CN117250244A - 一种可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器及其制备方法，属于生物传感器技术领域。将ZnAc、InCl3、Bi(NO3)3·5H2O、葡萄糖和硫代乙酰胺反应产物加入乙醇中，滴入掺杂氟的SnO2导电玻璃上，表面滴加甲胎蛋白抗体，孵育，然后滴加牛血清白蛋白，孵育，制得光电化学电极，与电沉积以形成的PB电极相连接，制得可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器。本发明制备了一种新型的可视化检测器，具有较高的光电流响应，能够直接通过肉眼观察到电致变色检测器的变色程度并同时对待测物的浓度进行定性检测，且小型便携、操作简单、灵敏度较高。

Description

一种可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，具体涉及一种可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器及其制备方法。
背景技术
生物标志物的免疫测定作为一种新出现的方法，在分析化学的学术领域引起了极大的兴趣。众所周知，它在一系列疾病的早期检测，疾病程度的评估和治疗后的反馈中发挥着重要的作用。为了有效的对癌症进行早期筛查，对低水平肿瘤标志物进行超灵敏检测显得尤为必要。
甲胎蛋白（AFP）在临床测定中被认为是确定疾病存在或监测疾病进展的有效指标，多与肝癌以及多种肿瘤的发生和发展有关，因此目前为止已经提出了各种测定AFP的方法，如电化学发光法，荧光测定法，液相色谱法和放射免疫分析法等。尽管上述检测取得了很大进展，但仍存在着仪器昂贵和操作复杂等一系列挑战，难以实现对现场肿瘤标志物的高效检测。因此，我们迫切需要开发一种操作简单、成本效益高，灵敏度高的AFP检测方法。
在先前报道的各种光阳极材料中，ZnIn2S4（ZIS）是一种三元硫族化合物，由于其具有高效的层结构、低带隙能量（约2.2-2.6 eV），良好的光稳定性并且易于在支架上生长等优点，已经引起了人们广泛的关注。研究发现，在靶表面上生长2D半导体纳米片有利于减少电子的扩散距离，并且会暴露出更多的光催化活性位点。Bi2S3（BS）具有较窄的带隙（即1.3-1.7 eV），并且能够很好的利用可见光。由于BS和ZIS的能级匹配良好，因此可以将它们组合以制备成一种异质结，从而抑制BS中光生载流子的复合，同时也能提高其光稳定性。而碳纳米材料由于其优异的导电性被用于与BS和ZIS协同制造成PEC器件的光电极，可以有效的分离光载流子并提高PEC性能。
尽管如此，光电化学（PEC）传感器对于实现小型集成化和现场检测的发展还是会不可避免地受到电化学工作站等大型复杂仪器的限制。因此开发出一种高效的小型PEC传感器，并能够实现对临床疾病标志物的现场可视化灵敏检测具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提出一种可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器及其制备方法，在电化学工作站光照射下，显示出高效的光电流响应，小型便携，具有较高的选择性和灵敏度。当电极被待测物甲胎蛋白（AFP）修饰后，光电流发生明显的下降，在一定范围内与AFP浓度的对数值呈现出一定的线性关系，且随着待测物浓度的增加，检测器呈现的蓝色逐渐加深，颜色变化可以在非常短的时间内实现，并能通过肉眼辨别，因此可以实现在临床上对疾病标志物AFP的快速含量检测，具有一定的潜力和十分广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1.将ZnAc、InCl3、Bi(NO3)3·5H2O和葡萄糖溶解在乙二醇中混合均匀，加入硫代乙酰胺，继续搅拌均匀，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬的高压釜中，加热反应，冷却到室温，产物洗涤，干燥，溶解在无水乙醇中，得到复合分散体；
S2.清洗掺杂氟的SnO2导电玻璃，干燥，粘贴带有圆孔的绝缘胶，在圆孔内滴入步骤S1制得的复合分散体，干燥，得到电极；
S3.向步骤S2制得的电极的小圆孔中滴加甲胎蛋白抗体溶液修饰电极，孵育，得到甲胎蛋白抗体修饰电极；
S4.将牛血清白蛋白溶液滴加得到的步骤S3制得的的甲胎蛋白抗体修饰电极表面，孵育，得到光电化学电极；
S5.取一块光电化学电极，清洗，用乙醇/NaOH溶液浸润表面，冲洗，吹干，在电极表面固定一个圆形区域，浸入含有氯化铁和K3Fe(CN)6的溶液中，采用循环伏安法进行电沉积以形成PB电极，将步骤S4制得光电化学电极与PB电极相连接，制得可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述ZnAc、InCl3、Bi(NO3)3·5H2O、葡萄糖、硫代乙酰胺的质量比为1-1.15：2-2.5：4-6：0.6-0.8：2.4-2.8，所述加热反应的温度为170-190℃，时间为10-14h，所述产物分别用去离子水和无水乙醇洗涤，所述产物和无水乙醇的固液比为1.5-2.5mg/mL；步骤S2中所述圆孔的直径为7-10mm，所述滴入的复合分散体的量为15-25μL。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述甲胎蛋白抗体溶液的浓度为8-12μg/mL，滴加量为15-25μL，所述孵育的条件为3-5℃，孵育1-3h；步骤S4中所述牛血清白蛋白溶液的浓度为0.5-1.5wt%，滴加量为15-25μL，所述孵育的条件为3-5℃，孵育1-3h；步骤S5中所述乙醇/NaOH溶液为乙醇和0.5-1.5mol/L的NaOH溶液按照体积比为1:1进行混合得到，所述浸润的时间为10-20min，所述圆形区域的直径为7-10mm，所述含有氯化铁和K3Fe(CN)6的溶液中氯化铁和K3Fe(CN)6的含量分别为2-3mmol/L和2-3mmol/L，所述循环伏安法的扫描速度为0.03-0.07V/s，在0.5至-0.2V之间CV扫描至稳定。
本发明采用的技术方案如下：
精密称量0.1098 g ZnAc，0.2212 g InCl3，0.4851 g Bi(NO3)3·5H2O和0.075 g葡萄糖溶解在30 mL 乙二醇（EG）中并搅拌30 min。然后缓慢加入0.2630 g 硫代乙酰胺（TAA），并将混合物继续搅拌30 min。之后，将混合溶液转移到50 mL Telfon衬里的高压釜中，在180℃下进行溶剂热反应12 h，反应结束后自然冷却到室温。将得到的黑色产物分别用去离子水和无水乙醇洗涤三次，然后在60℃烘箱中干燥过夜。
精密称量2 mg步骤1）得到的干燥黑色产物溶解在1 ml无水乙醇中，得到ZIS/BS/C复合分散体（2 mg·mL−1）。
PEC传感器的制备：将掺杂氟的SnO2导电玻璃（FTO玻璃）分别在丙酮，无水乙醇和去离子水中超声清洗，然后在60℃烘箱中干燥。将一块带有直径为8 mm小圆孔的绝缘胶粘在FTO玻璃上，然后在小圆孔内滴入20 μL步骤2）中得到的ZIS/BS/C复合分散体（2 mg·mL−1）。干燥后，得到ZIS/BS/C电极。
向步骤3）中制备好的ZIS/BS/C电极的小圆孔中滴加20 μL的AFP抗体（anti-AFP）（10 μg·mL−1）来修饰电极，并在4℃下孵育2 h使anti-AFP充分修饰到ZIS/BS/C电极表面。
将20 μL 1%牛血清白蛋白（BSA）滴加到步骤4）中得到的电极表面，同样在4°C下孵育2 h得到PEC电极。整个PEC传感器的修饰过程在室温下进行，并在孵育时和测试前储存在4°C下以保证其稳定有效。
新取一块FTO电极（1×2.5cm2），依次用丙酮，无水乙醇和去离子水进行超声清洗。然后，用1:1（v/v）的乙醇/NaOH（1M）溶液浸润15 min以激活表面，接着用去离子水冲洗，并用氮气吹干。随后，在电极表面固定一个直径为8 mm的圆形区域。在电极上对PB进行电沉积以形成PB电极，将步骤5）得到的PEC电极与PB电极相连接即可以实现对小型电致变色可视化检测器的制备。
步骤1）中，所制备的产物要分别用去离子水和无水乙醇洗涤三次，以保证能够同时除去水溶性和醇溶性杂质，使制备的材料达到较高的纯度从而具有高效的光电流响应。
步骤2）中，取2 mg步骤1）中得到的干燥黑色产物溶解在1 ml无水乙醇中，以保证制备的材料能够充分分散，若浓度过高或过低均会影响材料的光电效率。
步骤3）中将FTO玻璃分别在丙酮，无水乙醇和去离子水中超声清洗，以保证FTO玻璃在修饰前保持干净的状态，以免在后续实验中引入干扰物质。绝缘胶的小圆孔直径为8mm，滴加材料的体积20 μL，能够保证材料均匀的分散在圆孔中，充分的暴露在光照下，达到较高的光电效率。圆孔直径和滴涂体积不合适会导致材料过于聚集或分散不均匀，不能很好的被光照射到，降低光电效率。
步骤4）中滴加20 μL的anti-AFP后，由于抗体在室温下放置时容易失活，因此要在4°C下保存。同时为了使抗体能够与光电材料充分结合，要在4°C下孵育2 h以保证后续修饰能够达到良好的效果。
步骤5）中滴加20 μL 的BSA（1%），由于BSA能够封闭非特异性结合位点，能够减少后续修饰抗原待测物时一些非特异性物质的干扰。在测试前保存在4℃下，能够保证PEC传感器的稳定和高效性。为了去除未结合的游离蛋白，在电极的每次修饰后，用PBS缓冲液（0.1mol/L，pH=7.5）彻底清洗修饰电极。
步骤6）中用1:1（v/v）的乙醇/NaOH（1M）溶液浸润15 min以激活，从而使后续PB能够通过电沉积很好的结合在FTO电极表面。同时，用去离子水冲洗，并用氮气吹干后再对PB进行电沉积，能够去除FTO表面残留的乙醇/NaOH，保证后续PB电沉积的过程中不会因为有其他物质的引入而对其造成影响。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述复合分散体中还添加了Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料，所述复合分散体和Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的质量比为10:2-3。
作为本发明的进一步改进，所述Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的制备方法如下：
T1.前驱体TiO2微球的制备：将钛醇盐、有机酸溶于乙醇中，搅拌混合均匀，加热反应，加水搅拌反应，离心，洗涤，干燥，制得前驱体TiO2微球；
T2.TiO2/CuCo2O4复合材料的制备：将步骤T1制得的前驱体TiO2微球、硝酸铜、硝酸钴、脲和氯化铵依次加入乙醇中，搅拌混合均匀，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬的高压釜中，加热反应，产物离心，洗涤，干燥，煅烧，制得TiO2/CuCo2O4复合材料；
T3.聚多巴胺改性：将步骤T2制得的TiO2/CuCo2O4复合材料加入水中，加入多巴胺盐酸盐和催化剂，加热搅拌反应，离心，洗涤，干燥，制得改性TiO2/CuCo2O4复合材料；
T4.Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的的制备：将步骤T3制得的改性TiO2/CuCo2O4复合材料加入乙醇中，加入酞菁，超声反应，离心，洗涤，干燥，制得Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料；
T5.Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的的制备：将步骤T4制得的Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料加入壳聚糖溶液中浸泡第一时间，离心，洗涤，干燥，然后在硝酸铬和醋酸锰的甲醇溶液中浸泡第二时间，离心，洗涤，干燥，制得Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料。
作为本发明的进一步改进，步骤T1中所述钛醇盐、有机酸、乙醇、水的质量比为1-1.2：0.8-1.5：40-50：5-7，所述钛醇盐选自钛酸四丁酯、钛酸四乙酯、异丙醇钛中的至少一种，所述有机酸选自乙酸、丙酸、丁酸、戊酸中的至少一种，所述加热反应的温度为70-80℃，时间为3-5h，所述加水搅拌反应的时间为1-3h；步骤T2中所述前驱体TiO2微球、硝酸铜、硝酸钴、脲和氯化铵的质量比为10：0.8-2：2-4：1-3：2.5-3.5，所述加热反应的温度为130-150℃，时间为5-7h，所述煅烧的温度为300-400℃，时间为1-3h。
作为本发明的进一步改进，步骤T3中所述TiO2/CuCo2O4复合材料、多巴胺盐酸盐和催化剂的质量比为10:3-5:0.1-0.2，所述催化剂为pH=8.5-9的Tris-HCl溶液，所述加热搅拌反应的温度为40-50℃，时间为2-4h；步骤T4中所述改性TiO2/CuCo2O4复合材料、酞菁的质量比为10:2-3，所述超声反应的时间为1-2h，超声功率为500-700W；步骤T5中所述壳聚糖溶液为1-1.5wt%的壳聚糖溶液，所述硝酸铬和醋酸锰的甲醇溶液中述硝酸铬和醋酸锰的浓度分别为0.08-0.12mol/L和0.05-0.1mol/L，所述第一时间为10-15min，所述第二时间为10-20min。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器。
本发明进一步保护一种是哪个述可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器用于在临床中检测疾病标志物甲胎蛋白水平中的应用。
本发明进一步保护一种上述可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器用于检测疾病标志物甲胎蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）将甲胎蛋白溶液在可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器上孵育；
（2）孵育结束后，用PBS缓冲液冲洗电极；
（3）将步骤（2）中的电极置于PBS缓冲液中，以10s的频率间隔打开和关闭光源，在电化学工作站下记录光电流信号；
（4）光电流测试完毕后，将步骤（3）中的电极与PB电极以导线相连接组成小型可视化检测器；
（5）将步骤（4）中的两块电极均浸入PBS缓冲液中，在光源下持续光照30s，电化学工作站记录光电流信号。
具体如下：
将20 μL不同浓度的AFP在制备的PEC传感器上孵育1 h使其与anti-AFP充分结合；
孵育结束后，用PBS缓冲液（0.1mol/L，pH=7.5）冲洗电极；
将步骤2）中的电极置于50 mL PBS缓冲液（0.1mol/L，pH=7.5）中，通过精密定时器，以10 s的频率间隔打开和关闭光源，在电化学工作站下记录光电流信号。
上述PEC传感器对AFP的可视化检测方法：
光电流测试完毕后，将步骤3）中的PEC传感器与PB电极以导线相连接组成小型可视化检测器；
将步骤4）中检测器的两块电极均浸入50 mL PBS缓冲液（0.1mol/L，pH=7.5）中，在光源下持续光照30 s，电化学工作站记录光电流信号。
上述实验中的光电流测试均在CHI 660E电化学工作站上进行，使用传统的三电极系统（改性FTO工作电极，铂对电极，Ag/AgCl参比电极），采用500 W发光二极管（LED）激发，偏置电位设置为0 V。
PEC传感器的检测性能在很大程度上取决于光电活性材料，因此，PEC传感器的性能好坏很大程度决定于光电活性材料的载流子输运特性、高效的光采集能力、PEC信号响应和稳定的信号转导等能力。
本发明将高效的光阳极材料与电致变色光阴极材料普鲁士蓝（PB）相结合制备了一种新型的可视化检测器，具有较高的光电流响应，能够直接通过肉眼观察到电致变色检测器的变色程度并同时对待测物的浓度进行定性检测，且小型便携、操作简单、灵敏度较高，可在实际临床对疾病标志物的检测中被作为一种高效的光电化学（PEC）传感器。
在本发明中，制备的PEC传感器在电化学工作站光照射下，显示出高效的光电流响应，小型便携，具有较高的选择性和灵敏度。当电极被待测物甲胎蛋白（AFP）修饰后，光电流发生明显的下降，在一定范围内与AFP浓度的对数值呈现出一定的线性关系，且随着待测物浓度的增加，检测器呈现的蓝色逐渐加深，颜色变化可以在非常短的时间内实现，并能通过肉眼辨别，因此可以实现在临床上对疾病标志物AFP的快速含量检测，具有一定的潜力和十分广阔的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
本发明制得的光阳极材料具有较高的光电效率，优异的导电性能，可有效分离光载流子从而提高光催化活性。
本发明提供的光阳极材料制备过程简单，仅通过简单的一锅溶剂热法合成，无需其他复杂的操作，且合成的材料也能保持一定的高效性。
本发明制备的PEC传感器具有较高的稳定性，在400s进行多次重复的开/关光照周期下，光电流的强度也没有发生明显的变化。
本发明的PEC传感器能够保持长期有效性，将其在4°C下储存30天，每5天测定其光电流响应，30天后光电流强度仍能达到原始值的92%以上。
本发明制备的PEC传感器具有良好的制备重复性，同批次制备5个PEC传感器同时用于检测100 ng/mL的AFP，结果计算的相对标准偏差（RSD）为3.8 %，表明传感器具有可接受的制备再现性。
该PEC传感器对AFP表现出较强的选择性，即便是高浓度的干扰物质也不会引起电极光电流强度的显著变化。在一定范围内与AFP浓度的对数值呈现出一定的线性关系，且线性范围较宽，检测限低，可以作为一种可靠的PEC传感器用于AFP的检测。
该PEC传感器小型便携，操作简单，灵敏度较高，能够实现对AFP的现场临床检测。
本发明制备的PEC传感器能够直接通过肉眼观察到变色程度实现可视化，变色速度快，并同时对待测物的浓度进行定性检测，对于临床疾病标志物的检测具有巨大的应用前景和参考价值。
另外，本发明对制得的光阳极材料做了进一步的修饰，制备了一种Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料，一同加入复合分散体中，通过干燥固定在电极上。
TiO2是一种具有优良性能的半导体材料，具有较好的光电流响应，然而，TiO2只能吸收紫外激发光(λ＜387 nm)，而紫外光只占据了5%的太阳能谱，同时，TiO2的光生电子-空穴对较易发生复合，将其与其他对可见光有响应的纳米材料相结合，可以使其吸收向可见光拓展，增加光生电荷的分离，有效地改善TiO2在可见光照射下展现出的光化学活性。
二元过渡金属氧化物因为阳离子之间的活化能相对较低，是一种较好的电极修饰材料，其中，CuCo2O4具有优良的导电性、环保性、高比表面积、低成本，同时，其电化学活性比单组分CuO或Co3O4高，还能够很好的与TiO2形成复合异质结构，促进无晶型TiO2微球转变为纯锐钛矿型TiO2微球，改善其可见光的利用率。
酞菁（Pc）光电化学性质优异，热稳定性和化学稳定性高，在300-450nm的Soret带区域和约500-700nm的Q带区域均具有强的吸收，能够促进TiO2/CuCo2O4复合材料在可见光区的灵敏度和光能的利用度，以获得更优异的光电化学性能，经过聚多巴胺改性后，一方面能够提高复合材料对酞菁、金属离子Cd和Mn的固定率，另一方面，聚多巴胺可以作为电子供体，从而提高光电转化效率，降低检出限，提高线性相应范围。在金属离子Cd和Mn的协同作用下，能够提高光电流的相应，进一步改善传感器的灵敏度、选择性和重现性，使得制得的Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料能够与甲胎蛋白形成Cu-S和Co-S键，大大提高了对AFP的检测的灵敏度和反应速率，提高选择性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器的制备及对于AFP的检测原理示意图；
图2中：ZIS (A)、ZIS/BS (B)、ZIS/BS/C (C)的SEM图像；ZIS/BS/C的TEM图(D)和EDS元素映射图(E)；
图3为ZIS/BS/C的EDS总谱；
图4为(A) ZIS、BS、ZIS/BS和ZIS/BS/C复合材料的XRD谱图；ZIS/BS/C的XPS光谱:测量光谱(B)， Bi 4f+S 2p光谱(C)， In 3d光谱(D)， Zn 2p光谱(E)，C 1s和O 1s光谱(F)；
图5为ZIS、BS、ZIS/BS和ZIS/BS/C的PL光谱；
图6中：(A)为 DRS ZIS、BS、ZIS/BS和ZIS/BS/C的UV-Vis图；(B)为ZIS和BS的Tauc图；ZIS (C)和BS (D)的Mott-Schottky图；
图7为ZIS (A)和BS (B)的UPS光谱；(C) ZIS/BS异质结能带结构和内部电场变化示意图；
图8为ZIS/BS/C异质结的电子传递机理图；
图9中：(A)光电流响应和(B)EIS Nyquist图，其中，(a)FTO; (b)FTO/ZIS; (c)FTO/ZIS/BS; (d)FTO/ZIS/BS; (e)FTO/ZIS/BS/C/anti-AFP; (f)FTO/ZIS/BS/C/anti-AFP/BSA; (g) FTO/ZIS/BS/C/anti-AFP/BSA/AFP；
图10为葡萄糖(A)和PBS缓冲液的pH值(B)对光电流强度的影响 (误差条=标准差(SD)，n = 3)；
图11为AFP检测传感器的光电流响应(A)和线性曲线(B) (AFP浓度范围:0.001-100 ng/mL) (误差条=标准差(SD)，n=3)；(C)所制备传感器的特异性测试图，其中，(a) 空白，(b) 100 ng/mL AFP， (C) 1000 ng/mLCEA， (d) 1000 ng/mL HGB a， (e) 1000 ng/mL ALP， (f) 1000 ng/mL ATP， (g) 1000 ng/mL细胞色素C， (h) 100 ng/mL AFP+1000ng/mL其他干扰物；(D) 400 s开/关光照射周期的光电流强度变化；
图12为PB电极随AFP浓度的颜色变化示意图；
图13为实施例8制得的Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的的SEM图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1，本实施例提供一种可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器的制备方法，具体如下：
S1.精密称量0.1g ZnAc，0.2g InCl3，0.4g Bi(NO3)3·5H2O和0.06g葡萄糖溶解在30 mL 乙二醇（EG）中并搅拌30 min。然后缓慢加入0.26g 硫代乙酰胺（TAA），并将混合物继续搅拌30 min。之后，将混合溶液转移到50 mL Telfon衬里的高压釜中，在170℃下进行溶剂热反应10h，反应结束后自然冷却到室温。将得到的黑色产物分别用去离子水和无水乙醇洗涤三次，然后在60℃烘箱中干燥过夜。
S2.精密称量1.5mg步骤S1得到的干燥黑色产物溶解在1 ml无水乙醇中，得到ZIS/BS/C复合分散体。
S3.PEC传感器的制备：将FTO玻璃分别在丙酮，无水乙醇和去离子水中超声清洗，然后在60℃烘箱中干燥。将一块带有直径为7mm小圆孔的绝缘胶粘在FTO玻璃上，然后在小圆孔内滴入15μL步骤S2中得到的ZIS/BS/C复合分散体，干燥后，得到ZIS/BS/C电极。
S4.向步骤S3中制备好的ZIS/BS/C电极的小圆孔中滴加15μL的AFP抗体（anti-AFP）（8μg/mL）来修饰电极，并在3℃下孵育1h，使anti-AFP充分修饰到ZIS/BS/C电极表面。
S5.将15μL 0.5wt%牛血清白蛋白（BSA）滴加到步骤S4中得到的电极表面，同样在3℃下孵育1h，得到PEC电极。整个PEC传感器的修饰过程在室温下进行，并在孵育时和测试前储存在4°C下以保证其稳定有效。
S6.新取一块FTO电极（1×2.5cm2），依次用丙酮，无水乙醇和去离子水进行超声清洗。然后，用1:1（v/v）的乙醇/NaOH（0.5mol/L）溶液浸润10min以激活表面，接着用去离子水冲洗，并用氮气吹干。随后，在电极表面固定一个直径为7mm的圆形区域。浸入含有氯化铁和K3Fe(CN)6的溶液（所述含有氯化铁和K3Fe(CN)6的溶液中氯化铁和K3Fe(CN)6的含量分别为2mmol/L和2mmol/L，）中，采用循环伏安法进行电沉积以形成PB电极，所述循环伏安法的扫描速度为0.03V/s，在0.5至-0.2V之间CV扫描至稳定，将步骤S5得到的PEC电极与PB电极相连接，制得可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器。
实施例2
如图1，本实施例提供一种可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器的制备方法，具体如下：
S1.精密称量0.115g ZnAc，0.25g InCl3，0.6g Bi(NO3)3·5H2O和0.08g葡萄糖溶解在30 mL 乙二醇（EG）中并搅拌30 min。然后缓慢加入0.28g 硫代乙酰胺（TAA），并将混合物继续搅拌30 min。之后，将混合溶液转移到50 mL Telfon衬里的高压釜中，在190℃下进行溶剂热反应14h，反应结束后自然冷却到室温。将得到的黑色产物分别用去离子水和无水乙醇洗涤三次，然后在60℃烘箱中干燥过夜。
S2.精密称量2.5 mg步骤S1得到的干燥黑色产物溶解在1 ml无水乙醇中，得到ZIS/BS/C复合分散体。
S3.PEC传感器的制备：将FTO玻璃分别在丙酮，无水乙醇和去离子水中超声清洗，然后在60℃烘箱中干燥。将一块带有直径为10mm小圆孔的绝缘胶粘在FTO玻璃上，然后在小圆孔内滴入25μL步骤S2中得到的ZIS/BS/C复合分散体，干燥后，得到ZIS/BS/C电极。
S4.向步骤S3中制备好的ZIS/BS/C电极的小圆孔中滴加25μL的AFP抗体（anti-AFP）（12μg/mL）来修饰电极，并在5℃下孵育3h，使anti-AFP充分修饰到ZIS/BS/C电极表面。
S5.将25μL 1.5wt%牛血清白蛋白（BSA）滴加到步骤S4中得到的电极表面，同样在5℃下孵育3h，得到PEC电极。整个PEC传感器的修饰过程在室温下进行，并在孵育时和测试前储存在4°C下以保证其稳定有效。
S6.新取一块FTO电极（1×2.5cm2），依次用丙酮，无水乙醇和去离子水进行超声清洗。然后，用1:1（v/v）的乙醇/NaOH（1.5mol/L）溶液浸润20min以激活表面，接着用去离子水冲洗，并用氮气吹干。随后，在电极表面固定一个直径为10mm的圆形区域。浸入含有氯化铁和K3Fe(CN)6的溶液（所述含有氯化铁和K3Fe(CN)6的溶液中氯化铁和K3Fe(CN)6的含量分别为3mmol/L和3mmol/L，）中，采用循环伏安法进行电沉积以形成PB电极，所述循环伏安法的扫描速度为0.07V/s，在0.5至-0.2V之间CV扫描至稳定，将步骤S5得到的PEC电极与PB电极相连接，制得可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器。
实施例3
如图1，本实施例提供一种可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器的制备方法，具体如下：
S1.精密称量0.1098 g ZnAc，0.2212 g InCl3，0.4851 g Bi(NO3)3·5H2O和0.075g葡萄糖溶解在30 mL 乙二醇（EG）中并搅拌30 min。然后缓慢加入0.2630 g 硫代乙酰胺（TAA），并将混合物继续搅拌30 min。之后，将混合溶液转移到50 mL Telfon衬里的高压釜中，在180℃下进行溶剂热反应12 h，反应结束后自然冷却到室温。将得到的黑色产物分别用去离子水和无水乙醇洗涤三次，然后在60℃烘箱中干燥过夜。
S2.精密称量2 mg步骤S1得到的干燥黑色产物溶解在1 ml无水乙醇中，得到ZIS/BS/C复合分散体。
S3.PEC传感器的制备：将FTO玻璃分别在丙酮，无水乙醇和去离子水中超声清洗，然后在60℃烘箱中干燥。将一块带有直径为8 mm小圆孔的绝缘胶粘在FTO玻璃上，然后在小圆孔内滴入20 μL步骤S2中得到的ZIS/BS/C复合分散体。干燥后，得到ZIS/BS/C电极。
S4.向步骤S3中制备好的ZIS/BS/C电极的小圆孔中滴加20 μL的AFP抗体（anti-AFP）（10 μg/mL）来修饰电极，并在4℃下孵育2 h使anti-AFP充分修饰到ZIS/BS/C电极表面。
S5.将20 μL 1%牛血清白蛋白（BSA）滴加到步骤S4中得到的电极表面，同样在4°C下孵育2 h得到PEC电极。整个PEC传感器的修饰过程在室温下进行，并在孵育时和测试前储存在4°C下以保证其稳定有效。
S6.新取一块FTO电极（1×2.5cm2），依次用丙酮，无水乙醇和去离子水进行超声清洗。然后，用1:1（v/v）的乙醇/NaOH（1mol/L）溶液浸润15 min以激活表面，接着用去离子水冲洗，并用氮气吹干。随后，在电极表面固定一个直径为8 mm的圆形区域。浸入含有氯化铁和K3Fe(CN)6的溶液（所述含有氯化铁和K3Fe(CN)6的溶液中氯化铁和K3Fe(CN)6的含量分别为2.5mmol/L和2.5mmol/L，）中，采用循环伏安法进行电沉积以形成PB电极，所述循环伏安法的扫描速度为0.05V/s，在0.5至-0.2V之间CV扫描至稳定，将步骤S5得到的PEC电极与PB电极相连接，制得可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器。
扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）表征，如图2：如图2 A所示，观测到ZIS由许多切片组成，共同聚集呈现块状结构。图2 B显示，BS呈现纳米棒形状，纳米棒的聚集在一定程度上有利于可见光的吸收。同时由于BS的加入，ZIS的块状堆积结构得到分散并与BS纳米棒结合，尺寸较小，有利于载流子的传输，而少量ZIS则以不规则纳米片的形式存在。图2 C显示了ZIS/BS/C复合材料的形态，与ZIS/BS形貌无明显区别，ZIS与BS纳米棒相互聚集并被ZIS切片覆盖，说明葡萄糖的加入对ZIS/BS形貌的影响不大。ZIS/BS/C复合材料的TEM图像进一步证明了ZIS和BS形成了复合物（图2 D）。
为了进一步研究ZIS在BS的表面上的分布，记录了ZIS/BS/C的SEM能量色散谱（EDS）元素映射图像（图2 E），C和O元素均匀分布，而Zn、In、Bi和S元素则分布在指定的区域。EDS谱图也可清楚观察到Zn、In、Bi、S、C和O元素的存在（图3）。上述结果表明三元异质结的成功构建。
通过XRD分析了合成材料的结晶性质和组成，如图4。如图4 A，ZIS的衍射峰可以索引到六方相ZIS结构。位于21.97°、27.84°、47.21°，52.44°的特征衍射峰可分别归属于ZIS的(006)、(102)，(110)和(116)晶面。同样，BS的所有衍射峰与标准XRD图匹配良好。位于15.74°、17.65°、22.47°、23.78°、25.04°、25.29°、28.73°、31.92°、33.04°、35.75°、45.67°，46.64°和52.78°的特征峰分别归属于BS的(020)、(120)、(220)、(101)、(111)、(310)、(230)、(221)、(301)、(240)、(002)，(431)和(132)晶面。尖锐的XRD特征峰表明BS具有高的结晶质量。对于ZIS/BS和ZIS/BS/C复合材料，ZIS的峰分辨率降低，可能是因为其信号与BS的信号重叠。而出现的一系列与纯BS相对应的峰，表明BS的晶格不受ZIS的影响。ZIS/BS/C衍射峰强度的进一步减弱则是归因于ZIS/BS表面碳材料的掩盖。此外，ZIS/BS/C在26.8°出现的新衍射峰对应石墨碳的(002)晶面。因此，XRD的结果表明了ZIS/BS/C复合物成功形成。
此外，应用X射线光电子能谱（XPS）进一步确定了ZIS/BS/C复合材料的化学成分。如图4 B所示，在XPS全光谱中可以观察到对应于Bi、Zn、In、S，C和O的一系列峰。ZIS/BS/C样品中Bi 4f、S 2p、Zn 2p、In 3d，C 1s和O 1s的高分辨率XPS光谱中，Bi 4f7/2和Bi 4f5/2的结合能分别为158.3 eV和163.6 eV（图4 C），表明Bi以三价态存在。同时出现在161.1eV和162.2 eV处的峰归因于S 2p3/2和S 2p1/2，226.5 eV处的峰则被归属于S 2s（图4 B），证实了硫元素的存在。In 3d5/2和In 3d3/2对应的结合能分别为444.8 eV和462.6 eV（图4 D），表明In以三价态存在。1045.8 eV和1021.6 eV处的峰可归因于二价Zn（图4 E）。284.6 eV和531.7 eV处的峰则被归因于加入的葡萄糖热解生成的碳材料的C 1s和O 1s（图4 F）。
对PEC传感器的光学性质和能带结构进行了分析。
PL光谱用于测试光生电子和空穴的复合率。如图5所示，与纯ZIS和BS相比，ZIS/BS的PL强度显著减弱，表明BS的加入可以形成异质结有效抑制电子和空穴的复合。值得注意的是，ZIS/BS/C的PL强度最低，表明光诱导电荷载流子的复合率进一步降低，这可能是由于均匀分布的碳材料的高导电率促进了ZIS和BS之间的电子转移。
通过紫外-可见漫反射光谱（UV-vis DRS）分析检测了ZIS，BS和ZIS/BS的光吸收性质和带隙（Eg），如图6。如图6 A所示，ZIS的吸收边缘为550 nm，而BS的吸收边缘明显比其大很多，表明BS具有出色的光吸收特性，可以吸收几乎整个范围的可见光。BS的加入使ZIS/BS复合材料的吸收边缘有明显的红移，意味着可以获得更多的可见光。对于ZIS/BS/C复合材料，在可见光区域的吸收则进一步增强。此外，吸收更多的光子可以增加光诱导的电子-空穴对的产生，增强光电活性。ZIS和BS均为直接半导体，它们的相对(αhν)2-hν曲线如图6 B所示，各自的光学带隙（Eg）由Tauc方程分别被估计为2.53 eV和1.39 eV。这些结果表明，这三种成分结合在一起，BS的加入可以显著促进光的捕获，从而在可见光照射下产生更多的电荷载流子。
为了进一步阐明ZIS/BS异质结界面的电子转移行为，测试了用于估计ZIS和BS的导带（CB）电势的Mott-Schottky（M-S）图。M-S曲线是通过在0.1 M的Na2SO4溶液中测试得到的，初始和最终电位被设定在以开路电位为中心的1 V范围内。图6 C和图6 D分别显示了ZIS和BS的M-S图。两条曲线的斜率均为正值表明它们都是n型半导体。ZIS和BS的平带电位分别为-0.76 V vs. Ag/AgCl和-0.42 V vs. Ag/AgCl（对应于-0.56 V vs. NHE和-0.22 Vvs. NHE），进而相应的导带（CB）电位可以计算为-0.66 V vs. NHE和-0.32 V vs. NHE。因此，通过Eg值，可以计算ZIS和BS的价带（VB）电位分别为1.87 V vs. NHE和1.09 V vs.NHE。
紫外光电子能谱（UPS）的结果用于监测ZIS和BS之间的界面电荷转移过程，如图7。如图7 A-C所示，ZIS和BS的功函数（Φ）分别计算为4.7和5.7 eV。当具有不同费米能级（EF）的半导体接触时，较高EF（ZIS）中的电子将移动到较低EF（BS），直到两个费米能级趋于平衡。同时，ZIS的能带降低，而BS的能带增加，界面内部电场（IEF）将在ZIS和BS的界面处形成，如图7 C所示。
在上述结果和讨论的基础上，初步探讨了ZIS/BS/C复合材料电荷载流子的迁移过程。如图8所示，在光照射下，ZIS/BS吸收能量，当吸收的能量高于ZIS/BS时，电子被激发到ZIS和BS的CB，同时在VB中留下空穴。在异质结界面电势差引起的驱动力和可见光照射的影响下，光生电子从ZIS的CB迅速转移到BS的CB上，同时ZIS中的光生空穴留在原位或迁移到BS的VB，这使得电荷载流子能够实现有效地分离和转移。得益于可见光照射下IEF的存在，ZIS/BS复合材料与单一的ZIS相比，显著促进了光生电子和空穴对的分离。而其中加入的葡萄糖所形成的碳复合物，在ZIS/BS异质结中均匀嵌入，不仅增强了可见光的吸收，同时也作为电荷介质加速了电荷载流子的分离/转移。
为了表征材料的光电活性，进行了一些电化学测试，如图9。
如图9 A所示，在PBS缓冲液（0.1 M，pH=7.5）中，ZIS/BS的光电流比纯ZIS高很多，这归因于BS的加入，从而提高了ZIS/BS的光捕获能力并有效促进了光激发载流子的分离。同样，ZIS/BS/C相较ZIS/BS表现出更强的光电流，这与UV-Vis DRS和PL的结果一致。此外，这三个样品的电化学阻抗谱（EIS）可以清楚的反映电子在三者之间的迁移效率，圆弧直径可用于表示电极表面材料的电荷转移电阻。如图9 B所示，ZIS/BS/C与ZIS/BS和ZIS相比，具有明显较小的直径，表明电子的迁移效率较高。上述结果明确表明，ZIS/BS/C复合材料为光诱导载流子提供了超强的产生、分离和传输能力，意味着其在光电转换方面具有高效性。
为了证明PEC免疫传感器的成功制备，进行了光电流-时间（I-t）和EIS测试，如图9所示。光电流曲线如图9 A所示，裸FTO电极几乎没有光电流信号（曲线a）。ZIS（曲线b）、ZIS/BS（曲线c）和ZIS/BS/C（曲线d）的光电流强度不断增大。随着anti-AFP，BSA和AFP被逐层修饰在FTO电极上，光电流依次降低（曲线e-g）。这是因为蛋白质分子的大空间位阻阻碍了电子和空穴向电极表面的扩散，意味着PEC免疫传感器在每一步都被成功修饰。EIS Nyquist图被用来进一步验证了各层物质是否被成功组装在改性电极上（图9 B）。裸FTO电极的EISNyquist曲线显示出一个小的半圆弧（曲线a），ZIS修饰后圆弧半径明显变大，电极的阻抗值也略有增加（曲线b）。ZIS/BS/C（曲线d）和ZIS/BS（曲线c）则比ZIS显示了更小的圆弧半径，表明电荷转移电阻较低，这允许电子和空穴在复合材料中进行有效地分离。而随着anti-AFP，BSA和AFP（e，f，g）被逐层修饰在FTO电极上，这些蛋白类物质由于具有令人满意的绝缘性能，它们在电极表面的聚集使得阻抗不断增加。上述结果表明，所设计的逐层组装的PEC免疫传感器已经成功制备，并可用于AFP的光电流免疫分析。
实施例4
为了确保制备的PEC传感器具有最佳的光电性能，本发明对其制备条件进行了一系列优化，如图10。在本实验中，葡萄糖的加入量会影响ZIS/BS/C复合材料的光电流响应值。如图10 A所示，葡萄糖的量在0 g到0.15 g范围内变化时，光电流在0.075 g时达到峰值。继续增大用量，光电流下降，因此选择加入0.075 g葡萄糖作为最佳的材料合成条件。此外，外部检测条件也会影响PEC免疫传感器的光电流强度。电解液的pH值对于检测信号有极大的影响。当PBS缓冲液在pH 6.0-8.5范围内变化时，发现在pH值为7.5时可获得最大的光电流响应，因此选择pH值为7.5的PBS缓冲液作为最佳测试条件（图10 B）。此外，本实验材料本身即具有极高的光电流信号，添加抗坏血酸虽然对于信号的增强有益，但在测定的过程中也可能成为被引入的干扰。同时在可视化检测的过程中，抗坏血酸的还原性能够显著影响普鲁士蓝的颜色变化，这必将极大的干扰变色过程。因此本实验并未在电解液中引入抗坏血酸作为电子供体。
实施例5
在优化的条件下，构建的PEC免疫传感器可以被应用于AFP的检测，如图11。在图11A中，我们可以发现光电流信号随着AFP的浓度在0.001-1000 ng/mL范围增加而逐渐减少。图11 B显示，光电流（I）随着AFP浓度的对数（logc AFP）而呈现线性下降。线性方程为I (μA)=3.65-0.55 log (c AFP, ng/mL)，相关系数（R2）为0.9939，检测极限（LOD，S/N=3）为0.12 pg·mL-1。表明制备的PEC传感器具有高的灵敏度和低的检测限，是检测AFP的可靠方法。
同时，为实现AFP的肉眼定性和半定量，本发明制作了PB电极并与PEC传感器相连成为简单的可视化装置。图12显示了PB电极的颜色强度变化。随着待测物AFP浓度的增加，PEC传感电极能够供给的电子更少，PB被还原成无色普鲁士白（PW）的程度降低，从而呈现更深的颜色。颜色变化可以在非常短的时间内完成，并能通过肉眼辨别，从而通过简单的设计使PEC免疫传感器更具应用潜力。
测试例1
为了检验PEC传感器的实用性，对健康人血清样品中的AFP含量进行了检测。一般来说，健康成人血清中的AFP浓度低于20 ng/mL。为了证明传感器可用于测定真实人血清中的AFP，使用标准加入法检测不同浓度的AFP的血清样品的回收率。离心3次后，将人血清上清液稀释5倍作为空白样品。经计算得出相对标准偏差（RSD）为0.7%-4.2%，加标回收率为94.3%-106.7%。表明所设计的生物传感器用于血清中AFP的检测是可行的，这也表明PEC传感器在检测实际样品方面具有广阔前景。
测试例2
专属性对大多数免疫传感器至关重要，传感器的非特异性结合会严重影响检测结果，所以需要证明光电流信号对抗原的特异性反应。癌胚抗原（CEA）、人血红蛋白（HGB）、碱性磷酸酶（ALP）、三磷酸腺苷（ATP）和细胞色素C作为干扰物质被用来研究免疫传感器的专属性。
通过分别测量含有1000 ng/mL干扰物质和100 ng/mL AFP的溶液的光电流响应进行专属性实验。从图11 C可以看出，在没有AFP的情况下（a，c，d，e，f，g），即便是高浓度的干扰物质也不会引起电极光电流强度的显著变化，这表面PEC传感器具有较好的专属性。仅在含AFP（a，h）的情况下，光电流强度才会出现明显的下降。并且相比于仅孵育AFP（a），在电极上同时孵育AFP及所有干扰物质（h）后，光电流强度没有显著差异。因此，这种PEC免疫传感器的光电流响应强度不受高浓度干扰物的影响，证明了其对AFP的理想的特异性。
光电流响应的稳定性也是影响传感器应用潜力的一个重要因素。如图11 D所示，在400 s进行多次重复的开/关光照周期下，光电流的强度没有明显的变化。传感器的长期稳定性是通过在4°C下储存30天来评估的。每5天测定一次，30天后光电流强度仍能达到原始值的92%以上。结果表明，这种PEC传感器拥有较好的稳定性。此外，同批制备5个传感器同时用于检测100 ng/mL的AFP，计算得出结果的相对标准偏差（RSD）为3.8%，表明传感器具有可接受的制备再现性。
实施例6
与实施例3相比，不同之处在于，复合分散体中还添加了Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料，所述复合分散体和Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的质量比为10:2。
Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的制备方法如下：
T1.前驱体TiO2微球的制备：将1mg钛醇盐、0.8mg有机酸溶于40mg乙醇中，搅拌混合10min，加热至70℃，搅拌反应3h，加入5mg超纯水搅拌反应1h，离心，乙醇和水依次洗涤，干燥，制得前驱体TiO2微球；
T2.TiO2/CuCo2O4复合材料的制备：将10mg步骤T1制得的前驱体TiO2微球、0.8mg硝酸铜、2mg硝酸钴、1mg脲和2.5mg氯化铵依次加入20mL乙醇中，搅拌混合10min，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬的高压釜中，加热至130℃，搅拌反应5h，产物离心，乙醇和水洗涤，干燥，300℃煅烧1h，制得TiO2/CuCo2O4复合材料；
T3.聚多巴胺改性：将10mg步骤T2制得的TiO2/CuCo2O4复合材料加入20mL水中，加入3mg多巴胺盐酸盐和0.1mg催化剂，加热至40℃，搅拌反应2h，离心，清水洗涤，干燥，制得改性TiO2/CuCo2O4复合材料；
所述催化剂为pH=8.5的Tris-HCl溶液；
T4.Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的的制备：将10mg步骤T3制得的改性TiO2/CuCo2O4复合材料加入20mL乙醇中，加入2mg酞菁，500W超声反应1h，离心，乙醇和水依次洗涤，干燥，制得Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料；
T5.Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的的制备：将步骤T4制得的Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料加入1wt%的壳聚糖溶液中浸泡10min，离心，洗涤，干燥，然后在含有0.08mol/L硝酸铬和0.05mol/L醋酸锰的甲醇溶液中浸泡10min，离心，甲醇和水依次洗涤，干燥，制得Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料。
实施例7
与实施例3相比，不同之处在于，复合分散体中还添加了Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料，所述复合分散体和Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的质量比为10:3。
Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的制备方法如下：
T1.前驱体TiO2微球的制备：将1.2mg钛醇盐、1.5mg有机酸溶于50mg乙醇中，搅拌混合10min，加热至80℃，搅拌反应5h，加入7mg超纯水搅拌反应3h，离心，乙醇和水依次洗涤，干燥，制得前驱体TiO2微球；
T2.TiO2/CuCo2O4复合材料的制备：将10mg步骤T1制得的前驱体TiO2微球、2mg硝酸铜、4mg硝酸钴、3mg脲和3.5mg氯化铵依次加入20mL乙醇中，搅拌混合10min，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬的高压釜中，加热至150℃，搅拌反应7h，产物离心，乙醇和水洗涤，干燥，400℃煅烧3h，制得TiO2/CuCo2O4复合材料；
T3.聚多巴胺改性：将10mg步骤T2制得的TiO2/CuCo2O4复合材料加入20mL水中，加入5mg多巴胺盐酸盐和0.2mg催化剂，加热至50℃，搅拌反应4h，离心，清水洗涤，干燥，制得改性TiO2/CuCo2O4复合材料；
所述催化剂为pH=9的Tris-HCl溶液；
T4.Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的的制备：将10mg步骤T3制得的改性TiO2/CuCo2O4复合材料加入20mL乙醇中，加入3mg酞菁，700W超声反应2h，离心，乙醇和水依次洗涤，干燥，制得Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料；
T5.Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的的制备：将步骤T4制得的Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料加入1.5wt%的壳聚糖溶液中浸泡15min，离心，洗涤，干燥，然后在含有0.12mol/L硝酸铬和0.1mol/L醋酸锰的甲醇溶液中浸泡20min，离心，甲醇和水依次洗涤，干燥，制得Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料。
实施例8
与实施例3相比，不同之处在于，复合分散体中还添加了Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料，所述复合分散体和Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的质量比为10:2.5。
Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的制备方法如下：
T1.前驱体TiO2微球的制备：将1.1mg异丙醇钛、1.1mg有机酸溶于45mg乙醇中，搅拌混合10min，加热至75℃，搅拌反应4h，加入6mg超纯水搅拌反应2h，离心，乙醇和水依次洗涤，干燥，制得前驱体TiO2微球；
T2.TiO2/CuCo2O4复合材料的制备：将10mg步骤T1制得的前驱体TiO2微球、0.96mg硝酸铜、2.33mg硝酸钴、1.22mg脲和2.96mg氯化铵依次加入20mL乙醇中，搅拌混合10min，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬的高压釜中，加热至140℃，搅拌反应6h，产物离心，乙醇和水洗涤，干燥，350℃煅烧2h，制得TiO2/CuCo2O4复合材料；
T3.聚多巴胺改性：将10mg步骤T2制得的TiO2/CuCo2O4复合材料加入20mL水中，加入4mg多巴胺盐酸盐和0.15mg催化剂，加热至45℃，搅拌反应3h，离心，清水洗涤，干燥，制得改性TiO2/CuCo2O4复合材料；
所述催化剂为pH=8.7的Tris-HCl溶液；
T4.Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的的制备：将10mg步骤T3制得的改性TiO2/CuCo2O4复合材料加入20mL乙醇中，加入2.5mg酞菁，600W超声反应1.5h，离心，乙醇和水依次洗涤，干燥，制得Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料；
T5.Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的的制备：将步骤T4制得的Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料加入1.2wt%的壳聚糖溶液中浸泡12min，离心，洗涤，干燥，然后在含有0.1mol/L硝酸铬和0.08mol/L醋酸锰的甲醇溶液中浸泡15min，离心，甲醇和水依次洗涤，干燥，制得Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料，其SEM图如图13，由图可知，其粒径在400-800nm之间，表面较为粗糙。
测试例3
将实施例6-8制得的可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器进行加样回收实验，在人标准血清中，加入不同浓度的AFP 标准溶液测试相对标准差（RSD），RSD的值为1.4-3.2%，分析回收率的范围在99.2-101.0%。
测试实施例6-8制得的可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器的线性范围和检测限，发现其线性范围为0.0001-5000 ng/mL，检测限为0.07pg/mL。
这说明制得的可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器检测AFP具有高灵敏度和精确性，其效果更优于实施例3，同时具有更宽的线性检测范围和更低的检测限。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1.将ZnAc、InCl3、Bi(NO3)3·5H2O和葡萄糖溶解在乙二醇中混合均匀，加入硫代乙酰胺，继续搅拌均匀，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬的高压釜中，加热反应，冷却到室温，产物洗涤，干燥，溶解在无水乙醇中，得到复合分散体；
S2.清洗掺杂氟的SnO2导电玻璃，干燥，粘贴带有圆孔的绝缘胶，在圆孔内滴入步骤S1制得的复合分散体，干燥，得到电极；
S3.向步骤S2制得的电极的小圆孔中滴加甲胎蛋白抗体溶液修饰电极，孵育，得到甲胎蛋白抗体修饰电极；
S4.将牛血清白蛋白溶液滴加得到的步骤S3制得的的甲胎蛋白抗体修饰电极表面，孵育，得到光电化学电极；
S5.取一块光电化学电极，清洗，用乙醇/NaOH溶液浸润表面，冲洗，吹干，在电极表面固定一个圆形区域，浸入含有氯化铁和K3Fe(CN)6的溶液中，采用循环伏安法进行电沉积以形成PB电极，将步骤S4制得光电化学电极与PB电极相连接，制得可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述ZnAc、InCl3、Bi(NO3)3·5H2O、葡萄糖、硫代乙酰胺的质量比为1-1.15：2-2.5：4-6：0.6-0.8：2.4-2.8，所述加热反应的温度为170-190℃，时间为10-14h，所述产物分别用去离子水和无水乙醇洗涤，所述产物和无水乙醇的固液比为1.5-2.5mg/mL；步骤S2中所述圆孔的直径为7-10mm，所述滴入的复合分散体的量为15-25μL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述甲胎蛋白抗体溶液的浓度为8-12μg/mL，滴加量为15-25μL，所述孵育的条件为3-5℃，孵育1-3h；步骤S4中所述牛血清白蛋白溶液的浓度为0.5-1.5wt%，滴加量为15-25μL，所述孵育的条件为3-5℃，孵育1-3h；步骤S5中所述乙醇/NaOH溶液为乙醇和0.5-1.5mol/L的NaOH溶液按照体积比为1:1进行混合得到，所述浸润的时间为10-20min，所述圆形区域的直径为7-10mm，所述含有氯化铁和K3Fe(CN)6的溶液中氯化铁和K3Fe(CN)6的含量分别为2-3mmol/L和2-3mmol/L，所述循环伏安法的扫描速度为0.03-0.07V/s，在0.5至-0.2V之间CV扫描至稳定。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述复合分散体中还添加了Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料，所述复合分散体和Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的质量比为10:2-3。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的制备方法如下：
T1.前驱体TiO2微球的制备：将钛醇盐、有机酸溶于乙醇中，搅拌混合均匀，加热反应，加水搅拌反应，离心，洗涤，干燥，制得前驱体TiO2微球；
T2.TiO2/CuCo2O4复合材料的制备：将步骤T1制得的前驱体TiO2微球、硝酸铜、硝酸钴、脲和氯化铵依次加入乙醇中，搅拌混合均匀，将混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬的高压釜中，加热反应，产物离心，洗涤，干燥，煅烧，制得TiO2/CuCo2O4复合材料；
T3.聚多巴胺改性：将步骤T2制得的TiO2/CuCo2O4复合材料加入水中，加入多巴胺盐酸盐和催化剂，加热搅拌反应，离心，洗涤，干燥，制得改性TiO2/CuCo2O4复合材料；
T4.Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的的制备：将步骤T3制得的改性TiO2/CuCo2O4复合材料加入乙醇中，加入酞菁，超声反应，离心，洗涤，干燥，制得Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料；
T5.Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料的的制备：将步骤T4制得的Pc-改性TiO2-CuCo2O4复合材料加入壳聚糖溶液中浸泡第一时间，离心，洗涤，干燥，然后在硝酸铬和醋酸锰的甲醇溶液中浸泡第二时间，离心，洗涤，干燥，制得Pc/Cd:Mn-改性TiO2-CuCo2O4复合材料。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤T1中所述钛醇盐、有机酸、乙醇、水的质量比为1-1.2：0.8-1.5：40-50：5-7，所述钛醇盐选自钛酸四丁酯、钛酸四乙酯、异丙醇钛中的至少一种，所述有机酸选自乙酸、丙酸、丁酸、戊酸中的至少一种，所述加热反应的温度为70-80℃，时间为3-5h，所述加水搅拌反应的时间为1-3h；步骤T2中所述前驱体TiO2微球、硝酸铜、硝酸钴、脲和氯化铵的质量比为10：0.8-2：2-4：1-3：2.5-3.5，所述加热反应的温度为130-150℃，时间为5-7h，所述煅烧的温度为300-400℃，时间为1-3h。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤T3中所述TiO2/CuCo2O4复合材料、多巴胺盐酸盐和催化剂的质量比为10:3-5:0.1-0.2，所述催化剂为pH=8.5-9的Tris-HCl溶液，所述加热搅拌反应的温度为40-50℃，时间为2-4h；步骤T4中所述改性TiO2/CuCo2O4复合材料、酞菁的质量比为10:2-3，所述超声反应的时间为1-2h，超声功率为500-700W；步骤T5中所述壳聚糖溶液为1-1.5wt%的壳聚糖溶液，所述硝酸铬和醋酸锰的甲醇溶液中述硝酸铬和醋酸锰的浓度分别为0.08-0.12mol/L和0.05-0.1mol/L，所述第一时间为10-15min，所述第二时间为10-20min。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器。
9.一种如权利要求8所述可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器用于在临床中检测疾病标志物甲胎蛋白水平中的应用。
10.一种如权利要求8所述可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器用于检测疾病标志物甲胎蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将甲胎蛋白溶液在可视化检测甲胎蛋白的光电化学传感器上孵育；
（2）孵育结束后，用PBS缓冲液冲洗电极；
（3）将步骤（2）中的电极置于PBS缓冲液中，以10s的频率间隔打开和关闭光源，在电化学工作站下记录光电流信号；
（4）光电流测试完毕后，将步骤（3）中的电极与PB电极以导线相连接组成小型可视化检测器；
（5）将步骤（4）中的两块电极均浸入PBS缓冲液中，在光源下持续光照30s，电化学工作站记录光电流信号。
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