CN114371204A - 以纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析技术方法领域，涉及一种以纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光传感器。该传感器采用蛋氨酸包被的n型纳米金簇作为发光试剂和标记物，采用在电极表面实施夹心免疫反应的方式，将目标抗原与纳米金簇标记的二抗依次枝接并固定到工作电极上。传感器采用在无共反应剂条件下直接电氧化标记物的方式，向n型纳米金簇注入外源性空穴，利用外源性空穴与n型纳米金簇内自由电子之间的复合反应产生单波段近红外辐射，实施电化学发光免疫传感。本发明的免共反应剂型电化学发光免疫传感基于单波段近红外电化学发光辐射实施，不同于现有商业化电化学发光生化分析所采用的共反应剂型发光体系及其可见光波段辐射。
Description
技术领域
本发明属于分析技术方法领域，涉及一种以纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光传感器。
背景技术
电化学发光(ECL)是一种兼具化学发光和电化学发光的技术，由于响应快，灵敏度高，成本低，易于控制，因此在生物分析、环境监测和临床诊断中引起了广泛关注。在ECL检测中，对目标的高灵敏度检测不仅取决于发光体的高发光效率，还取决于有效的信号切换模式。
共反应剂型电化学发光能够依靠单向阳极或单向阴极电化学驱动的方式实现ECL，而且辐射效率高、强度大，是目前最常见的电化学发光应用模式，高浓度共反应剂(大部分为烷氨基)既是获得高强度电化学发光的先决条件，又是电化学发光技术进一步推广应用的限制条件；免共反应剂型电化学发光体系与相关技术研发具有重要价值和广阔应用前景。
现阶段，学术界通常采用将共反应剂与电化学发光物共价键偶联或共反应剂内嵌于发光物载体的方式实现无外加共反应剂的电化学发光效果。例如鞠熀先等采用将共反应剂三乙胺与发光物聚合物量子点共价偶联的方式，缩短电子转移路程和减少自由基中间体的传输距离，实现了无外加共反应剂型电化学发光的传感应用(Angew.Chem.Int.Ed.2021,60,197–201)依靠阳极氧或阴极还原方式实现免共反应剂型电化学发光的应用技术非常少。
此外，本发明的发明人前期专利文件CN112147132A公开了一种光谱型的近红外ECL免疫传感器的制备方法，然而，该传感器仍然需要加入共反应剂三乙醇胺(TEOA)才能产生电化学发光。最近也有文献和专利报道了来自磷化铟(Anal.Chem.2021,10.1021/acs.analchem.1c04612.，CN202110152918.8)的无共反应剂型发光，但是其发光波段位于黄光区且光谱范围很宽。
目前，不需要共反应剂的单波段近红外ECL传感器，未见报道。为此，提出本发明。
发明内容
针对现有技术的不足，尤其是现有的电化学发光免疫传感均需要共反应剂参与的不足，本发明提供一种以n型纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光试传感器。合成了蛋氨酸包被的一种n型纳米金簇。直接电氧化n型纳米金簇，向n型纳米金簇注入外源性空穴；利用外源性空穴与n型纳米金簇内自由电子之间的电荷复合反应，产生免共反应剂型单波段近红外电化学发光辐射，用于构建近红外电化学发光传感器。
术语说明：
抗原：本发明所述的抗原(Ag)指甲胎蛋白抗原，癌胚抗原，糖类抗原125，前列腺特异性抗原(PSA)等常规的抗原。
一抗：本发明所述的一抗(Ab1)指对本发明所述抗原对应产生的抗体，本发明对于上述抗原对应的单克隆抗体效果更好。
二抗：本发明所述的二抗指对上述抗原和一抗对应产生的二抗。
本发明的技术方案如下：
以纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光传感器，该传感器为纳米金簇标记二抗后，枝接并固定到工作电极表面，所述的纳米金簇为蛋氨酸包被的金纳米簇。
根据本发明，优选的，所述的纳米金簇按如下方法制备得到：
以H4AuCl4为金源，蛋氨酸为配体，在pH值为4.0-12.0，于30-40摄氏度孵育后，纯化，即得纳米金簇。
根据本发明，优选的，采用H4AuCl4溶液为金源，H4AuCl4溶液的浓度为80-100mM；
优选的，pH值范围为5-11，进一步优选6-10，例如：6.5、7、8、9；
优选的，在37摄氏度孵育，孵育时间为8-120小时，进一步优选40-80小时，例如：48h、52h、64h、72h；
优选的，以蛋氨酸溶液为配体，蛋氨酸溶液的浓度为0.1mM-1mM；
优选的，H4AuCl4和蛋氨酸的摩尔比为1：(50-3)；
优选的，纯化所用试剂为乙醇。
根据本发明，优选的，所述的二抗对应的抗原为甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、糖类抗原125或前列腺特异性抗原。
根据本发明，上述免共反应剂型电化学发光免疫传感器的制备方法，包括步骤如下：
(1)以H4AuCl4为金源，蛋氨酸为配体，在pH值为4.0-12.0，于30-40摄氏度孵育后，纯化，得纳米金簇；
(2)制备纳米金簇标记的二抗，即：Au|Ab2；
(3)采用在工作电极表面形成夹心免疫复合物的形式，将Au|Ab2枝接并固定到工作电极表面，制备免共反应剂型电化学发光免疫传感器。
根据本发明，优选的，步骤(1)中按如下方法制备纳米金簇：
将浓度为80-100mM的H4AuCl4溶液、浓度为0.2-1mM的蛋氨酸溶液超声混合均匀，H4AuCl4和蛋氨酸的摩尔比为3：50，用1M氢氧化钠溶液或1M盐酸将混合溶液调节pH值至5.0-11.0，于37摄氏度孵育8-72小时，然后将所得溶液离心去除底部大颗粒，将所得溶液用乙醇低转速离心纯化，所得沉淀即为金纳米团簇。
根据本发明，优选的，步骤(2)中制备纳米金簇标记的二抗Au|Ab2的步骤如下：
向纳米金簇溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化15-30min，离心后所得沉淀复溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，加入相应的二抗37℃孵育3小时，然后用牛血清蛋白进行封闭，所得的物质即为Au|Ab2。离心后将Au|Ab2复溶于PBS中，在4度冰箱中储存。
根据本发明，优选的，步骤(2)中所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐：羟基琥珀酰亚胺体积比＝1：1；
优选的，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐：纳米金簇溶液的体积比＝(1～2)：100。
根据本发明，优选的，步骤(3)中制备免共反应剂型电化学发光免疫传感器的步骤如下：
(i)：将玻碳电极(GCE)用氧化铝抛光处理后，再用酒精，超纯水清洗干净；以10mV/S的扫描速度，将GCE在1.0mM对氨基苯甲酸(ABA)水溶液中扫描6段3圈，扫描电位范围为0.4～1.2V，使得ABA电聚合到GCE表面，用10mM的PBS(pH＝6-8)清洗电极，除去未反应的ABA；
(ii)：向(i)所得的GCE修饰电极表面滴加乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHC)溶液，活化半小时，用10mM的PBS(pH＝7.4)清洗电极，除去未反应的EDC以及NHC；
(iii)：将一抗(Ab1)溶液滴加到(ii)所得的活化电极表面，孵育3h，再用牛血清蛋白封闭电极未反应的活性位点，并清洗电极；
(iv)：将抗原(Ag)滴加到(iii)处理后的电极表面，室温孵育90min；清洗电极，再将Au|Ab2滴加到电极表面进行孵育1h；基于形成免疫复合物的形式将Au|Ab2枝接并固定到工作电极表面，实现免共反应剂型电化学发光免疫传感器的制备。即得到表面修饰有纳米金簇免疫复合物的GCE工作电极。
根据本发明，优选的，步骤(iii)中所述的牛血清蛋白的体积分数为2％；步骤(iii)、(iv)中清洗电极所用冲洗液为PBST溶液，溶液的指标如下：0.01mol/L PBS中含0.025mol/L吐温20，pH＝7.4；
优选的，步骤(iv)中所述的抗原(Ag)为前列腺特异性抗原。
根据本发明，还提供了一种免共反应剂型电化学发光免疫传感器的检测方法，包括步骤如下：
I：以制备得到的表面修饰有纳米金簇免疫复合物的GCE为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在免任何共反应剂pH＝8-12的0.01-100mM的碳酸盐缓冲溶液(CBS)中，采用循环伏安法驱动固定于GCE表面的纳米金簇产生电化学发光；
II：依据电化学发光最大光强信号与待测抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
III：将各待测样品溶液按照步骤I和II中的方法进行电化学发光测试，根据所得电化学发光曲线上最大光强信号和工作曲线，检测待测样品溶液中的抗原浓度。
根据本发明，上述抗原标准品梯度溶液的配置方法是，将购置的抗原以磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制的0.01mol/L pH为7.4的标准品缓冲液，按0pg/mL、0.1pg/mL、0.6pg/mL、1pg/mL、2pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、40pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、1500pg/mL的比例制备模拟血清中抗原的13个标准品浓度，其中0pg/mL为标准品缓冲液。
本发明的有益效果：
1、本发明以纳米金簇为标记物，得到的电化学发光免疫传感器不需要任何共反应剂，即可实现电化学发光免疫检测。
2、本发明的免共反应剂型电化学发光免疫传感器和免疫检测方法，抗干扰能力强，选择性好，灵敏度高，检测灵敏度为0.6pg/mL，检测线性好。
附图说明
图1为实施例1中所制的水溶性纳米金簇的荧光光谱图。
图2为实施例1中所制的水溶性纳米金簇的紫外光谱图。
图3为实施例1中所制的水溶性纳米金簇的高倍透射电镜照片照片。
图4为实施例1中所制的水溶性纳米金簇的X射线光电子能谱分析。
图5为实施例1中所制的水溶性纳米金簇的Zeta电位分析。
图6为实施例2中的近红外电化学发光传感光谱图。
图7为实施例2中PSA抗原校准品标准曲线图。
图8为实施例2中PSA抗原浓度对应的电化学发光光强图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明：
本发明制备的纳米金簇的荧光光谱图由WGY-10型荧光分光光度计采集获得，高倍透射电镜图由TecnaiG2 F30高倍投射电子显微镜所得，操作电压为300kV。本发明制备的传感器的电化学发光由MPI-EII电化学发光检测仪所得，ECL光谱由、电化学发光光谱仪采集系统所得。
实施例1
(1)纳米金簇的合成：将96mM氯金酸(H4AuCl4)溶液(250微升)，4毫升蛋氨酸(Met)溶液(0.4mM)和氢氧化钠(NaOH)溶液超声混合均匀，同时用1M NaOH或1M盐酸(HCl)将混合所制的溶液调节pH至8，于37摄氏度孵育40小时，然后将所得溶液离心去除底部大颗粒，最后将所得溶液用乙醇低转速离心纯化，所得沉淀即为金纳米团簇。
将所得纳米金簇配制成1mg/mL的溶液检测荧光谱图，该纳米金簇有一个两个荧光光谱峰，分别位于如图1所示。由图1可知合成金纳米团簇有两个荧光过程，分别位于610nm和810nm，可以分别归属于带隙发射峰和缺陷荧光发射峰。
将所得纳米金簇配制浓度为1mg/mL的溶液检测紫外谱图，如图2所示。由图2可知该纳米金簇有两个吸收峰，分别位于380和541nm。
将所得纳米金簇配制浓度为0.5mg/mL的溶液滴于铜网观察形貌，如图3所示。由图3可知该纳米金簇的尺寸大约为4nm，在水中为单分散的球形。
将所得纳米金簇配制浓度为0.5mg/mL的溶液滴于硅片测试X射线光电子能谱，如图4所示。由图4可知所得金纳米团簇中含有Au和S元素。其中金(Au-4f)峰位于84.1和88.0eV，表明合成的金簇中同时含有+1和0价的金。蛋氨酸充当还原剂，将HAuCl4中+3价的金还原成为+1和0价的金。一价金的存在有助于金簇的稳定。S(S-2p)元素的峰位于161.8和162.8eV，表明合成的金簇表面配体S的价态是-2价。
将所得的纳米金簇测试其zeta电势，如图5所示。由图5可知，该纳米金簇的zeta电势为-29.5mV，证明其表面有大量的负电荷。
将所得的纳米金簇粉末测试其霍尔效应电势，如表1所示。
表1
由表1可知，该纳米金簇的霍尔系数为-38.36，证明其为n型半导体且内部有大量的自由电子。
(2)制备水溶性纳米金簇标记的二抗，即：Au|Ab2；
向步骤(1)制备的水溶性纳米金簇中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化20min，离心后所得沉淀复溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，加入相应的二抗37℃孵育3小时，然后用牛血清蛋白进行封闭，所得的物质即为Au|Ab2；离心后将Au|Ab2复溶于PBS中，在4度冰箱中储存；
所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐：羟基琥珀酰亚胺体积比＝1：1；
所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐：水溶性金簇的体积比＝(1～2)：100。
(3)采用在工作电极表面形成夹心免疫复合物的形式，将Au|Ab2枝接并固定到工作电极表面，制备免共反应剂型电化学发光免疫传感器，步骤如下：
(i)：将玻碳电极(GCE)用氧化铝抛光处理后，再用酒精，超纯水清洗干净；以10mV/S的扫描速度，将GCE在1.0mM对氨基苯甲酸(ABA)水溶液中扫描6段3圈，扫描电位范围为0.4～1.2V，使得ABA电聚合到GCE表面，用10mM的PBS(pH＝6-8)清洗电极，除去未反应的ABA；
(ii)：向(i)所得的GCE修饰电极表面滴加乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHC)溶液，活化半小时，用10mM的PBS(pH＝7.4)清洗电极，除去未反应的EDC以及NHC；
(iii)：将一抗(Ab1)溶液滴加到(ii)所得的活化电极表面，孵育3h，再用牛血清蛋白封闭电极未反应的活性位点，并清洗电极；
(iv)：将抗原(Ag)滴加到(iii)处理后的电极表面，室温孵育90min；清洗电极，再将Au|Ab2滴加到电极表面进行孵育1h；基于形成免疫复合物的形式将Au|Ab2枝接并固定到工作电极表面，实现免共反应剂型电化学发光免疫传感器的制备，得到表面修饰有纳米金簇免疫复合物的GCE。
步骤(iii)中所述的牛血清蛋白的体积分数为2％；步骤(iii)、(iv)中清洗电极所用冲洗液为PBST溶液，溶液的指标如下：0.01mol/L PBS中含0.025mol/L吐温20，pH＝7.4；步骤(iv)中所述的抗原(Ag)为前列腺特异性抗原(PSA)。
实施例2
一种免共反应剂型电化学发光免疫传感器的检测方法，包括步骤如下：
I：以实施例1制备得到的表面修饰有纳米金簇免疫复合物的GCE为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在免任何共反应剂pH＝9.4的100mM的碳酸盐缓冲溶液(CBS)中，采用循环伏安法驱动固定于GCE表面的纳米金簇产生电化学发光；近红外电化学发光传感光谱图如图6所示，由图6可知，其电化学发光波段位于近红外区，在824nm左右，相对于其带隙荧光光谱，其电化学发光波长红移了近200纳米，相对于其缺陷发光的荧光光谱，其电化学发光光谱红移了近14纳米，证明该纳米粒子表面有一定的缺陷并且这些缺陷也参与了电化学发光过程。
II：依据电化学发光最大光强信号与待测抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；如图7所示，PSA抗原浓度对应的电化学发光光强图如图8所示。由图7、8可知本实验对PSA的线性检测范围为2-1000pg/mL。本发明的免共反应剂型电化学发光免疫传感器和免疫检测方法，抗干扰能力强，选择性好，灵敏度高，检测灵敏度为0.6pg/mL，检测线性好。
III：将各待测样品溶液按照步骤I和II中的方法进行电化学发光测试，根据所得电化学发光曲线上最大光强信号和工作曲线，检测待测样品溶液中的抗原浓度。
本实施例中，采用PSA抗原，所述PSA抗原标准品梯度溶液的配置方法是，将购置的PSA抗原以磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制的0.01mol/L pH为7.4的标准品缓冲液，按0pg/mL、0.1pg/mL、0.6pg/mL、1pg/mL、2pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、40pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、1500pg/mL的比例制备模拟血清中PSA抗原的13个标准品浓度，其中0pg/mL为标准品缓冲液。
Claims (10)
1.一种以纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光传感器，其特征在于，所述的纳米金簇为蛋氨酸包被的n型纳米金簇。
2.根据权利要求1所述的以纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光传感器，其特征在于，所述的纳米金簇按如下方法制备得到：
以H4AuCl4为金源，蛋氨酸为配体，在pH值为4.0-12.0，于30-40摄氏度孵育后，纯化，即得纳米金簇。
3.根据权利要求2所述的以纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光传感器，其特征在于，采用H4AuCl4溶液为金源，H4AuCl4溶液的浓度为80-100mM；
优选的，pH值范围为5-11，进一步优选6-10；
优选的，在37摄氏度孵育，孵育时间为8-120小时，进一步优选40-80小时；
优选的，以蛋氨酸溶液为配体，蛋氨酸溶液的浓度为0.1mM-1mM；
优选的，H4AuCl4和蛋氨酸的摩尔比为1：(50-3)。
4.根据权利要求1所述的以纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光传感器，其特征在于，所述的二抗对应的抗原为甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、糖类抗原125或前列腺特异性抗原。
5.权利要求1所述的以纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光传感器，包括步骤如下：
(1)以H4AuCl4为金源，蛋氨酸为配体，在pH值为4.0-12.0，于30-40摄氏度孵育后，纯化，得纳米金簇；
(2)制备纳米金簇标记的二抗，即：Au|Ab2；
(3)采用在工作电极表面形成夹心免疫复合物的形式，将Au|Ab2枝接并固定到工作电极表面，制备免共反应剂型电化学发光免疫传感器。
6.根据权利要求5所述的以纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光传感器，其特征在于，步骤(1)中按如下方法制备纳米金簇：
将浓度为80-100mM的H4AuCl4溶液、浓度为0.2-1mM的蛋氨酸溶液超声混合均匀，H4AuCl4和蛋氨酸的摩尔比为3：50，用1M氢氧化钠溶液或1M盐酸将混合溶液调节pH值至5.0-11.0，于37摄氏度孵育8-72小时，然后将所得溶液离心去除底部大颗粒，将所得溶液用乙醇低转速离心纯化，所得沉淀即为纳米金簇。
7.根据权利要求5所述的以纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光传感器，其特征在于，步骤(2)中制备纳米金簇标记的二抗Au|Ab2的步骤如下：
向纳米金簇溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化15-30min，离心后所得沉淀复溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，加入相应的二抗37℃孵育3小时，然后用牛血清蛋白进行封闭，所得的物质即为Au|Ab2；
优选的，步骤(2)中所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐：羟基琥珀酰亚胺体积比＝1：1；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐：纳米金簇溶液的体积比＝(1～2)：100。
8.根据权利要求5所述的以纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光传感器，其特征在于，步骤(3)中制备免共反应剂型电化学发光免疫传感器的步骤如下：
(i)：将玻碳电极(GCE)用氧化铝抛光处理后，再用酒精，超纯水清洗干净；以10mV/S的扫描速度，将GCE在1.0mM对氨基苯甲酸(ABA)水溶液中扫描6段3圈，扫描电位范围为0.4～1.2V，使得ABA电聚合到GCE表面，用10mM的PBS(pH＝6-8)清洗电极，除去未反应的ABA；
(ii)：向(i)所得的GCE修饰电极表面滴加乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHC)溶液，活化半小时，用10mM的PBS(pH＝7.4)清洗电极，除去未反应的EDC以及NHC；
(iii)：将一抗(Ab1)溶液滴加到(ii)所得的活化电极表面，孵育3h，再用牛血清蛋白封闭电极未反应的活性位点，并清洗电极；
(iv)：将抗原(Ag)滴加到(iii)处理后的电极表面，室温孵育90min；清洗电极，再将Au|Ab2滴加到电极表面进行孵育1h；基于形成免疫复合物的形式将Au|Ab2枝接并固定到工作电极表面，实现免共反应剂型电化学发光免疫传感器的制备。
9.根据权利要求8所述的以纳米金簇为发光标记物的免共反应剂型近红外电化学发光传感器，其特征在于，步骤(iii)中所述的牛血清蛋白的体积分数为2％；步骤(iii)、(iv)中清洗电极所用冲洗液为PBST溶液，溶液的指标如下：0.01mol/L PBS中含0.025mol/L吐温20，pH＝7.4；
优选的，步骤(iv)中所述的抗原(Ag)为前列腺特异性抗原。
10.一种免共反应剂型电化学发光免疫传感器的检测方法，包括使用权利要求1所述的免共反应剂型电化学发光免疫传感器，包括步骤如下：
I：以制备得到的表面修饰有纳米金簇免疫复合物的GCE为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在免任何共反应剂pH＝8-12的0.01-100mM的碳酸盐缓冲溶液(CBS)中，采用循环伏安法驱动固定于GCE表面的纳米金簇产生电化学发光；
II：依据电化学发光最大光强信号与待测抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
III：将各待测样品溶液按照步骤I和II中的方法进行电化学发光测试，根据所得电化学发光曲线上最大光强信号和工作曲线，检测待测样品溶液中的抗原浓度。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20220419 |