CN115656495A - 一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法及应用，属于光电化学生物传感器技术领域，具体涉及采用BiPO₄/BiOBr/CdS复合材料检测甲胎蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法及应用。该方法通过在FTO修饰电极上组装三元异质结固定捕获抗体，通过光电流信号响应实现甲胎蛋白的准确测定。BiPO₄/BiOBr异质结扩大了禁带宽度，扩大了光吸收范围；由于CDs的敏化作用，增强了对可见光的吸收，从而增加了光电流信号。该方法具有稳定性好，特异性强，灵敏度高，重现性好等优点，对于甲胎蛋白得快速检测有较好的帮助，解决了现有的技术难点，为肿瘤标志物的检测提供了可行的方法。

Description

一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法及 应用

技术领域

本发明属于光电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种BiPO₄/BiOBr/CdS三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法及其在检测甲胎蛋白中的应用。

背景技术

近年来，癌症正在成为最常见的疾病和重大的公共卫生问题。虽然癌症的死亡率很高，但早期诊断和治疗干预可以显著提高癌症患者的治愈率。甲胎蛋白(AFP)是一种糖蛋白，属于白蛋白家族，主要由胎儿肝细胞及卵黄囊合成。甲胎蛋白在胎儿血液循环中浓度较高，出生后则渐渐下降，出生后2～3月甲胎蛋白基本被白蛋白替代，在血液中很难检出，所以在成人血清中含量极低。甲胎蛋白具有很多重要的生理功能，包括运输功能、作为生长调节因子的双向调节功能、免疫抑制、T淋巴细胞诱导凋亡等。甲胎蛋白与肝癌及多种肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤中均可表现出较高浓度，可作为肿瘤的阳性检测指标。目前临床上主要作为原发性肝癌的血清标志物，用于原发性肝癌的诊断及疗效监测。一般情况下，人血清中AFP的浓度小于20ng·mL^-1，但当高于此值时，可能导致肝细胞癌。作为重要的生物标志物，早期灵敏、快速地监测AFP含量异常变化对于原发性肝癌的早期诊断具有重要意义。

作为一种极具前景的分子检测和分析技术，光电化学(PEC)结合了光化学和电化学两者灵敏度高、响应速度快、背景响应低、操作简单的优点，在蛋白质检测、DNA检测和生物标志物检测中具有重大的应用价值。在光电化学检测过程中，当光活性材料被光源激发时，光生电子和空穴分离转移或发生氧化还原反应，从而产生光电流作为检测信号。在过去的几十年里，比率荧光法、基于适配体的荧光法、酶联免疫吸附试验、电感耦合等离子体质谱法、电化学免疫分析和电化学发光法等方法已被开发为检测AFP的有效方法。然而，这些现有的方法具有设备成本高、耗时且程序复杂的缺点。

作为光电传感器的核心，感光材料对光电传感器的性能有着巨大的影响。作为一种铋金属半导体材料，BiPO₄由于其无毒、耐腐蚀的特性，常被用作光活性材料参与光化学反应。然而，BiPO₄的宽带隙(4.40eV)导致其对可见光响应较弱，光生电子-空穴对复合率高，限制了其在光电化学传感器中的应用。将两种光电材料耦合形成异质结被认为是解决该问题的有效方法，能够大大提高复合材料的光电转换效率。一般来说，BiPO₄和BiOBr通常用于构建光催化材料，但很少有关于使用BiPO₄和BiOBr异质结建立光电化学传感器的报道。硫化镉(CdS)在可见光区域具有很强的光吸收能力。是一种极为重要的光电材料。由于其具有窄带隙的特性，CdS被认为是一种用于PEC分析的优秀材料，可用于高效光敏BiPO₄/BiOBr异质结以响应可见光，进一步提高材料对可见光的光电响应。

本发明将BiPO₄与BiOBr两种光电材料耦合形成异质结，再进一步使用CdS量子点敏化，匹配的能带结构使传感器的光电效率大大提高。

发明内容

针对现有技术所存在的问题，本发明提供一种BiPO₄/BiOBr/CdS三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法及其在检测甲胎蛋白中的应用。本发明构建的光电化学传感器利用抗原与抗体特异性结合的原理进行检测，制备方法简单，结构稳定。并且，该方法对人体及环境无危害，具有特异性强、准确性高、操作简单、更加快捷的优点，对于快速痕量检测有较好的帮助。

本发明采用如下方案解决上述技术问题：

本发明提供一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法，所述异质结为BiPO₄/BiOBr/CdS三元异质结复合材料，包括以下步骤：

步骤1：BiPO₄/BiOBr复合材料的制备；

在搅拌条件下，将NaBr、NaH₂PO₄和Bi(NO₃)₃·5H₂O加入到溶剂中混合，剧烈搅拌，得到混合溶液。将混合产物超声处理10-20min后，在室温下继续搅拌20-40min，然后转移到聚四氟乙烯衬里的反应釜中，在160-220℃下加热12-24h。反应结束后自然冷却，离心收集沉淀，用无水乙醇和超纯水分别洗涤2-4次沉淀物，然后将沉淀物在40-80℃下干燥12 -24h，得到BiPO₄/BiOBr异质结粉末。

采用上述方法制备的BiPO₄/BiOBr复合材料具有光吸收能力好、带隙窄、无污染、对人体及环境无害、合成简便以及材料易获得等优点。最终可以合成质量百分含量比为10-50wt％的BiPO₄/BiOBr复合材料，优选BiPO₄/BiOBr异质结重量比为40wt％，能够获得更强的光电流。

步骤2：水溶性CdS QDs的制备；

将CdCl₂加入到去离子水中，制备成CdCl₂溶液。加入巯基丙酸后，溶液用氮气脱气10-40min，然后用NaOH溶液调节pH值至9-12。加入Na₂S溶液，在100-120℃加热回流2-6h。溶液冷却至室温后，加入异丙醇进行沉降处理，离心得到固体沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤2-3次，在真空干燥箱中40-80℃干燥10-24h，得到CdS QDs粉末。

步骤3：BiPO₄/BiOBr/CdS三元异质结复合材料的制备；

分别称取BiPO₄/BiOBr异质结粉末和CdS QDs粉末，加入去离子水，涡旋5-10min得到混合溶液。超声处理30-90min使两种材料结合，得到CdS敏化的BiPO₄/BiOBr复合悬浮液，将其置于4℃的环境中避光保存备用。

步骤4：PEC免疫传感器的制备；

清洗FTO玻璃电极，均匀滴加CdS敏化的BiPO₄/BiOBr/CdS悬浮液至玻璃电极上，烘干，向烘干后的玻璃电极滴加AFP抗体、BSA和不同浓度的AFP抗原。

本发明方法制备的PEC免疫传感器通过CdS敏化提高了光电流的响应，能够用于有效检测甲胎蛋白，具有检测灵敏度高、吸附选择好、检测快速、性能稳定、信号响应强等优点。且该制备方法原料来源广泛且低廉，安全无毒，制备过程简便、易操作。

所述步骤1中，NaBr、NaH₂PO₄和Bi(NO₃)₃·5H₂O三者的投料摩尔比为(0.5-0.9):(0.5-0.1):1。

所述步骤1中，混合产物在聚四氟乙烯衬里的反应釜中，优选反应温度及反应时间为180℃加热24h。在180℃加热12-24h时，合成的复合材料产率较高，BiPO₄与BiOBr能够互相结合成异质结，并且能够具有良好的稳定性。

所述步骤1中，优选干燥温度及时间为60℃干燥12h。

所述步骤2中，混合溶液中，CdCl₂与Na₂S的摩尔比为1:(0.5-1)，CdCl₂与巯基丙酸的物料配比为每0.001mol CdCl₂加入100-500μl巯基丙酸。所述Na₂S溶液浓度为0.1mol·L^-1。

所述步骤2中，反应中加入巯基丙酸作为交联剂，有利于带正电的镉原子和带负电子的硫原子的结合。反应前用氮气脱气，将反应体系中的氧气完全去除，排除了氧气的干扰，使反应顺利进行。

所述步骤2中，优选地氢氧化钠溶液调整pH值为11。由于巯基丙酸为酸性，而反应体系需要在碱性条件中进行，当pH为9-12之间时反应较完全，当调整pH值为11时最佳。严格控制反应体系的pH值，并在100-120℃下加热回流有助于CdS量子点的合成。

所述步骤3中，BiPO₄/BiOBr异质结粉末和CdS QDs粉末的质量比为1:1-1:5，优选1:3。严格控制BiPO₄/BiOBr异质结粉末和CdS QDs粉末的质量比可以使材料获得强的光电流效果。当质量比在1:1-1:5之间时，光电流先升高后降低。当质量比为1:3时，光电流达到最大值，质量比继续增加时，光电流强度没有明显增强。

所述步骤4中，采用的是0.6×2.0cm²的FTO玻璃电极，清洗过程分别采用丙酮、1.0mol·L^-1NaOH与50％乙醇混合溶液(v/v，1:1)和超纯水在超声中清洗10-20min。清洗后的FTO玻璃电极在40-80℃干燥2-6h。FTO玻璃电极在丙酮中超声有利于脂溶性杂质的清洗，在NaOH与乙醇/水混合溶液中清洗是为了FTO玻璃电极的改性，在超纯水中的清洗有利于洗去前两步中丙酮或NaOH的残留。

所述步骤4中，将浓度为1.0-5.0mg·mL^-1的CdS敏化的BiPO₄/BiOBr/CdS悬浮液均匀滴加到FTO表面，而后在40-80℃下干燥10-24h。选择合适的悬浮液浓度对传感器的性质具有重大意义。当悬浮液浓度较低时，材料的光电流响应较弱，传感器的灵敏度较低；而当悬浮液浓度较高时，所孵育的复合材料超过了玻璃电极的负载限度，容易从玻璃电极上脱落下来，导致PEC传感器的稳定性不佳。优选地，所述悬浮液浓度为3.0mg·mL^-1。

所述步骤4中，优选地，将10-50μl浓度为5-20μg·mL^-1的AFP抗体滴加到BiPO₄/BiOBr/CdS修饰电极的表面。然后，将10-50μl浓度为0.5-2wt％的BSA溶液逐滴添加到修饰电极的表面。最后，将10-50μl浓度为0.001-1000ng·mL^-1的AFP抗原均匀滴在修饰电极表面，用于修饰不同浓度的AFP抗原，从而产生不同强度的光电流。每次修饰后用PBS缓冲液彻底清洗修饰电极，用以去除每个步骤后多余的游离蛋白，在37℃下孵育(蛋白质的最适温度，有利于生物大分子的结合)。进一步优选，30μl浓度为10μg·mL^-1的AFP抗体。一方面便于烘干，另一方面30μl足以覆盖修饰电极表面，选择该浓度是为了在取得准确结果的同时节约抗体溶液。进一步优选，30μl浓度为1wt％的BSA逐滴添加到修饰电极的表面并孵育90min，用以阻断非特异性结合位点，若浓度太高，则BSA难以溶于水溶液中，浓度太低，则无法达到阻断非特异性结合位点的效果。

本发明的另一目的在于提供一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器在检测甲胎蛋白方面的应用，具体包括如下步骤：

(1)采用三电极系统：制备的PEC免疫传感器用作工作电极；Ag/AgCl电极作为参比电极；铂电极用作对电极，人血清样品离心3次后取上清液作为初始样品，在4℃的冰箱中保存。

(2)在浓度为0.1mol·L^-1的PBS缓冲溶液中加入抗坏血酸(AA)作为电子供体。

(3)激发光源采用250W氙灯，每20s开关一次，外加0.0V电压。

(4)采用电化学工作站采集工作电极在光照和非光照条件下的光电流曲线，以氙灯20s开关一次为一个周期，取纵坐标最高点和最低点的差值作为光电流强度。

(5)绘制关于AFP浓度的标准曲线：以传感器的光电流强度为纵坐标，以AFP浓度为横坐标，绘制关于AFP浓度的标准曲线，得到标准曲线图。

(6)检测未知溶液中AFP浓度：将未知溶液孵育到制备的PEC免疫传感器上，检测传感器的光电流强度，结合标准曲线图，可以获得未知溶液中AFP的浓度。

Ag/AgCl电极作为参比电极保证了实验的重现性，铂电极作为对电极使工作电极上电流畅通，以保证所研究的反应在工作电极上发生。PBS缓冲溶液中加入抗坏血酸(AA)作为电子供体，有利于反应时电极上的电子空穴被及时消耗，促进了反应的持续。采取上述参数有利于获得更好的光电流效果。

本发明的有益效果：

首次成功构建了基于三元异质结复合材料的PEC免疫传感器，用于定量检测血清样本中的甲胎蛋白。其优点在于，首先，与纯BiPO₄相比，BiPO₄/BiOBr异质结具有更窄的带隙，扩大了光吸收范围，使光能得到充分利用。其次，PEC检测过程中光生电子和空穴对的分离是由于BiPO₄、BiOBr和CdS之间的能级有效匹配，抑制了光生电子的复合，从而提高了PEC免疫传感器的性能。第三，由于CdS QDs的存在，传感器的光吸收能力增强，产生更多的电子-空穴对，增加光电流信号。在最佳条件下，PEC免疫传感器对AFP的线性范围为0.001-1000ng·mL^-1，检测限为0.82pg·mL^-1；与传统的传感器相比检测范围更宽，灵敏度更高，且具有良好的重现性、稳定性和高灵敏度。

附图说明

图1为不同BiPO₄与BiOBr比例下光电流的考察；

图2为不同BiPO₄/BiOBr与CdS比例下光电流的考察；

图3为不同浓度BiPO₄/BiOBr/CdS悬浮液光电流的考察；

图4为不同浓度AA条件下光电流的考察；

图5为对不同抗体孵育时间的考察；

图6为对不同抗原孵育时间的考察；

图7为不同浓度AFP下传感器光电流强度的结果；

图8为本方法制备的PEC生物免疫传感器特异性对比结果；

图9为本方法制备的PEC生物免疫传感器重复性对比结果；

图10为本方法制备的PEC生物免疫传感器稳定性对比结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明提供一种BiPO₄/BiOBr/CdS三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法，具体操作如下：

步骤1：BiPO₄/BiOBr复合材料的制备；

采用一步水热法合成BiPO₄/BiOBr复合材料。

在搅拌条件下，将NaBr、NaH₂PO₄和Bi(NO₃)₃·5H₂O按摩尔比为(0.5-0.9)：(0.5-0.1)：1加入到甲醇中并剧烈搅拌10-15min。将混合产物超声处理10-20min后，将混合物在室温下再搅拌20-40min，然后转移到聚四氟乙烯衬里的反应器中，在160-220℃下加热12-24h。反应器自然冷却后，离心收集沉淀，产物用无水乙醇和超纯水洗涤2-3次。最后，将沉淀物在鼓风干燥箱中在40-80℃下干燥12-24h，得到BiPO₄/BiOBr异质结粉末。

步骤2：水溶性CdS量子点的制备；

将CdCl₂加入到去离子水中，制备CdCl₂溶液。加入巯基丙酸后，溶液用氮气脱气10-40min，然后用1.0mol·L^-1NaOH溶液调节pH至9-12。最后，向混合溶液中加入0.1mol·L^{- 1}Na₂S溶液，在100-120℃加热回流2-6h。待溶液冷却至室温后，加入异丙醇进行沉降处理，离心得到固体沉淀。沉淀用无水乙醇洗涤2-3次，在真空干燥箱中40-80℃干燥10-24h，得到CdS QDs粉末。上述混合溶液中CdCl₂与Na₂S的摩尔比为1:(0.5-1)，CdCl₂与巯基丙酸的物料配比为每0.001mol CdCl₂加入100-500μl巯基丙酸。

步骤3：BiPO₄/BiOBr/CdS复合材料的制备；

通过物理结合方法将水溶性CdS量子点加载到BiPO₄/BiOBr异质结上。

首先，按BiPO₄/BiOBr异质结粉末和CdS QDs粉质量比1:1-1:5，称取BiPO₄/BiOBr异质结粉末和CdS QDs粉末，加入去离子水以溶解混合物，涡旋5-10min以充分混合。超声处理30-90min使两种材料结合，得到浓度为1.0-5.0mg·mL^-1的CdS敏化的BiPO₄/BiOBr复合悬浮液，将其置于4℃冰箱避光保存备用。

步骤4：PEC免疫传感器的制备；

取0.6×2.0cm²的FTO玻璃电极，分别用丙酮、1.0mol·L^-1NaOH与50％乙醇混合溶液(v/v，1:1)和超纯水在超声中清洗10-20min。清洗后的FTO玻璃电极在40-80℃干燥2-6h。将制备的浓度为1.0-5.0mg·mL^-1的CdS敏化BiPO₄/BiOBr复合悬浮液均匀滴加到FTO上，在干燥箱中40-80℃干燥10-24h，至此，复合电极已成功制备。然后，通过滴加10-50μl浓度为5-20μg·mL^-1的AFP抗体并在37℃下孵育，将AFP抗体修饰到BiPO₄/BiOBr/CdS修饰电极的表面。接下来，将10-50μl BSA(0.5-2wt％)逐滴添加到修饰电极的表面以阻断非特异性结合位点。最后，将10-50μl浓度为0.001-1000ng·mL^-1的AFP抗原均匀滴在修饰电极表面，孵育，以产生特异性免疫结合。传感器在室温下进行制备，PEC免疫传感器在4℃下储存直至测试。为了去除多余的游离蛋白，每次修饰后用PBS缓冲液彻底清洗修饰电极。

所述BiPO₄/BiOBr/CdS三元异质结复合材料光电化学免疫传感器在检测甲胎蛋白方面的应用。具体操作如下：

(1)采用三电极系统：制备的PEC免疫传感器用作工作电极；Ag/AgCl电极作为参比电极；铂电极用作对电极。人血清样品离心3次后取上清液作为初始样品，在4℃的冰箱中保存。

(2)在浓度为0.1mol·L^-1的PBS缓冲溶液中加入抗坏血酸(AA)作为电子供体。

(3)激发光源采用250W氙灯，每20s开关一次，外加0.0V电压。

(4)采用电化学工作站采集工作电极在光照和非光照条件下的光电流曲线，以氙灯20s开关一次为一个周期，取纵坐标最高点和最低点的差值作为光电流强度。

(5)绘制关于AFP浓度的标准曲线：以传感器的光电流强度为纵坐标，以AFP浓度为横坐标，绘制关于AFP浓度的标准曲线，得到标准曲线图。

(6)检测未知溶液中AFP浓度：将未知溶液孵育到制备的PEC免疫传感器上，检测传感器的光电流强度，结合标准曲线图，可以获得未知溶液中AFP的浓度。

以下实施例中，AFP的抗体(Ab)和抗原(Ag)，癌胚抗原(CEA)购自上海泽叶生物科技有限公司(中国上海)。Bi(NO₃)₃·5H₂O、抗坏血酸(AA)、氯化铬(CdCl₂)和硫化钠(Na₂S)购自上海麦克莱恩生化科技有限公司(中国上海)。巯基丙酸(MPA)购自阿拉丁生化科技有限公司(中国上海)。磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)和溴化钠(NaBr)购自天津恒兴化学试剂制造有限公司(中国天津)。

本发明中未经特殊说明的实验材料均可通过本领域常规方法制备或者通过市购途径获得。

一、BiPO₄与BiOBr比例的考察

实施例1

在搅拌条件下，将NaH₂PO₄、NaBr和Bi(NO₃)₃·5H₂O同时混合在甲醇中并剧烈搅拌15min，三者的摩尔比为1：9：10。将混合产物超声处理15min后，将混合物在室温下再搅拌30min，然后转移到聚四氟乙烯衬里的反应釜中，在180℃下加热24h。反应釜自然冷却后，离心收集沉淀，产物用无水乙醇和超纯水洗涤3次。最后，将沉淀物在鼓风干燥箱中干燥12h，得到10wt％BiPO₄/BiOBr异质结粉末，用于后续实验。

实施例2，与实施例1不同的是NaH₂PO₄、NaBr和Bi(NO₃)₃·5H₂O三者的摩尔比为2：8：10，得到的BiPO₄/BiOBr异质结粉末为20wt％。

实施例3，与实施例1不同的是NaH₂PO₄、NaBr和Bi(NO₃)₃·5H₂O三者的摩尔比为3：7：10，得到的BiPO₄/BiOBr异质结粉末为30wt％。

实施例4，与实施例1不同的是NaH₂PO₄、NaBr和Bi(NO₃)₃·5H₂O三者的摩尔比为4：6：10，得到的BiPO₄/BiOBr异质结粉末为40wt％。

实施例5，与实施例1不同的是NaH₂PO₄、NaBr和Bi(NO₃)₃·5H₂O三者的摩尔比为5：5：10，得到的BiPO₄/BiOBr异质结粉末为50wt％。

实施例6，与实施例1不同的是NaH₂PO₄、NaBr和Bi(NO₃)₃·5H₂O三者的摩尔比为0：10：10，得到的BiPO₄/BiOBr异质结粉末为0wt％。

实验结果：

实施例1-6中不同BiPO₄与BiOBr比例对材料光电流的影响如图1所示，可见BiPO₄:BiOBr的比例从0wt％变为50wt％，当比例在30-50wt％时可以获得较强的光电流强度，当比例为40wt％时达到峰值。因此，优选NaBr、NaH₂PO₄和Bi(NO₃)₃·5H₂O三者的投料摩尔比为(0.5-0.7)：(0.5-0.3)：1。

二、BiPO₄/BiOBr/CdS悬浮液浓度的考察

实施例7

通过物理结合方法将水溶性CdS量子点加载到BiPO₄/BiOBr异质结上。首先，分别称取2mg BiPO₄/BiOBr异质结粉末和2mg CdS QDs粉末，加入4ml去离子水以溶解混合物，涡旋5min以充分混合，配置成浓度为1mg·mL^-1的悬浮液。超声处理1h使两种材料结合后，得到CdS敏化的BiPO₄/BiOBr复合悬浮液。

实施例8，与实施例7不同的是分别称取4mg BiPO₄/BiOBr异质结粉末和4mg CdSQDs粉末，加入4ml去离子水以溶解混合物，配置成浓度为2mg·mL^-1的悬浮液。

实施例9，与实施例7不同的是分别称取6mg BiPO₄/BiOBr异质结粉末和6mg CdSQDs粉末，加入4ml去离子水以溶解混合物，配置成浓度为3mg·mL^-1的悬浮液。

实施例10，与实施例7不同的是分别称取8mg BiPO₄/BiOBr异质结粉末和8mg CdSQDs粉末，加入4ml去离子水以溶解混合物，配置成浓度为4mg·mL^-1的悬浮液。

实施例11，与实施例7不同的是分别称取10mg BiPO₄/BiOBr异质结粉末和10mgCdS QDs粉末，加入4ml去离子水以溶解混合物，配置成浓度为5mg·mL^-1的悬浮液。

实验结果：

实施例7-11中不同BiPO₄/BiOBr/CdS悬浮液浓度对材料光电流的影响如图3所示。可见BiPO₄/BiOBr/CdS悬浮液的浓度从1mg·mL^-1变为5mg·mL^-1，当浓度在3mg·mL^-1时光电流强度达到峰值。这是由于当BiPO₄/BiOBr/CdS的含量太大时，电子向电极界面的转移受到阻碍。

三、BiPO₄/BiOBr和CdS质量比的考察

实施例12

通过物理结合方法将水溶性CdS量子点加载到BiPO₄/BiOBr异质结上。首先，分别称取6mg BiPO₄/BiOBr异质结粉末和6mg CdS QDs粉末，加入4ml去离子水以溶解混合物，涡旋5min以充分混合，配置成浓度为3mg·mL^-1的悬浮液，BiPO₄/BiOBr与CdS的质量比为1：1。

实施例13，与实施例12不同的是分别称取4mg BiPO₄/BiOBr异质结粉末和8mg CdSQDs粉末，加入4ml去离子水以溶解混合物，配置成浓度为3mg·mL^-1的悬浮液，BiPO₄/BiOBr与CdS的质量比为1：2。

实施例14，与实施例12不同的是分别称取3mg BiPO₄/BiOBr异质结粉末和9mg CdSQDs粉末，加入4ml去离子水以溶解混合物，配置成浓度为3mg·mL^-1的悬浮液，BiPO₄/BiOBr与CdS的质量比为1：3。

实施例15，与实施例12不同的是分别称取2.4mg BiPO₄/BiOBr异质结粉末和9.6mgCdS QDs粉末，加入4ml去离子水以溶解混合物，配置成浓度为3mg·mL^-1的悬浮液，BiPO₄/BiOBr与CdS的质量比为1：4。

实施例16，与实施例12不同的是分别称取2mg BiPO₄/BiOBr异质结粉末和10mgCdS QDs粉末，加入4ml去离子水以溶解混合物，配置成浓度为3mg·mL^-1的悬浮液，BiPO₄/BiOBr与CdS的质量比为1：5。

实验结果：

实施例12-16中BiPO₄/BiOBr和CdS质量比对材料光电流的影响如图2所示。可见随着BiPO₄/BiOBr和CdS质量比从1：1变为1：5，当质量比在1：3-1：5时可以获得较强的光电流强度，当比例为1：3时达到峰值。这是由于当CdS的量不断增加时，材料不断从电极表面剥离，引起了光电流的减小。

四、测量时AA浓度的考察

实施例17

光电流的测定条件：本研究采用三电极系统，制作的传感器用作工作电极；Ag/AgCl电极作为参比电极；铂电极用作对电极。通过在浓度为0.1mol·L^-1的PBS缓冲溶液中加入0.1mol抗坏血酸(AA)作为电子供体来绘制光电流。激发光源采用250W氙灯，每20s开关一次，外加0.0V电压。

实施例18，与实施例17不同的是PBS缓冲溶液中加入0.2mol抗坏血酸(AA)。

实施例19，与实施例17不同的是PBS缓冲溶液中加入0.3mol抗坏血酸(AA)。

实施例20，与实施例17不同的是PBS缓冲溶液中加入0.4mol抗坏血酸(AA)。

实施例21，与实施例17不同的是PBS缓冲溶液中不加入抗坏血酸(AA)。

实验结果：

实施例17-21中AA浓度对测量光电流的影响如图4所示。可见随着AA浓度从0变为0.4mol·L^-1时，当浓度在0.1mol·L^-1时光电流强度达到峰值。AA的浓度也是电极表面抗原捕获和信号标记特异性识别的重要参数。但当AA浓度过高时，则会阻碍电子的转移，从而引起了光电流的减小。

五、AFP抗体孵育时间的考察

实施例22

PEC复合电极制备成功后，滴加30μl AFP抗体(10μg·mL^-1)并在37℃下孵育30min，从而将AFP抗体修饰到BiPO₄/BiOBr/CdS修饰电极的表面。

实施例23，与实施例22不同的是AFP抗体的孵育时间为40min。

实施例24，与实施例22不同的是AFP抗体的孵育时间为50min。

实施例25，与实施例22不同的是AFP抗体的孵育时间为60min。

实施例26，与实施例22不同的是AFP抗体的孵育时间为70min。

实验结果：

AFP抗体的孵育时间在光电流性能测量中也起着相当大的作用。实施例22-26中AFP抗体的孵育时间对光电流性能的影响如图5所示。在孵育过程中，光电流信号逐渐减弱。当AFP抗体的孵育时间为70min时，光电流信号达到最小值，表明免疫反应处于平衡状态。但当赋予时间为60min时，光电流下降就已到了平台期。因此，为了节约时间，选择60min作为AFP抗体的最佳孵育时间。

六、不同浓度AFP孵育时间的考察

实施例27

将30μl BSA(1wt％)逐滴添加到修饰电极的表面以阻断非特异性结合位点。用0.01mol·L^-1的PBS缓冲溶液彻底清洗修饰电极。接着，将不同浓度的30μl AFP抗原并均匀滴在修饰电极表面，在37℃下孵育30min，从而将不同浓度的AFP抗原修饰到BiPO₄/BiOBr/CdS修饰电极的表面。

实施例28，与实施例27不同的是AFP抗原的孵育时间为40min。

实施例29，与实施例27不同的是AFP抗原的孵育时间为50min。

实施例30，与实施例27不同的是AFP抗原的孵育时间为60min。

实施例31，与实施例27不同的是AFP抗原的孵育时间为70min。

实验结果：

AFP抗原的孵育时间在光电流性能测量中也起着相当大的作用。实施例27-31中AFP抗原的孵育时间对光电流性能的影响如图6所示。在孵育过程中，光电流信号逐渐减弱。当AFP抗原的孵育时间为60min时，光电流信号达到最小值，表明免疫反应处于平衡状态。因此，60min为AFP抗体的最佳孵育时间。

七、利用光电流强度检测不同样品中的AFP浓度

采用上述实施例1-31中的优选结果进行以下实验。

实施例32

步骤1：BiPO₄/BiOBr复合材料的制备；

采用一步水热法合成了BiPO₄/BiOBr复合材料。在搅拌条件下，将0.1235g NaBr、0.096g NaH₂PO₄和0.97g Bi(NO₃)₃·5H₂O(按摩尔比NaBr：NaH₂PO₄：Bi(NO₃)₃·5H₂O＝0.6：0.4：1)同时混合在60ml甲醇中并剧烈搅拌15min。将混合产物超声处理15min后，将混合物在室温下再搅拌30min，然后转移到聚四氟乙烯衬里的反应器中，在180℃下加热24h。反应器自然冷却后，离心收集沉淀，产物用无水乙醇和超纯水洗涤3次。最后，将沉淀物在鼓风干燥箱中在60℃下干燥12h，得到BiPO₄/BiOBr异质结粉末，用于后续实验。

步骤2：水溶性CdS量子点的制备；

将0.2284g CdCl₂和100ml去离子水放入250ml三颈圆底烧瓶中，制备0.01mol·L^{- 1}CdCl₂溶液。加入500μl巯基丙酸后，溶液用氮气脱气30min，然后用1.0mol·L^-1NaOH溶液调节pH至11。最后，向混合溶液中加入10ml 0.1mol·L^-1Na₂S溶液，在110℃加热回流4h。待溶液冷却至室温后，加入25ml异丙醇进行沉降处理，离心得到固体沉淀。沉淀用无水乙醇洗涤3次，在真空干燥箱中60℃干燥12h，得到CdS QDs粉末，用于后续实验。

步骤3：BiPO₄/BiOBr/CdS复合材料的制备；

通过物理结合方法将水溶性CdS量子点加载到BiPO₄/BiOBr异质结上。首先，分别称取3mg BiPO₄/BiOBr异质结粉末和9mg CdS QDs粉末。接下来，加入4ml去离子水以溶解混合物，涡旋5min以充分混合。超声处理1h使两种材料结合后，得到CdS敏化的BiPO₄/BiOBr复合悬浮液(浓度为3mg·mL^-1)，将其置于4℃的冰箱中避光保存备用。

步骤4：PEC免疫传感器的制备；

首先，将上一步制备的CdS敏化BiPO₄/BiOBr复合悬浮液均匀滴加到FTO上，在真空干燥箱中60℃干燥12h。至此，复合电极已成功制备。然后，通过滴加30μl AFP抗体(10μg·mL^-1)并在37℃下孵育60min，将AFP抗体修饰到BiPO₄/BiOBr/CdS修饰电极的表面。接下来，将30μl BSA(1wt％)逐滴添加到修饰电极的表面以阻断非特异性结合位点。90min后，将30μl浓度为0.001ng·mL^-1的AFP抗原待测物均匀滴在修饰电极表面，孵育60min以产生特异性免疫结合。传感器在室温下进行制备，PEC免疫传感器在4℃下的冰箱中储存直至测试。为了去除多余的游离蛋白，每次修饰后用PBS缓冲液彻底清洗修饰电极。

实施例33，与实施例32不同的是，在修饰电极上滴加的AFP抗原浓度为0.005ng·mL-¹。

实施例34，与实施例32不同的是，在修饰电极上滴加的AFP抗原浓度为0.01ng·mL^-1。

实施例35，与实施例32不同的是，在修饰电极上滴加的AFP抗原浓度为0.05ng·mL^-1。

实施例36，与实施例32不同的是，在修饰电极上滴加的AFP抗原浓度为0.1ng·mL^-1。

实施例37，与实施例32不同的是，在修饰电极上滴加的AFP抗原浓度为0.5ng·mL^-1。

实施例38，与实施例32不同的是，在修饰电极上滴加的AFP抗原浓度为1ng·ml^-1。

实施例39，与实施例32不同的是，在修饰电极上滴加的AFP抗原浓度为5ng·mL^-1。

实施例40，与实施例32不同的是，在修饰电极上滴加的AFP抗原浓度为10ng·mL^-1。

实施例41，与实施例32不同的是，在修饰电极上滴加的AFP抗原浓度为50ng·mL^-1。

实施例42，与实施例32不同的是，在修饰电极上滴加的AFP抗原浓度为100ng·mL^-1。

实施例43，与实施例32不同的是，在修饰电极上滴加的AFP抗原浓度为500ng·mL^-1。

实施例44，与实施例32不同的是，在修饰电极上滴加的AFP抗原浓度为1000ng·mL-¹。

所制备的PEC免疫传感器在检测甲胎蛋白方面的应用，包括如下应用步骤：

(1)采用三电极系统：制备的PEC免疫传感器用作工作电极；Ag/AgCl电极作为参比电极；铂电极用作对电极。人血清样品离心3次后取上清液作为初始样品，在4℃的冰箱中保存。

(2)在浓度为0.1mol·L^-1的PBS缓冲溶液中加入抗坏血酸(AA)作为电子供体。

(3)激发光源采用250W氙灯，每20s开关一次，外加0.0V电压。

(4)采用电化学工作站采集工作电极在光照和非光照条件下的光电流曲线，以氙灯20s开关一次为一个周期，取纵坐标最高点和最低点的差值作为光电流强度。

(5)绘制关于AFP浓度的标准曲线：以传感器的光电流强度为纵坐标，以AFP浓度为横坐标，绘制关于AFP浓度的标准曲线，得到标准曲线图。

(6)检测未知溶液中AFP浓度：将未知溶液孵育到制备的PEC免疫传感器上，检测传感器的光电流强度，结合标准曲线图，可以获得未知溶液中AFP的浓度。

实验结果：

将抗原浓度的对数与光电流强度线性拟合得到校正方程，拟合结果如图7所示，得到的回归方程为I＝-0.2775lgC_AFP(ng·mL^-1)+1.919(R²＝0.999)。由于电极表面形成的免疫复合物作为惰性阻挡层阻碍电子转移，因此光电流信号在0.001-1000ng·mL^-1的范围内随着AFP浓度的增加而降低，具有较好的线性关系；LOD(检测限)计算为0.82pg·mL^-1，具有良好的灵敏度和准确度。

七、利用光电流强度测定该方法特异性

特异性对于大多数免疫传感器至关重要，因为非特异性结合会误导检测结果。取实施例32所制备的PEC免疫传感器，对血清中可能存在的生物标志物进行特异性识别实验。与实施例32不同的是，PEC免疫传感器上孵育的待测物为浓度为10μg·mL^-1的干扰物和浓度为100ng·mL^-1的AFP加10μg·mL^-1的干扰物。分别为a：空白；b：癌胚抗原；c：人血红蛋白；d：碱性磷酸酶；e：人血清白蛋白；f：三磷酸腺苷；g：细胞色素C；h：AFP；i：AFP+癌胚抗原；j：AFP+人血红蛋白；k：AFP+碱性磷酸酶；l：AFP+人血清白蛋白；m：AFP+三磷酸腺苷；n：AFP+细胞色素C。孵育结束后用PBS缓冲液彻底清洗修饰电极，并检测光电流强度。

检测结果如图8所示，在没有AFP(a，b，c，d，e，f，g)的情况下，干扰物质的孵育不会导致电极上的光电流发生显着变化。而在存在AFP(h,i,j,k,l,m,n)的情况下，在电极上孵育上述干扰后，没有观察到明显的光电流波动。因此，干扰蛋白的存在不会显著影响该PEC免疫传感器的光电流响应，表明PEC免疫传感器对AFP具有优良的选择性和特异性。

八、利用光电流强度测定该方法重复性与稳定性

重复性和稳定性也是PEC免疫传感器的重要特性，对生物传感器的开发和应用具有重要意义。取实施例32所制备的PEC免疫传感器共五个，检测浓度为100ng·mL^-1的AFP，对构建的传感器进行了重复性测试。

结果如图9所示，所测定的五个PEC免疫传感器光电流强度相似，计算的相对标准偏差(RSD)值为2.13％，为传感器的良好重复性提供了证据。

取实施例32所制备的PEC免疫传感器，检测浓度为100ng·mL^-1的AFP，对构建的传感器进行稳定性测试。在400s内多次开/关照射循环后，观察光电流的强度变化。

结果如图10所示，在400s内多次开/关辐照循环后，光电流保持不变，表明传感器具有良好的稳定性。

一系列结果表明，PEC免疫传感器具有良好的重复性和稳定性。

九、利用光电流强度测定血清样品中的AFP浓度

采用实施例32的方法研究了本方法所制备的PEC免疫传感器在测定人血清中AFP含量的可行性和适用性。和实施例32不同的是，PEC免疫传感器上孵育的待测物为含有不同浓度AFP的血清样品。取新鲜人血清，12000rpm离心20min，上清液用去离子水稀释50倍，以获得纯净的血清样品。将相对低、中、高浓度的AFP溶液依次引入稀释的血清样品中，并以实施例32相同的程序和条件对加标溶液样品进行分析。实验结果见表1所示，AFP的平均回收率为97.4％-104.9％，相对标准偏差不超过2.4％。结果表明，本方法所制备的PEC免疫传感器对血清中AFP的测定是可行的，具有较好的检测灵敏度，在生物、医学等领域具有很好的应用价值和应用前景。

表1利用光电流强度测定血清样品中的AFP浓度

“-”代表未测出

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述异质结为Bi PO₄/BiOBr/CdS三元异质结复合材料，包括以下步骤：

步骤1：BiPO₄/BiOBr复合材料的制备；

在搅拌条件下，将NaBr、NaH₂PO₄和Bi(NO₃)₃·5H₂O加入到溶剂中混合，剧烈搅拌，得到混合溶液，将其超声处理后，在室温下继续搅拌，然后转移到聚四氟乙烯衬里的反应釜中，加热反应，反应结束后自然冷却，离心收集沉淀，用无水乙醇和超纯水分别洗涤沉淀物，然后将沉淀物干燥处理，得到BiPO₄/BiOBr异质结粉末；

步骤2：水溶性CdS QDs的制备；

将CdCl₂加入到去离子水中，制备成CdCl₂溶液，加入巯基丙酸后，溶液用氮气脱气，然后用NaOH溶液调节pH值至9-12，加入Na₂S溶液，加热回流2-6h，溶液冷却至室温后，加入异丙醇进行沉降处理，离心得到固体沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥处理，得到CdS QDs粉末；

步骤3：BiPO₄/BiOBr/CdS三元异质结复合材料的制备；

分别称取BiPO₄/BiOBr异质结粉末和CdS QDs粉末，加入去离子水，涡旋，得到混合溶液，超声处理30-90min使两种材料结合，得到CdS敏化的BiPO₄/BiOBr复合悬浮液，将其置于4℃的环境中避光保存备用；

步骤4：PEC免疫传感器的制备；

清洗FTO玻璃电极，均匀滴加CdS敏化的BiPO₄/BiOBr/CdS悬浮液至玻璃电极上，烘干，向烘干后的玻璃电极滴加AFP抗体、BSA和不同浓度的AFP抗原。

2.根据权利要求1所述的一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，NaBr、NaH₂PO₄和Bi(NO₃)₃·5H₂O三者的投料摩尔比为(0.5-0.9):(0.5-0.1):1。

3.根据权利要求1所述的一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，混合物在聚四氟乙烯衬里的反应釜中，在160-220℃下加热12-24h；得到的沉淀物在40-80℃下干燥12-24h，得到质量百分含量比为10-50wt％的BiPO₄/BiOBr异质结粉末。

4.根据权利要求1所述的一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，混合溶液中，CdCl₂与Na₂S的摩尔比为1:(0.5-1)，CdCl₂与巯基丙酸的物料配比为每0.001mol CdCl₂加入100-500μl巯基丙酸，所述Na₂S溶液浓度为0.1mol·L^-1。

5.根据权利要求1所述的一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，BiPO₄/BiOBr异质结粉末和CdS QDs粉末的质量比为1:1-1:5。

6.根据权利要求1所述的一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，得到的CdS敏化的BiPO₄/BiOBr/CdS复合悬浮液浓度为1.0-5.0mg·mL^-1。

7.根据权利要求1所述的一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，采用的FTO玻璃电极尺寸为0.6×2.0cm²，清洗过程分别采用丙酮、1.0mol·L^-1NaOH与50％乙醇混合溶液及超纯水在超声中清洗，清洗后的FTO玻璃电极在40-80℃干燥2-6h；将10-50μl浓度为5-20μg·mL^-1的AFP抗体滴加到BiPO₄/BiOBr/CdS修饰电极的表面；然后，将10-50μl浓度为0.5-2wt％的BSA溶液逐滴添加到修饰电极的表面；最后，将10-50μl浓度为0.001-1000ng·mL^-1的AFP抗原均匀滴在修饰电极表面。

8.一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器，其特征在于，由权利要求1-7任一项制备得到。

9.一种权利要求8所述的三元异质结复合材料光电化学免疫传感器在检测甲胎蛋白方面的应用，具体包括如下步骤：

(1)采用三电极系统：制备的三元异质结复合材料光电化学免疫传感器用作工作电极；Ag/AgCl电极作为参比电极；铂电极用作对电极，人血清样品离心3次后取上清液作为初始样品，在4℃的冰箱中保存；

(2)在浓度为0.1mol·L^-1的PBS缓冲溶液中加入抗坏血酸作为电子供体；

(3)激发光源采用250W氙灯，每20s开关一次，外加0.0V电压；

(4)采用电化学工作站采集工作电极在光照和非光照条件下的光电流曲线，以氙灯20s开关一次为一个周期，取纵坐标最高点和最低点的差值作为光电流强度；

(5)绘制关于甲胎蛋白浓度的标准曲线：以传感器的光电流强度为纵坐标，以甲胎蛋白浓度为横坐标，绘制关于甲胎蛋白浓度的标准曲线，得到标准曲线图；

(6)检测未知溶液中甲胎蛋白浓度：将未知溶液孵育到制备的三元异质结复合材料光电化学免疫传感器上，检测传感器的光电流强度，结合标准曲线图，可以获得未知溶液中甲胎蛋白的浓度。

10.根据权利要求9所述的一种三元异质结复合材料光电化学免疫传感器在检测甲胎蛋白方面的应用，其特征在于，所述三元异质结复合材料光电化学免疫传感器对甲胎蛋白的线性范围为0.001-1000ng·mL^-1，检测限为0.82pg·mL^-1。

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