记，并采用与实施例1相同的方法进行流式检测，检测结果见图8 和图9。
由图8所示，采用本对比例制备的CD19-PE[1D3]与CD3-iFluor488[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞，虽然出现了较为明显的细胞分群，但分群效果较差。阳性细胞群CD19+CD3-淋巴细胞(Q1区域)占比82.2％，占比正常。
由图9所示，与现有技术相比，本发明的标记方法所获得的荧光探针的双阴性信号(即信号值较小的峰，对应图7和图8中的Q4区域)强度较弱，且本发明的标记方法所获得的荧光探针的阳性信号(即信号值较大的峰，对应图7 和图8中的Q1区域)较强，最终使得本发明的标记方法所获得的荧光探针的信噪比优于现有技术的标记方法。
Claims (9)
1.一种藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用胺-巯基交联剂活化目标蛋白；
(2)对藻红蛋白作巯基化处理，获得巯基化的藻红蛋白；
具体地，采用2-亚氨基硫烷盐酸盐对脱盐后的藻红蛋白作巯基化处理；
(3)将巯基化的藻红蛋白与活化后的目标蛋白交联，获得所述的藻红蛋白免疫荧光探针。
2.如权利要求1所述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的胺-巯基交联剂包括SMCC、Sulfo-SMCC、SPDP或SMPH。
3.如权利要求2所述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，其特征在于，目标蛋白与SMCC的摩尔比为1：10～1：100。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，其特征在于，步骤(1)中，按预设摩尔比向目标蛋白溶液中加入胺-巯基交联剂溶液后，置于25℃以上的室温下反应1.5h。
5.如权利要求1所述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，其特征在于，步骤(2)中，在巯基化处理前，先对藻红蛋白悬浊液作脱盐处理。
6.如权利要求5所述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，其特征在于，所述的脱盐处理包括：
(2-1-1)将藻红蛋白悬浊液震荡均匀，而后离心、去上清；
(2-1-2)向沉淀中加入含有EDTA的PBS缓冲液，待充分溶解后离心，取藻红蛋白上清液；
(2-1-3)将藻红蛋白上清液置于超滤管内，采用含有EDTA的PBS缓冲液对藻红蛋白上清液作超滤处理，获得脱盐后的藻红蛋白。
7.如权利要求1所述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，其特征在于，藻红蛋白与2-亚氨基硫烷盐酸盐之间的摩尔比为1:10～1:50。
8.如权利要求1或7所述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，其特征在于，所述的巯基化处理包括：将脱盐后的藻红蛋白与2-亚氨基硫烷盐酸盐按预设摩尔比混合后，置于25℃以上的室温下避光反应1.5h。
9.如权利要求1所述的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，其特征在于，步骤(3)中，将巯基化的藻红蛋白与活化后的目标蛋白按摩尔比3：1混匀后，置于25℃以上室温下避光反应3h。
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