CN109709176A - 一种甲胎蛋白光致电化学传感器的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甲胎蛋白光致电化学传感器的构建。利用CdS、SnS2和TiO2三种半导体材料构建级联构建传感界面，提高光电转换效率；通过（1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐）与N‑羟基琥珀酰亚胺共价偶联甲胎蛋白捕获抗体特异性识别甲胎蛋白；利用夹心方式结合碱性磷酸酶/甲胎蛋白二抗/金纳米颗粒复合物在抗坏血酸磷酸酯钠溶液中为光致电化学反应提供电子供体；利用三电极体系，波长200 nm~2500 nm的白光氙灯做光源，测定体系光电流，实现对甲胎蛋白的高选择，高灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料技术、免疫技术等领域，更具体地说是一种适合于甲胎蛋白的光致电化学传感器的构建。
背景技术
甲胎蛋白是原发性肝癌确诊最重要的生物标志物，血清中甲胎蛋白含量的检测对肝癌临床诊断以及早期筛查具有重要意义。原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居全球首位。目前，血清中甲胎蛋白含量的确定，临床检测主要采用免疫测定法，常规免疫测定包括酶联免疫吸附测定、放射免疫测定以及荧光免疫测定。但是，这些方法固有其自身缺陷，如会存在部分标记抗体的损失，会造成辐射危害以及环境污染等；荧光免疫测定中所需的标记物价格昂贵且容易受到外界干扰。此外，以上分析方法所需分析时间长，且需具备熟练的操作人员。因此，亟需开发一种简单、快速、灵敏和高选择性的检测方法。
光致电化学分析是一种新发展的用于生物分析的分析方法，由于光致电化学免疫传感器的内在优点如仪器操作简单、高灵敏和高选择性、宽的线性范围，具有良好的应用前景。在光致电化学检测中，光源用来激发具有光电化学活性的物质，电流作为检测信号。光致电化学分析结合了光激发和电化学检测，同时具有光学方法和电化学传感的优点。由于其分离的激发和检测源，光致电化学分析背景信号低。同时光化学检测方法中会使用到复杂且昂贵的光学成像设备和图像识别软件，电子检测设备的使用让光致电化学分析变得简单和廉价。
在光致电化学传感器的构建过程中，光电转换材料至关重要，TiO2由于具有抗光腐蚀性、无毒及价格低廉等优点，同时展现出高的比表面积、有效的电子传递路径、强的光散射能力等特点，但TiO2宽的能带只允许它吸收紫外光，需要在进行光致电检测过程中采用紫外光照射。并且二氧化钛受光激发后电子和空穴复合速度过快，如何提高二氧化钛材料对可见光的利用率以及增大电子和空穴的分离效率，提高光致电化学转换效率。SnS2量子点具有窄的带隙，是一种用于可见光催化并且不含有毒元素的潜在材料，SnS2和TiO2之间合适的能带排列使电荷载流子有效的从SnS2传递到TiO2，通过与窄带隙的CdS量子点形成级联光生电子-空穴的分离，提高光致电化学转换效率。构建一种用于甲胎蛋白的光致电化学传感器。
发明内容
本发明的目的是构建甲胎蛋白光致电化学传感器用于高选择、高灵敏、操作简便、低成本地检测甲胎蛋白。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：
（1）导电玻璃表面生长介孔TiO2微球，通过溶剂热法在TiO2表面生长SnS2量子点，然后进一步生长CdS量子点，制备CdS/SnS2/TiO2修饰导电玻璃的光致电化学传感界面；
（2）在步骤（1）中得到的传感界面上固定巯基乙酸，通过（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）与N-羟基琥珀酰亚胺共价偶联甲胎蛋白捕获抗体，利用牛血清白蛋白封闭活性位点；
（3）在步骤（2）中处理过的的导电玻璃上滴加一定量的甲胎蛋白溶液或者样品孵育25~40 min，采用pH 7.4的磷酸缓冲溶液清洗3次；
（4）碱性磷酸酶和甲胎蛋白二抗固定于金纳米颗粒表面，制备得到碱性磷酸酶/甲胎蛋白二抗/金纳米颗粒复合物；
（5）将步骤（4）制备得到的碱性磷酸酶/甲胎蛋白二抗/金纳米颗粒复合物滴加于步骤（3）中得到的导电玻璃表面孵育30 min；
（6）利用三电极体系，将步骤（5）处理得到的导电玻璃连接工作电极，Pt电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，三电极置于含有一定浓度的抗坏血酸磷酸酯钠的pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，应用波长200 nm~2500 nm的白光氙灯做光源，外加电压0 V，测定光电流。
本发明所述步骤（1）中CdS/SnS2/TiO2/导电玻璃制备具体步骤如下：0.05 g 钛酸四丁酯和3.0 g无水草酸溶于30 mL N,N-二甲基甲酰胺中，取15 mL溶液转移至25 mL聚四氟乙烯内胆不锈钢反应釜中，将导电玻璃置于反应釜中，170 ℃下反应10 h，自然冷却至室温，导电玻璃用乙醇清洗3次，在60 ℃下干燥，然后400 ℃煅烧5 h，得到导电玻璃表面生长介孔TiO2；将TiO2/导电玻璃置于25 mL反应釜中盛有6.0 mmol/L的SnCl4和20 mmol/L的L-半胱氨酸的15 mL溶液中，180 ℃下反应6 h，自然冷却至室温，导电玻璃用乙醇清洗3次，氮气气氛下400 ℃煅烧2h，制备得到SnS2/TiO2/导电玻璃；将SnS2/TiO2/导电玻璃置于由1.0mmol/L的CdSO4、5.0 mmol/L的硫脲和4%的NH3·H2O组成的50 mL溶液，70℃下搅拌3h，冷却后，蒸馏水和乙醇分别洗涤3次，60℃干燥3h，得到CdS/SnS2/TiO2/导电玻璃。
本发明步骤（2）中捕获抗体固定于CdS/SnS2/TiO2/导电玻璃制备步骤如下： CdS/SnS2/TiO2/导电玻璃浸入10 mmol/L巯基乙酸溶液中浸泡2h，蒸馏水清洗3次，然后将其浸入0.1 mmol/L （1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）、0.1 mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液中浸泡1h，蒸馏水清洗3次，随后在其表面滴加20 μL 20 μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体溶液孵育1 h，然后加入0.1% BSA溶液在25 °C下反应30 min。
本发明步骤（4）中碱性磷酸酶/甲胎蛋白二抗/金纳米颗粒复合物的制备步骤如下：20 mL质量浓度为0.01 %的氯金酸在搅拌条件下加热煮沸，然后逐滴加入质量浓度为1.5 %的柠檬酸钠0.3 mL继续搅拌，溶液颜色逐渐变蓝最终变成酒红色，然后继续煮沸10min，停止加热继续搅拌15 min，室温下冷却，制备得到的金纳米溶液；取2 mL金纳米溶液，采用0.2 mol/L K2CO3调节金纳米溶液pH为8.2，加入20 μL 1.0 mg/mL的甲胎蛋白二抗和40μL 1.0 mg/mL碱性磷酸酶，室温下震荡2 h，加入200 μL 1 %的牛血清白蛋白孵育30 min，在15000转/分离心10min，清洗3次，转入200 μL 1 %的牛血清白蛋白溶液中，制备得到碱性磷酸酶/甲胎蛋白二抗/金纳米颗粒复合物。
本发明的有益效果
（1）采用三种半导体级联制备光致电化学传感器提高光生电子-空穴分离，提高传感界面的光电转换效率。
（2）本发明构建的传感器用于甲胎蛋白检测操作简单，易于处理，灵敏度高。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容。
实施例1
一种甲胎蛋白光致电化学传感器的构建，以检测血清中甲胎蛋白为例：
（1）CdS/SnS2/TiO2/导电玻璃制备具体步骤如下：0.05 g 钛酸四丁酯和3.0 g无水草酸溶于30 mL N,N-二甲基甲酰胺中，取15 mL溶液转移至25 mL聚四氟乙烯内胆不锈钢反应釜中，将导电玻璃置于反应釜中，170 ℃下反应10 h，自然冷却至室温，导电玻璃用乙醇清洗3次，在60 ℃下干燥，然后400 ℃煅烧5 h，得到导电玻璃表面生长介孔TiO2；将TiO2/导电玻璃置于25 mL反应釜中盛有6.0 mmol/L的SnCl4和20 mmol/L的L-半胱氨酸的15 mL溶液中，180 ℃下反应6 h，自然冷却至室温，导电玻璃用乙醇清洗3次，氮气气氛下400 ℃煅烧2h，制备得到SnS2/TiO2/导电玻璃；将SnS2/TiO2/导电玻璃置于由1.0 mmol/L的CdSO4、5.0mmol/L的硫脲和4%的NH4OH组成的50 mL溶液，70℃下搅拌3h，冷却后，蒸馏水和乙醇分别洗涤3次，60℃干燥3h，得到CdS/SnS2/TiO2/导电玻璃。
（2）捕获抗体固定于CdS/SnS2/TiO2/导电玻璃制备步骤如下：CdS/SnS2/TiO2/导电玻璃浸入10 mmol/L巯基乙酸溶液中浸泡2h，蒸馏水清洗3次，然后将其浸入0.1 mmol/L（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）、0.1 mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液中浸泡1h，蒸馏水清洗3次，随后在其表面滴加20 μL 20 μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体溶液孵育1 h，然后加入0.1% BSA溶液在25 °C下反应30 min。
（3）在步骤（2）中得到的导电玻璃上滴加一定量的甲胎蛋白标准溶液或者样品孵育30 min，采用pH 7.4的磷酸缓冲溶液清洗3次。
（4）碱性磷酸酶/甲胎蛋白二抗/金纳米颗粒复合物的制备步骤如下：20 mL质量浓度为0.01 %的氯金酸在搅拌条件下加热煮沸，然后逐滴加入质量浓度为1.5 %的柠檬酸钠0.3 mL继续搅拌，溶液颜色逐渐变蓝最终变成酒红色，然后继续煮沸10 min，停止加热继续搅拌15 min，室温下冷却，制备得到的金纳米溶液；取2 mL金纳米溶液，采用0.2 mol/LK2CO3调节金纳米溶液pH为8.2，加入20 μL 1.0 mg/mL的甲胎蛋白二抗和40 μL 1.0 mg/mL碱性磷酸酶，室温下震荡2 h，加入200 μL 1 %的牛血清白蛋白孵育30 min，在15000转/分离心10min，清洗3次，转入200 μL 1 %的牛血清白蛋白溶液中，制备得到碱性磷酸酶/甲胎蛋白二抗/金纳米颗粒复合物。
（5）将步骤（4）制备得到的碱性磷酸酶/甲胎蛋白二抗/金纳米颗粒复合物20 μL滴加于步骤（3）中得到的导电玻璃表面孵育30 min。
（6）利用三电极体系，将步骤（5）处理得到的导电玻璃连接工作电极，Pt电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，三电极置于100 mmol/L的抗坏血酸磷酸酯钠的pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，应用波长200 nm~2500 nm的白光氙灯做光源，外加电压0 V，产生光电流信号，通过电化学工作站进行光电流信号的记录，将步骤获得的数据计算处理后得到甲胎蛋白的检测范围为0.7μg/L -100 μg/L，检测限为0.2μg/L。
Claims (4)
1.一种甲胎蛋白光致电化学传感器的构建，其特征是包括以下步骤：
（1） 导电玻璃表面生长介孔TiO2微球，通过溶剂热法在TiO2表面生长SnS2量子点，然后进一步生长CdS量子点，制备CdS/SnS2/TiO2修饰导电玻璃的光致电化学传感界面；
（2） 在步骤（1）中得到的传感界面上固定巯基乙酸，通过（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）与N-羟基琥珀酰亚胺共价偶联甲胎蛋白捕获抗体，利用牛血清白蛋白封闭活性位点；
（3） 在步骤（2）中处理过的的导电玻璃上滴加一定量的甲胎蛋白溶液或者样品孵育25~40 min，采用pH 7.4的磷酸缓冲溶液清洗3次；
（4） 碱性磷酸酶和甲胎蛋白二抗固定于金纳米颗粒表面，制备得到碱性磷酸酶/甲胎蛋白二抗/金纳米颗粒复合物；
（5）将步骤（4）制备得到的碱性磷酸酶/甲胎蛋白二抗/金纳米颗粒复合物滴加于步骤（3）中得到的导电玻璃表面孵育30 min；
（6） 利用三电极体系，将步骤（5）处理得到的导电玻璃连接工作电极，Pt电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，三电极置于含有一定浓度的抗坏血酸磷酸酯钠的pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，应用波长200 nm~2500 nm的白光氙灯做光源，外加电压0 V，测定光电流。
2.本发明所述步骤（1）中CdS/SnS2/TiO2/导电玻璃制备具体步骤如下：0.05 g 钛酸四丁酯和3.0 g无水草酸溶于30 mL N,N-二甲基甲酰胺中，取15 mL溶液转移至25 mL聚四氟乙烯内胆不锈钢反应釜中，将导电玻璃置于反应釜中，170 ℃下反应10 h，自然冷却至室温，导电玻璃用乙醇清洗3次，在60 ℃下干燥，然后400 ℃煅烧5 h，得到导电玻璃表面生长介孔TiO2；将TiO2/导电玻璃置于25 mL反应釜中盛有6.0 mmol/L的SnCl4和20 mmol/L的L-半胱氨酸的15 mL溶液中，180 ℃下反应6 h，自然冷却至室温，导电玻璃用乙醇清洗3次，氮气气氛下400 ℃煅烧2h，制备得到SnS2/TiO2/导电玻璃；将SnS2/TiO2/导电玻璃置于由1.0mmol/L的CdSO4、5.0 mmol/L的硫脲和4%的NH3·H2O组成的50 mL溶液，70℃下搅拌3h，冷却后，蒸馏水和乙醇分别洗涤3次，60℃干燥3h，得到CdS/SnS2/TiO2/导电玻璃。
3.本发明步骤（2）中捕获抗体固定于CdS/SnS2/TiO2/导电玻璃制备步骤如下： CdS/SnS2/TiO2/导电玻璃浸入10 mmol/L巯基乙酸溶液中浸泡2h，蒸馏水清洗3次，然后将其浸入0.1 mmol/L （1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）、0.1 mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液中浸泡1h，蒸馏水清洗3次，随后在其表面滴加20 μL 20 μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体溶液孵育1 h，然后加入0.1% BSA溶液在25 °C下反应30 min。
4.本发明步骤（4）中碱性磷酸酶/甲胎蛋白二抗/金纳米颗粒复合物的制备步骤如下：20 mL质量浓度为0.01 %的氯金酸在搅拌条件下加热煮沸，然后逐滴加入质量浓度为1.5 %的柠檬酸钠0.3 mL继续搅拌，溶液颜色逐渐变蓝最终变成酒红色，然后继续煮沸10 min，停止加热继续搅拌15 min，室温下冷却，制备得到的金纳米溶液；取2 mL金纳米溶液，采用0.2mol/L K2CO3调节金纳米溶液pH为8.2，加入20 μL 1.0 mg/mL的甲胎蛋白二抗和40 μL 1.0mg/mL碱性磷酸酶，室温下震荡2 h，加入200 μL 1 %的牛血清白蛋白孵育30 min，在15000转/分离心10min，清洗3次，转入200 μL 1 %的牛血清白蛋白溶液中，制备得到碱性磷酸酶/甲胎蛋白二抗/金纳米颗粒复合物。
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