KR101888741B1 - 포도당 측정기를 이용한 미생물 기반 항생제 간이 검사법 - Google Patents

포도당 측정기를 이용한 미생물 기반 항생제 간이 검사법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항생제의 검사법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 미생물을 기반으로 하여 항생제를 간이적으로 신속하게 검출할 수 있는 항생제 간이 검사법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항생제 검출 방법은 항생제에 대하여 감수성을 가지는 미생물, 상기 미생물의 배양용 배지, 및 포도당을 포함하는 검사 용액을 준비하는 단계; 상기 검사 용액을 피검 시료와 혼합하여 미생물을 배양하는 단계; 및 포도당의 농도 변화를 측정하여 항생제를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명에 의해서, 포도당 측정기와 미생물을 이용하여 항생제를 간편히 검출할 수 있는 방법이 제공되었다. 본 발명에 따른 방법은 미생물이 항생제에 대해서 감수성을 가지는 한 항생제 및/또는 미생물의 종류에 구애없이 사용할 수 있으며, 항생제의 존재 유무와 함께 간이적인 정량 분석이 가능하게 된다.

Description

포도당 측정기를 이용한 미생물 기반 항생제 간이 검사법{Methods of rapid sensing for antibiotics using glucose meter and bacteria}
본 발명은 항생제의 검사법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 미생물을 기반으로 하여 항생제를 간이적으로 신속하게 검출할 수 있는 항생제 간이 검사법에 관한 것이다.
항생제의 과다 사용은 슈퍼박테리아의 발생을 비롯하여 기타 인체 부작용을 일으킬 수 있으나 종래의 Disc plate 법은 배양 과정으로 인하여 검출에 하루 이상 소요되며 항생제에 대해 정확한 정보를 제공하지 못 하는 문제가 있기 때문에, 항생제를 보다 효과적으로 검출하기 위한 바이오센서들이 개발되고 있다. 금 나노입자나 형광체, 또는 방사선 동위 원소를 표지로 이용하는 항체를 이용한 면역 크로마토그래피 (Immunochromatography), 고성능 액체 크로마토그래피 (High-performance liquid chromatograph), 가스 크로마토그래피 (Gas chromatography), 비표지식(label-free) 바이오센서로서 표면 플라스몬 공진 바이오센서(SurfacePlasmon Resonance Biosensor), 전반사 일립소미트리 바이오센서(Total Internal Reflection Ellipsometry Biosensor), 광 도파로 바이오센서 (Waveguide Biosensor) 등의 광학 바이오 센서들이 주목 받고 있다. 대한민국 특허 공개 제2010-0009963호에서는 초임계유체추출법과 고성능 액체 크로마토그래피를 이용해서 항생제를 검출하는 방안들이 개시되어 있다. 그러나, 종래 항체 기반 항생제 검출 방법은, 항생제 별 항체가 사용되기 때문에 항생제를 검출하기 위하여 다양한 종류의 항체를 사용해야 되는 문제를 가지고 있다. 이에 따라 현장에서 사용되기에는 막대한 검사 비용이 요구되고, 검출 소요 시간이 길어 효율적이지 못하다는 문제가 있어, 발광 측정기와 같이 사용이 간편한 측정 장비와 더불어 다종의 항생제를 보다 효율적으로 검출할 수 있는 방법에 대한 요구가 계속되고 있다.
대한민국 특허 10-1459577호에서는 스테아로서모필러스균을 포함하는 잔류 항생제 검사용 배지를 제공한다. 스테아로서모필러스균이 성장할 경우, 배지에 있는 영양분을 분해하여 대사물질을 배출하게 되며, 배출된 대사물질은 산성으로서, 대사에 따라 pH가 점점 더 낮아지면서, 배지 내에 들어 있는 지시약에 의해서 배지의 색깔이 변하게 된다. 스테아로서모필러스균의 성장은 테스트 시료에 들어있는 항생제에 영향을 받으므로, 결국, 테스트 시료에 항생제가 들어 있으면 성장이 저해되어 대사물질의 배출이 없으며 이와 함께 색상의 변화도 없게 되며, 테스트 시료에 항생제가 없으면 성장이 저해되지 않아 대사 물질의 배출이 있으며 이와 함께 색상의 변화가 나타나게 된다.
그러나 이러한 방식은 지시약에 의한 색상 변화를 야기할 정도로 충분히 많은 양의 대사물질이 필요하게 된다. 또한, 지시약의 색상 변화에 의해서 기준 함량 이상의 항생제가 포함되어 있는지 여부를 알려줄 뿐, 시료에 포함된 항생제의 정량적인 정보는 제공하지 않는다.
또한, 이러한 방식은 스테아로서모필러스 균과 같이, 항생제에 대해 매우 높은 감수성을 가지며, 고온에서 선택적으로 성장할 수 있는 특정 균만을 사용할 수 있다는 단점이 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 미생물을 기반으로 하여 시료에 포함된 항생제를 간이적으로 정량적으로 신속하게 검출할 수 있는 항생제 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 미생물을 기반으로 하여 시료에 포함된 항생제를 간이적으로 정량적으로 신속하게 검출할 수 있는 항생제 검출 장치를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 검출 방법은
항생제에 대하여 감수성을 가지는 미생물, 상기 미생물의 배양용 배지, 및 포도당을 포함하는 검사 용액을 준비하는 단계;
상기 검사 용액을 피검 시료와 혼합하여 미생물을 배양하는 단계; 및
포도당의 농도 변화를 측정하여 항생제를 검출하는 단계
를 포함한다.
이론적으로 한정된 것은 아니지만, 피검 시료에 포함된 항생제의 함량이 증가하면 배양 시 미생물의 생장이 저해되며, 이에 따라 소비되는 포도당의 양도 감소한다. 미생물의 배양 시 소비되는 포도당의 농도는 휴대용 포도당 측정기를 이용함으로써 정량적인 측정이 가능하며, 항생제 함량의 증가에 따른 포도당의 농도 변화를 분석함으로써 항생제의 검출이 가능하게 되는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 항생제에 대하여 감수성을 가지는 미생물은 균주나 종에 제한되지 않고, 항생제의 의해서 배지에서의 배양이 억제되는 미생물을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에 있어서, 상기 항생제에 대하여 감수성을 가지는 미생물은 배양 과정에서 유의미하게 포도당을 소모하는 미생물을 사용할 수 있다.
본 발명의 실시에 있어서, 상기 종은 Escherichia coli, Salmonella, Vibrio, Bacillus, Micrococcus, Streptococcus 등이 이용 가능하다. 본 발명의 일 실시 예에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 Escherichia coli ATCC 11303이다.
본 발명에 있어서, 상기 포도당의 농도 변화는 포도당 측정기를 이용해서 이루어질 수 있으며, 이를 통해서 검사 비용 및 소요 시간을 절감하고, 검사의 간편성을 증대시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 포도당 농도 측정을 위해 사용되는 방법은, 휴대용 혈당계, 요당검사 시험지, 적외선 분광법, 라만 분광법, 빛 간섭 촬영법(Optical coherence tomography), 편광법, 현광법, 광음향 분광법(Photoacoustic spectroscopy)을 포함하는 광학적 방법, 역이온 삼투압 방식(Reverse iontophoresis), 임피던스 분광학(Impedance spectroscopy), 전자기적 탐지(Electromagnetic sensing) 방식을 포함하는 전기적 방법, 베네딕트 용액, 폴리아닐린 입자 등이 있다. 바람직하게는 휴대성의 편리함과, 간이성을 충족할 수 있도록 휴대용 혈당계를 이용할 수 있다. 상기 휴대용 혈당계는 공지된 제품을 구입하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검출 대상 항생제는 배지에 포함된 미생물의 배양을 억제할 수 있는 하나 이상의 항생제들이다. 본 발명의 실시에 있어서, 상기 항생제는 페니실린계, 퀴놀론계, 세팔로스포린계, 테트라사이클린계, 설폰아마이드계, 폴리에테르계, 펩타이드계 등이 포함된다.
본 발명의 일 실시에 있어서, 상기 항생제는 Nalidixic acid, ciprofloxacin, sarafloxacin, enrofloxacin과 같은 퀴놀론 계 항생제일 수 있다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 항생제에 대하여 감수성을 가지는 미생물, 상기 미생물의 배양용 배지, 및 포도당을 포함하는 검사 용액, 및 상기 검사 용액을 피검 시료와 혼합하여 미생물을 배양하는 과정에서 포도당의 농도 변화를 측정하는 포도당 농도 측정 장치로 이루어진 항생제를 검출하는 장치를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물의 배양용 배지는 미생물을 성장시킬 수 있는 환경을 제공할 수 있는 한 특별한 제한은 없으며, 미생물의 종류에 맞추어 공지된 배지를 선택해서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포도당은 미생물과 배양용 배지와 및 포도당을 혼합하여 검사 용액을 형성하고, 4시간 이하, 바람하게는 3시간 이하, 예를 들어, 2~3시간 사이에 투입된 포도당의 50% 이상, 바람직하게는 60%이상, 보다 더 바람직하게는 70% 이상이 소모되는 농도를 가지는 것이 바람직하다.
본 발명에 의해서, 포도당 측정기와 미생물을 이용하여 항생제를 간편히 검출할 수 있는 방법이 제공되었다.
본 발명에 따른 방법은 미생물이 항생제에 대해서 감수성을 가지는 한 항생제 및/또는 미생물의 종류에 구애없이 사용할 수 있으며, 항생제의 존재 유무와 함께 간이적인 정량 분석이 가능하게 된다.
도 1은 포도당 측정기 및 미생물 기반 항생제 간이 검사 모식도
도 2는 (a) 반응물 비율 별 포도당 농도 변화 (b) 배양 2.5 시간 후 포도당 농도 소비량
도 3은 (a) 배양 시간에 따른 엔로플록사신 농도별 포도당 소비 양상 (흑색: 0 ng/mL; 적색: 1 ng/mL; 청색: 5 ng/mL; 녹색: 10 ng/mL; 주황색: 100 ng/mL; 자색: 1000 ng/mL) 및 엔로플록사신 농도별 포도당 소비 양상 (b) 2시간 배양 후 (c) 3시간 배양 후
도 4는 (a) 배양 시간에 따른 날리딕스산 농도별 포도당 소비 양상 (b) 배양 3시간 후 날리딕스산 농도별 포도당 농도 변화
도 5는 (a) 배양 시간에 따른 사라플록사신 농도별 포도당 소비 양상 (b) 배양 3시간 후 사라플록사신 농도별 포도당 농도 변화
도 6은 (a) 배양 시간에 따른 시프로플록사신 농도별 포도당 소비 양상 (b) 배양 3시간 후 시프로플록사신 농도별 포도당 농도 변화
도 7은 항생제 종류 및 농도에 따른 3시간 배양 후 포도당 농도 변화 (흑색: 날라딕스산, 적색: 사라플록사신, 청색: 시프로플록사신, 녹색: 엔로플록사신)
도 8은 베네딕트 시약 농도별 반응 양상 (a) 가열 전 (b) 포도당 부재 시 가열 후 (c) 100 mg/dL 포도당 존재 시 가열 후 (d) (b)에 대한 흡광도 (e) (c)에 대한 흡광도 (흑색: 1.08 mM 가열 전; 적색: 5.4 mM 가열 전; 청색: 10.8 mM 가열 전; 녹색: 54 mM 가열 전; 회색: 1.08 mM 가열 후; 갈색: 5.4 mM 가열 후; 자색: 10.8 mM 가열 후; 청녹색: 54 mM 가열 후). (f) 베네딕트 시약 농도 별 450 nm 영역에 대한 흡광도
도 9는 (a) 1 v/v% 및 (b) 10 v/v% 베네딕트 시약 농도별 반응 사진 (각 사진 좌측부터 각각 100, 50, 10, 5, and 1 mg/dL) (c) 450 nm에서의 흡광도 (청색: 1 v/v%; 적색: 10 v/v% 베네딕트 시약)
도 10은 엔로플록사신 농도별 배양 후 용액에 대한 베네딕트 반응 결과
도 11은 엔로플록사신 농도별 가열 전후 흡광도 변화 (a) 0 ng/mL (b) 1 ng/mL (c) 5 ng/mL (d) 10 ng/mL (e) 100 ng/mL (f) 1000 ng/mL (청색: 가열 전; 녹색: 가열 후)
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 상세하게 기재하고 있지만, 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이며, 본 발명의 범위는 특허청구범위에 의해서 정하여짐을 유의하여야 한다.
1. 시약 및 장비
검사 물질인 날리딕스산, 엔로플록사신, 시프로플록사신, 사라플록사신과 배지를 만들기 위한 LB broth와 포도당은 시그마-알드리치 社에서 구매하였으며, 미생물은 한국 미생물 보존센터에서 분양 받았다.
탈이온증류수는 상용 초순수제조장치(Human Science 社, 한국)를 이용하여 얻어졌고 배지 및 포도당 용액을 만드는데 사용되었다.
미생물을 배양하기 위한 shaking incubator는 ㈜한양 사이언스 社에서, 검사 용액 및 시료 내 포도당 농도를 측정하기 위한 포도당 측정기 및 검사지는 One touch 社에서 각각 구매하였다.
2. 미생물 준비
2.5 g의 LB broth 가루를 100 mL의 탈이온 증류수에 녹인 후 120℃에서 15분간 살균작용을 거쳐 신선한 배지를 준비한다. 준비된 배지 중 10 mL를 취하여 균주를 접종한 후 37℃에서 16시간동안 배양하여 109 cfu/mL의 농도를 가지는 미생물 용액을 준비한다.
3. 미생물, 배지, 포도당이 포함된 검사 용액 제조
2.5 g의 LB broth 가루를 10 mL의 탈이온 증류수에 녹인 후 120℃에서 15분간 살균작용을 거쳐 신선한 배지를 준비한다. 1.5 g의 포도당을 10 mL의 탈이온 증류수에 녹여 150 mg/mL의 포도당 용액을 준비한다.
실시예 2에서 준비한 미생물 용액 0.1 mL와 실시예 3에서 준비한 배지 용액 0.1 mL, 포도당 용액 0.01 mL를 혼합하여 검사 용액을 제조하여 즉시 사용한다.
4. 포도당 측정기 및 미생물 기반 항생제 검출
실시예 3에서 준비한 검사 용액에 대하여 1 mL의 시료를 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 배양시켜 포도당 측정기를 이용하여 포도당의 농도 변화를 측정한다. (도1)은 검사법의 모식도로써 검사 대상이 되는 시료 속에 항생제가 존재할 경우 미생물의 생장이 저해되어 포도당 소비가 억제되며, 항생제가 존재하지 않을 경우 미생물의 생장이 진행되어 포도당 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 검사 시 항생제가 포함되지 않은 대조군 시료를 준비하여 검사 대상 시료의 포도당 농도와 비교함으로써, 항생제 존재 여부에 대하여 보다 정확한 검사가 가능하도록 한다.
1 세대 퀴놀론계인 Nalidixic acid에 대한 검사 결과는 [도 2]와 같으며, 2세대 퀴놀론계인 Enrofloxacin, Sarafloxacin, Ciprofloxacin에 대한 검사 결과는 각각 [도 3], [도 4], [도 5]와 같으며 상기의 항생제들에 대하여 항생제 농도 증가에 따라 포도당 소비가 감소하는 것을 확인하였다.
3시간의 배양 후, 대조군 시료(0 ng/mL)의 포도당 농도에 대하여 검사 대상 시료(10, 100, 1000 ng/mL)의 포도당 농도를 제한 결과는 [도 6]과 같다.

Claims (7)

  1. 항생제에 대하여 감수성을 가지는 미생물, 상기 미생물의 배양용 배지, 및 포도당을 포함하는 검사 용액을 준비하는 단계;
    상기 검사 용액을 피검 시료와 혼합하여 미생물을 배양하는 단계; 및
    포도당의 농도 변화를 측정하여 항생제를 검출하는 단계
    를 포함하는 항생제 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 Escherichia coli, Salmonella, Vibrio, Bacillus, Micrococcus, Streptococcus에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 항생제 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 포도당의 농도 변화는 휴대용 혈당계, 요당검사 시험지, 적외선 분광법, 라만 분광법, 빛 간섭 촬영법(Optical coherence tomography), 편광법, 현광법, 광음향 분광법(Photoacoustic spectroscopy), 역이온 삼투압 방식(Reverse iontophoresis), 임피던스 분광학(Impedance spectroscopy), 전자기적 탐지(Electromagnetic sensing) 방식, 또는 베네딕트 용액을 이용해서 측정되는 것을 특징으로 하는 항생제 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 포도당의 농도 변화는 휴대용 혈당계로 측정되는 것을 특징으로 하는 항생제 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항생제는 페니실린계 항생제, 퀴놀론계 항생제, 세팔로스포린계 항생제, 테트라사이클린계 항생제, 설폰아마이드계 항생제, 폴리에테르계 항생제, 펩타이드계 항생제로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 항생제 검출 방법.
  6. 항생제에 대하여 감수성을 가지는 미생물, 상기 미생물의 배양용 배지, 및 포도당을 포함하는 검사 용액; 및
    상기 검사 용액을 피검 시료와 혼합하여 미생물을 배양하는 과정에서 포도당의 농도 변화를 측정하는 포도당 농도 측정 장치;
    로 이루어진 항생제 간이 검출 장치.
  7. 제6항에 있어서, 상기 포도당 농도 측정 장치는 휴대용 혈당계인 것을 특징으로 하는 항생제 간이 검출 장치.


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