CN112147132A - 一种光谱型的近红外电化学发光免疫传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析技术方法领域,涉及一种光谱型、近红外电化学发光(~915nm)免疫传感器的制备,主要包括(1)以蛋氨酸作为稳定剂,制备能够产生近红外电化学发光的水溶性Au‑Ag双金属纳米团簇,(2)金银双金属纳米团簇标记二抗(Au‑Ag|Ab2)的制备,(3)基于夹心免疫原理,以金银双金属纳米金银团簇为标记物的光谱型近红外电化学发光传感器的制备和(4)工作曲线的绘制。所制备光谱型电化学发光免疫传感器的检测灵敏度高,其他抗原蛋白不对该发明的目标抗原传感检测产生干扰。
Description
技术领域
本发明属于分析技术方法领域,涉及一种以金银双金属纳米材料为标记物的、光谱型近红外电化学发光免疫传感器的制备方法。
背景技术
目前绝大多数电化学发光(ECL)生化分析和临床诊断均采用最大辐射波长位于红光区(620纳米)的钌联吡啶作为标记物,且以检测ECL辐射总强度的方式实现。发展辐射波段各异的新型ECL生化分析技术和检测方法对于推动ECL技术的进步具有重要意义。例如:中国专利文件CN104764737B公开了一种辐射波段位于绿光区的(550nm)、以CdSe量子点为标记物的光强型ECL免疫检测方法;中国专利文件CN102749452A公开了辐射波段位于近红外区的(780nm)、以CdTe量子点为标记物的光强型ECL免疫检测方法,实现了对甲胎蛋白抗原的特异性检测。光强型ECL生化分析技术和检测方法无法采用波段分辨的方式识别或区分非标记物ECL的辐射信息,也难以区分不同ECL标记物的辐射信息。
中国发明专利CN106053823A公布了一种以CdZnSe量子点为标记物的光谱型电化学发光免疫检测方法,该方法可以准确识别并采集标记物的ECL光谱信息,可有效排除非标记物ECL的辐射信息干扰;中国发明专利ZL2016 1 0237580.5采用光谱分辨手段识别三种不同标记物ECL辐射信息的方法实现了ECL多组分免疫分析,该方法可以准确检测辐射波段分别位于550、660和780纳米附近的三种标记物的特征辐射信息,有效避免光信号的相互干扰。发展更长波段的光谱型ECL免疫分析方法与手段对于推动ECL谱学的更广泛应用具有重要价值(Biosensors and Bioelectronics,2020,150,111880)。截止到目前,尚无辐射波段超越850纳米的光谱型ECL免疫检测方法或手段报道。
发明内容
针对现有技术的不足,尤其是电化学发光免疫传感尚未突破至850纳米以上波段的局限性,本发明以金银双金属纳米材料为标记物,提供了一种光谱型的近红外电化学发光免疫传感器制备方法,所制备免疫传感器的电化学发光辐射波段位于915纳米。
术语说明:
抗原:本发明所述的抗原(Ag)指甲胎蛋白抗原,癌胚抗原,糖类抗原125,前列腺特异性抗原等常规的抗原。
一抗:本发明所述的一抗(Ab1)指对本发明所述抗原对应产生的抗体,本发明对于上述抗原对应的单克隆抗体效果更好。
二抗:本发明所述的二抗指对上述抗原和一抗对应产生的二抗。
U的定义:在实验规定的条件下,如最适温度、最适pH、最适底物浓度时,1min内催化1μmol底物发生反应所需要的酶量作为一个酶活力国际单位U。
本发明的技术方案如下:
一种光谱型、近红外电化学发光免疫传感器的制备方法,包括步骤如下:
(1)以氯金酸为金源,硝酸银为银源,以蛋氨酸作为还原剂和稳定剂,通过蛋氨酸还原Au+和Ag+,制备得到水溶性金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs;
(2)制备金银双金属纳米团簇标记的二抗,即:Au-Ag|Ab2;
(3)采用在工作电极表面形成夹心免疫复合物的形式,将Au-Ag|Ab2枝接并固定到工作电极表面,制备光谱型近红外电化学发光免疫传感器。
根据本发明,优选的,步骤(1)中金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs的制备过程如下:
(a)将氯金酸溶液与硝酸银溶液超声混合均匀;
(b)将蛋氨酸溶液加入氢氧化钠溶液进行溶解,超声混合均匀;
(c)将步骤(a)、(b)所制的溶液混合均匀,并且调节pH值至9.0-12.0,于37摄氏度孵育6-10小时,然后将所得溶液离心去除底部大颗粒;上清液中加入硫酸溶液,再离心分离,将所得沉淀溶于氨水中,于70-90℃下孵育10-30分钟;
(d)将步骤(c)所得溶液用异丙醇离心纯化,所得沉淀即为金银双金属纳米团簇。
根据本发明,步骤(1)金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs的制备过程中,优选的条件如下:
步骤(a)中金:银摩尔比=(1-5):1,最优选2:1;
步骤(a)中氯金酸溶液的浓度为80-100mM,AgNO3溶液的浓度为5-15mM;
步骤(b)中蛋氨酸与步骤(a)中的AgNO3的摩尔比为5-25:6,最优选20:6;
步骤(c)中最后混合溶液的pH值为11.0-12.0,调节pH值后混合溶液的孵育时间为8-10小时,硫酸溶液的浓度为98wt%,氨水的浓度为2wt%;
最优选的,步骤(c)溶液混合均匀后,Au:Ag:蛋氨酸=20:10:3,摩尔比;pH值为12。
根据本发明,最优选的,步骤(1)中金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs的制备过程如下:
将0.40mM蛋氨酸、0.25mL Au(96mM)溶液与1.2mL的Ag(10mM)溶液超声混匀,加入0.6mL 1M的氢氧化钠进行溶解,超声混匀;置于37摄氏度孵育10小时,将最后所制的溶液先5000转离心去除底部大颗粒,然后加入0.5毫升的1M的硫酸溶液,在8000转下离心,去掉上清液,将最后离心所得的沉淀加入3毫升2%的氨水,在烘箱80℃下孵育20分钟;最后将制的量子点用异丙醇在13300转下离心,得到金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs,保存在4℃的冰箱当中。
根据本发明,优选的,步骤(2)中制备金银双金属纳米团簇标记的二抗,即:Au-Ag|Ab2,的过程如下:
向金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化半小时,离心后复溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,加入相应的二抗37℃孵育3小时,然后用牛血清蛋白进行封闭,所得的物质即为Au-Ag|Ab2;将Au-Ag|Ab2复溶于PBS中,于4度冰箱中储存。
根据本发明,优选的,步骤(3)中电化学发光免疫传感器的制备过程如下:
(i):将玻碳电极(GCE)用氧化铝抛光处理后,再用酒精,超纯水清洗干净。以10mV/S的扫描速度,将GCE在1.0mM对氨基苯甲酸(ABA)水溶液中扫描4段2圈,扫描电位范围为0.4V-1.2V,使的ABA电聚合到GCE表面,用10mM的PBS(pH=7.4)缓冲液清洗电极,除去未反应的ABA;
(ii):向(i)所得的修饰电极表面滴加EDC和NHC溶液,活化半小时,用10mM的PBS(pH=7.4)清洗电极,除去未反应的EDC以及NHC。
(iii):将一抗(Ab1)溶液滴加到(ii)所得的活化电极表面,孵育3h,再用牛血清蛋白封闭电极未反应的活性位点,清洗电极。
(iv):将抗原(Ag)滴加到(3)处理后的电极表面,室温孵育90min。清洗电极,再将Au-Ag|Ab2滴加到电极表面进行孵育1h;采用在工作电极表面形成夹心免疫复合物的形式,将Au-Ag|Ab2枝接并固定到工作电极表面,实现光谱型近红外电化学发光免疫传感器的制备。
根据本发明,优选的,步骤(2)、(3)中所述的牛血清蛋白的体积分数为2%。
根据本发明,优选的,骤(3)中所述的抗原(Ag)为甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、糖类抗原或前列腺特异性抗原。
根据本发明,优选的,步骤(2)、(3)中所述的缓冲溶液PBS、Tris-Hcl缓冲溶液或B-R缓冲溶液中的一种,所述的PBS为K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液;
优选的,步骤(iii)中冲洗电极所用冲洗液为PBST溶液,溶液的指标如下:0.01mol/L PBS中含0.025mol/L吐温20,pH=7.4。
本发明还提供一种光谱型、近红外电化学发光的免疫检测方法,包括步骤如下:
I:以上述制备得到的表面修饰有免疫复合物和金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs的GCE为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极,在含10mM的三乙醇胺(TEOA)的PBS中,采用循环伏安法驱动固定于GCE表面的金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs产生电化学发光;
II:以曝光成像方式收集电化学发光全过程的所有光子,并基于色散电化学发光辐射全部光子的方式获取总光谱;依据光谱曲线上最大辐射波长处光强与待测抗原标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
III:将各待测样品溶液按照步骤I和II中的方法进行电化学发光光谱测试,根据所得电化学发光光谱曲线上最大辐射波长处的光强信号和工作曲线,检测待测样品溶液中的抗原浓度。
本发明的原理:
本发明采用蛋氨酸包被的金银双金属纳米团簇为标记物;金银双金属纳米团簇表面的羧基可在被EDC和NHS活化后枝接第二抗体表面的氨基,实现第二抗体的标记。。
本发明采用在电聚合条件下形成碳氮键的方式将对氨基苯甲酸(ABA)枝接到工作电极GCE表面,并通过采用EDC和NHS进一步活化GCE表面ABA的羧基的方式完成枝接第一抗体。
本发明中电化学发光光谱采集的硬件装置参考-《一种可准确采集电致化学发光光谱信息的检测系统》ZL2016 2 0300698.3中所构建的电化学发光光谱采集系统。该系统采用将VersaSTAT 3型电化学分析仪与Acton SP-2300型CCD光栅光谱仪联用的方式实现光谱采集。本发明中电化学发光光谱的采集方式参考-《一种基于光谱分辨原理的电致化学发光多组分免疫检测方法》ZL2016 1 0237580.5中所构建的电化学发光免疫分析之光谱采集方法,所采用的电势窗口为0~1.6伏,扫描速度为50毫伏/秒,起始电位为0V,初扫向正。
本发明的有益效果:
1、本发明方法的选择性高。本发明构建的光谱型电化学发光免疫传感器是基于抗原和抗体之间的特异性识别和结合构建的,因此待测液中的干扰蛋白并不能与抗原第一抗体和第二抗体结合,对本发明检测体系无干扰。
2、本发明方法操作简单,重复性好,对临床早期诊断癌症具有重要的科学意义和应用价值。
3、本发明方法采用收集电化学发光辐射全过程的全部光子成谱的原理开展免疫分析,所得特征波长下的光强强度大,能够灵敏检测糖类蛋白125抗原,检测限可达0.05mU/mL,线性范围0.5mU-1U。通过特征波长的选择,可以有效区分与消除非标记物ECL辐射的干扰,有助于进一步提升分析传感的准确性和选择性。
4、本发明的电化学发光辐射波段位于915纳米,与现有光谱型多组分免疫分析技术结合后,能够进一步丰富多组分研究的内容和检出指标信息。
附图说明
图1为实施例1中所制的金银双金属纳米团簇的荧光光谱图。
图2为实施例2中所制的金银双金属纳米团簇的紫外光谱图。
图3为实施例3中所制的金银双金属纳米团簇的高倍透射电镜照片。
图4为实施例4中所制的金银双金属纳米团簇的差分脉冲伏安曲线图。
图5为实施例5中没有添加任何量子点空白样的电化学发光光强图。
图6为实施例6中所制的双金属纳米团簇的电化学发光光强图。
图7为实施例7中裸玻碳电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图。
图8为实施例8中制得电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图。
图9为实施例9中制得电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图。
图10为实施例10中制得电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图。
图11为实施例11中制得近红外单色ECL传感器的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线图。
图12为实施例12中所制的糖类抗原125浓度为1U的双金属金银量子点为标记物的近红外单色免疫传感器的电化学发光光谱图。
图13为实施例13中所制的糖类抗原125浓度为0.5U的双金属金银量子点为标记物的近红外单色免疫传感器的电化学发光光谱图。
图14为实施例14中所制的糖类抗原125浓度为0.2U的双金属金银量子点为标记物的近红外单色免疫传感器的电化学发光光谱图。
图15为实施例15中所制的糖类抗原125浓度为0.05U的双金属金银量子点为标记物的近红外单色免疫传感器的电化学发光光谱图。
图16为实施例16中所制的糖类抗原125浓度为0.01U的双金属金银量子点为标记物的近红外单色免疫传感器的电化学发光光谱图。
图17为实施例17中所制的糖类抗原125浓度为0.005U的双金属金银量子点为标记物的近红外单色免疫传感器的电化学发光光谱图。
图18为实施例18中所制的糖类抗原125浓度为0.001U的双金属金银量子点为标记物的近红外单色免疫传感器的电化学发光光谱图。
图19为实施例19中所制的糖类抗原125浓度为0.0005U的双金属金银量子点为标记物的近红外单色免疫传感器的电化学发光光谱图。
图20为实施例20中所制的糖类抗原125浓度为0.00005U的双金属金银量子点为标记物的近红外单色免疫传感器的电化学发光光谱图。
图21为实施例21中所制的糖类抗原125浓度为0U的双金属金银量子点为标记物的近红外单色免疫传感器的电化学发光光谱图。
图22为实施例22中所制的糖类抗原125的双金属金银量子点为标记物的近红外单色免疫传感器的工作曲线。
图23为实施例23中所制的传感器的选择性谱图。
图24为本发明传感器的机理图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明,但不限于此。
实施例1
将所有的器皿用新鲜制得的王水泡24小时,用超纯水和乙醇彻底冲洗,然后在空气中干燥;将0.4mM的蛋氨酸,0.25mL的Au溶液(96mM)与1.2mL的Ag溶液(10mM)溶于4ml超纯水超声混匀,加入1M的氢氧化钠超声混匀调节pH值于12.0,置于37摄氏度孵育10小时。将所制的溶液在5000转下离心去除底部大颗粒,上清液加入0.5毫升的1M的硫酸溶液,在8000转下离心沉淀初始金纳米颗粒,去掉上清液,将最后离心所得的沉淀加入3mL 2%的氨水,在烘箱80℃下孵育20分钟,最后将制的量子点用异丙醇在13300转下离心,保存在4℃的冰箱当中,双金属纳米团簇溶液固定浓度1mg/mL测试荧光光谱图,如图1所示。
双金属纳米团簇标记二抗的制备(Au-Ag|Ab2):向双金属纳米团簇中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHC)活化半小时,离心后复溶于磷酸盐缓冲溶液中,加入相应的二抗37℃孵育3小时以及牛血清蛋白进行封闭,复溶于磷酸盐缓冲溶液中并且4度冰箱中储存,所得的物质即为Au-Ag NCs-Ab2。
以金银双金属纳米团簇为标记物的光谱型近红外电化学发光免疫传感器的制备:
(1):将玻碳电极(GCE)用氧化铝抛光处理后,再用酒精,超纯水清洗干净。以10mV/S的扫描速度,将GCE在1.0mM对氨基苯甲酸(ABA)水溶液中扫描4段2圈,扫描电位范围为0.4V-1.2V,使的ABA电聚合到GCE表面,用10mM的PBS(pH=7.4)缓冲液清洗电极,除去未反应的ABA;
(2):向(1)所得的修饰电极表面滴加乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHC)溶液,活化半小时,用10mM的磷酸盐(pH=7.4)缓冲液清洗电极,除去未反应的EDC以及NHC。
(3):将一抗(Ab1)溶液滴加到(2)所得的活化电极表面,孵育3h,再用牛血清蛋白封闭电极未反应的活性位点。
(4):将抗原(Ag)滴加到(3)处理后的电极表面,室温孵育90min。清洗电极,再将Au-Ag|Ab2滴加到电极表面进行孵育1h,即得光谱型近红外电化学发光免疫传感器。
实施例2
步骤同实施例1,所不同的是:双金属纳米团簇溶液测试方法为紫外光谱图,如图2所示。
实施例3
步骤同实施例1,所不同的是将制备好的双金属纳米团簇溶液滴于铜网观察形貌。测试所制的金银双金属纳米团簇的高倍透射电镜照片,如图3所示。
实施例4
步骤同实施例1,不同的是:电化学方法为差分脉冲伏安法,双金属纳米团簇测试的电化学谱图,如图4所示。
实施例5
步骤同实施例1,所不同的是:电化学方法为循环伏安驱动的电化学发光光强方法,并且没有添加任何量子点的空白样,空白样的电化学发光光强图如图5所示。
实施例6
步骤同实施例1,所不同的是:电化学方法为循环伏安驱动的电化学发光光强方法,双金属纳米团簇的电化学发光光强图如图6所示。
实施例7
将玻碳电极用氧化铝抛光处理后,再用酒精,超纯水清洗干净。用铁氰化钾进行循环扫描进行测试。裸玻碳电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线如图7所示。
实施例8
步骤同实施例7后,将玻碳电极(GCE)用氧化铝抛光处理后,再用酒精,超纯水清洗干净。以10mV/S的扫描速度,将GCE在1.0mM对氨基苯甲酸(ABA)水溶液中扫描4段2圈,扫描电位范围为0.4V-1.2V,使的ABA电聚合到GCE表面,用10mM的PBS(pH=7.4)缓冲液清洗电极,除去未反应的ABA。制得电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线如图8所示。
实施例9
步骤同实施例8后,向修饰后的电极滴加乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHC)活化半小时,用10mmol/L的磷酸盐(pH=7.4)缓冲液清洗电极,除去未反应的EDC以及NHC,用铁氰化钾进行循环扫描进行测试。制得电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线如图9所示。
实施例10
步骤同实施例9后,将一抗(Ab1)滴加到活化后的电极上孵育3h,再用牛血清蛋白封闭电极未反应的活性位点。用铁氰化钾进行循环扫描进行测试,制得电极的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线如图10所示。
实施例11
双金属纳米团簇标记二抗的制备(Au-Ag|Ab2):向双金属纳米团簇中加入EDC和NHC活化半小时,离心后复溶于磷酸盐缓冲溶液中,加入第二抗体37℃孵育3小时、采用牛血清蛋白封闭未反应活性位点,所得的物质即为Au-Ag|Ab2。将Au-Ag|Ab2复溶于磷酸盐缓冲溶液中并且4度冰箱中储存。
以金银双金属纳米团簇为标记物的光谱型近红外电化学发光免疫传感器的制备:
(1):将玻碳电极(GCE)用氧化铝抛光处理后,再用酒精,超纯水清洗干净。以10mV/S的扫描速度,将GCE在1.0mM对氨基苯甲酸(ABA)水溶液中扫描4段2圈,扫描电位范围为0.4V-1.2V,使的ABA电聚合到GCE表面,用10mM的PBS(pH=7.4)缓冲液清洗电极,除去未反应的ABA;
(2):向(1)所得的修饰电极表面滴加EDC和NHC溶液,活化半小时,用10mM的磷酸盐(pH=7.4)缓冲液清洗电极,除去未反应的EDC以及NHC。
(3):将一抗(Ab1)溶液滴加到(2)所得的活化电极表面,孵育3h,再用牛血清蛋白封闭电极未反应的活性位点,清洗电极。
(4):将浓度为1U的糖类抗原125抗原(Ag)滴加到步骤(3)处理后的电极表面,室温孵育90min。清洗电极,再将制得的Au-Ag NCs-Ab2滴加到电极表面进行孵育1h,得到光谱型近红外电化学发光免疫传感器。制得免疫传感器的铁氰化钾扫描的循环伏安曲线如图11所示。
实施例12
步骤同实施例11,所不同的是:测试方法为循环伏安驱动的电化学发光光谱图谱,光谱型近红外电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图谱如图12所示。
实施例13
步骤同实施例12,所不同的是:步骤(4)中加的抗原为0.5U,光谱型近红外电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图13所示。
实施例14
步骤同实施例12,所不同的是:步骤(4)中加的抗原为0.2U,光谱型近红外电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图14所示。
实施例15
步骤同实施例12,所不同的是步骤(4)中加的抗原为0.05U,近红外电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图15所示。
实施例16
步骤同实施例12,所不同的是步骤(4)中加的抗原为0.01U,近红外电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图16所示。
实施例17
步骤同实施例12,所不同的是步骤(4)中加的抗原为0.005U,近红外电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图17所示。
实施例18
步骤同实施例12,所不同的是步骤(4)中加的抗原为0.001U,近红外电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图18所示。
实施例19
步骤同实施例12,所不同的是步骤(4)中加的抗原为0.0005U,近红外电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图19所示。
实施例20
步骤同实施例12,所不同的是步骤(4)中加的抗原为0.00005U,近红外电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图20所示。
实施例21
步骤同实施例12,所不同的是步骤(4)中加的抗原为0U,近红外电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图21所示。
实施例22
光谱型近红外电化学发光免疫检测方法,包括步骤如下:
I:以上述制备得到的表面修饰有免疫复合物和金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs的GCE为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极,在含10mM的三乙醇胺(TEOA)的PBS中,采用循环伏安法驱动固定于GCE表面的金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs产生电化学发光;
II:以曝光成像方式收集电化学发光全过程的所有光子,并基于色散电化学发光辐射全部光子的方式获取总光谱;依据光谱曲线上最大辐射波长处光强与待测抗原标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
本实施例中,用于检测糖类抗原125的光谱型、近红外电化学发光免疫传感器的工作曲线如图22所示。
III:将各待测样品溶液按照步骤I和II中的方法进行电化学发光光谱测试,根据所得电化学发光光谱曲线上最大辐射波长处的光强信号和工作曲线,检测待测样品溶液中的抗原浓度。
实施例23
步骤同实施例12,确定该传感器的选择性。所不同的是:步骤(4)中抗原分别为空白,甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、糖类抗原125以及四种检测物的混合物。本实施例中传感器的选择性谱图如图23所示。由图23所示,本实施例中制得的传感器为对糖类抗原125选择性良好,其他抗原蛋白不对该发明的目标抗原传感检测产生干扰。
Claims (10)
1.一种光谱型近红外电化学发光免疫传感器的制备方法,包括步骤如下:
(1)以氯金酸为金源,硝酸银为银源,以蛋氨酸作为还原剂和稳定剂,通过蛋氨酸还原Au+和Ag+,制备得到水溶性金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs;
(2)制备金银双金属纳米团簇标记的二抗Au-Ag|Ab2;
(3)采用在工作电极表面形成夹心免疫复合物的形式,将Au-Ag|Ab2枝接并固定到工作电极表面,制备光谱型近红外电化学发光免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的免疫传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)中金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs的制备过程如下:
(a)将氯金酸(H4AuCl4)溶液与硝酸银(AgNO3)溶液超声混合均匀;
(b)将蛋氨酸溶液加入氢氧化钠溶液进行溶解,超声混合均匀;
(c)将步骤(a)、(b)所制的溶液混合均匀,并且调节pH值至9.0-12.0,于37摄氏度孵育6-10小时,然后将所得溶液离心去除底部大颗粒;上清液中加入硫酸溶液,再离心分离,将所得沉淀溶于氨水中,于70-90℃下孵育10-30分钟;
(d)将步骤(c)所得溶液用异丙醇离心纯化,所得沉淀即为金银双金属纳米团簇。
3.根据权利要求2所述的免疫传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs的制备过程中,条件如下:
步骤(a)中金:银摩尔比=(1-5):1;
步骤(a)中氯金酸溶液的浓度为80-100mM,硝酸银溶液的浓度为5-15mM;
步骤(b)中蛋氨酸与步骤(a)中的硝酸银的摩尔比为5-25:6;
步骤(c)中最后混合溶液的pH值为11.0-12.0,调节pH值后混合溶液的孵育时间为8-10小时,硫酸溶液的浓度为98wt%,氨水的浓度为2wt%。
4.根据权利要求2所述的免疫传感器的制备方法,其特征在于,步骤(c)所述溶液混合均匀后,Au:Ag:蛋氨酸=20:10:3,摩尔比;pH值为12。
5.根据权利要求2所述的免疫传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)中金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs的制备过程如下:
将0.40mM蛋氨酸,0.25mL氯金酸溶液(96mM)溶液与1.2mL硝酸银溶液(10mM)溶液超声混匀,加入0.6mL 1M的氢氧化钠进行溶解,超声混匀;置于37摄氏度孵育10小时,将最后所制的溶液先5000转离心去除底部大颗粒,然后加入0.5毫升的1M的硫酸溶液,在8000转下离心,去掉上清液,将最后离心所得的沉淀加入3毫升2%的氨水,在烘箱80℃下孵育20分钟;最后将制的量子点用异丙醇在13300转下离心,得到金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs,保存在4℃的冰箱当中。
6.根据权利要求1所述的免疫传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中制备金银双金属纳米团簇标记的二抗Au-Ag|Ab2的过程如下:
向金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化半小时,离心后所得沉淀复溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,加入相应的二抗37℃孵育3小时,然后用牛血清蛋白进行封闭,所得的物质即为Au-Ag|Ab2,可溶于PBS且在4度冰箱中储存。
7.根据权利要求1所述的免疫传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中制备光谱型、近红外电化学发光免疫传感器的过程如下:
(i):将玻碳电极(GCE)用氧化铝抛光处理后,再用酒精,超纯水清洗干净;以10mV/S的扫描速度,将GCE在1.0mM对氨基苯甲酸(ABA)水溶液中扫描4段2圈,扫描电位范围为0.4V-1.2V,使的ABA电聚合到GCE表面,用10mM的PBS(pH=7.4)清洗电极,除去未反应的ABA;
(ii):向(i)所得的GCE修饰电极表面滴加乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及羟基琥珀酰亚胺(NHC)溶液,活化半小时,用10mM的PBS(pH=7.4)清洗电极,除去未反应的EDC以及NHC;
(iii):将一抗(Ab1)溶液滴加到(ii)所得的活化电极表面,孵育3h,再用牛血清蛋白封闭电极未反应的活性位点,并清洗电极;
(iv):将抗原(Ag)滴加到(iii)处理后的电极表面,室温孵育90min;清洗电极,再将Au-Ag|Ab2滴加到电极表面进行孵育1h;基于形成免疫复合物的形式将Au-Ag|Ab2枝接并固定到工作电极表面,实现光谱型、近红外电化学发光免疫传感器的制备。
8.根据权利要求7所述的免疫传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述的牛血清蛋白的体积分数为2%;
所述的抗原(Ag)为甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、糖类抗原或前列腺特异性抗原。
9.根据权利要求7根据权利要求所述的免疫传感器的制备方法,其特征在于,步骤(iii)中冲洗电极所用冲洗液为PBST溶液,溶液的指标如下:0.01mol/L PBS中含0.02%吐温20,pH=7.4。
10.一种光谱型、近红外电化学发光的检测方法,包括使用权利要求1-9任一项所述的夹心免疫传感器,包括步骤如下:
I:以表面修饰有免疫复合物和金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs的GCE为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极,在含10mM的三乙醇胺(TEOA)的PBS中,采用循环伏安法驱动固定于GCE表面的金银双金属纳米团簇Au-Ag NCs产生电化学发光;
II:以曝光成像方式收集电化学发光全过程的所有光子,并基于色散电化学发光辐射全部光子的方式获取总光谱;依据光谱曲线上最大辐射波长处光强与待测抗原标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
III:将各待测样品溶液按照步骤I和II中的方法进行电化学发光光谱测试,根据所得电化学发光光谱曲线上最大辐射波长处的光强信号和工作曲线,检测待测样品溶液中的抗原浓度。
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