CN109884319A - 一种卵巢癌肿瘤标记物的双模式免疫分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种卵巢癌肿瘤标记物的双模式免疫分析方法。该传感界面的构筑方法是以碳纳米角、铜纳米簇功能化的混合相（锐钛矿/金红石）二氧化钛介观晶体作为基底，进而固定化脂解激活脂蛋白受体抗体(Ab)（一种早期卵巢癌肿瘤标记物抗体）；游离的脂解激活脂蛋白受体（一种早期卵巢癌肿瘤标记物）可与固定化的脂解激活脂蛋白受体抗体进行特异性识别并结合到传感界面上，引起电极光电流信号的减弱同时削弱电极对过氧化氢光催化分解的能力；而不同浓度的过氧化氢溶液又可氧化还原态亚甲基蓝使之呈现不同色度的蓝色。基于该现象可建立起对于脂解激活脂蛋白受体的比色和光电化学响应的双模式分析方法。
Description
技术领域
本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，具体涉及一种卵巢癌肿瘤标记物的双模式免疫分析方法。
背景技术
光电化学（PEC）检测，是以光作为激发信号，以光电流作为检测信号，通过采用不同形式的能量作为激发信号和检测信号，使激发和检测信号互不干扰，因而背景信号较低，可获得较高的灵敏度。在光电化学传感器的构建过程中，光敏材料的选择对于信号的响应至关重要，目前所用的材料中，TiO2纳米材料因其独特的光催化活性、无毒性，优异的化学和物理稳定性，使其成为光催化和光电化学传感器的理想材料。TiO2介观晶体是晶体亚单元有序排列构成的，相比于传统的TiO2单晶，TiO2介观晶体具有更加优良的太阳能转换和催化性能，能显著提高PEC性能。本实验中使用了TiO2介观晶体中两种不同的晶相（锐钛矿TiO2介观晶体和金红石TiO2介观晶体）并堆叠组成一种混合相的TiO2介观晶体，与单晶相基底相比由于不同晶相间费米能级的差异在紫外光的激发下更容易产生持续的高强度光电流。此外，铜纳米簇具有超微粒径和局域表面共振效应，不仅能提高基底导电性，还能捕获TiO2介观晶体中的电子促进电荷分离增强载流子寿命从而提高光电流强度。
卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。在全世界范围内，每年有近20万名女性被诊断为卵巢癌，并有超过半数的患者死于该疾病。卵巢癌也因此成为死亡率最高的恶性肿瘤，对女性生命健康造成严重威胁。由于卵巢深居盆腔，体积小，缺乏典型症状，难以早期发现。卵巢上皮癌患者手术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占不足30%，大多数已扩散到盆腹腔器官，所以早期诊断是一大难题。到目前为止较为常用的卵巢癌生物标记主要有癌抗原125(CA125)和人附睾蛋白4(HE4)，但以上两种生物标记只适用于良性卵巢癌的诊断。在这种情况下，开发出一种新型、可靠能提高早期卵巢癌监测灵敏度和特异性的方法显得至关重要。幸运的是已有相关研究表明脂质代谢与许多恶性肿瘤，尤其是卵巢癌相关。其中脂解激活脂蛋白受体作为一种具有强结合力的脂代谢调节蛋白，对卵巢癌的脂质环境的调控具有显著影响，因此可以被认定为是卵巢癌早期诊断的又一重要生物标记。免疫检测分析方法具有良好的灵敏性和特异性，常用于快速定量检测目标抗原。该方法的核心主要是抗体以及对应的抗原通过特异性识别位点与检测物质结合。目标抗原结合到固定在电极表面的抗体可引起电信号的变化，实现对脂解激活脂蛋白受体的高灵敏检测。
在本实验中，碳纳米角作为基底材料固定在氧化铟锡（ITO）电极表面利用其良好的导电性，可使光生电子更好的传递到电极表面。混合相（锐钛矿/金红石）TiO2介观晶体的引入增大了比表面积，可固定更多的抗体，同时由于不同晶相间费米能级的差异在紫外光的激发下更容易产生持续的高强度光电流。铜纳米簇的表面共振效应加速了电子传递，减少电子-空穴的复合，大大提高了混合相（锐钛矿/金红石）TiO2介观晶体的光电效应和光催化性能，光电流明显增强，光电流信号与脂解激活脂蛋白受体浓度在一定范围内呈线性。将反应后的电极作为光电阳极对0.6wt%的过氧化氢溶液进行光催化电解，电解后的溶液滴入还原态亚甲基蓝修饰的比色凝胶薄膜上，通过色度分析，记录色度变化，同样可以检测脂解激活脂蛋白受体浓度，该传感器的成功构建为脂解激活脂蛋白受体的双模式检测提供了平台。
发明内容
本发明的目的是提供一种卵巢癌肿瘤标记物的双模式免疫分析方法。
为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：
(1) 氧化铟锡（ITO）电极氧化铟锡（ITO）电极的预处理：首先ITO放入超声水浴中清洗，直至清洗干净，然后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
(2) CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极的制备：将0.6mL浓度为3mg/ml 的碳纳米角悬浮液于干净的ITO电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，然后在上述电极表面修饰依次修饰0.6mL浓度为3mg/mL的锐钛矿TiO2介观晶体和金红石TiO2介观晶体悬浊液，在红外灯下烘干冷却至室温，如此反复三次，即得到CNHs/Anatase/Rutile修饰电极；将巯基苯硼酸溶液与铜纳米簇(Cu NCs)溶液反应，得到复合溶液，然后将0.6mL的复合溶液滴涂到修饰过的电极表面，在烘箱里烘干冷却至室温；将修饰好的电极浸泡在含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中活50min；最终，将所获得的修饰电极浸泡于18μg/mL的脂解激活脂蛋白受体抗体溶液，在4°C下孵育50min，随后使用pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液去除多余的脂解激活脂蛋白受体抗体Ab，再将电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，冲去表面残余液后，即得到CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极；
(3) CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极的制备：将CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极浸入不同浓度的脂解激活脂蛋白受体（LSR）标准溶液中于4°C下孵育50min，通过异性识别结合固定在电极表面的抗体；用pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极；
(4)脂解激活脂蛋白受体的检测：采用三电极体系进行测定，以CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0.1V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH=7.5浓度为0.3mol/L的 PBS溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10-6 ng/mL–10ng/mL之间的一系列不同浓度的脂解激活脂蛋白受体标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替脂解激活脂蛋白受体标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。或者将反应后的电极作为光电阳极在pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液中对0.6wt%的过氧化氢溶液进行光催化电解，电解后的溶液滴入还原态亚甲基蓝修饰的比色凝胶薄膜上，通过色度分析，记录色度变化，同样可以检测脂解激活脂蛋白受体浓度
上述金红石型TiO2介观晶体材料的制备：
0.5 g十二烷基苯磺酸钠（SDBS）溶解在25 mL 2.2 mol/mL HNO3溶液中，搅拌15分钟。然后加入0.5 mL异丙醇钛（IV），在80°C下搅拌48 h。随后，所得产物经离心、用超纯水、乙醇洗涤4-5次后，在60 °C下干燥过夜。上述产物在400 °C空气中煅烧1h以去除残留的有机物，制得金红石型TiO2介观晶体。
上述锐钛矿型TiO2介观晶体材料的制备：
上述的锐钛矿型TiO2介观晶体材料由下述方法制备的：首先将1.5mL纯度为97%的钛酸四异丙酯（Ti(OCH(CH3)2)4,、3mL重量百分比浓度为99.9%的醋酸 (CH3COOH) 和3mL重量百分比浓度为99.9%乙醇(C2H5OH) 混合得到TiO2溶胶-凝胶前驱体；接着将上述混合物加入7.5mL含有0.45g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的乙醇溶液中搅拌1h得到浅黄色的溶胶-凝胶体，以2000rmp的转速旋涂到石英基片上在120°C下干燥30min;最后在500°C下煅烧1h去除残留的有机物即可得到锐钛矿型TiO2介观晶体。
上述铜纳米簇（Cu NCs）材料的制备：
制备前所使用的容器需在王水中浸泡，并在水中进行彻底清洗；将100 mg酵母提取物溶于8mL超纯水，并与2mL 100mM CuCl2溶液在室温下混合，搅拌2-3min；将上述混合物在100 °C下回流12h直至溶液颜色由浅蓝变为深绿色；最后将所得样品在10000rmp下离心10min取上清夜得到纯化的铜纳米簇溶液。
上述功能化凝胶材料的制备：
将2g聚乙烯醇固体（PVA）、8mL甘油溶于40mL超纯水,加热搅拌使其充分溶解，蒸发浓缩至胶体状；稍加冷却后依次加入0.3g柠檬酸和0.5g碳酸氢钠固体搅拌均匀并将其平铺在培养皿中，待其冷却凝固即可得到多孔的海绵状的凝胶薄膜；将薄膜裁剪成形状大小均一的片状体；将10mL浓度为0.1mol/L的抗坏血酸溶液与3mL浓度为1mmol/L的亚甲基蓝溶液混合制得还原态的无色亚甲基蓝溶液，并将凝胶薄膜浸入混合液浸泡10min得到功能化的比色凝胶薄膜。本发明所述的一种卵巢癌肿瘤标记物的双模式免疫传感器，包括工作电极、铂丝电极为对电极和Ag/ AgCl为参比电极，其特征在于所述的工作电极采用CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极，其由下述步骤的方法制备而成的1）氧化铟锡（ITO）电极氧化铟锡（ITO）电极的预处理：首先ITO放入超声水浴中清洗，直至清洗干净，然后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；2）CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极的制备：将0.6mL浓度为3mg/ml 的碳纳米角悬浮液于干净的氧化铟锡（ITO）电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，然后在上述电极表面修饰依次修饰0.6mL浓度为3mg/mL的锐钛矿TiO2介观晶体和金红石TiO2介观晶体悬浊液，在红外灯下烘干冷却至室温，如此反复三次，即得到CNHs/Anatase/Rutile修饰电极；将巯基苯硼酸溶液与铜纳米簇(Cu NCs)溶液反应，得到复合溶液，然后将0.6mL 的复合溶液滴涂到修饰过的电极表面，在烘箱里烘干冷却至室温；将修饰好的电极浸泡在含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中活50min；最终，将所获得的修饰电极浸泡于18μg/mL的脂解激活脂蛋白受体抗体溶液，在4°C下孵育50 min，随后使用pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液去除多余的脂解激活脂蛋白受体抗体Ab，再将电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，冲去表面残余液后，即得到CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极；将CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极浸入不同浓度的脂解激活脂蛋白受体（LSR）标准溶液中于4°C下孵育50min，通过异性识别结合固定在电极表面的抗体；用pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极；
本发明所述的一种卵巢癌肿瘤标记物的双模式免疫分析方法，其特征在于，步骤如下：1）采用三电极体系进行测定，以CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0.1V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；2）在pH=7.5浓度为0.3mol/L的 PBS溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10-6 ng/mL–10 ng/mL之间的一系列不同溶度的脂解激活脂蛋白受体标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替脂解激活脂蛋白受体标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。或者将反应后的电极作为光电阳极在pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液中对0.6wt%的过氧化氢溶液进行光催化电解，电解后的溶液滴入还原态亚甲基蓝修饰的比色凝胶薄膜上，通过色度分析，记录色度变化，同样可以检测脂解激活脂蛋白受体浓度。
本发明的显著优点为：
(1)脂解激活脂蛋白受体作为一种具有强结合力的脂代谢调节蛋白，对卵巢癌的脂质环境的调控具有显著影响，因此可以被认定为是卵巢癌早期诊断的一重要生物标记。
(2)以混合相（锐钛矿/金红石）TiO2介观晶体为光活性物，由于不同晶相间费米能级的差异在紫外光的激发下更容易产生持续的高强度光电流，与传统的TiO2单晶材料相比，能有效提高光电转换效率。目标抗原通过特异性识别反应结合固定在电极表面的抗体，通过光信号的变化，实现对目标物的灵敏检测。
(3)铜纳米簇具有超微粒径和局域表面共振效应可作为增敏剂，不仅提高导电性，还能捕获TiO2介观晶体中的电子促进电荷分离增长载流子寿命从而提高光电流强度和传感器的灵敏度。
(4)反应后的电极可作为光电阳极对过氧化氢溶液进行光催化电解，电解后的溶液滴入还原态亚甲基蓝修饰的比色凝胶薄膜上，通过色度分析，记录色度变化，同样可以检测脂解激活脂蛋白受体浓度，为脂解激活脂蛋白受体的双模式检测提供了平台。
附图说明
图1为本发明所述的脂解激活脂蛋白受体的signal-off型比色-光电化学传感器的制备过程示意图。
图2 A为不同浓度1×10-6 ng/mL–10 ng/mL（a-g）脂解激活脂蛋白受体标准溶液传感电极的光电流响应图。
图2 B为传感电极的光电流响应与脂解激活脂蛋白受体标准溶液浓度的线性关系图。
图3A为用不同浓度脂解激活脂蛋白受体标准溶液（1×10-6 ng/mL–10 ng/mL）修饰的电极电解后的过氧化氢溶液在凝胶片上的显色反应图。
图3B为比色凝胶薄膜色度值与脂解激活脂蛋白受体标准溶液浓度的线性关系。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
一种卵巢癌肿瘤标记物的双模式免疫分析方法(如图1所示)：
（1）氧化铟锡（ITO）电极氧化铟锡（ITO）电极的预处理：首先将氧化铟锡（ITO）电极放入超声水浴中清洗，直至清洗干净，然后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
（2）滴加0.6mL浓度为3mg/ml 的碳纳米角悬浮液于干净的ITO电极极表面，红外灯下烘干，冷却至室温；
（3）在上述电极表面依次修饰0.6mL浓度为3mg/mL的锐钛矿TiO2介观晶体悬浊液和0.6mL浓度为3mg/mL的金红石TiO2介观晶体悬浊液，在红外灯下烘干冷却至室温，如此反复三次，即得到CNHs/Anatase/Rutile修饰电极；
（4）将浓度为1mM的巯基苯硼酸溶液与浓度为0.20 mg/mL铜纳米簇(Cu NCs)溶液按1：10体积比混合，使之发生复合反应，得到复合溶液，然后将0.6mL的复合溶液滴涂到修饰过的电极表面，在烘箱里烘干冷却至室温；
（5）将修饰好的电极浸泡在体积配比为4：1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中活化50 min；随后，将所获得的修饰电极浸泡于18μg/mL 的脂解激活脂蛋白受体抗体溶液，在4°C下孵育50 min，用pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液去除多余的脂解激活脂蛋白受体抗体Ab，再将电极浸入浓度为1.0wt.%的BSA 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，冲去表面残余液后，即得到CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极；
（6）将CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极浸入不同浓度的脂解激活脂蛋白受体（LSR）标准溶液中于4°C下孵育50min，通过异性识别结合固定在电极表面的抗体；用pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极；
上述的金红石型TiO2介观晶体材料由下述方法制备的：0.5 g十二烷基苯磺酸钠（SDBS）溶解在25 mL 2.2 mol/mL HNO3溶液中，搅拌15分钟；然后加入0.5mL异丙醇钛（IV），在80°C下搅拌48 h；随后，所得产物经离心、用超纯水、乙醇洗涤4-5次后，在60°C下干燥过夜；上述产物在400 °C 空气中煅烧1h以去除残留的有机物，制得金红石型TiO2介观晶体。
上述的锐钛矿型TiO2介观晶体材料由下述方法制备的：首先将1.5mL纯度为97%的钛酸四异丙酯（Ti(OCH(CH3)2)4,、3mL重量百分比浓度为99.9%的醋酸 (CH3COOH) 和3mL重量百分比浓度为99.9%乙醇(C2H5OH) 混合得到TiO2溶胶-凝胶前驱体；接着将上述混合物加入7.5mL含有0.45g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的乙醇溶液中搅拌1h得到浅黄色的溶胶-凝胶体，以2000rmp的转速旋涂到石英基片上在120°C下干燥30min;最后在500°C下煅烧1h去除残留的有机物即可得到锐钛矿型TiO2介观晶体。
上述铜纳米簇（Cu NCs）材料由下述方法制备的：
制备前所使用的容器需在王水中浸泡，并在水中进行彻底清洗；将100 mg酵母提取物溶于8mL超纯水，并与2mL 100mM CuCl2溶液在室温下混合，搅拌2-3min；将上述混合物在100 °C下回流12h直至溶液颜色由浅蓝变为深绿色；最后将所得样品在10000rmp下离心10min取上清夜得到纯化的铜纳米簇溶液。
上述脂解激活脂蛋白受体抗体、脂解激活脂蛋白受体（LSR）购自武汉三鹰生物技术有限公司。
实施例2
一种卵巢癌肿瘤标记物的双模式免疫分析方法，步骤如下：
（1）采用三电极体系进行测定，以实施例1制得的CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0.1V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；
（2）在pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10-6ng/mL–10 ng/mL一系列不同浓度的脂解激活脂蛋白受体标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线。图2 A为不同浓度1×10-6 ng/mL–10 ng/mL（a-g）脂解激活脂蛋白受体标准溶液，传感电极的光电流响应。图2 B为传感电极的光电流响应与脂解激活脂蛋白受体标准溶液浓度的线性关系图。
（3）将待测样品溶液代替脂解激活脂蛋白受体标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。
（4）将修饰有不同浓度标准溶液的CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极作为光电阳极，通过电化学工作站在pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液中对0.6wt%的过氧化氢溶液，进行光催化电解，电解后的溶液滴入还原态亚甲基蓝修饰的比色凝胶薄膜上，记录色度变化，通过颜色函数（Color value=red value + green value×256 + blue value×65536）对薄膜进行色度分析，绘制工作曲线。图3A为经过不同浓度脂解激活脂蛋白受体标准液（1×10-6 ng/mL–0.1 ng/mL）修饰电极电解后的过氧化氢溶液在比色凝胶薄膜上的显色反应。图3B为比色凝胶薄膜色度与标准溶液浓度的线性关系。
上述比色凝胶薄膜材料由下述方法制备的：将2g聚乙烯醇固体（PVA）、8mL甘油溶于40mL超纯水,加热搅拌使其充分溶解，蒸发浓缩至胶状；稍加冷却后依次加入0.3g柠檬酸和0.5g碳酸氢钠固体搅拌均匀并将其平铺在培养皿中，待其冷却凝固即可得到多孔的海绵状的凝胶薄膜；将薄膜裁剪成形状大小均一的片状体;将10mL浓度为0.1mol/L的抗坏血酸溶液与3mL浓度为1mmol/L的亚甲基蓝溶液混合制得还原态的无色亚甲基蓝溶液，并将凝胶薄膜浸入混合液浸泡10min得到功能化的比色凝胶薄膜。
Claims (7)
1.一种卵巢癌肿瘤标记物的双模式免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）氧化铟锡（ITO）电极的预处理：首先将ITO放入超声水浴中清洗，直至清洗干净，然后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
（2）CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极的制备：将0.6mL浓度为3mg/mL 的碳纳米角悬浮液于干净的氧化铟锡（ITO）电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，然后在上述电极表面依次修饰0.6mL浓度为3mg/mL的锐钛矿TiO2介观晶体和0.6mL浓度为3mg/mL的金红石TiO2介观晶体悬浊液，在红外灯下烘干冷却至室温，如此反复三次，即得到CNHs/Anatase/Rutile修饰电极；将巯基苯硼酸溶液与铜纳米簇(Cu NCs)溶液反应，得到复合溶液，然后将0.6mL 的复合溶液滴涂到修饰过的电极表面，在烘箱里烘干冷却至室温；将修饰好的电极浸泡在含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中活化50min；最终，将所获得的修饰电极浸泡于18μg/mL 的脂解激活脂蛋白受体抗体溶液，在4°C下孵育50 min，随后使用pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液去除多余的脂解激活脂蛋白受体抗体Ab，再将电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，冲去表面残余液后，即得到CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极；
（3）CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极的制备：将CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极浸入不同浓度的脂解激活脂蛋白受体（LSR）标准溶液中于4°C下孵育50min，通过异性识别结合固定在电极表面的抗体；用pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极；
（4）脂解激活脂蛋白受体的检测：采用三电极体系进行测定，以CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0.1V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液中，通过光电化学工作站检测1×10-6 ng/mL–10 ng/mL之间的一系列不同浓度的脂解激活脂蛋白受体标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替脂解激活脂蛋白受体标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得；或者将反应后的电极作为光电阳极在pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液中对0.6wt%的过氧化氢溶液进行光催化电解，电解后的溶液滴入还原态亚甲基蓝修饰的比色凝胶薄膜上，通过色度分析，记录色度变化，同样可以检测脂解激活脂蛋白受体浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的金红石型TiO2介观晶体材料由下述方法制备的：0.5 g十二烷基苯磺酸钠（SDBS）溶解在25 mL 2.2 mol/mL HNO3溶液中，搅拌15分钟；然后加入0.5mL异丙醇钛（IV），在80°C下搅拌48 h；随后，所得产物经离心、用超纯水、乙醇洗涤4-5次后，在60°C下干燥过夜；上述产物在400 °C 空气中煅烧1h以去除残留的有机物，制得金红石型TiO2介观晶体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的锐钛矿型TiO2介观晶体材料由下述方法制备的：首先将1.5mL纯度为97%的钛酸四异丙酯（Ti(OCH(CH3)2)4,、3mL重量百分比浓度为99.9%的醋酸 (CH3COOH) 和3mL重量百分比浓度为99.9%乙醇(C2H5OH) 混合得到TiO2溶胶-凝胶前驱体；接着将上述混合物加入7.5mL含有0.45g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的乙醇溶液中搅拌1h得到浅黄色的溶胶-凝胶体，以2000rmp的转速旋涂到石英基片上在120°C下干燥30min;最后在500°C下煅烧1h去除残留的有机物即可得到锐钛矿型TiO2介观晶体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铜纳米簇（Cu NCs）材料由下述方法制备的：
制备前所使用的容器需在王水中浸泡，并在水中进行彻底清洗；将100 mg酵母提取物溶于8mL超纯水，并与2mL 100mM CuCl2溶液在室温下混合，搅拌2-3min；将上述混合物在100 °C下回流12h直至溶液颜色由浅蓝变为深绿色；最后将所得样品在10000rmp下离心10min取上清夜得到纯化的铜纳米簇溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述比色凝胶薄膜材料由下述方法制备的：将2g聚乙烯醇固体（PVA）、8mL甘油溶于40mL超纯水,加热搅拌使其充分溶解，蒸发浓缩至胶状；稍加冷却后依次加入0.3g柠檬酸和0.5g碳酸氢钠固体搅拌均匀并将其平铺在培养皿中，待其冷却凝固即可得到多孔的海绵状的凝胶薄膜；将薄膜裁剪成形状大小均一的片状体；将10mL浓度为0.1mol/L的抗坏血酸溶液与3mL浓度为1mmol/L的亚甲基蓝溶液混合制得还原态的无色亚甲基蓝溶液，并将凝胶薄膜浸入混合液浸泡10min得到功能化的比色凝胶薄膜。
6.一种卵巢癌肿瘤标记物的双模式免疫传感器，包括工作电极、铂丝电极为对电极和Ag/ AgCl为参比电极，其特征在于，所述的工作电极采用CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极，所述的CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极由下述方法制备而成的：1）氧化铟锡（ITO）电极的预处理：首先将ITO放入超声水浴中清洗，直至清洗干净，然后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；2）CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极的制备：将0.6mL浓度为3mg/ml 的碳纳米角悬浮液于干净的氧化铟锡（ITO）电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，然后在上述电极表面修饰依次修饰0.6mL浓度为3mg/mL的锐钛矿TiO2介观晶体和金红石TiO2介观晶体悬浊液，在红外灯下烘干冷却至室温，如此反复三次，即得到CNHs/Anatase/Rutile修饰电极；将巯基苯硼酸溶液与铜纳米簇(Cu NCs)溶液反应，得到复合溶液，然后将0.6mL 的复合溶液滴涂到修饰过的电极表面，在烘箱里烘干冷却至室温；将修饰好的电极浸泡在含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中活50min；最终，将所获得的修饰电极浸泡于18μg/mL 的脂解激活脂蛋白受体抗体溶液，在4°C下孵育50 min，随后使用pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液去除多余的脂解激活脂蛋白受体抗体Ab，再将电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，冲去表面残余液后，即得到CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极；3）CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极的制备：将CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab修饰电极浸入不同浓度的脂解激活脂蛋白受体（LSR）标准溶液中于4°C下孵育50min，通过异性识别结合固定在电极表面的抗体；用pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极。
7.权利要求6所述的一种卵巢癌肿瘤标记物的双模式免疫传感器用于脂解激活脂蛋白受体的检测方法，其特征在于，步骤如下：1）采用三电极体系进行测定，以CNHs/Anatase/Rutile/Cu NCs/Ab/Ag修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0.1V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；2）在pH=7.5浓度为0.3mol/L的 PBS溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10-6 ng/mL–10 ng/mL之间的一系列不同溶度的脂解激活脂蛋白受体标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替脂解激活脂蛋白受体标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得；或者将反应后的电极作为光电阳极在pH=7.5浓度为0.3mol/L的PBS溶液中对0.6wt%的过氧化氢溶液进行光催化电解，电解后的溶液滴入还原态亚甲基蓝修饰的比色凝胶薄膜上，通过色度分析，记录色度变化，同样可以检测脂解激活脂蛋白受体浓度。
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