CN114384248A - 一种以金纳米团簇为发光体实施缺陷诱导型单色电化学发光免疫分析的方法 - Google Patents

一种以金纳米团簇为发光体实施缺陷诱导型单色电化学发光免疫分析的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种以金纳米团簇为发光体实施缺陷诱导型单色电化学发光免疫分析的方法，利用11‑巯基十一烷酸为单一包被剂制备了水溶性一元金纳米团簇，以金纳米团簇/水合肼ECL体系发展了以单一巯基烷酸包被金纳米团簇为发光团的ECL生化分析。本发明的11‑巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA‑AuNCs在用于电化学发光时只有一个波段峰，属于完全由缺陷诱导的电化学发光。对电化学发光的调控，无需采用调控贵金属纳米团簇的尺寸的方法，仅仅改变含巯基的长直链烷酸碳链长度对金纳米团簇表面状态进行调控，即可完成电化学发光的控制，方法灵活，调控易于操作。

Description

一种以金纳米团簇为发光体实施缺陷诱导型单色电化学发光 免疫分析的方法
技术领域
本发明属于分析技术方法领域，涉及一种以11-巯基十一烷酸包被金纳米团簇为标记物、水合肼为共反应剂的电化学发光免疫分析方法。
背景技术
电化学发光(ECL)生化分析具有灵敏度高、线性范围宽、仪器操作简单等优点，已在化学、医学和体外诊断等领域得到广泛应用(Chem.Rev.2014,114,11027)。近十年来，纳米粒子正在逐步取代传统的分子类ECL发光试剂，成为ECL生化分析的主流发光试剂和标记物(Chem.Rev.2008,108,2506)。
纳米粒子ECL分为禁带调控和缺陷诱导两种类型(Chem.Commun.2020,56,5665–5668)。禁带调控型ECL光谱与纳米粒子荧光光谱高度一致，缺陷诱导型ECL光谱相对于纳米粒子荧光光谱产生明显红移。禁带调控和缺陷诱导型ECL同时存在的现象导致纳米粒子ECL通常表现为双波段辐射(Nano Lett.2003,3,1053)。研发单色ECL体系是提高ECL生化分析通量的有效途径，学术界通常采用抑制纳米粒子表面缺陷的方式，实施以纳米粒子为标记物的禁带调控型ECL生化分析(Anal.Chem.2018,90,12361)。
采用有效方式抑制纳米粒子的禁带调控型ECL，开发以纳米粒子为发光物的缺陷诱导型单色ECL体系能够进一步丰富ECL单色体系，推动单色ECL生化分析的发展(Anal.Chem.2018,90,3563)。贵金属纳米团簇是一类新型的ECL发光材料，具有良好的稳定性和生物相容性。CN112122621B公开了一种以双支链巯基烷酸——蛋氨酸为包被剂的金银双金属纳米团簇的制备方法，采用向金纳米团簇中引入银元素的方式构建了金银双金属纳米团簇，并据此实现缺陷诱导型单波段ECL，实施了单波段ECL生化分析(CN112147132B)。Jia等以双稳定剂包被金纳米团簇为发光团实现了缺陷诱导型单波段ECL辐射(ACSAppl.Nano Mater.2021,4,2657)。
目前，学术界尚未明确包被剂碳链在实现缺陷诱导型ECL过程中的作用，基于直链巯基烷酸包被剂直接实现金纳米团簇缺陷诱导型ECL的方法与手段有限。
发明内容
针对现有技术的不足，尤其是基于单一直链巯基烷酸包被剂直接实施金纳米团簇缺陷诱导ECL的技术手段的不足，本发明提供一种以直链巯基烷酸为包被剂制备金纳米团簇、实施缺陷诱导型单波段ECL生化分析的方法。利用11-巯基十一烷酸为单一包被剂制备了水溶性一元金纳米团簇，以金纳米团簇/水合肼ECL体系发展了以单一巯基烷酸包被金纳米团簇为发光团的ECL生化分析。
术语说明：
抗原：本发明所述的抗原(Ag)指甲胎蛋白抗原，癌胚抗原，前列腺特异性抗原，糖类抗原125等常规的抗原。
一抗：本发明所述的一抗(Ab1)指对本发明所述抗原对应产生的抗体，本发明对于上述抗原对应的单克隆抗体效果更好。
二抗：本发明所述的二抗(Ab2)指对上述抗原和一抗对应产生的二抗。
U的定义：在实验规定的条件下，如最适温度、最适pH、最适底物浓度时，1min内催化1μmol底物发生反应所需要的酶量作为一个酶活力国际单位U。
本发明的技术方案如下：
一种完全由缺陷诱导ECL发光的金纳米团簇，该金纳米团簇采用含巯基的长直链烷酸为配体对金纳米团簇进行包被，所述的含巯基的长直链烷酸的直链碳数为7以上，优选8-12。
根据本发明，优选的，所述的含巯基的长直链烷酸为11-巯基十一烷酸。
根据本发明，优选的，上述完全由缺陷诱导ECL发光的金纳米团簇的制备方法，包括步骤如下：
以氯金酸为金源，四羟甲基氯化磷为还原剂合成非光致发光的金纳米团簇；然后以11-巯基十一烷酸为配体进行包被，制备得到金纳米团簇(MUA-AuNCs)。
根据本发明，优选的，所述的金纳米团簇(MUA-AuNCs)的制备过程如下：
(a)将氢氧化钠(NaOH)溶液、四羟甲基氯化磷(THPC)溶液和氯金酸(HAuCl4·3H2O)溶液混合均匀，冰水浴搅拌，得到金前驱溶液；
(b)将11-巯基十一烷酸溶液加入金前驱溶液，并加入硼砂缓冲液，黑暗静置；然后经离心、洗涤即得MUA-AuNCs。
根据本发明，11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇(MUA-AuNCs)的制备过程中，优选的条件如下：
步骤(a)中冰水浴搅拌时间为10-20min，优选为15min；
步骤(a)中氯金酸的浓度为80-100mmol/L；
步骤(b)中11-巯基十一烷酸与步骤(a)中氯金酸的摩尔比为5-20：2，优选为15：2；
步骤(b)中黑暗静置的反应时间为70-90h，优选为72h。
根据本发明，最优选的，11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs的制备过程如下：
将0.5mL氢氧化钠(1M)溶液、12μL80％的四羟甲基氯化磷溶液依次加入至45mL超纯水中混匀；向上述混合溶液中加入375μL氯金酸(96mM)溶液并置于冰水浴中搅拌15分钟；取5mL上述溶液加入0.03mol11-巯基十一烷酸和1mL pH＝9.2的硼砂缓冲液(50mM)并用超纯水稀释至10mL置于黑暗环境孵育72小时；最后将所制得的溶液用异丙醇在15000rpm离心，得到金纳米团簇溶液MUA-AuNCs，置于4℃冰箱中储存备用。
根据本发明，还提供基于11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs的电化学发光体系，包括：
11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs为发光物质、水合肼为共反应剂。可采用循环伏安法驱动金纳米团簇MUA-AuNCs产生电化学发光。
根据本发明，还提供基于11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs电化学发光免疫传感器，包括：工作电极，所述的工作电极表面修饰有包含11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs的夹心型免疫复合物。
根据本发明，上述基于11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs电化学发光免疫传感器的制备方法，包括步骤如下：
(1)以氯金酸为金源，四羟甲基氯化磷为还原剂合成非光致发光的金纳米团簇；然后以11-巯基十一烷酸为配体进行包被，制备得到金纳米团簇(MUA-AuNCs)溶液；
(2)制备11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇标记的二抗，即MUA-AuNCs|Ab2；
(3)以玻碳电极为工作电极，采用在电极表面形成夹心型免疫复合物的形式，将MUA-AuNCs|Ab2枝接并固定在玻碳电极表面，制备得到电化学发光免疫传感器。
根据本发明，优选的，步骤(2)中，向11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇(MUA-AuNCs)中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化半小时，离心后沉淀复溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，加入相应的二抗37℃孵育3小时，然后用牛血清蛋白进行封闭，所得的物质即为MUA-AuNCs|Ab2；将MUA-AuNCs|Ab2离心后复溶于PBS中，在4度冰箱中储存；
优选的，步骤(2)中所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐：羟基琥珀酰亚胺体积比＝1：1。
根据本发明，优选的，步骤(3)中制备电化学发光免疫传感器的过程如下：
(i)：将玻碳电极(GCE)用氧化铝抛光处理后，再用酒精，超纯水清洗干净；以10mV/s的扫描速度，将GCE在1.0mM对氨基苯甲酸(ABA)水溶液中扫描4段2圈，扫描电位范围为0.4～1.2V，使得ABA电聚合到GCE表面，用10mM的PBS(pH＝7.4)清洗电极，除去未反应的ABA；
(ii)：向(i)所得的GCE修饰电极表面滴加乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHC)溶液活化半小时，用10mM的PBS(pH＝7.4)清洗电极，除去未反应的EDC以及NHC；
(iii)：将一抗(Ab1)溶液滴加到(ii)所得的活化电极表面，孵育3h，再用牛血清蛋白封闭电极未反应的活性位点，并清洗电极；
(iv)：将抗原(Ag)滴加到(iii)处理后的电极表面，室温孵育90min；清洗电极，再将MUA-AuNCs|Ab2滴加到电极表面进行孵育1h；基于形成免疫复合物的形式将MUA-AuNCs|Ab2枝接并固定到工作电极表面，实现电化学发光免疫传感器的制备。
根据本发明，优选的，步骤(iii)中所述的牛血清蛋白的体积分数为2％。
根据本发明，优选的，步骤(iii)、(iv)中清洗电极所用冲洗液为PBST溶液，溶液的指标如下：0.01mol/L PBS(pH＝7.4)溶液中含0.025mol/L吐温20。
根据本发明，优选的，步骤(iv)中所述的抗原(Ag)为甲胎蛋白抗原，癌胚抗原，前列腺特异性抗原或糖类抗原125。
本发明还提供一种利用上述电化学发光免疫传感器进行免疫检测的方法，包括步骤如下：
I：以上述表面修饰有包含11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs的夹心型免疫复合物的玻碳电极GCE为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含10mM水合肼的pH＝7.4、100mM的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，采用循环伏安法驱动固定于GCE表面的金纳米团簇MUA-AuNCs产生电化学发光；
II：依据测试得到的电化学发光最大光强信号与待测抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
III：将各待测样品溶液按照步骤I和II中的方法进行电化学发光测试，根据所得电化学发光曲线上最大光强信号和工作曲线，检测待测样品溶液中的抗原浓度。
本发明的原理：
本发明采用11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇为标记物；金纳米团簇表面的羧基可在被EDC和NHS活化后枝接第二抗体表面的氨基，实现第二抗体的标记。
本发明采用在电聚合条件下形成碳氮键的方式将对氨基苯甲酸(ABA)枝接到工作电极GCE表面，并通过采用EDC和NHS进一步活化GCE表面ABA的羧基的方式完成枝接第一抗体。
本发明中电化学发光光谱采集的硬件装置参考-《一种可准确采集电致化学发光光谱信息的检测系统》ZL2016203006983中所构建的电化学发光光谱采集系统。该系统采用将VersaSTAT 3型电化学分析仪与Acton SP-2300型CCD光栅光谱仪联用的方式实现光谱采集。本发明中电化学发光光谱的采集方式参考-《一种基于光谱分辨原理的电致化学发光多组分免疫检测方法》ZL2016102375805中所构建的电化学发光免疫分析之光谱采集方法，所采用的电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0V，初扫向正。本发明中电化学发光光强采集装置为西安瑞迈分析仪器有限公司生产的MPI-E II型多功能电化学发光仪。
本发明利用抗原抗体之间的特异性识别，以具有优良电化学发光性质的11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇为标记物，以水合肼为共反应剂，构建了用于糖类抗原125等抗原检测的夹心型电化学免疫传感器。
本发明的有益效果：
1、本发明采用含巯基的长直链烷酸为配体对金纳米团簇进行包被，得到的金纳米团簇MUA-AuNCs，避免了各支链之间在空间上存在相互作用，易于探究配体的碳骨架对电化学发光的影响。
2、本发明的11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs在用于电化学发光时只有一个波段峰，属于完全由缺陷诱导的电化学发光。对电化学发光的调控，无需采用调控贵金属纳米团簇的尺寸的方法，仅仅改变含巯基的长直链烷酸碳链长度对金纳米团簇表面状态进行调控，即可完成电化学发光的控制，方法灵活，调控易于操作。
3、本发明提供了一种操作简单，重复性好的电化学发光免疫传感检测方法，该方法对临床早期诊断癌症具有重要的科学意义和应用价值。
4、本发明方法的灵敏度高。本发明构建的电化学发光免疫传感器可在1mU/mL～1U/mL癌胚抗原的浓度范围内与电化学发光信号呈现良好的线性关系，且检测限可达0.5mU/mL，因此可通过检测电化学发光信号判断癌胚抗原的浓度。
5、本发明方法的选择性高。本发明构建的电化学发光免疫传感器是基于抗原和抗体之间的特异性识别和结合构建的，因此待测液中的干扰蛋白并不能与抗原第一抗体和第二抗体结合，对本发明检测体系无干扰。
附图说明
图1为实施例1中所制的金纳米团簇的荧光光谱图(横坐标为波长，纵坐标为荧光强度)。
图2为实施例2中所制的金纳米团簇的紫外光谱图(横坐标为波长，纵坐标为吸光度)。
图3为实施例3中所制的金纳米团簇的高倍透射电镜照片。
图4为实施例4中所制的金纳米团簇的差分脉冲伏安曲线图(横坐标为电压，纵坐标为电流)。
图5为实施例5中未添加金纳米团簇的空白样的电化学发光光强图(电流-电压以及电化学发光强度-电压图)。
图6为实施例6中所制的金纳米团簇的电化学发光光强图(电流-电压以及电化学发光强度-电压图)。
图7为实施例7中裸玻碳电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图(横坐标为电压，纵坐标为电流)。
图8为实施例8中制得电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图(横坐标为电压，纵坐标为电流)。
图9为实施例9中制得电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图(横坐标为电压，纵坐标为电流)。
图10为实施例10中制得电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图(横坐标为电压，纵坐标为电流)。
图11为实施例11中所制的传感器电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图(横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
图12为实施例12中所制的糖类抗原125浓度为1U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强图(横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
图13为实施例13中所制的糖类抗原125浓度为0.5U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强图(横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
图14为实施例14中所制的糖类抗原125浓度为0.05U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强图(横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
图15为实施例15中所制的糖类抗原125浓度为0.01U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强图(横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
图16为实施例16中所制的糖类抗原125浓度为0.005U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强图(横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
图17为实施例17中所制的糖类抗原125浓度为0.001U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强图(横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
图18为实施例18中所制的糖类抗原125浓度为0.0005U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强图(横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
图19为实施例19中所制的糖类抗原125浓度为0U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强图(横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度)。
图20为实施例20中所制的糖类抗原125的金纳米团簇为标记物的传感器的工作曲线(横坐标为糖类抗原125浓度，纵坐标为电化学发光强度)。
图21为实施例21中所制的传感器的选择性谱图(纵坐标为电化学发光强度)。
图22为本发明传感器的机理图。
图23为对比例1中所制的金纳米团簇的电化学发光光强图(电流-电压以及电化学发光强度-电压图)。
图24为对比例2中所制的金纳米团簇的电化学发光光强图(电流-电压以及电化学发光强度-电压图)。
图25为对比例3中所制的金纳米团簇的电化学发光光强图(电流-电压以及电化学发光强度-电压图)。
图26为对比例4中所制的金纳米团簇的电化学发光光强图(电流-电压以及电化学发光强度-电压图)。
图27为对比例5中所制的金纳米团簇的电化学发光光强图(电流-电压以及电化学发光强度-电压图)。
图28为对比例6中所制的金纳米团簇的电化学发光光强图(电流-电压以及电化学发光强度-电压图)。
具体实施方法
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但不限于此。
实施例1
将所有器皿用新鲜制得的王水泡24小时，用超纯水和乙醇彻底冲洗，烘干；将0.5mL氢氧化钠(1M)溶液、12μL 80％的四羟甲基氯化磷溶液依次加入至45mL超纯水中混匀；向上述混合溶液中加入375μL氯金酸(96mM)溶液并置于冰水浴中搅拌15分钟；取5mL上述溶液加入0.03mol 11-巯基十一烷酸和1mL pH＝9.2的硼砂缓冲液(50mM)并用超纯水稀释至10mL置于黑暗环境孵育72小时；最后将所制得的溶液用异丙醇在15000rpm离心，置于4℃冰箱中储存备用，金纳米团簇溶液固定浓度5mg/mL测试荧光光谱图，如图1所示。由图1可知，金纳米团簇的荧光峰波长在520nm。
金纳米团簇标记二抗的制备(MUA-AuNCs|Ab2)：向11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇(MUA-AuNCs)中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化半小时，离心后沉淀复溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入相应的二抗37℃孵育3小时，然后用牛血清蛋白进行封闭，离心后复溶于磷酸盐缓冲溶液中并在4度冰箱中储存，所得的物质即为MUA-AuNCs|Ab2。
以金纳米团簇为标记物的电化学发光免疫传感器的制备：
(1)：将玻碳电极(GCE)用氧化铝抛光处理后，再用酒精，超纯水清洗干净；以10mV/s的扫描速度，将GCE在1.0mM对氨基苯甲酸(ABA)水溶液中扫描4段2圈，扫描电位范围为0.4～1.2V，使得ABA电聚合到GCE表面，用10mM的PBS(pH＝7.4)清洗电极，除去未反应的ABA；
(2)：向(1)所得的GCE修饰电极表面滴加乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHC)溶液活化半小时，用10mM的PBS(pH＝7.4)清洗电极，除去未反应的EDC以及NHC；
(3)：将一抗(Ab1)溶液滴加到(ii)所得的活化电极表面，孵育3h，再用牛血清蛋白封闭电极未反应的活性位点，并清洗电极；
(4)：将抗原(Ag)滴加到(iii)处理后的电极表面，室温孵育90min；清洗电极，再将MUA-AuNCs|Ab2滴加到电极表面进行孵育1h，即得电化学发光免疫传感器。
实施例2
步骤同实施例1，所不同的是：金纳米团簇溶液测试方法为紫外光谱图，如图2所示。由图2所示，金纳米团簇的紫外吸收峰的波长在368nm。
实施例3
步骤同实施例1，所不同的是将制备好的金纳米团簇溶液滴于铜网观察形貌。测试所得的金纳米团簇的高倍透射电镜照片，如图3所示。由图3所示，金纳米团簇呈现为球形颗粒，其平均直径在1.73nm，具有良好的单分散性和均匀性。
实施例4
步骤同实施例1，所不同的是：电化学方法为差分脉冲伏安法，金纳米团簇测试的电化学谱图，如图4所示。由图4所示，金纳米团簇在阳极电位下显示了+0.58V和+0.98V两个氧化峰。
实施例5
步骤同实施例1，所不同的是：电化学方法为循环伏安驱动的电化学发光光强方法，并且没有添加金纳米团簇的空白样，空白样的电化学发光光强图，如图5所示。由图5所示，空白在阳极电位下无氧化峰。
实施例6
步骤同实施例1，所不同的是：电化学方法为循环伏安驱动的电化学发光光强方法，金纳米团簇的电化学发光光强图，如图6所示。由图6所示，金纳米团簇的电化学发光电位为+0.70V和+1.05V。
实施例7
将玻碳电极用氧化铝抛光处理后，再用酒精，超纯水清洗干净。裸玻碳电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线，如图7所示。由图7所示，裸玻碳电极的铁氰化钾扫描显示了可逆氧化还原峰。
实施例8
步骤同实施例7后，以10mV/s的扫描速度，将GCE在1.0mM对氨基苯甲酸(ABA)水溶液中扫描4段2圈，扫描电位范围为0.4～1.2V，使得ABA电聚合到GCE表面，用10mM的PBS(pH＝7.4)清洗电极，除去未反应的ABA。制得电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线，如图8所示。由图8所示，制得电极的铁氰化钾扫描峰电流下降，峰电位分离增加，显示ABA的成功沉积。
实施例9
步骤同实施例8后，向修饰后的电极滴加乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHC)溶液活化半小时，用10mM的PBS(pH＝7.4)清洗电极，除去未反应的EDC以及NHC。将一抗(Ab1)溶液滴加到(ii)所得的活化电极表面，孵育3h，再用牛血清蛋白封闭电极未反应的活性位点，并清洗电极。制得电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线，如图9所示。由图9所示，制得电极的铁氰化钾扫描峰电流升高，峰电位分离减小，显示一抗(Ab1)的成功修饰。
实施例10
步骤同实施例9后，将抗原(Ag)滴加到处理后的电极表面，室温孵育90min后清洗电极。制得电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线，如图10所示。由图10所示，制得电极的铁氰化钾扫描峰电位下降，峰电位分离增加，显示抗原(Ag)的成功修饰。
实施例11
金纳米团簇标记二抗的制备(MUA-AuNCs|Ab2)：向11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇(MUA-AuNCs)中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化半小时，离心后沉淀复溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入相应的二抗37℃孵育3小时，然后用牛血清蛋白进行封闭，离心后复溶于磷酸盐缓冲溶液中并在4度冰箱中储存，所得的物质即为MUA-AuNCs|Ab2。
以金纳米团簇为标记物的电化学发光免疫传感器的制备：
(1)：将玻碳电极(GCE)用氧化铝抛光处理后，再用酒精，超纯水清洗干净；以10mV/s的扫描速度，将GCE在1.0mM对氨基苯甲酸(ABA)水溶液中扫描4段2圈，扫描电位范围为0.4～1.2V，使得ABA电聚合到GCE表面，用10mM的PBS(pH＝7.4)清洗电极，除去未反应的ABA；
(2)：向(1)所得的GCE修饰电极表面滴加乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHC)溶液活化半小时，用10mM的PBS(pH＝7.4)清洗电极，除去未反应的EDC以及NHC；
(3)：将一抗(Ab1)溶液滴加到(ii)所得的活化电极表面，孵育3h，再用牛血清蛋白封闭电极未反应的活性位点，并清洗电极；
(4)：将浓度为1U/mL的糖类抗原125(Ag)滴加到(iii)处理后的电极表面，室温孵育90min；清洗电极，再将MUA-AuNCs|Ab2滴加到电极表面进行孵育1h，即得电化学发光免疫传感器。所制的传感器电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图，如图11所示。由图11所示，制得电极的铁氰化钾扫描峰电位下降，峰电位分离增加，显示所制传感器电极的成功构建。
实施例12
步骤同实施例11后，所不同的是：测试方法为循环伏安驱动的电化学发光光强图，电化学发光免疫传感器的电化学发光光强图，如图12所示。由图12所示，所制的糖类抗原125浓度为1U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强为11126。
实施例13
步骤同实施例12后，所不同的是：步骤(4)中加的抗原为0.5U/mL，电化学发光免疫传感器的电化学发光光强图，如图13所示。由图13所示，所制的糖类抗原125浓度为0.5U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强为9466。
实施例14
步骤同实施例12后，所不同的是：步骤(4)中加的抗原为0.05U/mL，电化学发光免疫传感器的电化学发光光强图，如图14所示。由图14所示，所制的糖类抗原125浓度为0.05U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强为6839。
实施例15
步骤同实施例12后，所不同的是：步骤(4)中加的抗原为0.01U/mL，电化学发光免疫传感器的电化学发光光强图，如图15所示。由图15所示，所制的糖类抗原125浓度为0.01U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强为5118。
实施例16
步骤同实施例12后，所不同的是：步骤(4)中加的抗原为0.005U/mL，电化学发光免疫传感器的电化学发光光强图，如图16所示。由图16所示，所制的糖类抗原125浓度为0.005U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强为3889。
实施例17
步骤同实施例12后，所不同的是：步骤(4)中加的抗原为0.001U/mL，电化学发光免疫传感器的电化学发光光强图，如图17所示。由图17所示，所制的糖类抗原125浓度为0.001U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强为1813。
实施例18
步骤同实施例12后，所不同的是：步骤(4)中加的抗原为0.0005U/mL，电化学发光免疫传感器的电化学发光光强图，如图18所示。由图18所示，所制的糖类抗原125浓度为0.0005U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强为631。
实施例19
步骤同实施例12后，所不同的是：步骤(4)中加的抗原为0U/mL，电化学发光免疫传感器的电化学发光光强图，如图19所示。由图19所示，所制的糖类抗原125浓度为0U/mL的金纳米团簇为标记物的传感器的电化学发光光强为200。
实施例20
电化学发光免疫传感器进行免疫检测的方法，包括步骤如下：
I：以上述表面修饰有包含11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs的夹心型免疫复合物的玻碳电极GCE为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含10mM水合肼的pH＝7.4、100mM的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，采用循环伏安法驱动固定于GCE表面的金纳米团簇MUA-AuNCs产生电化学发光；
II：依据测试得到的电化学发光最大光强信号与待测抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
本实施例中，用于检测糖类抗原125的电化学发光免疫传感器的工作曲线，如图20所示。由图20所示，用于检测糖类抗原125的电化学发光免疫传感器的工作曲线的线性范围为0.001U/mL-1U/mL，检测限为0.0005U/mL。
III：将各待测样品溶液按照步骤I和II中的方法进行电化学发光测试，根据所得电化学发光曲线上最大光强信号和工作曲线，检测待测样品溶液中的抗原浓度。
实施例21
步骤同实施例12后，确定该传感器的选择性。所不同的是：步骤(4)中抗原分别为空白、甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、糖类抗原125以及四种检测物的混合物。本实施例中传感器的选择性谱图，如图21所示。由图21所示，本实施例中制得的传感器为对糖类抗原125选择性良好，其他抗原蛋白不对该发明的目标抗原传感检测产生干扰。
对比例1
将所有器皿用新鲜制得的王水泡24小时，用超纯水和乙醇彻底冲洗，烘干；将0.5mL氢氧化钠(1M)溶液、12μL 80％的四羟甲基氯化磷溶液依次加入至45mL超纯水中混匀；向上述混合溶液中加入375μL氯金酸(96mM)溶液并置于冰水浴中搅拌15分钟；取5mL上述溶液加入0.03mol 12-巯基十二烷酸和1mL pH＝9.2的硼砂缓冲液(50mM)并用超纯水稀释至10mL置于黑暗环境孵育72小时；最后将所制得的溶液用异丙醇在15000rpm离心，置于4℃冰箱中储存备用，电化学方法为循环伏安驱动的电化学发光光强方法，金纳米团簇溶液固定浓度5mg/mL的电化学发光光强图，如图23所示。由图23所示，金纳米团簇的电化学发光电位为+0.71V和+1.06V且ECL强度低于11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs。
对比例2
步骤同对比例1，所不同的是：将12-巯基十二烷酸换为8-巯基辛酸，电化学发光免疫传感器的电化学发光光强图，如图24所示。由图24所示，金纳米团簇的电化学发光电位为+0.67V和+1.07V且ECL强度低于11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs。
对比例3
步骤同对比例1，所不同的是：将12-巯基十二烷酸换为5-巯基戊酸，电化学发光免疫传感器的电化学发光光强图，如图25所示。由图25所示，金纳米团簇ECL极弱。
对比例4
步骤同对比例1，所不同的是：将12-巯基十二烷酸换为4-巯基丁酸，电化学发光免疫传感器的电化学发光光强图，如图26所示。由图26所示，金纳米团簇无ECL。
对比例5
步骤同对比例1，所不同的是：将12-巯基十二烷酸换为3-巯基丙酸，电化学发光免疫传感器的电化学发光光强图，如图27所示。由图27所示，金纳米团簇ECL极弱。
对比例6
步骤同对比例1，所不同的是：将12-巯基十二烷酸换为2-硫代乙醇酸，电化学发光免疫传感器的电化学发光光强图，如图28所示。由图28所示，金纳米团簇无ECL。

Claims (10)

1.一种完全由缺陷诱导ECL发光的金纳米团簇，其特征在于，该金纳米团簇采用含巯基的长直链烷酸为配体对金纳米团簇进行包被，所述的含巯基的长直链烷酸的直链碳数为7以上，优选8-12。
2.根据权利要求1所述的完全由缺陷诱导ECL发光的金纳米团簇，其特征在于，所述的含巯基的长直链烷酸为11-巯基十一烷酸。
3.权利要求1所述的完全由缺陷诱导ECL发光的金纳米团簇的制备方法，包括步骤如下：
以氯金酸为金源，四羟甲基氯化磷为还原剂合成非光致发光的金纳米团簇；然后以11-巯基十一烷酸为配体进行包被，制备得到金纳米团簇(MUA-AuNCs)。
4.根据权利要求3所述的完全由缺陷诱导ECL发光的金纳米团簇的制备方法，其特征在于，所述的金纳米团簇(MUA-AuNCs)的制备过程如下：
(a)将氢氧化钠(NaOH)溶液、四羟甲基氯化磷(THPC)溶液和氯金酸(HAuCl4·3H2O)溶液混合均匀，冰水浴搅拌，得到金前驱溶液；
(b)将11-巯基十一烷酸溶液加入金前驱溶液，并加入硼砂缓冲液，黑暗静置；然后经离心、洗涤即得MUA-AuNCs。
5.根据权利要求4所述的完全由缺陷诱导ECL发光的金纳米团簇的制备方法，其特征在于，11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇(MUA-AuNCs)的制备过程中，条件如下：
步骤(a)中冰水浴搅拌时间为10-20min；
步骤(a)中氯金酸的浓度为80-100mmol/L；
步骤(b)中11-巯基十一烷酸与步骤(a)中氯金酸的摩尔比为5-20：2；
步骤(b)中黑暗静置的反应时间为70-90h。
6.基于11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs的电化学发光体系，包括：
11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs为发光物质、水合肼为共反应剂。
7.基于11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs电化学发光免疫传感器，包括：工作电极，所述的工作电极表面修饰有包含11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs的夹心型免疫复合物。
8.基于11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs电化学发光免疫传感器的制备方法，包括步骤如下：
(1)以氯金酸为金源，四羟甲基氯化磷为还原剂合成非光致发光的金纳米团簇；然后以11-巯基十一烷酸为配体进行包被，制备得到金纳米团簇(MUA-AuNCs)溶液；
(2)制备11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇标记的二抗，即MUA-AuNCs|Ab2；
(3)以玻碳电极为工作电极，采用在电极表面形成夹心型免疫复合物的形式，将MUA-AuNCs|Ab2枝接并固定在玻碳电极表面，制备得到电化学发光免疫传感器。
9.根据基于11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，向11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇(MUA-AuNCs)中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化半小时，离心后沉淀复溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，加入相应的二抗37℃孵育3小时，然后用牛血清蛋白进行封闭，所得的物质即为MUA-AuNCs|Ab2；将MUA-AuNCs|Ab2离心后复溶于PBS中，在4度冰箱中储存；
优选的，步骤(3)中制备电化学发光免疫传感器的过程如下：
(i)：将玻碳电极(GCE)用氧化铝抛光处理后，再用酒精，超纯水清洗干净；以10mV/s的扫描速度，将GCE在1.0mM对氨基苯甲酸(ABA)水溶液中扫描4段2圈，扫描电位范围为0.4～1.2V，使得ABA电聚合到GCE表面，用10mM的PBS(pH＝7.4)清洗电极，除去未反应的ABA；
(ii)：向(i)所得的GCE修饰电极表面滴加乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHC)溶液活化半小时，用10mM的PBS(pH＝7.4)清洗电极，除去未反应的EDC以及NHC；
(iii)：将一抗(Ab1)溶液滴加到(ii)所得的活化电极表面，孵育3h，再用牛血清蛋白封闭电极未反应的活性位点，并清洗电极；
(iv)：将抗原(Ag)滴加到(iii)处理后的电极表面，室温孵育90min；清洗电极，再将MUA-AuNCs|Ab2滴加到电极表面进行孵育1h；基于形成免疫复合物的形式将MUA-AuNCs|Ab2枝接并固定到工作电极表面，实现电化学发光免疫传感器的制备。
10.一种电化学发光免疫传感器进行免疫检测的方法，包括步骤如下：
I：以权利要求7所述的表面修饰有包含11-巯基十一烷酸包被的金纳米团簇MUA-AuNCs的夹心型免疫复合物的玻碳电极GCE为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含10mM水合肼的pH＝7.4、100mM的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，采用循环伏安法驱动固定于GCE表面的金纳米团簇MUA-AuNCs产生电化学发光；
II：依据测试得到的电化学发光最大光强信号与待测抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
III：将各待测样品溶液按照步骤I和II中的方法进行电化学发光测试，根据所得电化学发光曲线上最大光强信号和工作曲线，检测待测样品溶液中的抗原浓度。
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