CN112964875A - 一种基于多功能临床阴道拭子的人乳头瘤病毒16型e6蛋白多模式免疫分析方法 - Google Patents
一种基于多功能临床阴道拭子的人乳头瘤病毒16型e6蛋白多模式免疫分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种基于多功能临床阴道拭子的人乳头瘤病毒16型E6蛋白多模式免疫分析方法。该传感平台以棉签拭子为传感基底，设计了一种集样品采集和分析为一体的多功能临床阴道拭子。标记探针Ag@CS‑SiC与游离的目标人乳头瘤病毒16型E6蛋白病通过竞争免疫识别吸附到拭子上，并在拭子表面包裹一层柔性发光温度指示器FLTI装入微型气压装置。在808nm激光的辐射下，Ag@CS‑SiC的光热效应能引起传感界面的温度升高从而导致柔性发光温度指示器FLTI上的荧光猝灭，亦能引起气压装置内过氧化氢的分解导致气压的升高。基于上述原理可实现对人乳头瘤病毒16型E6蛋白于荧光‑光热双模式分析。
Description
技术领域
本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，具体涉及一种基于荧光和光热化学传感器的人乳头瘤病毒16型E6蛋白双模式免疫分析方法。
背景技术
宫颈癌是全球妇女中最常见的恶性肿瘤之一,占女性生殖器官恶性肿瘤的首位。宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)发展至宫颈癌需经历很长一段时间,晚期及复发转移病例预后差。近年来宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的发病率有上升趋势,尤其是年轻宫颈癌的发病率明显升高。普遍认为HPV癌蛋白(E6、E7)在宫颈癌的发生发展中起主要作用。其中高危型HPV16编码的E6蛋白与P53蛋白结合,使其失活,导致细胞增殖。因此研究出新型具有高灵敏度和特异性的人乳头瘤病毒16型E6蛋白检测分析方法对相关恶性肿瘤的早期诊断具有重大意义。
光热化学检测，是以光作为激发信号，以光辐射所产生的热量作为检测信号。通过光辐射引起基底局部温度升高引起不同形式的能量变化作为检测信号，可获得较高的灵敏度。在光热化学传感器的构建过程中，光热材料的选择对于信号的响应至关重要，目前所用的材料中，碳化硅纳米粒(SiC NCs)纳米材料因其独特的光热活性、无毒性，优异的化学和物理稳定性，使其成为光热化学传感器的理想材料。此外，经六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌(Ru(bipyridyl)3)修饰的聚乙烯醇(PVA)凝胶具有高强度荧光活性，其荧光强度随着温度升高而变化，表现出高灵敏的荧光-温度响应性能。
在本实验中，以六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌（Ru(bipyridyl)3）修饰的聚乙烯醇(PVA)凝胶作为荧光温敏材料。本发明通过将标记有碳化硅纳米粒（SiC NCs）的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原与不同浓度的人乳头瘤病毒16型E6蛋白游离抗原标准溶液竞争结合固定在基底的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原抗体。由于碳化硅纳米粒（SiC NPs）的光热效应导致凝胶基底温度显著增强，从而引起基底的荧光的猝灭，荧光强度的变化与人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原浓度在一定范围内呈线性。此外，将修饰好的基底放入密闭容器中，在808nm近红外激光的辐射下基底温度变化亦能引起密闭容器内部压力的变化，压力变化值与人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原的浓度在一定范围内也呈线性。通过气压和荧光强度的变化，可实现人乳头瘤病毒16型E6蛋白的高灵敏检测，该传感器的成功构建，为人乳头瘤病毒16型E6蛋白的无毒检测提供了平台。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于多功能临床阴道拭子的人乳头瘤病毒16型E6蛋白多模式免疫分析方法。
为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：
（1）棉签拭子的预处理：首先称取4.0 mg 的脱脂棉制成棉签拭子，用50 μL 10mg/ml 的1-羧甲基-3-丙基咪唑氯盐（中科院兰州化学物理研究所监制）浸泡润湿，在烘箱下干燥10 min;
（2）swab/Ab修饰拭子的制备：将拭子浸入加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液，两者体积比为4:1活化30 min；接着加入5 μL 100 μg/mL 的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗体 Ab 孵育40 min, 用pH 7.4 的磷酸缓冲溶液洗去未吸附的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗体Ab， 用浓度为1.0 wt.%的牛血清蛋白（BSA）溶液封闭非特异性位点即可得到swab/Ab修饰拭子；
（3）swab/Ab/Ag@CS-SiC修饰拭子的制备：将10 mg/mL 的碳化硅纳米粒SiC NPs分散于 3 mg/mL 的壳聚糖CS溶液中，在超声下分散1h 得到100 μL 3 mg/mL SiC-CS复合物；将25 μL 100 μg/mL 的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原Ag用10 μL EDC/NHS 溶液活化2h，加入上述SiC-CS复合物中常温下搅拌12h； 将上述混合物在3000 rpm/min下离心10 min,去除上清液以分离未吸附的抗原Ag, 将得到的沉淀物重新分散于100 μL pH 7.4 的磷酸缓冲溶液中即可得到SiC-CS@Ag复合探针；将步骤2）制得的swab/Ab拭子浸入不同浓度的人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准液与SiC-CS@Ag复合探针的混合溶液中于4°C下孵育60min，使SiC-CS@Ag复合探针通过与抗体的特异性识别结合到拭子表面；用pH 7 .4的磷酸缓冲溶液冲洗拭子并在室温条件下自然晾干，得到swab/Ab/Ag@CS-SiC修饰拭子；
（4）swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子的制备：将0.5g 聚乙烯醇(PVA)固体与2mL丙三醇溶解于10mL 蒸馏水中，加热搅拌20min直至得到均匀的透明水溶胶；加入200 μL 5mg/ml 的六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌溶液（上海西格玛试剂有限公司），继续加热并搅拌直至胶体呈金黄色粘液状即可获得水溶胶状的柔性发光温度指示器FLTI；用注射针筒吸取该水溶胶并注入96孔板中，每孔100μL；将步骤3）制得的swab/Ab/Ag@CS-SiC拭子浸水溶胶状入柔性发光温度指示器FLTI冷却至固态即可得到swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子；
（5）人乳头瘤病毒16型E6蛋白的检测：用808nm激光对swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子辐射1min （光功率密度5 W cm-2）, 采用电子式气压计测量1×10-6 ng/mL–1 ng/mL之间的气压变化；用808nm激光对swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子辐射1min （光功率密度5 W cm-2）,用便携式荧光光谱仪记录1×10-6 ng/mL–1 ng/mL之间荧光强度变化；通过记录808nm激光辐射前后产生的不同的气压、荧光强度变化，绘制工作曲线；用待测样品溶液代替人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。
上述碳化硅纳米粒（SiC NCs）材料的制备：
将活性炭粉末研磨成直径为1mm的颗粒，与硅胶按1:1.5的重量比混合, 在混匀器中混合2h; 将上述混合物放入管式炉在1700 °C 氩气中（流速50 L/h）煅烧1h; 接着将所收集的固体混合物在700 °C空气中继续煅烧2h以除去残留炭；并将上述固体继续用50 wt%的氢氟酸刻蚀1h以除去残留的二氧化碳硅；最后用无水乙醇洗去残留物，在60 °C下干燥12h制得碳化硅纳米粒（SiC NPS）。
本发明所述的一种基于多功能临床阴道拭子的人乳头瘤病毒16型E6蛋白多模式免疫传感器，其特征在于，所述的swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子由下述方法制备而成的：1）首先称取4.0 mg 的脱脂棉制成棉签拭子，用50 μL 10 mg/ml 的羧基离子液体（1-羧甲基-3-丙基咪唑氯盐，中科院兰州化学物理研究所监制）浸泡润湿，在烘箱下干燥10 min;2）将拭子浸入加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液，两者体积比为4:1活化30 min；接着加入5 μL 100 μg/mL 的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗体 Ab 孵育40 min, 用pH 7.4 的磷酸缓冲溶液洗去未吸附的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗体Ab， 用浓度为1.0 wt.%的牛血清蛋白（BSA）溶液封闭非特异性位点即可得到swab/Ab修饰拭子；将10 mg/mL 的碳化硅纳米粒SiC NPs分散于 3 mg/mL 的壳聚糖CS溶液中，在超声下分散1h 得到100 μL 3 mg/mL SiC-CS复合物；将25 μL 100 μg/mL 的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原Ag用10 μL EDC/NHS 溶液活化2h，加入上述SiC-CS复合物中常温下搅拌12h； 将上述混合物在3000 rpm/min下离心10 min,去除上清液以分离未吸附的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原Ag, 将得到的沉淀物重新分散于100 μL pH 7.4 的磷酸缓冲溶液中即可得到SiC-CS@Ag复合探针；将步骤2）制得swab/Ab拭子浸入不同浓度的人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准液与SiC-CS@Ag复合探针的混合溶液中于4°C下孵育60min，使SiC-CS@Ag复合探针通过与抗体的特异性识别结合到拭子表面；用pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗拭子并在室温条件下自然晾干，得到swab/Ab/Ag@CS-SiC修饰拭子；接着将0.5g 聚乙烯醇PVA固体与2mL丙三醇溶解于10mL 蒸馏水中，加热搅拌20min直至得到均匀的透明水溶胶；加入200 μL 5 mg/ml 的六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌溶液，继续加热并搅拌直至胶体呈金黄色粘液状即可获得水溶胶状的柔性发光温度指示器FLTI；用注射针筒吸取该水溶胶并注入96孔板中，每孔100μL；将步骤3）制得的swab/Ab/Ag@CS-SiC修饰拭子浸水溶胶状入柔性发光温度指示器FLTI冷却至固态即可得到swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子；
本发明所述的一种基于多功能临床阴道拭子的人乳头瘤病毒16型E6蛋白多模式免疫分析方法，其特征在于，步骤如下： 1）将swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子放入体积为2mL的密闭容器中用808nm激光对swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子进行辐射；2) 人乳头瘤病毒16型E6蛋白的测量：用808nm激光对权利要求3所述的swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子辐射1min （光功率密度5 W cm-2）, 采用电子式气压计测量1×10-6 ng/mL–1 ng/mL之间的气压变化；用808nm激光对权利要求3所述的swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子辐射1min （光功率密度5 W cm-2）,用便携式荧光光谱仪记录1×10-6 ng/mL–1 ng/mL之间荧光强度变化；通过记录808nm激光辐射前后产生的不同的气压、荧光强度变化，绘制工作曲线；用待测样品溶液代替人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。
本发明的显著优点为：
(1)碳化硅纳米粒(SiC NCs)的光热效应引起基底温度升高，而温度的升高能导致容器内部气压的变化，为人乳头瘤病毒16型E6蛋白的超灵敏检测提供了平台。
(2)六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌(Ru(bipyridyl)3)作为一种高荧光活性物质在紫外光的激发下能产生高强度的荧光，而其荧光强度对外界温度变化具有高灵敏响应可将其改性制成柔性发光温度指示器FLTI。
(3)将具有光热活性和过氧化氢酶活性的SiC-CS复合物作为探针作为识别端激发swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子的上的荧光猝灭，反应容器内过氧化氢的分解即可实现对人乳头瘤病毒16型E6蛋白的荧光-压力双模式检测。
附图说明
图1为本发明所述的人乳头瘤病毒16型E6蛋白荧光-光热化学传感器制备过程示意图。
图2A为用不同浓人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准溶液（1×10-6 ng/mL–0.1 ng/mL）修饰的swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子被近红外激光辐射后的荧光强度变化图。
图2 B为传感基底的荧光流响应与人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准溶液浓度的线性关系图。
图3A为荧光强度变化值与人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准溶液浓度的线性关系。
图3B为气压变化值与人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准溶液浓度的线性关系。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
一种基于多功能临床阴道拭子的人乳头瘤病毒16型E6蛋白多模式免疫分析方法(如图1所示)：
1）棉签拭子的预处理：首先称取4.0 mg 的脱脂棉制成棉签拭子，用50 μL 10 mg/ml 的羧基离子液体（1-羧甲基-3-丙基咪唑氯盐，中科院兰州化学物理研究所监制）浸泡润湿，在烘箱下干燥10 min，获得棉签拭子;
2）将棉签拭子浸入加入有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液，两者体积比为4:1活化30 min；接着加入5 μL 100 μg/mL 的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗体 Ab（北京博奥森生物技术有限公司）孵育40 min, 用pH 7.4的磷酸缓冲溶液洗去未吸附的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗体Ab ， 用浓度为1.0 wt.%的牛血清蛋白（BSA）溶液封闭非特异性位点即可得到swab/Ab修饰拭子；
3）将10 mg/mL 的碳化硅纳米粒SiC NPs分散于 3 mg/mL 的壳聚糖CS溶液中，在超声下分散1h 得到100 μL 3 mg/mL SiC-CS复合物；将25 μL 100 μg/mL 的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原Ag（北京博奥森生物技术有限公司）人乳头瘤病毒16型E6蛋白用10 μL体积比为4:1的EDC/NHS 溶液活化2h，加入上述SiC-CS复合物中常温下搅拌12h； 将上述混合物在3000 rpm/min下离心10 min,去除上清液以分离未吸附的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原Ag, 将得到的沉淀物重新分散于100 μL pH 7.4 的磷酸缓冲溶液中即可得到SiC-CS@Ag复合探针；将步骤2）制得的swab/Ab修饰拭子浸入不同浓度的人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准液与SiC-CS@Ag复合探针的混合溶液中于4°C下孵育60min，使SiC-CS@Ag复合探针通过与抗体的特异性识别结合到swab/Ab修饰拭子表面；用pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗swab/Ab修饰拭子并在室温条件下自然晾干，得到swab/Ab/Ag@CS-SiC修饰拭子；
4）将0.5g 聚乙烯醇PVA固体与2mL丙三醇溶解于10mL 蒸馏水中，加热搅拌20min直至得到均匀的透明水溶胶；加入200 μL 5 mg/ml 的六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌溶液（上海西格玛试剂有限公司），继续加热并搅拌直至胶体呈金黄色粘液状即可获得水溶胶状的柔性发光温度指示器FLTI；用注射针筒吸取该水溶胶状的柔性发光温度指示器FLTI并注入96孔板中，每孔100μL；将步骤3）制得的swab/Ab/Ag@CS-SiC修饰拭子浸入水溶胶状的柔性发光温度指示器FLTI冷却至固态即可得到swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子；
上述碳化硅纳米粒（SiC NCs）材料的制备：
将活性炭粉末研磨成直径为1mm的颗粒，与硅胶按1:1.5的重量比混合, 在混匀器中混合2h; 将上述混合物放入管式炉在1700 °C 氩气中（流速50 L/h）煅烧1h; 接着将所收集的固体混合物在700 °C空气中继续煅烧2h以除去残留炭；并将上述固体继续用50 wt%的氢氟酸刻蚀1h以除去残留的二氧化碳硅；最后用无水乙醇洗去残留物，在60 °C下干燥12h制得碳化硅纳米粒（SiC NPS）。
实施例2
一种基于多功能临床阴道拭子的人乳头瘤病毒16型E6蛋白多模式免疫分析方法，步骤如下：
(1)采用电子式气压计和便携式荧光光谱仪进行测定，以实施例1制得的swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI拭子为基底，利用808nm近红外光进行辐射，设置光功率密度为5 W cm-2；
(2)用808nm激光对swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI拭子辐射1min （光功率密度5 W cm-2）, 采用电子式气压计测量1×10-6 ng/mL–1 ng/mL之间的气压变化；用808nm激光对swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI拭子辐射1min （光功率密度5 W cm-2）,用便携式荧光光谱仪记录1×10-6 ng/mL–1 ng/mL之间荧光强度变化；通过记录808nm激光辐射前后产生的不同的气压、荧光强度变化，绘制工作曲线；
用待测样品溶液代替人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。
Claims (4)
1.一种基于多功能临床阴道拭子的人乳头瘤病毒16型E6蛋白人乳头瘤病毒16型E6蛋白多模式免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
棉签拭子的预处理：首先称取4.0 mg 的脱脂棉制成棉签，用50 μL浓度为10 mg/ml 的1-羧甲基-3-丙基咪唑氯盐浸泡润湿，在烘箱下干燥10 min，获得棉签拭子;
swab/Ab修饰拭子的制备：将棉签拭子浸入加入有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液，两者体积比为4:1、活化30 min；接着加入5 μL 浓度为100 μg/mL 的人乳头瘤病毒16型E6蛋白人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗体Ab孵育40 min, 用pH 7.4 的磷酸缓冲溶液洗去未吸附的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗体Ab， 用浓度为1.0 wt.%的牛血清蛋白BSA溶液封闭非特异性位点即得到swab/Ab修饰拭子；
swab/Ab/Ag@CS-SiC修饰拭子的制备：将10 mg/mL 的碳化硅纳米粒SiC NPs分散于 3mg/mL 的壳聚糖CS溶液中，在超声下分散1h 得到100 μL浓度为3 mg/mL SiC-CS复合物；将25 μL 100 μg/mL 的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原Ag用10 μL 体积比为4:1的EDC/NHS 溶液活化2h，加入上述SiC-CS复合物中常温下搅拌12h，获得混合物；将上述混合物在3000rpm/min下离心10 min,去除上清液以分离未吸附的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原Ag, 将得到的沉淀物重新分散于100 μL pH 7.4 的磷酸缓冲溶液中即得到SiC-CS@Ag复合探针；将步骤（2）制得的swab/Ab修饰拭子浸入不同浓度的人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准液与SiC-CS@Ag复合探针的混合溶液中于4°C下孵育60min，使SiC-CS@Ag复合探针通过与抗体的特异性识别结合到swab/Ab修饰拭子表面；用pH 7 .4的磷酸缓冲溶液冲洗swab/Ab修饰拭子并在室温条件下自然晾干，得到swab/Ab/Ag@CS-SiC修饰拭子；
swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子的制备：将0.5g 聚乙烯醇(PVA)固体与2mL丙三醇溶解于10mL 蒸馏水中，加热搅拌20min直至得到均匀的透明水溶胶；加入200 μL浓度为 5mg/ml 的六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌溶液，继续加热并搅拌直至胶体呈金黄色粘液状即获得水溶胶状的柔性发光温度指示器FLTI；用注射针筒吸取该水溶胶状的柔性发光温度指示器FLTI并注入96孔板中，每孔100μL；将步骤（3）制得的swab/Ab/Ag@CS-SiC修饰拭子浸入水溶胶状的柔性发光温度指示器FLTI中冷却至固态即得到swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子；
人乳头瘤病毒16型E6蛋白的检测：用808nm激光对swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子在光功率密度5 W cm-2下辐射1min , 采用电子式气压计测量1×10-6 ng/mL–1 ng/mL之间的气压变化；用808nm激光对swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子在光功率密度5 W cm-2下辐射1min ,用便携式荧光光谱仪记录1×10-6 ng/mL–1 ng/mL之间荧光强度变化；通过记录808nm激光辐射前后产生的不同的气压、荧光强度变化，绘制工作曲线；用待测样品溶液代替人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碳化硅纳米粒SiC NCS材料由下述方法制备：将活性炭粉末研磨成直径为1mm的颗粒，与硅胶按1:1.5的重量比混合, 在混匀器中混合2h，获得混合物; 将上述混合物放入管式炉在1700 °C 流速50 L/h氩气中煅烧1h，获得固体混合物；接着将所收集的固体混合物在700 °C空气中继续煅烧2h以除去残留炭；并将上述固体继续用50 wt %的氢氟酸刻蚀1h以除去残留的二氧化碳硅；最后用无水乙醇洗去残留物，在60 °C下干燥12h制得碳化硅纳米粒SiC NCS。
3.一种基于多功能临床阴道拭子的人乳头瘤病毒16型E6蛋白多模式免疫传感器，其特征在于，所述的swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子由下述方法制备而成的：1）棉签拭子的预处理：首先称取4.0 mg 的脱脂棉制成棉签拭子，用50 μL浓度为 10 mg/ml 的1-羧甲基-3-丙基咪唑氯盐浸泡润湿，在烘箱下干燥10 min，获得棉签拭子; 2）将棉签拭子浸入加入有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液，两者体积比为4:1活化30 min；接着加入5 μL浓度为100 μg/mL 的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗体Ab Ag 孵育40 min, 用pH 7.4 的磷酸缓冲溶液洗去未吸附的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗体Ab，用浓度为1.0 wt.%的牛血清蛋白BSA溶液封闭非特异性位点即得到swab/Ab修饰拭子；3）将10 mg/mL 的碳化硅纳米粒SiC NPs分散于 3 mg/mL 的壳聚糖CS溶液中，在超声下分散1h 得到100 μL 3 mg/mL SiC-CS复合物；将25 μL 浓度为100 μg/mL 的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原Ag用10 μL体积比为4:1的EDC/NHS 溶液活化2h，加入上述SiC-CS复合物中常温下搅拌12h，获得混合物； 将上述混合物在3000 rpm/min下离心10 min,去除上清液以分离未吸附的人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原Ag, 将得到的沉淀物重新分散于100 μL pH 7.4 的磷酸缓冲溶液中即可得到SiC-CS@Ag复合探针；将步骤2）制得swab/Ab修饰拭子浸入不同浓度的人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准液与SiC-CS@Ag复合探针的混合溶液中于4°C下孵育60min，使SiC-CS@Ag复合探针通过与抗体的特异性识别结合到swab/Ab修饰拭子表面；用pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗swab/Ab修饰拭子并在室温条件下自然晾干，得到swab/Ab/Ag@CS-SiC修饰拭子；4）接着将0.5g 聚乙烯醇(PVA)固体与2mL丙三醇溶解于10mL 蒸馏水中，加热搅拌20min直至得到均匀的透明水溶胶；加入200μL 浓度为5 mg/ml 的六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌溶液，继续加热并搅拌直至胶体呈金黄色粘液状即获得水溶胶状的柔性发光温度指示器FLTI；用注射针筒吸取该水溶胶状的柔性发光温度指示器FLTI并注入96孔板中，每孔100μL；将步骤3）制得的swab/Ab/Ag@CS-SiC拭子浸入水溶胶状的柔性发光温度指示器FLTI中冷却至固态即得到swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子。
4.一种基于多功能临床阴道拭子的人乳头瘤病毒16型E6蛋白多模式免疫分析方法，其特征在于，步骤如下： 1）将权利要求3所述的swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子放入体积为2mL的密闭容器中，用808nm激光对swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子进行辐射；2) 人乳头瘤病毒16型E6蛋白的测量：用808nm激光所述的swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子辐射1min，光功率密度5 W cm-2, 采用电子式气压计测量1×10-6 ng/mL–1 ng/mL之间的气压变化；用808nm激光对所述的swab/Ab/Ag@CS-SiC/FLTI修饰拭子辐射1min，光功率密度5 Wcm-2,采用便携式荧光光谱仪记录1×10-6 ng/mL–1 ng/mL之间荧光强度变化；通过记录808nm激光辐射前后产生的不同的气压、荧光强度变化，绘制工作曲线；用待测样品溶液代替人乳头瘤病毒16型E6蛋白标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。
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