CN106093021B - 酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法 - Google Patents

酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法。处理氯金酸水溶液制备获得葡聚糖修饰的纳米金溶液；处理磁珠水溶液制备获得抗体修饰的磁珠分散液，对待测大肠杆菌进行富集分离，将伴刀豆凝集素蛋白A(ConA)与待测大肠杆菌进行结合，用酸调节pH，降解为二聚体并从菌体表面释放，用碱调节pH形成四聚体ConA分散液，然后与葡聚糖修饰的纳米金溶液发生相互作用，用紫外‑可见分光光度计检测光谱，由光谱获得大肠杆菌可视化检测结果。本发明方法提出了刀豆凝集素ConA的新性质，在充分利用磁珠的分离富集功能的基础上引入凝集素使得葡聚糖修饰的纳米金发生团聚，通过吸光度输出信号检测，方法简便、低成本，应用前景好。

Description

酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法
技术领域
本发明涉及纳米材料科学及生物传感领域，尤其是一种酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法。
背景技术
大肠杆菌O157:H7是目前世界范围内最为重要的食源性致病菌之一，属于肠出血性大肠杆菌，一般通过受污染的牛肉、牛奶及其制品等引起食物中毒。大肠杆菌O157:H7毒性极强，数量100-200个就能使人中毒，而其它致泻性大肠杆菌通过食物感染人体需要100万个以上。开发食源性致病菌的有效快速检测技术能有效确保农产品质量安全。目前大肠杆菌O157:H7的常用检测方法有传统培养、免疫学、分子生物学检测方法等，但对于大规模的农产品致病菌快速检测，需要开发更快速便捷的技术及装置来实现现场监测。
生物传感器是一种含有固定化生物识别分子(如抗体、酶、适配体、细胞等)并与换能器紧密结合的分析工具或系统，因检测过程简单迅速、准确度和灵敏度高、设备体积小、可以实现连续在线监测、便于推广普及等优点而被广泛应用。纳米金具有极高的消光系数和强烈的粒子间距效应，其在分散状态下呈红色，变为交联团聚状态后呈蓝色，基于纳米金变色响应的比色法可视化生物传感器更具有简单快捷、成本低廉、高灵敏且可肉眼观察等优势，在食品安全、环境、医学领域等具有广阔的应用前景。目前在快速检测领域纳米金比色法普遍用于检测离子和有机小分子，然而对于大体积的细菌却很难实现纳米金比色法检测，因此构建集成生物识别和信号输出功能的元件并开发灵敏快速的大肠杆菌O157:H7生物传感分析方法具有极为重要的应用前景。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明提供了一种酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法，基于酸度调节和ConA识别的纳米金比色信号进行大肠杆菌O157:H7生物传感检测。
本发明采用以下技术方案：
本发明先制备抗体修饰的磁珠和葡聚糖修饰的纳米金，通过抗体修饰的磁珠和伴刀豆凝集素蛋白A识别大肠杆菌，通过葡聚糖修饰的纳米金捕获大肠杆菌的信号进行提取，主要包括免疫磁分离、凝集素识别和酸度调控释放、可视化检测的三个步骤。
所述方法具体包括：
1)处理氯金酸水溶液，制备获得葡聚糖修饰的纳米金溶液；
2)处理磁珠水溶液，制备获得抗体修饰的磁珠分散液；
3)用步骤1)获得的抗体修饰的磁珠分散液对待测大肠杆菌进行富集分离；
4)将伴刀豆凝集素蛋白A(ConA)与待测大肠杆菌进行结合，得到大肠杆菌悬浮液；
5)用酸调节步骤4)获得的大肠杆菌悬浮液的pH，将伴刀豆凝集素蛋白A降解为二聚体并从菌体表面释放，获得二聚体ConA溶液；
6)用碱调节步骤5)获得的二聚体ConA溶液的pH形成四聚体ConA分散液，然后将四聚体ConA分散液与步骤1)获得的葡聚糖修饰的纳米金溶液发生相互作用，用紫外-可见分光光度计检测光谱，从光谱中提取获得吸光度值，通过吸光度值获得大肠杆菌可视化检测结果。由光谱获得大肠杆菌可视化检测结果。
所述步骤1)具体如下：
1.1)在干净的玻璃器皿中加入47mL超纯水，10mg葡聚糖和浓度为98mM的0.6mLHAuCl4溶液，超声分散，得到分散均匀的澄清溶液；
1.2)在快速搅拌下将浓度为1M的1mL NaOH溶液加入至上述步骤获得的溶液中，调节pH至11，保持搅拌12-16小时，直到溶液颜色变为酒红色时停止反应，转入干净的玻璃瓶，且4℃保存；
1.3)将步骤1.2)获得的溶液在转速1000rpm下离心5分钟，用浓度为20mM且pH为6.8的磷酸缓冲液分散，获得葡聚糖修饰的纳米金溶液，4℃低温下保存备用。
所述步骤2)具体如下：
2.1)将浓度为1mg/mL的羧基化磁珠水溶液在工作频率为40kHz、功率为160W的超声作用下分散2min，得到分散均匀的磁珠分散液；
2.2)将步骤1.1)获得的磁珠分散液用磷酸缓冲液在磁分离器中进行先磁性分离、后去除上清液的清洗步骤三次，然后分散于MES缓冲液中，使得磁珠的最终浓度为1mg/mL，4℃下保存，得到羧基化磁珠的MES分散液；
2.3)将2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.35mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到1mL的羧基化磁珠的MES分散液中，常温下搅拌反应0.5小时，用磷酸缓冲液在磁分离器中进行先磁性分离、后去除上清液的清洗步骤三次，得到活化磁珠，分散在1mL的磷酸缓冲液中，得到活化磁珠分散液；
2.4)取活化磁珠分散液与浓度为1mg/mL的0.2mL的链霉亲和素溶液在常温下混合反应1小时，用pH为6.0的磷酸缓冲液在磁分离器中进行先磁性分离、后去除上清液的清洗步骤三次，分散在1mL磷酸缓冲液中，得到链霉亲和素修饰磁珠溶液；
2.5)取链霉亲和素修饰磁珠溶液与浓度为1.15mg/mL的生物素修饰的单克隆抗体溶液在常温下混合反应45分钟，用pH为6.0的磷酸缓冲液在磁分离器中进行先磁性分离、后去除上清液的清洗步骤三次，得到抗体修饰磁珠，分散在含质量分数1％BSA的1mL磷酸缓冲液中，4℃保存，得到抗体修饰的磁珠分散液。
所述步骤3)具体如下：将100μL步骤2)获得的抗体修饰磁珠分散液与200μL的待测大肠杆菌菌体液进行混合，常温下培育30-90min，培育后用pH为6.8的200μL磷酸缓冲液在磁分离器中进行先磁性分离、后去除上清液的清洗步骤三次，得到磁珠富集的大肠杆菌溶液。
优选的所述步骤3)中的培育时间为30min。
所述步骤3)中的待测大肠杆菌菌体液的浓度为101-108CFU/mL。
所述步骤4)具体如下：将步骤3)获得的磁珠富集的大肠杆菌溶液分散在pH为6.8的200μL PBS磷酸缓冲液中，加入浓度为0-11μg/mL的伴刀豆凝集素蛋白A溶液，常温下培育30-90min，培育后用pH为6.8的200μL磷酸缓冲液在磁分离器中进行先磁性分离、后去除上清液的清洗步骤两次，再用pH为6.8的50μL磷酸缓冲液重新分散，得到伴刀豆凝集素蛋白A结合的大肠杆菌悬浮液。
优选地，所述步骤4)中伴刀豆凝集素蛋白A溶液的浓度为5μg/mL，反应时间为30min。
所述步骤5)具体如下：所述步骤4)得到的大肠杆菌悬浮液中，用0.1M的盐酸调节pH至5，常温培育5min，用磷酸缓冲液在磁分离器中进行磁性分离，然后取上清液，获得二聚体ConA溶液。
所述步骤6)具体如下：6.1)在二聚体ConA溶液中用0.1M的NaOH溶液调节pH至7，常温培育5min，获得四聚体ConA溶液；6.2)将四聚体ConA溶液与50μL的步骤1)获得的葡聚糖修饰的纳米金溶液混合，常温反应1min，取混合溶液至石英比色皿中，用紫外-可见分光光度计测量400nm-700nm的吸收光谱。
本发明采用抗体修饰磁珠捕获大肠杆菌O157:H7，采用抗体修饰磁珠对大肠杆菌O157:H7富集和分离，然后在菌体表面结合伴刀豆凝集素ConA，用酸调节pH至5，ConA由四聚体分解为二聚体从菌体表面释放；用碱调节pH至7，ConA重组为四聚体，使葡聚糖修饰的纳米金瞬间产生团聚，发生可视化的颜色变化；基于纳米金的紫外-可见吸收峰变化定量检测大肠杆菌O157:H7，形成生物传感检测过程。
该发明首次采用酸度调节使得伴刀豆凝集素ConA在不用形态下识别菌体，同时作为信号输出元素诱导葡聚糖修饰纳米金发生显色变化，实现了微米级尺寸致病菌的纳米金比色法检测。该传感方法可搭建一系列纳米金比色法的分析平台，实现其他种类致病菌、蛋白等快速定量分析。
本发明的有益效果是：
采用本发明的方法可在前期基于磁分离而简便修饰操作，检测时通过纳米金紫外吸收峰值变化，实现对目标物的便利和灵敏检测。
本发明的方法创新利用了凝集素ConA新性质，在充分利用免疫磁分离和ConA对菌体的识别功能基础上，引入不同pH条件下ConA的解离性质，诱发纳米金的分散状态变化，藉此开发了针对食源致病菌的纳米金比色法传感器。
本发明生物传感技术可简便、低成本和灵敏检测大肠杆菌O157:H7，并且在食品安全快速检测领域应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明中生物传感器构建和检测原理示意图。
图2为本发明中磁珠捕获大肠杆菌O157:H7(A)、葡聚糖修饰纳米金(B)、葡聚糖修饰纳米金与ConA结合后(C)的扫描电镜表征。
图3为本发明方法中不同大肠杆菌O157:H7浓度时生物传感器的紫外可见吸收谱图和响应曲线。
图4为本发明中制备的葡聚糖修饰纳米金与不同浓度的Con A相互作用后的紫外可见光谱图和响应曲线图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明技术方案，下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明。
本发明的实施例如下：
实施例1
在干净的玻璃器皿中加入47mL超纯水，10mg葡聚糖和0.6mL HAuCl4(98mM)，超声分散，得到分散均匀的澄清溶液；在快速搅拌下将1mL NaOH(1M)加入至上述混合溶液中，调节pH至11，保持搅拌12-16小时，溶液颜色变为酒红色时停止反应，转入干净的玻璃瓶，4℃保存。上述葡聚糖修饰纳米金在转速1000rpm下离心5分钟，用磷酸缓冲液(20mM，pH 6.8)分散，低温保存备用。
将15mL磁珠水溶液置于50mL离心管中，在工作频率为40kHz，功率为160W的超声作用下分散5min，得到分散均匀的磁珠分散液。依次进行磁性分离、去除上清液，将磁珠用磷酸缓冲液清洗三次，然后分散于15mL MES缓冲液中(磁珠的最终浓度约为1mg/mL)，4℃下保存。
将EDC(2mg)和NHS(0.35mg)加入到1mL磁珠分散液中，常温下搅拌反应0.5小时，用磷酸缓冲液(pH 6.0)磁性分离清洗三次，再分散在1mL磷酸缓冲液中，得到活化后的磁珠分散液。取上述活化磁珠与0.2mL链霉亲和素(1mg/mL)于常温下反应1小时，用磷酸缓冲液(pH6.0)磁性分离、去除上清液，重复清洗三次，得到链霉亲和素修饰磁珠，分散在1mL磷酸缓冲液中。
取上述链霉亲和素修饰磁珠与生物素修饰的单克隆抗体(1.15mg/mL)于常温下反应45分钟，用磷酸缓冲液(pH 6.0)磁性分离、去除上清液，重复清洗三次，得到抗体修饰磁珠，分散在1mL磷酸缓冲液(1％BSA)中，在冰箱中4℃保存。
大肠杆菌O157:H7检测。传感器制备过程如图1所示，将100μL上述抗体修饰磁珠分散液与200μL大肠杆菌O157:H7(实施例采用7个不同浓度的菌液进行比较，如下表1)进行混合，常温下培育30min。用200μL磷酸缓冲液(pH6.8)磁性分离、去除上清液，重复清洗三次，得到磁珠富集的大肠杆菌O157:H7。
实施例用透射电子显微镜表征，如图2A所示，多个磁珠捕获在大肠杆菌O157:H7表面。在干净的玻璃器皿中加入47mL超纯水，10mg葡聚糖和0.6mL HAuCl4(98mM)，超声分散，得到分散均匀的澄清溶液；在快速搅拌下将1mL NaOH(1M)加入至上述混合溶液中，调节pH至11，保持搅拌12-16小时，溶液颜色变为酒红色时停止反应，转入干净的玻璃瓶，4℃保存。上述葡聚糖修饰纳米金在转速1000rpm下离心5分钟，用磷酸缓冲液(20mM，pH 6.8)分散，低温保存备用。用透射电子显微镜表征，如图2B所示，葡聚糖修饰纳米金保持稳定分散状体，粒径分布在20nm左右。
将上述磁珠富集的大肠杆菌O157:H7分散在200μL PBS磷酸缓冲液(pH6.8)中，加入5μg/mL ConA溶液，常温下培育30min。用200μL磷酸缓冲液(pH 6.8)磁性分离、去除上清液，重复清洗两次，用50μL磷酸缓冲液(pH 6.8)重新分散，得到ConA结合的大肠杆菌O157:H7悬浮液。上述得到的ConA结合的大肠杆菌分散液中，用0.1M的盐酸调节pH至5，常温培育5min，用磁分离器进行磁分离，取上清液，获得二聚体ConA溶液。在二聚体ConA溶液中用0.1M的NaOH调节pH至7，常温培育5min，获得四聚体ConA溶液。
将上述四聚体ConA溶液与50μL葡聚糖修饰的纳米金溶液混合，常温反应1min后纳米金颜色变蓝，用透射电子显微镜表征，如图2C所示，葡聚糖修饰纳米金已经与ConA发生相互作用，发生团聚。
取纳米金混合溶液至石英比色皿中，用紫外分光光度计测量400nm-700nm的吸收光谱。葡聚糖修饰纳米金的紫外-可见吸收光谱图及吸光度比值信号与大肠杆菌浓度成正比，如图3所示。
采用该方法应用于七个不同大肠杆菌浓度的子实施例检测，结果如表1所示。
表1本发明方法应用于7个浓度实施例的检测参数与性能
由此可得生物传感器的线性检测范围从1×102-1×106CFU/mL，线性方程为y＝0.1144lgx+0.508(r2＝0.988731)，检测限(S/N＝3)为41CFU/mL，如图3所示。
实施例2
将15mL磁珠水溶液置于50mL离心管中，在工作频率为40kHz，功率为160W的超声作用下分散5min，得到分散均匀的磁珠分散液。依次进行磁性分离、去除上清液，将磁珠用磷酸缓冲液清洗的步骤三次，然后分散于15mL MES缓冲液中(磁珠的最终浓度约为1mg/mL)，4℃下保存。
将EDC(2mg)和NHS(0.35mg)加入到1mL上述功能磁珠分散液中，常温下搅拌反应2小时，用磷酸缓冲液(pH 6.0)磁性分离清洗三次，再分散在1mL磷酸缓冲液中，得到活化后的磁珠分散液。取上述活化磁珠与0.2mL链霉亲和素(1mg/mL)于常温下反应1小时，用磷酸缓冲液(pH 6.0)磁性分离、去除上清液，重复清洗三次，得到链霉亲和素修饰磁珠，分散在1mL磷酸缓冲液中。
取上述链霉亲和素修饰磁珠与生物素修饰的单克隆抗体(1.15mg/mL)于常温下反应45分钟，用磷酸缓冲液(pH 6.0)磁性分离、去除上清液，重复清洗三次，得到抗体修饰磁珠，分散在1mL磷酸缓冲液(1％BSA)中，在冰箱中4℃保存。
将100μL上述抗体修饰磁珠分散液分别与200μL浓度为1×102、1×103、1×104CFU/mL的大肠杆菌O157:H7进行混合，常温下培育30min后进行磁性分离，得到三组磁珠富集的大肠杆菌O157:H7，同时取上清液进行铺盘培养计数，采用以下公式计算磁分离效率。磁分离效率越高，说明方法的检测准确率越高。
分离效率(％)＝(N总-N上清液)/N总
实施例平行测定3次，得到分离效率在95％以上。可见本发明方法传感检测准确率高，效果好。
实施例3
在干净的玻璃器皿中加入47mL超纯水，10mg葡聚糖和0.6mL HAuCl4(98mM)，超声分散，得到分散均匀的澄清溶液；在快速搅拌下将1mL NaOH(1M)加入至上述混合溶液中，调节pH至11，保持搅拌12-16小时，溶液颜色变为酒红色时停止反应，转入干净的玻璃瓶，4℃保存。
上述葡聚糖修饰纳米金在转速1000rpm下离心5分钟，用磷酸缓冲液(20mM，pH6.8)分散，低温保存备用。取100μL葡聚糖修饰纳米金与最终浓度分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11μg/mL的凝集素ConA进行混合反应，孵育1min后，取纳米金混合溶液至微量荧光比色皿中，用紫外分光光度计测量400nm-700nm的吸收光谱。
葡聚糖修饰纳米金的紫外-可见吸收光谱图及吸光度比值信号与ConA浓度成正比，如图4所示。ConA浓度在0-4μg/mL时吸光度比值有很好的线性关系，当ConA浓度为5μg/mL时，纳米金颜色开始变为蓝色，因此优选地最终考虑选取5μg/mL作为本生物传感器制备时的最佳浓度。
由实施例可见，本发明方法提出的伴刀豆凝集素ConA的新性质以及凝集素的识别和释放功能，能导致葡聚糖修饰的纳米金发生团聚，获得吸光度输出信号，方法简便、低成本，可灵敏检测食源致病菌大肠杆菌O157:H7，应用前景好。

Claims (8)

1.一种酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法，其特征在于：
先制备抗体修饰的磁珠和葡聚糖修饰的纳米金，通过抗体修饰的磁珠和伴刀豆凝集素蛋白A识别大肠杆菌，通过葡聚糖修饰的纳米金捕获大肠杆菌的信号进行提取，主要包括免疫磁分离、凝集素识别、酸度调控释放、可视化检测的四个步骤；
所述方法具体包括：
1)处理氯金酸水溶液，制备获得葡聚糖修饰的纳米金溶液；
2)处理磁珠水溶液，制备获得抗体修饰的磁珠分散液；
3)用步骤2)获得的抗体修饰的磁珠分散液对待测大肠杆菌进行富集分离；
4)将伴刀豆凝集素蛋白A与待测大肠杆菌进行结合，得到大肠杆菌悬浮液；
5)用酸调节步骤4)获得的大肠杆菌悬浮液的pH，将伴刀豆凝集素蛋白A降解为二聚体并从菌体表面释放，获得二聚体ConA溶液；
6)用碱调节步骤5)获得的二聚体ConA溶液的pH形成四聚体ConA分散液，然后将四聚体ConA分散液与步骤1)获得的葡聚糖修饰的纳米金溶液发生相互作用，用紫外-可见分光光度计检测光谱，由光谱获得大肠杆菌可视化检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法，其特征在于：所述步骤1)具体如下：
1.1)在干净的玻璃器皿中加入47mL超纯水，10mg葡聚糖和浓度为98mM的0.6mL HAuCl4溶液，超声分散，得到分散均匀的澄清溶液；
1.2)在快速搅拌下将浓度为1M的1mL NaOH溶液加入至上述步骤获得的溶液中，调节pH至11，保持搅拌12-16小时，直到溶液颜色变为酒红色时停止反应，转入干净的玻璃瓶；
1.3)将步骤1.2)获得的溶液在转速1000rpm下离心5分钟，用浓度为20mM且pH为6.8的磷酸缓冲液分散，获得葡聚糖修饰的纳米金溶液。
3.根据权利要求1所述的一种酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法，其特征在于：所述步骤2)具体如下：
2.1)将浓度为1mg/mL的羧基化磁珠水溶液在工作频率为40kHz、功率为160W的超声作用下分散2min，得到分散均匀的磁珠分散液；
2.2)将步骤2.1)获得的磁珠分散液用磷酸缓冲液进行先磁性分离、后去除上清液的清洗步骤三次，然后分散于MES缓冲液中，使得磁珠的最终浓度为1mg/mL，4℃下保存，得到羧基化磁珠的MES分散液；
2.3)将2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.35mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到1mL的羧基化磁珠的MES分散液中，常温下搅拌反应0.5小时，用磷酸缓冲液进行先磁性分离、后去除上清液的清洗步骤三次，得到活化磁珠，分散在1mL的磷酸缓冲液中，得到活化磁珠分散液；
2.4)取活化磁珠分散液与浓度为1mg/mL的0.2mL的链霉亲和素溶液在常温下混合反应1小时，用pH为6.0的磷酸缓冲液进行先磁性分离、后去除上清液的清洗步骤三次，分散在1mL磷酸缓冲液中，得到链霉亲和素修饰磁珠溶液；
2.5)取链霉亲和素修饰磁珠溶液与浓度为1.15mg/mL的生物素修饰的单克隆抗体溶液在常温下混合反应45分钟，用pH为6.0的磷酸缓冲液进行先磁性分离、后去除上清液的清洗步骤三次，得到抗体修饰磁珠，分散在含质量分数1％BSA的1mL磷酸缓冲液中，4℃保存，得到抗体修饰的磁珠分散液。
4.根据权利要求1所述的一种酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法，其特征在于：所述步骤3)具体如下：将100μL步骤2)获得的抗体修饰磁珠分散液与200μL的待测大肠杆菌菌体液进行混合，常温下培育30-90min，培育后用pH为6.8的200μL磷酸缓冲液进行先磁性分离、后去除上清液的清洗步骤三次，得到磁珠富集的大肠杆菌溶液。
5.根据权利要求1所述的一种酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法，其特征在于：所述步骤4)具体如下：将步骤3)获得的磁珠富集的大肠杆菌溶液分散在pH为6.8的200μL PBS磷酸缓冲液中，加入浓度为0-11μg/mL的伴刀豆凝集素蛋白A溶液，常温下培育30-90min，培育后用pH为6.8的200μL磷酸缓冲液进行先磁性分离、后去除上清液的清洗步骤两次，再用pH为6.8的50μL磷酸缓冲液重新分散，得到伴刀豆凝集素蛋白A结合的大肠杆菌悬浮液。
6.根据权利要求5所述的一种酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法，其特征在于：所述步骤4)中伴刀豆凝集素蛋白A溶液的浓度为5μg/mL，反应时间为30min。
7.根据权利要求1所述的一种酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法，其特征在于：所述步骤5)具体如下：所述步骤4)得到的大肠杆菌悬浮液中，用0.1M的盐酸调节pH至5，常温培育5min，用磷酸缓冲液进行磁性分离，然后取上清液，获得二聚体ConA溶液。
8.根据权利要求1所述的一种酸度调控和凝集素识别的大肠杆菌可视化生物传感方法，其特征在于：所述步骤6)具体如下：
6.1)在二聚体ConA溶液中用0.1M的NaOH溶液调节pH至7，常温培育5min，获得四聚体ConA溶液；
6.2)将四聚体ConA溶液与50μL的步骤1)获得的葡聚糖修饰的纳米金溶液混合，常温反应1min，取混合溶液至石英比色皿中，用紫外-可见分光光度计测量400nm-700nm的吸收光谱。
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