CN104764737B

CN104764737B - 一种基于绿光辐射量子点的单色ecl免疫检测方法

Info

Publication number: CN104764737B
Application number: CN201510163940.7A
Authority: CN
Inventors: 邹桂征; 张新
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2015-04-08
Filing date: 2015-04-08
Publication date: 2018-04-27
Anticipated expiration: 2035-04-08
Also published as: CN104764737A

Abstract

本发明公开了一种基于绿光辐射量子点的单色ECL免疫检测方法，主要包括(1)CdSe量子点标记二抗(CdSe QDs‑Ab₂)的制备，(2)以CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的制备和(3)绘制工作曲线，进行单色ECL免疫检测三个步骤。本发明方法检测的灵敏度高，检测限达到0.1fg/mL，可以实现对抗原的单分子检测；选择性高。本发明构建的电化学发光免疫传感器是基于抗原和抗体之间的特异性识别和结合构建的，因此待测液中的干扰蛋白并不能与抗原第一抗体和第二抗体结合，对本发明检测体系无干扰。

Description

一种基于绿光辐射量子点的单色ECL免疫检测方法

技术领域

本发明涉及一种电致化学发光(electrogenerated chemiluminescence,ECL)免疫检测方法，尤其涉及一种以能在绿光区域产生单色电致化学发光辐射的表面高度钝化CdSe量子点为标记物的免疫检测方法。

背景技术

目前绝大多数ECL试剂盒和临床诊断技术多采用Ru(bpy)₃ ²⁺作为ECL标记物。鉴于Ru(bpy)₃ ²⁺体系的ECL辐射光谱较宽，且位于红光区域，在非红光区域开发高效的单色ECL体系对于ECL分析的基础和应用研究都具有十分重要的价值。

量子点作为一类新型的ECL发光体，其独特的光电性质为非红光区域ECL体系的开发提供了可能。Liang等人采用近红外CdTe量子点开发了一种近红外的ECL免疫检测方法，并通过夹心免疫反应制得ECL免疫传感器检测甲胎蛋白(参见：Anal.Chem.2012，84，10645-10649)。中国专利文件CN103048314A(申请号：201210439347.7)公开了一种负载量子点包被纳米金介孔材料构建的电化学发光免疫传感器及对HIV的检测方法，基于负载量子点包被纳米金介孔材料构建的电致化学发光免疫传感器，实现对HIV抗体检测的夹心免疫分析方法；所述的电致化学发光免疫传感器是通过负载量子点并且包被纳米金的介孔材料作为信号标签，通过生物免疫的方法形成免疫复合物，修饰到电极表面，构成电致化学发光免疫传感器。

上述以量子点为标记物的ECL免疫检测方法虽然具有较高的灵敏度和准确性，但采用的量子点大都是ECL辐射在700nm附近的近红外量子点，仍属红光区域，检测范围仍然无法延伸至绿光区域。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明以CdSe量子点为标记物，提供了一种能在绿光区域产生单色辐射的ECL免疫检测方法，所构建的ECL检测方法具有ECL辐射强、光谱单色性好、灵敏度高、选择性好的特点。

术语说明：

巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点：可根据中国专利文件CN102766463A描述的方法得到。

抗原(Ag)：本发明所述的抗原指：甲胎蛋白抗原，癌胚抗原，糖类抗原125，糖类抗原15-3，糖类抗原72-4，糖类抗原19-9，前列腺特异性抗原，游离前列腺特异抗原，爱滋病抗原，乙肝表面抗原，乙肝e抗原，甲状腺球蛋白，肌钙蛋白T抗原，肌红蛋白抗原等常规的抗原。

一抗(Ab₁)：本发明所述的一抗指：对上述抗原对应产生的抗体，本发明对于上述抗原对应的单克隆抗体效果更好。

二抗(Ab₂)：本发明所述的二抗指：对上述抗原和一抗对应产生的二抗。

处理过的病人血清样品：指按照医学领域通用的血清处理标准处理后的病人血清样品。

本发明的技术方案如下：

一种基于绿光辐射量子点的单色ECL免疫检测方法，包括步骤如下：

(1)CdSe量子点标记二抗(CdSe QDs-Ab₂)的制备

向巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液中加入含有1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的缓冲溶液进行活化，离心纯化并分散在磷酸盐缓冲溶液中；然后加入二抗和小牛血清白蛋白，室温孵育1-2h后离心纯化，所得沉淀物分散在磷酸盐(PBS)缓冲溶液中，得CdSe量子点标记的二抗(CdSe QDs-Ab₂)；

(2)以CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的制备

a、将玻碳电极抛光处理后，置于含对氨基苯甲酸(ABA)的磷酸盐缓冲溶液中，在0.4～1.2V的电位范围内进行循环伏安扫描，制得对氨基苯甲酸(ABA)修饰的玻碳电极，再用含有1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的缓冲溶液进行活化，得修饰并活化后的玻碳电极；

b、向修饰并活化后的玻碳电极表面滴加含一抗(Ab₁)的缓冲溶液，室温下孵育1-4h后用pH 7.4的磷酸盐(PBS)缓冲溶液清洗，再用小牛血清蛋白(BSA)封闭未反应的活性位点并用磷酸盐(PBS)缓冲溶液清洗；

c、将抗原(Ag)滴加到步骤b处理后的电极表面，室温下孵育1-4h，清洗电极；再将CdSe量子点标记的二抗(CdSe QDs-Ab₂)滴加到步骤b处理后的电极表面，室温下孵育1-4h，清洗电极；制得以CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器；

(3)绘制工作曲线，进行单色ECL免疫检测

i、以步骤(2)制得的CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器为工作电极，铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含0.01-0.1mol/L过硫酸铵的磷酸盐(PBS)缓冲溶液中，采用循环伏安法对一系列标准浓度的抗原溶液进行ECL测试，绘制工作曲线；

ii、将待测样品溶液按照步骤i中的方法进行ECL测试，根据所得电化学发光的光信号强度对应工作曲线，得到待测样品溶液中抗原的浓度。

根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的荧光辐射范围为540nm-560nm，更优选550nm；

优选的，所述的小牛血清白蛋白的体积分数为1-5％。

根据本发明，优选的，步骤(2)的b中，所述的小牛血清白蛋白的体积分数为1-3％；

优选的，步骤(2)的c中，所述的抗原为甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、糖类抗原125、糖类抗原15-3、糖类抗原72-4、糖类抗原19-9、前列腺特异性抗原、游离前列腺特异抗原、爱滋病抗原、乙肝表面抗原、乙肝e抗原、甲状腺球蛋白、肌钙蛋白T抗原或肌红蛋白抗原。

根据本发明，优选的，步骤(1)、(2)、(3)中所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris～HCl缓冲溶液或B～R缓冲溶液中的一种；所述的磷酸盐缓冲溶液为K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液。

根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液按如下方法制备得到：

室温下，搅拌条件下，向0.1-0.3mol/L CdCl₂溶液中依次加入六偏磷酸钠(HMP)和巯基丙酸(MPA)，用NaOH调节溶液pH至8.0，加入Na₂SeO₃，加热回流5-15min后，加入N₂H₄·H₂O，加热回流反应8-12h，即得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液；

制备过程中Cd：MPA：HMP：Se：N₂H₄·H₂O的摩尔比为1：(0.05-0.2)：(0.3-0.7)：(2-3)：400。

本发明的原理：

本发明采用巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的荧光辐射在540nm-560nm的CdSe量子点为标记物，该量子点表面被高度钝化，ECL光谱与其PL光谱的峰位置一致，且单色性良好。该量子点与生物分子反应后，其ECL光谱与其荧光光谱峰位置不变，且对其ECL发光强度影响较小。

本发明采用的CdSe量子点表面带有羧基，采用1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化量子点表面的羧基后，与二抗的氨基反应，将量子点标记到二抗上，采用小牛血清蛋白(BSA)对量子点表面未反应的活性位点进行封闭。

本发明通过电聚合的方法使玻碳电极(GCE)与对氨基苯甲酸(ABA)形成碳氮键将ABA修饰在GCE上，得到表面具有羧基修饰的玻碳电极，与一抗中氨基反应得到表面有一抗修饰的玻碳电极，通过抗原抗体的特异性结合将抗原和量子点修饰的二抗修饰到电极表面。

本发明采用过硫酸铵为ECL的共反应剂，其发光过程如下：

R+e→R^—·

S₂O₈ ^2-+e→SO₄ ^—·+SO₄ ^2—

SO₄ ^—·+R^—·→R^*+SO₄ ^2—

R^*→R+hv

本发明的原理图如图16所示。

本发明的有益效果：

1、本发明方法检测的灵敏度高，检测限达到0.1fg/mL，可以实现对抗原的单分子检测。

2、本发明方法的选择性高。本发明构建的电化学发光免疫传感器是基于抗原和抗体之间的特异性识别和结合构建的，因此待测液中的干扰蛋白并不能与抗原第一抗体和第二抗体结合，对本发明检测体系无干扰。

3、本发明方法操作简单，重复性好。本发明所构建的ECL免疫检测方法是在绿光区域(可见光区域)具有ECL辐射强、光谱单色性好、灵敏度高、选择性好的特点，其发光体CdSe量子点在基底电极上的固定化不会对ECL强度产生猝灭，对临床早期诊断癌症具有重要的科学意义和应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例中所制得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的荧光光谱图和紫外-可见吸收光谱图。

图2为本发明实施例中所制得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的ECL光谱图。

图3为本发明实施例1步骤(1)中CdSe量子点标记二抗后的荧光光谱图和紫外-可见吸收光谱图。

图4为本发明实施例1步骤(1)中CdSe量子点标记二抗后的ECL光谱图。

图5为本发明实施例1步骤(2)中制得的癌胚抗原浓度为0.1fg/mL的CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的电化学发光图。

图6为本发明实施例1步骤(2)中制得的癌胚抗原浓度为0.5fg/mL的CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的电化学发光图。

图7为本发明实施例1步骤(2)中制得的癌胚抗原浓度为1.0fg/mL的CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的电化学发光图。

图8为本发明实施例1步骤(2)中制得的癌胚抗原浓度为10fg/mL的CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的电化学发光图。

图9为本发明实施例1步骤(2)中制得的癌胚抗原浓度为0.1pg/mL的CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的电化学发光图。

图10为本发明实施例1步骤(2)中制得的癌胚抗原浓度为1.0pg/mL的CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的电化学发光图。

图11为本发明实施例1步骤(2)中制得的癌胚抗原浓度为5.0pg/mL的CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的电化学发光图。

图12为本发明实施例1步骤(2)中制得的癌胚抗原浓度为10pg/mL的CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的电化学发光图。

图13为本发明实施例1步骤(2)中制得的癌胚抗原浓度为1.0fg/mL CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的ECL谱图。

图14为本发明实施例1步骤(3)绘制的工作曲线。

图15为本发明实施例1玻碳电极a、b、c、d、e的电化学图。

图16为本发明单色ECL免疫检测的原理图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例中所用的原料均为常规原料，所用设备均为常规设备，市购产品。

其中：紫外-可见吸收光谱由北京普析通用仪器有限公司生产的TU-1901双光束紫外可见分光光度计采集，荧光光谱由天津港东科技发展股份有限公司生产的F-320荧光分光光度计采集。实施例中所采用的癌胚抗原单克隆抗体、抗原及二抗均购自北京博奥森生物科技有限公司。实施例中的ECL传感测试均由西安瑞迈分析仪器有限公司生产的MPI-A型多功能化学发光分析仪完成，光电倍增管高压为600V，放大级数为2。ECL光谱测试采用将CHI822C型电化学分析仪与PG-2000Pro光谱仪联用的方式实现，电势窗口为0～-1.6V，扫描速度为20mV/s。

实施例中所用的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液(K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液)，pH 7.4，0.01mol/L。

实施例中所用的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点，根据中国专利文件CN102766463A描述的方法得到。具体方法如下：

室温下，向0.2mol/L CdCl₂溶液中依次加入六偏磷酸钠(HMP)和巯基丙酸(MPA)，加入过程在磁力搅拌条件下进行。用NaOH调节溶液pH至8.0，加入Na₂SeO₃，100℃下加热回流10min后，加入3.67mL N₂H₄·H₂O，回流10h，得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点溶液。将CdSe量子点溶液离心纯化，于4℃冰箱中储存备用。制备过程中Cd：MPA：HMP：Se：N₂H₄·H₂O的摩尔比为1：0.10：0.50：2.5：400。

图1为制得的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的荧光光谱图和紫外-可见吸收光谱图。如图1所示，所得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的最大荧光发射波长为544nm，半峰宽为38.8nm。

将40μL纯化后的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点滴加到玻碳电极表面，待电极表面自然晾干后将此电极作为工作电极，铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含0.1mol/L过硫酸铵的磷酸盐缓冲溶液中，采用循环伏安法进行ECL测试；电位范围0～-1.6V、扫速0.02V/s。其ECL光谱图如图2所示，由图2可知，最大ECL发射波长为553nm，半峰宽为28nm。

实施例1、

(1)CdSe量子点标记二抗的制备

向500μL巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液中加入20μL含100mg/mL 1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)的磷酸盐缓冲溶液和20μL含100mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液，室温下反应30min；12000rpm离心纯化后，取沉淀物加500μL磷酸盐缓冲溶液超声分散，再加入50μL 1.0μg/mL的二抗，室温下振荡2h；再加入20μL1％体积浓度的小牛血清白蛋白，室温孵育1h，12000rpm离心纯化后，取沉淀物加500μL磷酸盐缓冲溶液超声分散，得CdSe量子点标记的二抗，于4℃冰箱中储存备用；

CdSe量子点标记二抗后的荧光光谱图和紫外-可见吸收光谱图如图3所示，由图3可知，标记二抗后的CdSe量子点最大荧光发射波长为552nm，半峰宽为36nm；CdSe量子点标记二抗后的ECL光谱图如图4所示，由图4可知，最大ECL发射波长为553nm，半峰宽为28nm；对比图2、4可知，CdSe量子点标记二抗后，其电化学发光性能没有受到影响；

(2)以CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的制备

a、将直径为5mm的玻碳电极用0.3μm的三氧化二铝抛光处理，超纯水冲洗干净后，置于含1mmol/L对氨基苯甲酸的磷酸盐缓冲溶液中，在0.4～1.2V的电位范围内进行循环伏安扫描，扫速为10mV/s，扫描段为4，制得对氨基苯甲酸修饰的玻碳电极，将上述所得的电极用无水乙醇和超纯水依次冲洗干净后，在电极上滴加含有100mg/mL的1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液各10μL，室温下反应30min，将所得电极用磷酸盐缓冲溶液冲洗干净，得修饰并活化后的玻碳电极；

b、向修饰并活化后的玻碳电极表面滴加含一抗的磷酸盐缓冲溶液，室温下孵育1h后用磷酸盐缓冲溶液清洗，再用20μL 1％体积浓度的小牛血清白蛋白封闭未反应的活性位点并用磷酸盐缓冲溶液清洗；

c、将20μL含有不同浓度(0.1fg/mL、0.5fg/mL、1.0fg/mL、10fg/mL、0.1pg/mL、1.0pg/mL、5.0pg/mL、10pg/mL)癌胚抗原的磷酸盐缓冲溶液滴加到步骤b处理后的电极表面，室温下孵育1.5h，清洗电极；再将CdSe量子点标记的二抗滴加到步骤b处理后的电极表面，室温下孵育1.5h，清洗电极；制得以CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器；

不同癌胚抗原浓度的以CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的电化学发光图如图5-12所示；

癌胚抗原浓度为1.0fg/mL CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的ECL谱图如图13所示，由图13可知，最大ECL发射波长为551nm，半峰宽为35nm；对比图2、4、13可知，接上癌胚抗原后的CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器电化学发光性能没有受到影响；

(3)绘制工作曲线，进行单色ECL免疫检测

i、以步骤(2)制得的CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器为工作电极，铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含0.1mol/L过硫酸铵的磷酸盐缓冲溶液中，采用循环伏安法进行ECL测试；根据图5-12得到的电化学发光强度和癌胚抗原浓度的关系绘制发光强度和癌胚抗原浓度之间的工作曲线，如图14所示；

由图14可知，以CdSe量子点为标记物的ECL免疫传感器对癌胚抗原的检测线性范围为0.1fg/mL～10pg/mL，检出限为0.1fg/mL。本发明对于癌胚抗原的检测具有较高的灵敏度和精确性。

本实施例中，步骤(2)a中三氧化二铝抛光处理后的玻碳电极记为a，对氨基苯甲酸修饰的玻碳电极记为b；

步骤(2)b中滴加含一抗的磷酸盐缓冲溶液并活化的玻碳电极记为c；

步骤(2)c中滴加癌胚抗原的磷酸盐缓冲溶液并活化的玻碳电极记为d，滴加CdSe量子点标记的二抗并活化的玻碳电极记为e。

测试玻碳电极a、b、c、d、e的电化学图，如图15所示，由图15可知对氨基苯甲酸、一抗、癌胚抗原和CdSe量子点标记的二抗都已成功的接到玻碳电极表面。

实施例2-14、

一种基于绿光辐射量子点的单色ECL免疫检测方法，步骤同实施例1，不同的是：

步骤(2)c中将癌胚抗原分别用甲胎蛋白抗原、糖类抗原125、糖类抗原15-3、糖类抗原72-4、糖类抗原19-9、前列腺特异性抗原、游离前列腺特异抗原、爱滋病抗原、乙肝表面抗原、乙肝e抗原、甲状腺球蛋白、肌钙蛋白T抗原或肌红蛋白抗原代替。

实施例15、

一种基于绿光辐射量子点的单色ECL免疫检测方法，步骤同实施例1，不同的是所用的小牛血清白蛋白的体积分数均为2％。

Claims

1.一种基于绿光辐射量子点的单色ECL免疫检测方法，包括步骤如下：

（1）CdSe量子点标记二抗（CdSe QDs- Ab₂）的制备

向巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液中加入含有1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的缓冲溶液进行活化，离心纯化并分散在磷酸盐缓冲溶液中；然后加入二抗和小牛血清白蛋白，室温孵育1-2 h后离心纯化，所得沉淀物分散在磷酸盐（PBS）缓冲溶液中，得CdSe量子点标记的二抗（CdSe QDs- Ab₂）；

所述的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的荧光辐射范围为540nm-560nm；

所述的小牛血清白蛋白的体积分数为1-5%；

（2）以CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的制备

a、将玻碳电极抛光处理后，置于含对氨基苯甲酸（ABA）的磷酸盐缓冲溶液中，在0.4～1.2 V的电位范围内进行循环伏安扫描，制得对氨基苯甲酸（ABA）修饰的玻碳电极，再用含有1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的缓冲溶液进行活化，得修饰并活化后的玻碳电极；

b、向修饰并活化后的玻碳电极表面滴加含一抗（Ab₁）的缓冲溶液，室温下孵育1-4 h后用pH 7.4的磷酸盐（PBS）缓冲溶液清洗，再用小牛血清蛋白（BSA）封闭未反应的活性位点并用磷酸盐（PBS）缓冲溶液清洗；所述的小牛血清白蛋白的体积分数为1-3%；

c、将抗原（Ag）滴加到步骤b处理后的电极表面，室温下孵育1-4 h，清洗电极；再将CdSe量子点标记的二抗（CdSe QDs- Ab₂）滴加到上述电极表面，室温下孵育1-4 h，清洗电极；制得以CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器；

（3）绘制工作曲线，进行单色ECL免疫检测

i、以步骤（2）制得的CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器为工作电极，铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含0.01-0.1 mol/L过硫酸铵的磷酸盐（PBS）缓冲溶液中，采用循环伏安法对一系列标准浓度的抗原溶液进行ECL测试，绘制工作曲线；

2.根据权利要求1所述的单色ECL免疫检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的荧光辐射范围为550nm。

3.根据权利要求1所述的单色ECL免疫检测方法，其特征在于，步骤（2）的c中，所述的抗原为甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、糖类抗原 125、糖类抗原15-3、糖类抗原 72-4、糖类抗原19-9、前列腺特异性抗原、游离前列腺特异抗原、爱滋病抗原、乙肝表面抗原、乙肝 e 抗原、甲状腺球蛋白、肌钙蛋白 T 抗原或肌红蛋白抗原。

4.根据权利要求1所述的单色ECL免疫检测方法，其特征在于，步骤（1）、（2）、（3）中所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或Tris~HCl 缓冲溶液；所述的磷酸盐缓冲溶液为K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液。

5.根据权利要求1所述的单色ECL免疫检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液按如下方法制备得到：

室温下，搅拌条件下，向0.1-0.3 mol/L CdCl₂溶液中依次加入六偏磷酸钠（HMP）和巯基丙酸（MPA），用NaOH调节溶液pH至8.0，加入Na₂SeO₃，加热回流5-15 min后，加入N₂H₄•H₂O，加热回流反应8-12 h，即得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液；

制备过程中Cd：MPA：HMP：Se：N₂H₄•H₂O的摩尔比为1：（0.05-0.2）：（0.3-0.7）：（2-3）：400。