CN113125716A - 一种同时杀灭和检测微生物的方法 - Google Patents

一种同时杀灭和检测微生物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113125716A
CN113125716A CN202110310313.7A CN202110310313A CN113125716A CN 113125716 A CN113125716 A CN 113125716A CN 202110310313 A CN202110310313 A CN 202110310313A CN 113125716 A CN113125716 A CN 113125716A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
targeting molecule
microorganisms
bacteria
mixing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110310313.7A
Other languages
English (en)
Inventor
郑金铠
陆畅
高飞
李玉芝
赵成英
赵少杰
冯丽萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Food Science and Technology of CAAS
Original Assignee
Institute of Food Science and Technology of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Food Science and Technology of CAAS filed Critical Institute of Food Science and Technology of CAAS
Priority to CN202110310313.7A priority Critical patent/CN113125716A/zh
Publication of CN113125716A publication Critical patent/CN113125716A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本公开涉及一种同时检测和杀灭微生物的方法，其中，所述杀灭微生物的方法包括如下步骤：S1、将可能含有所述微生物的样本与纳米酶溶液和捕获菌的溶液混合，得到混合液；S2、将所述混合液与H2O2溶液在光照条件下混合；其中，所述纳米酶溶液含有结合有第一靶向分子的金纳米粒子；所述捕获菌的溶液含有结合有第二靶向分子的免疫磁性纳米粒子；所述第一靶向分子和所述第二靶向分子不同且能够与所述微生物特异地结合。该方法成本低、灵敏度高、稳定性好，可以快速、有效检测和杀灭微生物。

Description

一种同时杀灭和检测微生物的方法
技术领域
本公开涉及酶工程、环境监测技术及医疗抗菌技术领域，具体地，涉及一种快速杀灭和检测微生物的方法。
背景技术
近年来，食品安全已成为当今世界性公共卫生热点。食源性致病菌(如大肠杆菌、副溶血弧菌、沙门氏菌等)是引起食源性疾病的首要原因，食源性致病菌对人类健康造成极大危害，是食品安全的重大隐患。同时致病菌也会引起伤口感染，严重威胁人类健康。人体的肠道中栖息着大量微生物，在消化吸收、能量代谢、免疫调节、抗病能力等方面发挥着重要作用，与很多疾病的发生息息相关。食源性致病菌和肠道菌的检测对人类健康具有非常重要的意义。目前广泛使用的菌株检测方法存在检测时间长，过程繁琐，需要大型仪器来辅助，不利于现场的快速检测，对操作人员技术要求高以及对多种菌难以同时检测的问题，滥用抗生素引起的广发的多药耐药性也使细菌感染的治疗遇到了瓶颈。因此，建立研究快速检测和杀灭特异菌的方法就显得尤为重要。
传统的天然酶纳米材料的比色传感方法因其操作简单，成本低廉而引起人们的广泛关注，但仍存在灵敏度低、稳定性差等问题。纳米酶是一类具有酶催化活性的纳米材料，能在温和的生理条件下高效催化酶的底物，产生与天然酶相同的反应产物，但相比天然酶，它具有灵敏度高、稳定性好、循环利用效率高等优势，有望替代传统的天然酶在比色生物传感检测领域具有应用前景。但是由于食品基质成分复杂，易对测定物质产生干扰，单纯依赖比色传感方法仍然无法保障检测所需的特异性和选择性。基于以上问题，如何提供一种价格低廉，灵敏度高、稳定性好，可以有效、快速检测并杀灭特异菌株的方法是亟需解决的问题。
发明内容
本公开的目的是提供一种同时杀灭和检测微生物的方法，该方法成本低、灵敏度高、稳定性好，可以快速、有效检测和杀灭微生物。
为了实现上述目的，本公开第一方面提供一种杀灭微生物的方法，其中，所述方法包括如下步骤：S1、将可能含有所述微生物的样本与纳米酶溶液和捕获菌的溶液混合，得到混合液；S2、将所述混合液与H2O2溶液在光照条件下混合；其中，所述纳米酶溶液含有结合有第一靶向分子的金纳米粒子；所述捕获菌的溶液含有结合有第二靶向分子的免疫磁性纳米粒子；所述第一靶向分子和所述第二靶向分子不同且能够与所述微生物特异地结合。
本公开第二方面提供一种检测微生物的方法，其中，所述方法包括如下步骤：A1、将可能含有所述微生物的样本与纳米酶溶液和捕获菌的溶液混合，得到混合液；B2、将所述混合液与3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液、H2O2溶液在光照条件下混合，然后进行紫外吸收光谱测试；其中，所述纳米酶溶液含有结合有第一靶向分子的金纳米粒子；所述捕获菌的溶液含有结合有第二靶向分子的免疫磁性纳米粒子；所述第一靶向分子和所述第二靶向分子不同且能够与同一所述微生物上的不同靶标特异地结合。
通过上述技术方案，相对于传统方法，本公开提供了一种同时检测和杀灭微生物的方法，利用合成的复合纳米材料可以特异性定量检测和杀灭微生物，实现短时间内有效杀灭和检测微生物，检测速度快，灵敏度高，也适用于多种目标物的检测，在食品安全、环境检测、健康快检等技术领域具有广阔的应用前景。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是本发明同时检测和杀灭特异菌方法的流程示意图。
图2是实施例1中金纳米棒和复合纳米酶的UV-vis图。
图3是实施例1中金纳米棒(a)和复合纳米酶(b)TEM图。
图4是实施例1中复合纳米酶的催化活性(a)和光热性能(b)图。
图5是实施例1和对比例中对待检测菌进行杀灭得到的对比图。
图6是实施例2中检测大肠杆菌O157:H7的UV-vis谱图以及检测大肠杆菌O157:H7的标准曲线图。
图7是实施例3对副溶血弧菌进行杀灭得到的图。
图8是实施例4检测大肠杆菌O157:H7的特异性图。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面提供一种杀灭微生物的方法，其中，所述方法包括如下步骤：S1、将可能含有所述微生物的样本与纳米酶溶液和捕获菌的溶液混合，得到混合液；S2、将所述混合液与H2O2溶液在光照条件下混合；
其中，所述纳米酶溶液含有结合有第一靶向分子的金纳米粒子；所述捕获菌的溶液含有结合有第二靶向分子的免疫磁性纳米粒子；所述第一靶向分子和所述第二靶向分子不同且能够与所述微生物特异地结合。
本公开第二方面提供一种检测微生物的方法，其中，所述方法可以包括如下步骤：A1、将可能含有所述微生物的样本与纳米酶溶液和捕获菌的溶液混合，得到混合液；B2、将所述混合液与3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液、H2O2溶液在光照条件下混合，然后进行紫外吸收光谱测试；
其中，所述纳米酶溶液可以含有结合有第一靶向分子的金纳米粒子；所述捕获菌的溶液含有结合有第二靶向分子的免疫磁性纳米粒子；所述第一靶向分子和所述第二靶向分子不同且能够与同一所述微生物上的不同靶标特异地结合。
根据本公开，其中，所述第一靶分子和所述第二靶分子可以各自独立地选自抗体、适配体、亲和素、肽聚糖或生物素中的一种；优选地，所述第一靶分子为适配体，所述第二靶分子为抗体；更优选地，所述第一靶向分子为适配体，所述第二靶向分子为特异性结合目标菌表面蛋白的单克隆抗体；所述适配体包括调控金纳米粒子生长的序列和特异性识别微生物的序列，所述调控金纳米粒子生长的序列包括10～30个碱基且各碱基各自独立地选自A、G、C、T中的任意一种；所述适配体的序列可以如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1中的第1位至第20位中的N可以各自独立地选自A、G、C、T中的任意一种；所述特异性识别微生物的序列可以如SEQ ID NO.1中第21位至第62位所示；所述调控金纳米粒子生长的序列的3’端与特异性识别微生物的5’端相连接。
根据本公开，其中，所述纳米酶溶液可以通过包括如下步骤的方法制备得到：将含有所述第一靶向分子的溶液、含有所述金纳米粒子的溶液与还原剂和生长试剂混合；所述还原剂包括抗坏血酸和羟胺盐酸盐中的至少一种，所述生长试剂包括氯铂酸、氯钯酸和硝酸银中的至少一种；含有所述第一靶向分子的溶液中，所述第一靶向分子的浓度为0.1-10μmol/L，含有所述金纳米粒子的溶液中，所述第一靶向分子、所述金纳米粒子、所述还原剂和所述生长试剂的重量比为(0.5-6)：100：(0.5-10)：(0.2-50)；
根据本公开，所述捕获菌的溶液可以通过包括如下步骤的方法制备得到：将含有所述第二靶向分子的溶液与含有所述免疫磁性纳米粒子的溶液混合；优选地，所述第二靶向分子为生物素标记抗体，所述免疫磁性纳米粒子为链霉亲和素标记的纳米磁珠；含有所述第二靶向分子的溶液中，所述第二靶向分子的浓度为0.5-10mg/mL，含有所述免疫磁性纳米粒子的溶液中，所述第二靶向分子和所述免疫磁性纳米粒子的重量比为(0.5-10)：100。优选地，所述菌为大肠杆菌时，所述生物素标记抗体可以为生物标记的购自Meridian LifeScience的商品号为B65001R的单克隆抗体。
根据本公开，其中，步骤S1的反应条件包括：温度25-37℃，时间0.5-5h；所述可能含有所述微生物的样本为液体，所述可能含有所述微生物的样本、所述纳米酶溶液和所述捕获菌的溶液的体积比为100：(1-20)：(0.1-10)；
步骤S2的反应条件包括：光照强度0.04-0.4W/cm2，光照波长750-1000nm，时间为2.5-30min；步骤S2所述H2O2溶液的浓度为25-250mmol/L，所述混合液与H2O2溶液的体积比为100：(0.1-5)。
根据本公开，其中，步骤A1的反应条件包括：温度25-37℃，时间0.5-5h；所述可能含有所述微生物的样本为液体，所述可能含有所述微生物的样本、所述纳米酶溶液和所述捕获菌的溶液的体积比为100：(1-20)：(0.1-10)；步骤B2的反应条件包括：光照强度0.04-0.4W/cm2，光照波长750-1000nm，时间为2.5-30min；步骤A1中所述混合液中纳米酶的浓度为5-100mg/mL，捕获菌的浓度为10-200μg/mL；
步骤B2所述混合过程还包括加入缓冲溶液的操作，所述缓冲溶液包括柠檬酸钠溶液、柠檬酸钾溶液、醋酸钠溶液和醋酸钾溶液中的至少一种；步骤B2中3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为0.5-5mmol/L，缓冲溶液的浓度为0.4-4mol/L，H2O2溶液的浓度为25-250mmol/L；所述混合液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液、缓冲溶液和H2O2溶液的体积比为100：(2-10)：(10-20)：(0.1-5)。
根据本公开，其中，所述金纳米粒子包括金纳米棒、金纳米球、金纳米花和金纳米片中的至少一种。
根据本公开，其中，含有所述金纳米粒子的溶液的制备方法包括：利用种子生长法制备所述金纳米粒子。
根据本公开，其中，所述免疫磁性纳米粒子包括免疫磁珠、三氧化二铁和氧化铁中的至少一种，所述免疫磁性纳米粒子的粒径为150-500nm。
根据本公开，其中，所述微生物包括食源性致病菌和肠道菌中的至少一种，所述食源性致病菌包括大肠杆菌、副溶血弧菌、沙氏门菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌中的至少一种。
根据本公开，可使用电镜检测步骤S1中所述杀灭的微生物，所述电镜检测包括透射电镜检测、高分辨率透射电镜检测和扫描电镜检测中的至少一种，当使用电镜观察所述杀灭微生物的混合液，可根据观察结果中是否出现破坏的菌得知微生物是否被杀灭。还可以将所述杀灭微生物的混合液进行菌培养及计数，培养条件和方法均是本领域常规方法。当计数结果中没有出现菌时，说明已经实现了对微生物的杀灭；当计数结果中出现大量微生物时，说明没有实现对菌的杀灭。或者可将所述杀灭微生物后的混合液进行荧光染色随后用显微镜观察，所述染色条件和方法均可为本领域常用方法，如果使用美蓝染色，死的微生物为蓝色，活的微生物会被染成无色，当染色结果为无色时，说明没有实现对微生物的杀灭，当染色结果为蓝色时，说明实现了对微生物的杀灭。
根据本公开，对步骤B2中所述混合液进行紫外吸收光谱测试，即快速准确地检测出混合液中是否含有微生物，检测的条件和方法可以为本领域常规的。当检测结果中TMB在652nm处出现特征峰且溶液颜色变为蓝色时，说明待检测溶液中含有所述微生物；当检测结果中TMB在652nm处没有出现特征峰且溶液颜色没有变蓝时，说明待检测溶液中不含所述微生物。也可通过该方法快速检测出微生物的含量，将步骤B2中所得混合液进行UV-vis检测，建立微生物浓度与吸光度值之间的标准曲线，将待检测混合液的吸光度值带入所述标准曲线，得出混合溶液中微生物的含量。
本公开步骤S1/A1中所述纳米酶为复合纳米材料，合成方法简单，成本低，具有纳米酶的催化活性、光热性能、稳定性和生物识别特性，可特异性定量检测和杀灭微生物，以实现短时间内有效杀灭微生物，检测速度快，灵敏度高，在食品安全、环境健康等领域具有广阔的前景。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例1
本实施例用于举例说明待测样品中大肠杆菌O157:H7的杀灭。
向5mL十六烷基三甲溴化铵溶液(0.2mol/L)中加入5mL氯金酸溶液(0.5mmol/L)和300μL硼氢化钠溶液(浓度为10mmol/L)，在27℃下反应2h，得到金种溶液。向10mL十六烷基三甲溴化铵溶液(浓度为0.2mol/L)中加入100μL氯金酸溶液(50mmol/L)、100μL硝酸银溶液(10mmol/L)、24μL金种溶液和100μL抗坏血酸溶液(100mmol/L)，在30℃下反应2h后离心，收集离心沉淀物即固体产物。将该离心沉淀物按照与水混合得到浓度为1mg/mL的金纳米棒溶液。
100μL金纳米棒溶液中加入15μL的5’-AAAAAAAAAAAAAAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCAGGTGTGACGG-3’SEQ ID NO.2所示的适配体DNA溶液(10μmol/L)、10μL羟胺盐酸盐溶液(10mmol/L)和10μL氯铂酸溶液(10mmol/L)，在30℃下反应2h，得到纳米酶溶液。
100μL含有链霉亲和素标记的纳米磁珠溶液(1mg/mL)与1μL生物素标记的大肠杆菌抗体(生物标记的购自Meridian Life Science的商品号为B65001R的单克隆抗体，以下相同)溶液(0.5mg/mL)混合，得到捕获菌溶液；取10μL该捕获菌溶液与100μL的可能含有大肠杆菌O157:H7的样本溶液和20μL的纳米酶溶液混合，在25℃下反应0.5h，磁分离后得到混合液。
将100μL混合液和1μL的H2O2溶液(50mmol/L)在0.4W/cm2、808nm的光照条件下混合5分钟，得到杀灭致病菌的混合液。然后对杀灭致病菌的混合液进行如下检测，结果见图5：(1)将所述反应后的测试混合液进行菌培养及计数，计数结果中没有菌，说明已实现了对致病菌的杀灭，并且在5分钟内对致病菌的杀伤效果可高达95％；(2)将上述杀灭致病菌的混合液进行美蓝染色随后用显微镜观察，可以看到染色结果中出现大量蓝色斑点时，说明已实现了对致病菌的杀灭；(3)将上述杀灭致病菌的混合液进行电镜观察，当观察结果中出现破坏的菌时，说明已实现了对致病菌的杀灭。
实施例2
本实施例用于说明待测样品中大肠杆菌O157:H7的检测。
向10mL十六烷基三甲溴化铵溶液(0.2mol/L)中加入10mL氯金酸溶液(0.5mmol/L)和600μL硼氢化钠溶液(浓度为10mmol/L)，在28℃反应1h，得到金种溶液。向10mL十六烷基三甲溴化铵溶液(浓度为0.2mol/L)中加入50μL氯金酸溶液(100mmol/L)、70μL硝酸银溶液(10mmol/L)、24μL金种溶液和80μL抗坏血酸溶液(100mmol/L)，在32℃反应2.5h后离心，收集离心沉淀物即固体产物。将该离心沉淀物与水混合得到浓度为1mg/mL的金纳米棒溶液。
100μL金棒溶液中加入2μL的5’-TTTTTTTTTTTTTTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCAGGTGTGACGG-3′SEQ ID NO.3所示的适配体DNA溶液(10μmol/L)、10μL羟胺盐酸盐溶液(100mmol/L)和20μL氯铂酸溶液(100mmol/L)，在27℃反应3h，得到纳米酶溶液。
100μL含有链霉亲和素标记的纳米磁珠溶液(1mg/mL)与1μL生物素标记的大肠杆菌抗体溶液(2mg/mL)混合，得到捕获菌溶液；取5μL该捕获菌溶液与100μL可能含有大肠杆菌O157:H7的样本溶液和10μL用于纳米酶溶液混合，在27℃下反应0.5h，磁分离后得到混合液。
将100μL混合液、2μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液(2mmol/L)、1μL的H2O2溶液(50mmol/L)和10μL醋酸盐缓冲液(1mol/L)在0.3W/cm2、900nm的光照条件下混合5分钟，然后进行紫外吸收光谱(UV)检测，检测结果显示TMB在652nm处出现特征峰，且溶液颜色变为蓝色，说明上述样本溶液中含有所述大肠杆菌O157:H7，实现了对大肠杆菌O157:H7的定性检测。
将10μL纳米酶溶液、5μL捕获菌溶液分别与100μL的一系列含不同浓度的大肠杆菌的标准溶液(0-107CFU/mL)混合进行反应得到一系列的大肠杆菌标准混合液，将所述步骤得到的大肠杆菌标准混合液分别与2μL的TMB溶液(2mmol/L)、1μL的H2O2溶液(50mmol/L)和80μL醋酸盐缓冲液(1mol/L)在0.3W/cm2、900nm的光照条件下混合5分钟，然后进行紫外吸收光谱(UV)测试，建立致病菌浓度与吸光度值之间的标准曲线(图6)，检测限可达2CFU/mL，线性范围为101-107CFU/mL；将可能含有大肠杆菌O157:H7的样本溶液按照上述步骤测得的吸光度值带入所述标准曲线；得出可能含有大肠杆菌O157:H7的样本溶液中大肠杆菌的含量，实现对致病菌的定量检测。
实施例3
本实施例用于举例说明待测样本中副溶血弧菌的杀灭。
利用与实施例1相同的方法对可能含有副溶血弧菌ATCC 17802的样本溶液进行杀灭和检测，唯一不同的是本实施例中的第一靶向分子和第二靶向分子分别为5’-CCCCCCCCCCCCCCCTCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGA-3’SEQ ID NO.4和5′-生物素-TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGA SEQ ID NO.5所示的适配体DNA溶液。对杀灭致病菌的混合液进行如下检测，结果如图7：(1)将所述反应后的测试混合液进行菌培养及计数，计数结果中没有菌，说明已实现了对致病菌的杀灭，并且在5分钟内实现对致病菌的杀伤效果可高达92％；(2)将上述杀灭致病菌的混合液进行美蓝染色随后用显微镜观察，可以看到染色结果中出现大量蓝色斑点时，说明已实现了对致病菌的杀灭；(3)将上述杀灭致病菌的混合液进行电镜观察，当观察结果中出现破坏的菌时，说明已实现了对致病菌的杀灭。
实施例4
本实施例用于说明特异性检测大肠杆菌O157:H7。
向10mL十六烷基三甲溴化铵溶液(0.2mol/L)中加入10mL氯金酸溶液(0.5mmol/L)和600μL硼氢化钠溶液(浓度为10mmol/L)，在29℃下反应1h，得到金种溶液。向10mL十六烷基三甲溴化铵溶液(浓度为0.2mol/L)中加入50μL氯金酸溶液(100mmol/L)、80μL硝酸银溶液(10mmol/L)、24μL金种溶液和70μL抗坏血酸溶液(100mmol/L)，在30℃下反应1.5h后离心，收集离心沉淀物。将该离心沉淀物与水混合得到浓度为2mg/mL的金纳米棒溶液。
100μL金棒溶液中加入3μL的5’-AAAAAAAAAAAAAAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCAGGTGTGACGG-3’SEQ ID NO.6所示的适配体DNA溶液(10μmol/L)、2μL羟胺盐酸盐溶液(100mmol/L)和5μL氯铂酸溶液(100mmol/L)，在28℃下反应2.5h，得到纳米酶溶液。
100μL含有链霉亲和素标记的纳米磁珠溶液(1mg/mL)与1μL生物素标记的大肠杆菌抗体溶液(10mg/mL)混合，得到捕获菌溶液；取5μL该捕获菌溶液分别与100μL不同菌(大肠杆菌、李斯特菌，沙门氏菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，副溶血弧菌)溶液和10μL纳米酶溶液混合，在28℃下反应0.5h，磁分离后分别得到不同菌的混合液。
分别将100μL不同菌的混合液和2μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液(2mmol/L)，1μL的H2O2溶液(30mmol/L)和10μL醋酸盐缓冲液(2mol/L)在0.2W/cm2、950nm的光照条件下混合5分钟，进行紫外吸收光谱(UV)检测，结果如图8所示：检测结果显示只有含有大肠杆菌O157:H7的测试混合液在652nm处出现特征峰，且溶液颜色变为蓝色；其他菌液混合液在652nm处没有出现特征峰，且溶液颜色仍为无色。结果表明，本发明提供的方法可特异性的检测到大肠杆菌O157:H7的特征信号，对其它菌(如大肠杆菌ATCC 25933、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、李斯特菌)无明显的信号响应。
对比例1
向5mL十六烷基三甲溴化铵溶液(0.2mol/L)中加入5mL氯金酸溶液(0.5mmol/L)和300μL硼氢化钠溶液(浓度为10mmol/L)，在27℃反应2h，得到金种溶液。向10mL十六烷基三甲溴化铵溶液(浓度为0.2mol/L)中加入100μL氯金酸溶液(50mmol/L)、100μL硝酸银溶液(10mmol/L)、24μL金种溶液和100μL抗坏血酸溶液(100mmol/L)，在30℃下反应2h后离心，收集离心沉淀物即固体产物。将该离心沉淀物按照与水混合得到浓度为1mg/mL的金纳米棒溶液。
100μL金纳米棒溶液中加入10μL羟胺盐酸盐溶液(10mmol/L)和10μL氯铂酸溶液(10mmol/L)，在30℃下反应2h，得到纳米酶溶液。
100μL含有链霉亲和素标记的纳米磁珠溶液(1mg/mL)与1μL生物素标记的大肠杆菌抗体溶液(0.5mg/mL)混合，得到捕获菌溶液；取10μL该捕获菌溶液与100μL的可能含有大肠杆菌O157:H7的样本溶液和20μL的纳米酶溶液混合，在25℃下反应0.5h，磁分离后得到混合液。
将100μL混合液和1μL的H2O2溶液(50mmol/L)在0.4W/cm2、808nm的光照条件下混合5分钟，得到杀灭致病菌的混合液。然后对杀灭致病菌的混合液进行检测，具体地，对本对比例的杀灭致病菌的混合液进行菌培养及计数，计数结果中出现大量菌，说明没有实现对菌的杀灭；将所述杀灭致病菌的混合液进行美蓝染色随后用显微镜观察，染色结果为无色，说明没有实现对菌的杀灭；将所述杀灭致病菌的混合液进行电镜观察，观察结果中菌是没有被破坏的，说明没有实现对致病菌的杀灭。
通过实施例、对比例的结果可以看出，本公开的方法能够非常准确地测定待检测溶液中大肠杆菌的含量及实现对大肠杆菌的杀灭。
本发明利用DNA调控生成复合纳米酶可实现同时对特异菌的检测和杀灭，对食品及肠道中特异菌的检测有较大的实用价值。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国农业科学院农产品加工研究所
<120> 一种同时杀灭和检测微生物的方法
<130> 19919CAAS-F-LC
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccggacgctt atgccttgcc atctacagag caggtgtgac 60
gg 62
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaaaaaaa aaaaaccgga cgcttatgcc ttgccatcta cagagcaggt gtgacgg 57
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttttttttt tttttccgga cgcttatgcc ttgccatcta cagagcaggt gtgacgg 57
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccccccccc ccccctctaa aaatgggcaa agaaacagtg actcgttgag a 51
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctaaaaatg ggcaaagaaa cagtgactcg ttgaga 36
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaaaaaaaa aaaaaccgga cgcttatgcc ttgccatcta cagagcaggt gtgacgg 57

Claims (10)

1.一种杀灭微生物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将可能含有所述微生物的样本与纳米酶溶液和捕获菌的溶液混合，得到混合液；
S2、将所述混合液与H2O2溶液在光照条件下混合；
其中，所述纳米酶溶液含有结合有第一靶向分子的金纳米粒子；所述捕获菌的溶液含有结合有第二靶向分子的免疫磁性纳米粒子；所述第一靶向分子和所述第二靶向分子不同且能够与所述微生物特异地结合。
2.一种检测微生物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A1、将可能含有所述微生物的样本与纳米酶溶液和捕获菌的溶液混合，得到混合液；
B2、将所述混合液与3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液、H2O2溶液在光照条件下混合，然后进行紫外吸收光谱测试；
其中，所述纳米酶溶液含有结合有第一靶向分子的金纳米粒子；所述捕获菌的溶液含有结合有第二靶向分子的免疫磁性纳米粒子；所述第一靶向分子和所述第二靶向分子不同且能够与同一所述微生物上的不同靶标特异地结合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一靶向分子和所述第二靶向分子各自独立地选自抗体、适配体、亲和素、肽聚糖或生物素中的一种；优选地，所述第一靶向分子为适配体，所述第二靶向分子为抗体；
更优选地，所述第一靶向分子为适配体，所述第二靶向分子为特异性结合目标菌表面蛋白的单克隆抗体；所述适配体包括调控金纳米粒子生长的序列和特异性识别微生物的序列，所述调控金纳米粒子生长的序列包括10～30个碱基且各碱基各自独立地选自A、G、C、T中的任意一种，所述特异性识别微生物的序列如SEQ ID NO.1所示；所述调控金纳米粒子生长的序列的3’端与特异性识别微生物的5’端相连接。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述纳米酶溶液通过包括如下步骤的方法制备得到：将含有所述第一靶向分子的溶液、含有所述金纳米粒子的溶液与还原剂和生长试剂混合；所述还原剂包括抗坏血酸和羟胺盐酸盐中的至少一种，所述生长试剂包括氯铂酸、氯钯酸和硝酸银中的至少一种；含有所述第一靶向分子的溶液中，所述第一靶向分子的浓度为0.1-10μmol/L，含有所述金纳米粒子的溶液中，所述第一靶向分子、所述金纳米粒子、所述还原剂和所述生长试剂的重量比为(0.5-6)：100：(0.5-10)：(0.2-50)；
所述捕获菌的溶液通过包括如下步骤的方法制备得到：将含有所述第二靶向分子的溶液与含有所述免疫磁性纳米粒子的溶液混合；优选地，所述第二靶向分子为生物素标记抗体，所述免疫磁性纳米粒子为链霉亲和素标记的纳米磁珠；含有所述第二靶向分子的溶液中，所述第二靶向分子的浓度为0.5-10mg/mL，含有所述免疫磁性纳米粒子的溶液中，所述第二靶向分子和所述免疫磁性纳米粒子的重量比为(0.5-10)：100。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S1的反应条件包括：温度25-37℃，时间0.5-5h；所述可能含有所述微生物的样本为液体，所述可能含有所述微生物的样本、所述纳米酶溶液和所述捕获菌的溶液的体积比为100：(1-20)：(0.1-10)；步骤S2的反应条件包括：光照强度0.04-0.4W/cm2，光照波长750-1000nm，时间为2.5-30min；步骤S2所述H2O2溶液的浓度为25-250mmol/L，所述混合液与H2O2溶液的体积比为100：(0.1-5)。
6.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤A1的反应条件包括：温度25-37℃，时间0.5-5h；所述可能含有所述微生物的样本为液体，所述可能含有所述微生物的样本、所述纳米酶溶液和所述捕获菌的溶液的体积比为100：(1-20)：(0.1-10)；
步骤B2的反应条件包括：光照强度0.04-0.4W/cm2，光照波长750-1000nm，时间为2.5-30min；步骤A1中所述混合液中纳米酶的浓度为5-100mg/mL，捕获菌的浓度为10-200μg/mL；
步骤B2所述混合过程还包括加入缓冲溶液的操作，所述缓冲溶液包括柠檬酸钠溶液、柠檬酸钾溶液、醋酸钠溶液和醋酸钾溶液中的至少一种；步骤B2中3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为0.5-5mmol/L，缓冲溶液的浓度为0.4-4mol/L，H2O2溶液的浓度为25-250mmol/L；所述混合液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液、缓冲溶液和H2O2溶液的体积比为100：(2-10)：(10-20)：(0.1-5)。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述金纳米粒子包括金纳米棒、金纳米球、金纳米花和金纳米片中的至少一种。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，含有所述金纳米粒子的溶液的制备方法包括：利用种子生长法制备所述金纳米粒子。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫磁性纳米粒子包括免疫磁珠、三氧化二铁和氧化铁中的至少一种，所述免疫磁性纳米粒子的粒径为150-500nm。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述微生物包括食源性致病菌和肠道菌中的至少一种，所述食源性致病菌包括大肠杆菌、副溶血弧菌、沙氏门菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌中的至少一种。
CN202110310313.7A 2021-03-23 2021-03-23 一种同时杀灭和检测微生物的方法 Pending CN113125716A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110310313.7A CN113125716A (zh) 2021-03-23 2021-03-23 一种同时杀灭和检测微生物的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110310313.7A CN113125716A (zh) 2021-03-23 2021-03-23 一种同时杀灭和检测微生物的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113125716A true CN113125716A (zh) 2021-07-16

Family

ID=76774046

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110310313.7A Pending CN113125716A (zh) 2021-03-23 2021-03-23 一种同时杀灭和检测微生物的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113125716A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114280046A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 江南大学 检测微生物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103439496A (zh) * 2013-08-13 2013-12-11 南昌大学 大肠杆菌o157：h7富集和快速检测方法
US20150316545A1 (en) * 2014-05-02 2015-11-05 Academia Sinica Ultrasensitive detection of a biological target by aptamer-conjugated gold nanoparticles
CN107860934A (zh) * 2017-10-30 2018-03-30 绿城农科检测技术有限公司 一种微流控芯片及改性方法和在检测食品细菌数量上应用
CN108690865A (zh) * 2018-05-25 2018-10-23 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种铂-纳米花及其制备方法和应用
CN109530719A (zh) * 2018-12-10 2019-03-29 江苏大学 一种双功能的金@多肽纳米复合材料及其制备方法和用途
CN109781696A (zh) * 2018-12-25 2019-05-21 中国农业科学院农产品加工研究所 检测食源性致病菌的方法、用于sers法检测食源性致病菌的试剂及其制备方法
CN111206065A (zh) * 2020-01-20 2020-05-29 中国农业科学院农产品加工研究所 一种uv和sers同时检测食源性致病菌的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103439496A (zh) * 2013-08-13 2013-12-11 南昌大学 大肠杆菌o157：h7富集和快速检测方法
US20150316545A1 (en) * 2014-05-02 2015-11-05 Academia Sinica Ultrasensitive detection of a biological target by aptamer-conjugated gold nanoparticles
CN107860934A (zh) * 2017-10-30 2018-03-30 绿城农科检测技术有限公司 一种微流控芯片及改性方法和在检测食品细菌数量上应用
CN108690865A (zh) * 2018-05-25 2018-10-23 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种铂-纳米花及其制备方法和应用
CN109530719A (zh) * 2018-12-10 2019-03-29 江苏大学 一种双功能的金@多肽纳米复合材料及其制备方法和用途
CN109781696A (zh) * 2018-12-25 2019-05-21 中国农业科学院农产品加工研究所 检测食源性致病菌的方法、用于sers法检测食源性致病菌的试剂及其制备方法
CN111206065A (zh) * 2020-01-20 2020-05-29 中国农业科学院农产品加工研究所 一种uv和sers同时检测食源性致病菌的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114280046A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 江南大学 检测微生物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法
CN114280046B (zh) * 2021-12-28 2024-01-05 江南大学 检测微生物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rowland et al. Nanomaterial-based sensors for the detection of biological threat agents
Shen et al. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Escherichia coli O157: H7 using immunomagnetic and beacon gold nanoparticles
Wang et al. M13 phage-based nanoprobe for SERS detection and inactivation of Staphylococcus aureus
Du et al. Quantum dot: Lightning invisible foodborne pathogens
Vizzini et al. Highly sensitive detection of Campylobacter spp. In chicken meat using a silica nanoparticle enhanced dot blot DNA biosensor
AU2020205292B2 (en) Biosensor for detection of salmonella typhimurium and its application
Yang et al. A novel fluorescent platform of DNA-stabilized silver nanoclusters based on exonuclease III amplification-assisted detection of Salmonella Typhimurium
Liu et al. Development of a fluorescence sensing platform for specific and sensitive detection of pathogenic bacteria in food samples
Li et al. One-step synthesis of mannose-modified polyethyleneimine copolymer particles as fluorescent probes for the detection of Escherichia coli
CN107084962A (zh) 一种检测沙门氏菌的方法
Pan et al. Emerging nanolabels-based immunoassays: Principle and applications in food safety
Wang et al. Sensitive immunoassay of Listeria monocytogenes with highly fluorescent bioconjugated silica nanoparticles probe
CN113866408A (zh) 基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌o157：h7的方法
Huang et al. A phage-based magnetic relaxation switching biosensor using bioorthogonal reaction signal amplification for salmonella detection in foods
Hiremath et al. A redox-coupled carbon dots-MnO2 nanosheets based sensory platform for label-free and sensitive detection of E. coli
Wang et al. G-quadruplex-based assay combined with aptamer and gold nanoparticles for Escherichia coli K88 determination
Gao et al. Nano-biosensor based on manganese dioxide nanosheets and carbon dots for dual-mode determination of Staphylococcus aureus
CN113125716A (zh) 一种同时杀灭和检测微生物的方法
Yan et al. Dual recognition strategy for the rapid and precise detection of Bacillus cereus using post-modified nano-MOF and aptamer
Han et al. Fluorescence sensor array of a multiplexing probe with three/four excitations/emissions for rapid and highly sensitive discrimination of foodborne pathogenic bacteria
Zhuang et al. Advances in detection methods for viable Salmonella spp.: current applications and challenges
Li et al. PMAxx combined with recombinase aided amplification technique for specific and rapid detection of Salmonella in milk
Wang et al. A sensitive fluorescence method for detection of E. Coli using rhodamine 6G dyeing
CN116482357A (zh) 一种用于检测单增李斯特菌的荧光淬灭型生物传感器及其制备方法
Wang et al. Bridge-DNA synthesis triggered by an allosteric aptamer for the colorimetric detection of pathogenic bacteria

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210716