CN113567418A - 一种融合光谱技术的病原性微生物检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种融合光谱技术的病原性微生物检测方法，包括：S1，准备待测样本以及活性基底；S2，将活性基底与待测样本按一定比例混合，摇匀静置2‑3h；S3，取适量混合液滴在干净的硅片上进行晾干；S4，通过拉曼光谱仪对硅片进行照射，将硅片上微生物所产生的拉曼光谱信息进行收集；S5，接收拉曼光谱信息并进行处理，获得相关峰图并在移动终端上显示出来；S6，根据获得的相关峰图检测待测样本中所含有的微生物种类。本发明检测所需样本较少，样本不易损坏，检测成本较低，灵敏度较高，耗时较短且便于现场和野外检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种融合光谱技术的病原性微生物检测方法。
背景技术
微生物包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生物群体，个体微小，与人类生活密切相关。广泛涉及健康、医药、工农业、环保等诸多领域。一般来说，将微生物划分为以下八大类：细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体以及螺旋体。
对于微生物的检测，常采用显微镜、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化以及培养技术，但是采用上述方法处理时，所需样本多且损坏样本的概率较大，成本较高，灵敏度较低，过程较为复杂且耗时较长，不利于现场和野外的检测。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种融合光谱技术的病原性微生物检测方法，检测所需样本较少，样本不易损坏，检测成本较低，灵敏度较高，耗时较短且便于现场和野外检测。
为了完成上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种融合光谱技术的病原性微生物检测方法，包括：
S1，准备待测样本以及活性基底；
S2，将活性基底与待测样本按一定比例混合，摇匀静置2-3h；
S3，取适量混合液滴在干净的硅片上进行晾干；
S4，通过拉曼光谱仪对硅片进行照射，将硅片上微生物所产生的拉曼光谱信息进行收集；
S5，接收拉曼光谱信息并进行处理，获得相关峰图并在移动终端上显示出来；
S6，根据获得的相关峰图检测待测样本中所含有的微生物种类。
其中，所述S1中，活性基体采用金属溶胶法制备。
其中，所述金属溶胶法制备包括以下步骤：
S31，称取45mg的硝酸银，用少量蒸馏水使其溶解，定容至250mL容量瓶中备用，得到10-3mol/L硝酸银溶液；
S32，取1g柠檬酸钠溶于100mL蒸馏水中，得到1％柠檬酸钠溶液备用；
S33，取配置好的硝酸银溶液100mL置于250mL烧杯中，置于磁力搅拌器上，将其加热至沸腾90℃，不断搅拌硝酸银溶液；
S34，将量取好的10mL1％柠檬酸钠溶液缓慢滴加到沸腾的硝酸银溶液中，滴加完成后，沸腾状态下继续加热10-15min，继续不断搅拌，直至溶液呈灰绿色后停止加热，自然冷却到室温，得到灰绿色的2-65纳米银溶胶。
其中，所述S34中，沸腾状态下继续加热12min。
其中，所述金属溶胶法制备包括以下步骤：
S51，分别称取2g硝酸银溶于10ml超纯水中，称取0.1g聚乙烯吡咯烷酮溶于10ml超纯水中，称取0.2g抗坏血酸溶于10ml超纯水中；
S52，按顺序分别取10ml去离子水、0.2ml硝酸银溶液以及2ml聚乙烯吡咯烷酮于烧杯中；
S53，将以上混合溶液在恒温磁力搅拌器下搅拌，搅拌均匀后迅速加入1ml抗坏血酸溶液，搅拌15min；
S54，离心洗涤去除杂质，分别用乙醇和超纯水洗涤三次并离心；
S55，加入10ml超纯水并利用超声波震荡使其分散均匀便得到500纳米银溶胶。
其中，所述S53中，恒温磁力搅拌器的转速为555-650r/min。
其中，所述S54中，离心的转速为8000r/min，时间为10min。
其中，所述活性基底在与待测样本混合前需要进行拉曼光谱检测。
其中，所述拉曼光谱仪激发光源的波长范围为500-600nm。
其中，所述S5中，在移动终端内建立有微生物多光谱标准数据库，拉曼光谱仪所获得的相关峰图在移动终端上显示时将自动与微生物多光谱标准数据库进行比对。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明在检测病原微生物的过程中不需要对样本进行标记，检测过程快速，效率较高，耗时较短。
2、采用纳米基体可提高病原微生物拉曼光谱的信号强度，从而提高检测过程中的灵敏度。
3、所需样本较少，只需将混合液滴在硅片上即可进行检测，无需对大量样本进行检测，降低样本损坏的概率。
4、所需纳米基体价格较低且可以反复使用，其检测成本较低，具有一定的市场推广性。
5、拉曼光谱仪可实现小型化，携带较为方便，便于现场或野外检测。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1
为了进一步验证本发明所述方法对病原微生物进行检测，下面以大肠杆菌(O157:H7)为例，分别用不同的还原剂作为活性基底，当活性基底以柠檬酸钠作为还原剂时：
(1)大肠杆菌样本的准备：从环境中或患者体内直接分离出大肠杆菌，将获得的大肠杆菌菌株分别放入培养基进行培养，去掉培养基，利用PBS(磷酸缓冲盐溶液)缓冲液稀释并进行高温灭活处理后，得到在600nm处的光密度(OD600)为1.0的大肠杆菌样品作为待测样本。
(2)活性基底的准备：
301，称取45mg的硝酸银，用少量蒸馏水使其溶解，定容至250mL容量瓶中备用，得到10-3mol/L硝酸银溶液。
302，取1g柠檬酸钠溶于100mL蒸馏水中，得到1％柠檬酸钠溶液备用；
303，取配置好的硝酸银溶液100mL置于250mL烧杯中，置于磁力搅拌器上，将其加热至沸腾90℃，不断搅拌硝酸银溶液。
304，将量取好的10mL1％柠檬酸钠溶液缓慢滴加到沸腾的硝酸银溶液中，滴加完成后，沸腾状态下继续加热12min，继续不断搅拌，直至溶液呈灰绿色后停止加热，自然冷却到室温，得到灰绿色的30纳米的银溶胶。
305，将配制好的银溶胶进行拉曼光谱检测，将制备的银溶胶取适量滴在干净的硅片上，在60℃的真空干燥箱中干燥8个小时，再通过拉曼光谱仪进行检测，以确定活性基底的信号强度，确定信号强度最好的活性基底为30纳米的银溶胶。
(3)混合
将待测的大肠杆菌样本与银溶胶按照1:50的体积比进行混合，摇匀静置3h，取适量混合液滴在干净的硅片上进行晾干待测。
(4)检测
将拉曼光谱仪的激光波长设置为532nm，对硅片进行照射，激发微生物产生拉曼光谱，再将硅片上微生物所产生的拉曼光谱信息进行收集，接收拉曼光谱信息并进行处理，获得相关峰图并在移动终端上显示出来，在移动终端内建立有微生物多光谱标准数据库，拉曼光谱仪所获得的相关峰图在移动终端上显示时将自动与微生物多光谱标准数据库进行比对，根据获得的相关峰图检测待测样本中所含有的微生物种类，移动终端自动将比对吻合的微生物种类列出来，可直观进行查看。
当活性基底以抗坏血酸作为还原剂时：
(1)大肠杆菌样本的准备：从环境中或患者体内直接分离出大肠杆菌，将获得的大肠杆菌菌株分别放入培养基进行培养，去掉培养基，利用PBS(磷酸缓冲盐溶液)缓冲液稀释并进行高温灭活处理后，得到在600nm处的光密度(OD600)为1.0的大肠杆菌样品作为待测样本。
(2)活性基底的准备：
301，分别称取2g硝酸银溶于10ml超纯水中，称取0.1g聚乙烯吡咯烷酮溶于10ml超纯水中，称取0.2g抗坏血酸溶于10ml超纯水中。
302，按顺序分别取10ml去离子水、0.2ml硝酸银溶液以及2ml聚乙烯吡咯烷酮于烧杯中。
303，将以上混合溶液在恒温磁力搅拌器转速为600r/min下搅拌，搅拌均匀后迅速加入1ml抗坏血酸溶液，搅拌15min。
304，离心洗涤去除杂质，离心的转速为8000r/min，时间为10min，分别用乙醇和超纯水洗涤三次并离心。
305，加入10ml超纯水并利用超声波震荡使其分散均匀便得到500纳米银溶胶。
(3)混合
将待测的大肠杆菌样本与银溶胶按照1:50的体积比进行混合，摇匀静置3h，取适量混合液滴在干净的硅片上进行晾干待测。
(4)检测
将拉曼光谱仪的激光波长设置为532nm，对硅片进行照射，激发微生物产生拉曼光谱，再将硅片上微生物所产生的拉曼光谱信息进行收集，接收拉曼光谱信息并进行处理，获得相关峰图并在移动终端上显示出来，在移动终端内建立有微生物多光谱标准数据库，拉曼光谱仪所获得的相关峰图在移动终端上显示时将自动与微生物多光谱标准数据库进行比对，根据获得的相关峰图检测待测样本中所含有的微生物种类，移动终端自动将比对吻合的微生物种类列出来，可直观进行查看。
活性基底的选择
将以柠檬酸钠作为还原剂的银溶胶和以抗坏血酸作为还原剂的银溶胶进行实验对比，其以罗丹明6G(R6G)为待测分子、以所制备的银纳米溶胶作为表面增强拉曼散射基底进行了拉曼检测，分别对不同浓度的R6G进行了拉曼光谱采集，分别为10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M五个浓度梯度，随着浓度梯度的减小，表面增强拉曼散射信号强度会逐渐减弱，其中，以柠檬酸钠作为还原剂的银溶胶在10-6M已经观察不到表面增强拉曼散射信号，而以抗坏血酸作为还原剂的银溶胶在10-8M浓度时依然可以观察到表面增强拉曼散射信号，这说明对于R6G来说以抗坏血酸作为还原剂可以达到10-8M浓度甚至更低的检测限，同时证明了以抗坏血酸为还原剂所制备的纳米银溶胶有较好的表面增强拉曼散射增强效果，可以作为表面增强拉曼散射实验的活性基底，以抗坏血酸作为还原剂的银溶胶具有高活性和稳定性。
拉曼光谱仪的激光波长的选择
将大肠杆菌直接滴在硅片上晾干并分别利用532nm、564nm、585nm三种波长的激光进行拉曼检测，不能利用传统拉曼检测技术直接检测得到有用的拉曼光谱，直接利用532nm波长的激光激发获得大肠杆菌的拉曼光谱图都有较强的荧光背景，除了526.75nm附近的硅的峰并没有有价值的其他拉曼峰；而对于564nm波长的激光激发的拉曼光光谱在1400cm-1处出现了信号异常，这可能是由于激光使得样品发生了损坏或者移动；利用585nm波长的激光激发所得到的拉曼光谱有很强的硅的拉曼峰，样品的拉曼光谱却被湮没而且强度极小，同样不能得到有用的拉曼光谱图，故采用532nm波长的激光可获得较强的拉曼光谱。
对比例
通过分离培养进行鉴定，包括以下步骤：
1)增菌培养：将大肠杆菌O157:H7接种到改良E.C新生霉素增菌肉汤m(EC)n中，在38℃下增菌培养20h，即得菌悬液，备用，该步骤增菌效果显著，使得大肠杆菌O157:H7达到对数生长期，此时细菌结构稳定，代谢、生理特性比较一致且良好，防御能力最强，叠氮溴乙锭作用难度最大；
2)菌株基因组DNA的提取：取培养菌悬液1ml，避光条件下加入浓度为0.05mg/mL的叠氮溴乙锭溶液(EMA)，使EMA终浓度达到4.0mg/L，轻微振荡混匀，黑暗中静置14min，然后将菌液取出，距离灯管16cm，开盖置于冰上，用600W卤钨灯持续曝光10min使叠氮溴乙锭光解，将样品取出后置于转速为10000r/min的离心机中离心5min，弃上清，用超纯水重悬1次，然后98℃金属浴12min，再置于转速为10000r/min的离心机中离心5min，上清液即提取的菌株基因组DNA，备用，该步骤中EMA作为一种新型的DNA插入型荧光染料，能插入到细胞壁或细胞膜不完整的死细胞DNA中，当用高强度的可见光曝光激活EMA时，会产生有活性的氮宾中间体，中间体与DNA紧密共价结合形成复合物而使其失去继续扩增能力，体系中游离的EMA氮宾活性中间体与体系中的水结合形成羟胺，从而使EMA完全被消耗掉，不会影响后续DNA扩增，而活细胞完整的细胞壁与细胞膜能够阻止EMA染料的进入，由于羟胺的形成，有效避免了对活菌DNA扩增的影响，从而可不用将活菌和死菌分开而直接检测活菌，同时该步骤用金属浴方法不耗费试剂，操作简单、直接、快速，获得DNA量更多，纯度也可达到试验要求，同时同样作用温度下，金属浴相较于水浴，灭活细菌的效果更好；
3)引物和探针的设计与合成：使用引物设计软件Primer Premier 5.0，根据检测目的，综合PCR试验灵敏度、特异性等多项指标，筛选目的基因及对应的引物，再将筛选出的引物和探针在Genbank中进行回检分析，同时做同源性比较，选择同源性低的引物，构建双重PCR引物、探针组合fliC基因，备用，rfbE基因或fliC基因的灵敏度高、扩增效率高，两基因的最低检出限均达到116CFU/mL，低于国家标准检测大肠杆菌O157:H7的rfbE单基因荧光PCR最低检出限度291CFU/mL，符合要求；
4)PCR反应扩增：将提取的菌株基因组DNA，用无菌超纯水做10倍梯度稀释，从中选取5个梯度稀释DNA溶液作为模板，进行双重荧光PCR扩增，双重荧光PCR反应总体积25μL，内含Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL、10μM上下游引物各0.5μL、5μM探针各1μL、ddH2O7.5μL、DNA模板1μL，PCR反应参数：37℃5min，94℃预变性3min，94℃变性20s，60℃退火延伸45s(检测荧光信号)，40个循环；
5)结果判断：根据LightCycler480荧光定量PCR仪操作手册，选用“最大二阶导数法”进行分析，以CP值(crossing point，指扩增曲线产生荧光突跃时的循环次数)判断结果，CP值≤35判为阳性，CP值≥40判为阴性，CP值介于35-40之间，应适当增加模板量重做试验。
准备相同数量的大肠杆菌分别通过实验例和对比例中的方法进行检测，结果显示采用本发明方法所检测的大肠杆菌不需要对样本进行标记，检测过程快速，效率较高，耗时较短。且通过本发明采用纳米基体可提高病原微生物拉曼光谱的信号强度，从而提高检测过程中的灵敏度，所需样本较少，只需将混合液滴在硅片上即可进行检测，无需对大量样本进行检测，降低样本损坏的概率，分离培养检测的大肠杆菌样本在检测过程中容易损坏，不利于检测，分离培养检测所需的材料较多，导致成本较高，而本发明所用到的纳米基体价格较低且可以反复使用，其检测成本较低，具有一定的市场推广性，分离培养所需的材料较多，只能在实验室内进行，在现场或者野外时较为不便，存在一定的障碍，本发明所使用到的拉曼光谱仪可实现小型化，携带较为方便，便于现场或野外检测。
虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属于本发明所保护的范围。
Claims (10)
1.一种融合光谱技术的病原性微生物检测方法，其特征在于，包括：
S1，准备待测样本以及活性基底；
S2，将活性基底与待测样本按一定比例混合，摇匀静置2-3h；
S3，取适量混合液滴在干净的硅片上进行晾干；
S4，通过拉曼光谱仪对硅片进行照射，将硅片上微生物所产生的拉曼光谱信息进行收集；
S5，接收拉曼光谱信息并进行处理，获得相关峰图并在移动终端上显示出来；
S6，根据获得的相关峰图检测待测样本中所含有的微生物种类。
2.根据权利要求1所述的融合光谱技术的病原性微生物检测方法，其特征在于，所述S1中，活性基体采用金属溶胶法制备。
3.根据权利要求2所述的融合光谱技术的病原性微生物检测方法，其特征在于，所述金属溶胶法制备包括以下步骤：
S31，称取45mg的硝酸银，用少量蒸馏水使其溶解，定容至250mL容量瓶中备用，得到10- 3mol/L硝酸银溶液；
S32，取1g柠檬酸钠溶于100mL蒸馏水中，得到1％柠檬酸钠溶液备用；
S33，取配置好的硝酸银溶液100mL置于250mL烧杯中，置于磁力搅拌器上，将其加热至沸腾90℃，不断搅拌硝酸银溶液；
S34，将量取好的10mL1％柠檬酸钠溶液缓慢滴加到沸腾的硝酸银溶液中，滴加完成后，沸腾状态下继续加热10-15min，继续不断搅拌，直至溶液呈灰绿色后停止加热，自然冷却到室温，得到灰绿色的2-65纳米银溶胶。
4.根据权利要求3所述的融合光谱技术的病原性微生物检测方法，其特征在于，所述S34中，沸腾状态下继续加热12min。
5.根据权利要求2所述的融合光谱技术的病原性微生物检测方法，其特征在于，所述金属溶胶法制备包括以下步骤：
S51，分别称取2g硝酸银溶于10ml超纯水中，称取0.1g聚乙烯吡咯烷酮溶于10ml超纯水中，称取0.2g抗坏血酸溶于10ml超纯水中；
S52，按顺序分别取10ml去离子水、0.2ml硝酸银溶液以及2ml聚乙烯吡咯烷酮于烧杯中；
S53，将以上混合溶液在恒温磁力搅拌器下搅拌，搅拌均匀后迅速加入1ml抗坏血酸溶液，搅拌15min；
S54，离心洗涤去除杂质，分别用乙醇和超纯水洗涤三次并离心；
S55，加入10ml超纯水并利用超声波震荡使其分散均匀便得到500纳米银溶胶。
6.根据权利要求5所述的融合光谱技术的病原性微生物检测方法，其特征在于，所述S53中，恒温磁力搅拌器的转速为555-650r/min。
7.根据权利要求5所述的融合光谱技术的病原性微生物检测方法，其特征在于，所述S54中，离心的转速为8000r/min，时间为10min。
8.根据权利要求2所述的融合光谱技术的病原性微生物检测方法，其特征在于，所述活性基底在与待测样本混合前需要进行拉曼光谱检测。
9.根据权利要求1所述的融合光谱技术的病原性微生物检测方法，其特征在于，所述拉曼光谱仪激发光源的波长范围为500-600nm。
10.根据权利要求1所述的融合光谱技术的病原性微生物检测方法，其特征在于，所述S5中，在移动终端内建立有微生物多光谱标准数据库，拉曼光谱仪所获得的相关峰图在移动终端上显示时将自动与微生物多光谱标准数据库进行比对。
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