CN106770161A - 一种食源性致病菌的快速检测方法 - Google Patents

一种食源性致病菌的快速检测方法 Download PDF

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赵勇
林艳宁
王倩
巴永兵
王娟娟
张先翼
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Abstract

一种食源性致病菌的快速检测方法，步骤为：对加有食源性致病菌标准菌株菌液的纳米银增强柱进行扫描，获取其对应的表面增强拉曼光谱及其特征峰、拉曼峰强度与对应致病菌数量的线性比例关系；以这些数据为依据建立起对应各致病菌种类和数量的拉曼光谱数据库；将被测样品前处理后的样品液滴加到纳米银增强柱上，扫描获取其表面增强拉曼光谱；将被测样品的表面增强拉曼光谱与拉曼光谱数据库数据进行比对，若被测样品拉曼光谱中具有数据库中某种致病菌株表面增强拉曼光谱的所有特征峰，则判定被测样品中具有该菌种，反之则无；以被测样品的表面增强拉曼光谱与数据库中不同浓度的光谱数据进行检索匹配，来确定被测样品中该菌种的数量。

Description

一种食源性致病菌的快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种食源性致病菌的快速检测方法，属于食源性致病菌检测技术领域。
背景技术
近些年来，世界各地的食品安全事故频繁发生，其中，食源性疾病的爆发率一直处在上升状态，食源性疾病与食品污染已成为一个巨大的并正在不断扩展的世界性公共卫生问题。
食源性疾病多由食源性致病菌引起，因此，如何快速灵敏地检测出食源性致病菌的存在已成为控制食品安全的关键所在。
目前已知的食源性致病菌包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，其中，革兰氏阴性菌以沙门氏杆菌CMCC50041和副溶血性弧菌ATCC17802为代表，革兰氏阳性菌以单增李斯特菌ATCC19115为代表最具危险性。
食源性致病菌的传统检测方法都要经过分离培养、生化鉴定等步骤，存在着操作步骤繁琐、耗时多、检测灵敏度低和容易出现假阴性等缺点，在应对突发性食品安全公共事件上，不能满足快速、准确、灵敏和特异性高等要求。
虽然现在已经有了一些食源性疾病的快速检测技术，包括如常规检测方面的微生物专有酶快速反应技术、疏水性栅格滤膜法技术，免疫学检测方面的免疫磁性分离技术、免疫扩散技术，代谢学检测方面的电阻抗技术、微量量热技术、ATP生物发光技术，分子生物学检测方面的DNA探针技术、聚合酶链式反应技术等，但应用这些快速检测技术时，样品的前处理同样极其复杂耗时，且实验准确性还会受到工作人员操作技能的影响。
中国专利文献CN102115778A公开了一种对“食源性致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法”。虽然该技术方案通过采用表面增强拉曼光谱检测技术进行聚类分析，在实现对多种食源性致病菌具有理想、快速的检测效果方面提出了一种解决方案。
但是，根据本发明人对采用表面增强拉曼光谱检测技术的深入研究，发现上述技术方法依然存在以下缺陷：
其一，不仅需要将预处理好的细菌样品与增强基底混合振荡后才能进行加测，而且在进行振荡时需要限定金或银纳米溶胶的使用量与致病菌的用量在数量上的匹配；
其二，该方法采用蒸馏水清洗细菌，考虑到蒸馏水在和细菌接触清洗的过程会影响细菌的渗透压、导致细菌死亡，从而影响检测活菌的准确度；
其三，该方法在获得细菌光谱后，对其进行聚类分析，后续未知细菌样品则利用聚类分析结合细菌光谱特征峰来对细菌进行区分；这一分析过程依然显得比较繁琐；
其四，上述分析方法采用的样品为纯菌样品，没有针对实际样品中存在的细菌检测提出，因此其针对性存在一定的距离。
鉴于上述分析，本发明人认为提供一种切实可行、既能够快速，又具有更加正确的检测多种食源性致病菌的方法，依然是相关领域迫切需要解决的课题。
发明内容
本发明的目的：旨在为克服现有技术的不足，提供一种食源性致病菌的快速检测方法，以期达到简化检测步骤、缩短检测时间的目的。
为达上述目的，本发明提供如下的技术方案：
这种食源性致病菌的快速检测方法，包括如下步骤：
a)使用拉曼光谱仪，设定扫描条件为输出功率30mw、探测波长为785nm、扫描时间为5s，对加有食源性致病菌：沙门氏杆菌CMCC50041、副溶血性弧菌ATCC17802、单增李斯特菌ATCC19115标准菌株菌液的纳米银增强柱进行扫描，确定具有731cm-1、798cm-1、1646cm-1特征峰的为沙门氏杆菌CMCC50041表面增强拉曼光谱，具有573cm-1、898cm-1、1149cm-1特征峰的为副溶血性弧菌ATCC17802表面增强拉曼光谱，具有566cm-1、895cm-1、1414cm-1特征峰的为单增李斯特菌ATCC19115表面增强拉曼光谱；
b)将上述致病菌标准菌株的表面增强拉曼光谱、以及各标准菌株表面增强拉曼光谱拉曼峰强度与对应标准菌株数量的线性比例关系，建立起对应各标准菌株种类和数量的拉曼光谱数据库；
c)对被测样品进行前处理，得到样品液后滴加到纳米银增强柱上，以步骤a)相同的扫描条件对其进行扫描，获取被测样品的表面增强拉曼光谱以及各表面增强拉曼光谱拉曼峰强度数据；
d)将上述被测样品的表面增强拉曼光谱与步骤b)建立的拉曼光谱数据库数据进行匹配比对，若被测样品中的某一表面增强拉曼光谱具有数据库中某种致病菌标准菌株表面增强拉曼光谱中的所有特征峰，则判定被测样品中具有该菌种，反之则无；以被测样品的表面增强拉曼光谱与数据库里不同浓度的光谱数据进行检索匹配，来确定被测样品中该菌种的数量。
所述的标准菌株菌液为标准菌株活化后经36-38℃液体培养8-9小时至对数期，然后用生理盐水将培养液清洗、并经重悬浮操作后所得到的细菌悬浮液。
所述的样品液是由被测样品与生理盐水按重量体积比1:8-12的比例混合后，放入均质袋中，在均质机中拍打2-5分钟；然后取其上清液，在600-1000rpm、3-5℃条件下离心处理5-10分钟，再将上清液转移到离心管中得到样品粗液，将样品粗液再用生理盐水清洗、并经重悬浮操作后得到细菌悬浮液。
上述操作中，所述的生理盐水其重量体积比浓度为0.85％。
上述操作中，所述的重悬浮操作是将清洗后的培养液或样品粗液在3500-4500rpm、3-5℃条件下离心处理3-8分钟，
与现有技术相比，本发明提供的食源性致病菌快速检测方法其有益效果和显著进步在于：
1)本发明利用了表面增强拉曼光谱技术，通过对食源性致病菌标准菌株菌液的扫描，获取其表面增强拉曼光谱及其特征峰和拉曼强度数据，依此作为被测样品菌种和菌量的表面增强拉曼光谱的对比标准，由此达到只需通过比对被测样品表面增强拉曼光谱中是否出现对比标准中的特征峰，就可以判定被测样品中是否含有特征峰所对应的致病菌，进一步还可以根据被测样品中该致病菌的拉曼光谱与数据库中已知浓度光谱的检索匹配测出样品中该致病菌的数量。
2)本发明提供的检测方法在建立了食源性致病菌标准菌株表面增强拉曼光谱图数据库后，对被测样品致病菌的检测只需先对被测样品进行25分钟左右的简单处理、再经5分钟左右的拉曼光谱测定和数据比对就可完成，比现有技术需要7-8小时才能获得检测结果不仅简化了食源性致病菌的检测步骤，还极大地缩短了检测时间，为食品安全提供了有效技术保障；
3)本发明提供的食源性致病菌检测方法具有操作简单、快速、准确、灵敏度高等特点，因而极具推广应用价值。
附图说明
图1为食源性致病菌标准菌株的表面增强拉曼光谱图。
图中：
沙门氏杆菌CMCC50041其表面增强拉曼光谱特征峰为731cm-1、798cm-1、1646cm-1；
副溶血性弧菌ATCC17802其表面增强拉曼光谱特征峰为573cm-1、898cm-1、1149cm-1；
单增李斯特菌ATCC19115其表面增强拉曼光谱特征峰为566cm-1、895cm-1、1414cm-1。
具体实施方式
表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)是一种高灵敏的拉曼检测技术，以金属纳米结构介导信号增强，相比普通拉曼光谱具有更高的分辨率和灵敏度，其原理是在特殊制备的一些贵金属表面或溶胶中，样品表面或近表面的电磁场的增强，导致产生吸附分子的拉曼散射信号比普通拉曼散射信号大大增强的现象出现，这种信号增强可达6～14个数量级。
由于SERS能有效避免溶液相中相同物质的信号干扰，具有极高的灵敏度和表面选择性，能获得高质量的表面拉曼信号，实现高达1014倍的单分子拉曼信号增强，因此，在低浓度分析物的检测方面极具优势，能够清晰显示出被测样品的特征峰，为定性分析提供了基础。
拉曼光谱依赖于激发光的非弹性散射和分子间的振动产生指纹图谱，具有快速检测多种化学、生物物质的能力，以此来鉴别特定的待检分子，可进行实时检测。
由于水的拉曼效应很弱，使得拉曼光谱对水环境中的生物样品检测非常有效。因此，利用不同的食源性致病菌有不同的振动拉曼光谱的这一特点，经过简单样品前处理，就可以在几分钟之内完成食源性致病菌的检测，弥补了现有技术对食品中食源性致病菌进行检测时，须进行长时间繁琐前期处理操作这一缺点，简化了检测步骤，缩短了检测时间。
结合实施例对本发明提供的一种食源性致病菌的快速检测方法作进一步详细说明。
实施例
a)获取标准菌株的表面增强拉曼光谱
分别将沙门氏杆菌CMCC50041、副溶血性弧菌ATCC17802、单增李斯特菌ATCC19115的标准菌株活化，然后分别在36～38℃条件下液体培养8～9小时至对数期，再分别用重量体积比为0.85％的生理盐水将菌液清洗3次，各自吸取1mL菌液，进行4000rpm、4℃条件下离心5min的重悬浮操作，然后，再吸取不同菌种的菌液4μL，分别加到纳米银增强柱上，在拉曼光谱仪输出功率为30mw、探测波长为785nm条件下，扫描5秒钟，获取各标准菌株的表面增强拉曼光谱。
如图1所示的食源性致病菌标准菌株表面增强拉曼光谱图所示：
沙门氏杆菌CMCC50041其表面增强拉曼光谱特征峰为731cm-1、798cm-1、1646cm-1；
副溶血性弧菌ATCC17802其表面增强拉曼光谱特征峰为573cm-1、898cm-1、1149cm-1；
单增李斯特菌ATCC19115其表面增强拉曼光谱特征峰为566cm-1、895cm-1、1414cm-1。
b)建立对应标准菌株的拉曼光谱数据库
将上述各致病菌标准菌株的表面增强拉曼光谱包括其特征峰数据、以及各标准菌株表面增强拉曼光谱拉曼峰强度与对应标准菌株数量的线性比例关系，建立起对应各标准菌株种类和数量的拉曼光谱数据库；
还可进一步地根据标准菌株对应的表面增强拉曼光谱中拉曼峰的强度，结合标准菌株菌液的浓度、加在纳米银增强柱上的数量等数据，通过检索已建立好的数据库得出相关的菌株数量；以此，建立起对应标准菌株的拉曼光谱数据库。
c)获取被测样品的表面增强拉曼光谱
取已被食源性致病菌污染过的被测样品若干，按重量体积比为1:10的比例加入体积比浓度为0.85％的生理盐水，混合后放入均质袋中，用均质机拍打2min,然后取2mL上清液，在800rpm、4℃条件下进行离心分离处理8min,弃沉淀后将上清液转移到1.5mL离心管内，获取样品粗液；然后将样品粗液用重量体积浓度为0.85％的生理盐水清洗3次，再进行4000rpm、4℃条件下进行离心分离处理5min的重悬浮操作，其悬浮液即为样品液；
然后，吸取4μL样品液，滴加到纳米银增强柱上，以实施例步骤a)相同的扫描条件对其进行扫描，获取被测样品的表面增强拉曼光谱。
d)确定被测样品中食源性致病菌的种类和数量
将上述获取的被测样品表面增强拉曼光谱与实施例步骤b)建立的拉曼光谱数据库内的数据进行匹配比较，以被测样品中是否具有数据库中某种致病菌株的表面增强拉曼光谱特征峰来判断被测样品中是否具有该菌种：
若被测样品中的表面增强拉曼光谱中包含731cm-1、798cm-1、1646cm-1这几个峰值，就可以判定被测样品中含有沙门氏杆菌CMCC50041；
若被测样品中的表面增强拉曼光谱中包含573cm-1、898cm-1、1149cm-1；这几个峰值，就可以判定被测样品中含有副溶血性弧菌ATCC17802；
若被测样品中的表面增强拉曼光谱中包含566cm-1、895cm-1、1414cm-1这几个峰值，就可以判定被测样品中含有单增李斯特菌ATCC19115；
以被测样品的拉曼光谱与数据库中对应的菌株的不同浓度光谱数据进行检索、比对，就可得出被测样品中该菌种的数量。
综上所述可见：
通过对食源性致病菌标准菌株菌液的扫描获取其表面增强拉曼光谱并以此作为被测样品表面增强拉曼光谱的对比标准，只需对被测样品进行25分钟左右的简单处理，再经5分钟左右的简单处理，再经5分钟左右的拉曼光谱测定和数据对比，就可完成对食源性致病菌种类和数量的检测。
显然，相对于现在已有的检测技术需要7-8个小时才能获得的检测结果，采用本方法则在30分钟左右的时间即可完成。不仅大大简化了食源性致病菌的检测步骤，还能及大地缩短检测时间；为保证食品安全提供了新的可靠检测手段，具有广泛的推广价值。
最后，有必要说明的是：
上述内容仅用于帮助理解本发明的技术方案，不能理解为对本发明保护范围的限制；本领域技术人员根据本发明提供的上述内容所做出的非本质改进和调整，均属本发明所要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种食源性致病菌的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)使用拉曼光谱仪，设定扫描条件为输出功率30mw、探测波长为785nm、扫描时间为5s，对加有食源性致病菌：沙门氏杆菌CMCC50041、副溶血性弧菌ATCC17802、单增李斯特菌ATCC19115标准菌株菌液的纳米银增强柱进行扫描，确定具有731cm-1、798cm-1、1646cm-1特征峰的为沙门氏杆菌CMCC50041表面增强拉曼光谱，具有573cm-1、898cm-1、1149cm-1特征峰的为副溶血性弧菌ATCC17802表面增强拉曼光谱，具有566cm-1、895cm-1、1414cm-1特征峰的为单增李斯特菌ATCC19115表面增强拉曼光谱；
b)将上述致病菌标准菌株的表面增强拉曼光谱、以及各标准菌株表面增强拉曼光谱拉曼峰强度与对应标准菌株数量的线性比例关系，建立起对应各标准菌株种类和数量的拉曼光谱数据库；
c)对被测样品进行前处理，得到样品液后滴加到纳米银增强柱上，以步骤a)相同的扫描条件对其进行扫描，获取被测样品的表面增强拉曼光谱以及各表面增强拉曼光谱的特征峰数据；
d)将上述被测样品的表面增强拉曼光谱与步骤b)建立的拉曼光谱数据库数据进行匹配比对，若被测样品中的某一表面增强拉曼光谱具有数据库中某种致病菌标准菌株表面增强拉曼光谱中的所有特征峰，则判定被测样品中具有该菌种，反之则无；以被测样品的表面增强拉曼光谱与数据库中不同浓度的光谱数据进行检索匹配，来确定被测样品中该菌种的数量。
2.根据权利要求1所述的一种食源性致病菌的快速检测方法，其特征在于：所述的样品液是由被测样品与生理盐水按重量体积比1:8-12的比例混合后，放入均质袋中，在均质机中拍打2-5分钟；然后取其上清液，在600-1000rpm、3-5℃条件下离心处理5-10分钟，再将上清液转移到离心管中得到样品粗液，将样品粗液再用生理盐水清洗、并经重悬浮操作后得到细菌悬浮液。
3.根据权利要求1所述的一种食源性致病菌的快速检测方法，其特征在于：所述的标准菌株菌液为标准菌株活化后经36-38℃液体培养8-9小时至对数期，然后用生理盐水将培养液清洗、并经重悬浮操作后所得到的细菌悬浮液。
4.根据权利要求1所述的一种食源性致病菌的快速检测方法，其特征在于：所述的样品液是由被测样品与生理盐水按重量体积比1:8-12的比例混合后，放入均质袋中，在均质机中拍打2-5分钟；然后取其上清液，在600-1000rpm、3-5℃条件下离心处理5-10分钟，再将上清液转移到离心管中得到样品粗液，将样品粗液再用生理盐水清洗、并经重悬浮操作后得到细菌悬浮液。
5.根据权利要求2或3所述的一种食源性致病菌的快速检测方法，其特征在于：所述的生理盐水，其重量体积比浓度为0.85％。
6.根据权利要求2或3所述的一种食源性致病菌的快速检测方法，其特征在于：所述的重悬浮操作是将清洗后的培养液或样品粗液在3500-4500rpm、3-5℃条件下离心分离3-8分钟。
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