CN114280046A - 检测微生物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测微生物的比色‑光热双模式试纸条及其制备方法，包括以下步骤：(1)制备Au‑CuFeSe2复合物纳米颗粒，表面吸附待测物抗体即一抗(病原菌抗体)，得到信号探针；(2)组装试纸条，在检测区和质控区上分别固定待测物抗体和二抗；(3)将信号探针与待测样品液混合后，将试纸条样品垫端插入该混合液中进行层析；(4)检测，(4.1)比色模式：检测区颜色深度与样品待测物浓度成反比，肉眼定性、灰度分析定量；(4.2)光热模式：以808nm激光照射检测区并用热成像或测温设备采集温度，根据检测区温度与样品待测物浓度成正比进行定量分析。本发明检测模式灵活、线性范围宽、灵敏性高、特异性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物快速检测技术，特别是一种检测小分子化合物如微生物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法，具体是一种基于Au-CuFeSe2复合物的、用于检测微生物的比色-光热双模式侧流免疫层析试纸条，属于分析检测技术领域。
背景技术
侧流免疫层析试纸(LFIA)具有分析性能快、选择性良好、成本低、样品量要求小、易于大规模生产以及可稳定的长期储存的特点，被广泛应用于便携式分析检测传感器的设计中。
传统的LFIA中，胶体金纳米粒子通常被用作信号探针。肉眼可以直接观察进行定性或半定量检测。然而，以胶体金为主的比色型LFIA存在灵敏度低、线性范围窄和缺乏定量分析等缺陷。为提高分析检测的灵敏度，研究人员通过使用各种荧光纳米粒子作为探针，开发了荧光型LFIA，然而，这些荧光物质受到自发荧光的干扰，导致信噪比较低。此外，通常用昂贵且复杂的仪器进行信号采集，这也降低了其现场检测的适用性。
近年来，金纳米粒子的表面等离子体共振效应(LSPR)被发现，以光热信号探针的形式再次运用到了LFIA中，与比色模式相比，灵敏度提高了几十至上百倍，光热型LFIA开始受到研究人员们的关注与探索，此类检测方式的信号由光热效应引起温度变化，背景信号较低，传感灵敏，可以在不同颜色的各种基底上进行，有强大的应用潜力。目前仍然需要具有更高光热转换效率的新纳米材料作为信号探针形成更明显的热反差，以进一步提高光热型LFIA的性能。
具有LSPR效应的纳米材料受到研究人员的青睐，不同种类的材料被陆续合成，包括贵金属纳米颗粒、碳基材料、金属和非金属化合物以及多种纳米复合材料。随着一些三元半导体纳米材料独特的物理和化学性质被发现，比如在近红外区的较高吸收系数和较高光热转换效率以及低毒性，使它们在光声成像、光热治疗等生物医学等领域具有广泛的应用前景。具有高光热转换效率CuFeSe2三元纳米材料，已经成功地用于癌症的诊断以及治疗。目前，将CuFeSe2材料应用于LFIA并且以Au-CuFeSe2复合物为探针的光热定量免疫层析试纸条还未见报道。
传统的微生物检测方法，如培养法和菌落计数法，因其良好的选择性和可靠性而被认为是金标准但耗费时间相对过长，操作过程较为繁琐。快速检测方法有聚合酶链式反应、核酸探针技术等，这些方法大多数需要专业人士操作，且需要进行预处理。将LFIA应用于微生物的快速检测中有效提高了检测效率，但检测灵敏度较低。而纳米光热探针的引入，使LFIA的灵敏度得到大幅提高，可实现微生物痕量检测，同时利用光热效应可以杀死捕获的微生物，无需后续无害化处理，有别于传统带材方法。
发明内容
技术问题：
为克服传统胶体金试纸的技术缺陷，本发明研制一种高光热转换效率的Au-CuFeSe2复合物纳米材料，并创设一种基于Au-CuFeSe2复合物的比色-光热双模式侧流免疫层析试纸条用于微生物的检测。
技术方案：本发明的技术方案如下：
本发明的第一个目的是，提供一种微生物的比色-光热双模式试纸条，所述试纸条包含试纸条主体和信号探针两部分，
试纸条主体结构为PVC底板上沿水平方向依次交叠粘贴有样品垫、硝酸纤维素膜即NC膜、吸收垫，所述NC膜两端位于交叠的下层，NC膜用于实现样品中分析物与其他物质的分离和检测，样品垫用于上样，吸收垫用于吸收过量液体，PVC底板为试纸提供物理支撑；
所述NC膜包括检测区即T区、质控区即C区，
所述检测区上固定有第一一抗，
所述质控区上固定有二抗即针对所述一抗来源的抗一抗，所述二抗包括但不限于羊抗鼠二抗、兔抗鼠二抗、羊抗兔二抗、驴抗兔二抗；
信号探针为吸附有第二一抗的Au-CuFeSe2复合材料，
所述第一一抗、第二一抗均为一抗，所述两种一抗为针对同一种病原菌抗体不同抗原表位的单抗或多抗，所述病原菌抗体包括但不限于鼠伤寒沙门氏沙门氏菌抗体、大肠杆菌抗体等。
信号探针可以独立于试纸条形式使用，也可以干燥在结合垫上然后叠加在样品垫和NC膜之间使用。
本发明的另一个目的是，提供一种微生物的比色-光热双模式试纸条的制备方法，制备步骤如下：
(1)制备信号探针Au-CuFeSe2复合材料；
(2)Au-CuFeSe2复合材料与所述第二一抗即mAb的混合液即为信号探针Au-CuFeSe2-mAb；
(3)用PBS溶液将第一一抗稀释，配制成检测区溶液，用PBS溶液将二抗稀释，配制成质控区溶液；
(4)构建试纸条主体：T区滴加或喷涂检测区溶液以固定第一一抗，C区滴加或喷涂质控区溶液以固定二抗，干燥后真空保存备用。
进一步的，所述的步骤(1)具体方法为：将湿化学方法在水溶液中制备的CuFeSe2纳米晶分散液进行稀释，取稀释后的CuFeSe2溶液于离心管中，加入柠檬酸三钠溶液，混匀后加入HAuCl4溶液，加入超纯水，然后立即置于涡旋振荡器上，室温下振荡反应，溶液颜色由浅棕色变为紫色，得到Au-CuFeSe2复合材料，4℃环境中储存备用。
进一步的，所述的步骤(2)具体方法为：取Au-CuFeSe2于离心管中，加入K2CO3溶液调节体系的pH值为6-8，振荡混匀再加入鼠伤寒沙门氏菌抗体，混匀后于37℃下振荡反应。反应结束后，加入BSA封闭，经离心后去除上清液，再重溶于运行缓冲液中，得到Au-CuFeSe2-mAb混合液，4℃环境中保存备用。
进一步的，所述再重溶于运行缓冲液中是指：再重溶于100μL运行缓冲液(20mmol/LNa3PO4、5％BSA、0.25％Tween-20、10％蔗糖)中。运行缓冲液是在缓冲液的基础上又添加了些成分调节pH的磷酸盐，比如蔗糖和BSA可以起到封闭试纸的作用，避免信号分子非特异性吸附，降低假阳性出现的可能性；吐温-20作为非离子型表面活性剂，常添加于层析试纸条的运行缓冲液中，用于避免非特异性吸附，增加信号探针的释放速度。运行缓冲液是影响试纸显色的重要因素。通常运行缓冲液里吐温-20、BSA是必须的，蔗糖可有可无可多可少。
进一步的，所述的步骤(3)具体方法为：用10mM PBS溶液分别将第一一抗以及二抗进行稀释配制成检测区及质控区溶液。
进一步的，所述步骤(4)中，T区滴加或喷涂含有0.5-10mg/mL待测物抗体的5-20mMPBS溶液，C区滴加或喷涂含有0.05-10mg/mL二抗的5-20mM PBS溶液。
本发明的另一种目的在于，提供一种用于检测微生物的检测装置，
当采用比色模式检测时，所述检测装置包括上述的微生物比色-光热双模式试纸条，即试纸条主体和微生物单克隆抗体修饰的复合材料Au-CuFeSe2-mAb即信号探针；
当采用光热模式检测时，所述检测装置包括上述的微生物比色-光热双模式试纸条(即试纸条主体、信号探针)、激光光源(通常选用808nm激光光源，也可以是其他波长的激光光源)、热成像或测温设备及智能显示端，所述检测装置以激光为光源，以Au-CuFeSe2-mAb为光热转换材料。
进一步的，所述热成像或测温设备包括手机红外热成像配件、红外热成像分析仪、手持式红外热成像分析仪或者测温枪，所述智能显示端包括电脑或智能手机，所述热成像或测温设备采集光热成像照片，并通过与之相连的智能显示端得以输出显示。常见的热成像或测温设备有各种型号的手机红外热成像分析配件、红外热成像分析仪，手持式红外热成像分析仪或者红外测温枪也可选常见的产品型号，比如高德智感FLIR E50手持式热成像仪。使用时，先在智能手机上下载相应的应用软件，再把热成像或测温设备与智能手机连接(无线或有线根据实际情况而定)，将热成像或测温设备的探头对准试纸条主体，对应的温度即可在智能手机的应用软件上显示。不同的红外热成像分析仪的具体方法依据其自身的使用方法而定，在本发明中不做具体限定。
进一步的，制备微生物单克隆抗体修饰的复合材料的方法为：制备复合材料Au-CuFeSe2并修饰待测物抗体，得到微生物单克隆抗体修饰的Au-CuFeSe2-mAb，所述用于修饰复合材料的单克隆抗体来源包括但不限于小鼠、大鼠、兔。所述小分子化合物单克隆抗体修饰的复合材料以溶液或冻干粉末的状态保存于包括离心管在内的密闭容器中。对应的，所述质控区固定的二抗是针对一抗来源的二抗。
本发明的另一个目的是，提供一种使用上述的检测装置的方法，包括以下步骤：待测样品溶于运行缓冲液中，放入信号探针及试纸条主体，采用比色法和/或光热法进行检测，
当采用比色法检测时，15-30min后根据T区显色情况可通过裸眼初步进行定性判断，或者后续还可以利用Image J软件分析T区灰度值进而读取试纸条的比色结果，进行目标物含量的定量判断；
当采用光热法检测时，试纸条干燥后置于激光光源下激发，使用光热图像采集设备及智能显示端获取光热成像，读取温度结果。
进一步的，所述运行缓冲液为10mM PBS包含5-15％蔗糖，1-10％牛血清蛋白溶液(BSA)，0.15-1％吐温-20，pH 6.5-8.0溶液，所述缓冲液还可以是硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等。
进一步的，所述信号探针独立于所述试纸条使用，或干燥在结合垫上后叠加在所述试纸条主体的样品垫和NC膜之间使用。
当信号探针独立于所述试纸条使用时，具体方法为：将待测样品与所述信号探针置于运行缓冲液中混合3-10min，放入所述试纸条主体，采用比色法或光热法进行检测；
当信号探针干燥在结合垫上后叠加在所述试纸条主体的样品垫和NC膜之间使用，具体方法为：将信号探针滴加在结合垫上后并且干燥，将结合垫组装叠加在所述试纸条主体的样品垫和NC膜之间，将待测样品与运行缓冲液(与上述同样的运行缓冲液)混合后，放入含有结合垫的试纸条主体，采用比色法或光热法进行检测。
进一步的，C区作为验证试纸结果有效性的参照，始终显紫色；T区的激发温度强度与样品中微生物含量呈正相关，显色强度与样品中微生物含量呈正相关，具体为：
当样品中含有微生物时，T区显紫色，光热效应强，激发温度升高；
当样品不含微生物时，T区不显色，光热效应弱，激发温度与室温相近。
本发明的检测微生物的比色-光热双模式试纸条检测原理，以鼠伤寒沙门氏菌为例解释如下：样品溶液和Au-CuFeSe2-mAb预混合后在毛细作用下向吸水纸方向移动，而在激光的激发下Au-CuFeSe2产生LSPR效应，温度升高。当样品中存在沙门氏菌时，硝基纤维素膜上的抗体可以捕获样品中的沙门氏菌，Au-CuFeSe2-mAb与被捕获的沙门氏菌结合被固定，形成双抗夹心免疫复合物，T区因标记物的积累而显紫色，而在激光的激发下Au-CuFeSe2产生LSPR效应，温度升高。经过T区未结合的游离Au-CuFeSe2-mAb继续向前泳动，到达C区时，与C区中的二抗结合，形成复合物，C区显色，C区作为验证试纸结果有效性的参照，始终显色。
有益效果：
本发明的用于检测微生物的比色-光热双模式试纸条基于等离子体共振效应，以高光热转换效率、微小尺寸的Au-CuFeSe2复合材料为T区固定信号探针，近红外激光光源激发结合智能显示端实现光热信号的采集，有效去除样品液基底颜色以及试纸荧光背景干扰进而提高信噪比。该方法具有更低的检测限、更宽的检测范围和较好的特异性，较其他光热检测试纸灵敏度更高，适用于微生物的快速检测。
附图说明
图1为不含结合垫的试纸条主体的示意图。
图2为信号探针干燥在结合垫上后使用时的试纸条组装示意图。
图3为复合材料各项表征示意图，其中，(A)CuFeSe2的电镜表征；(B)紫外吸收光谱；(C)电势表征。
图4为比色模式下试纸条T区和C区显色情况，其中，(A)阳性样品；(B)阴性样品。
图5为光热模式下试纸条T区的温度分布，其中，(A)阳性样品；(B)阴性样品。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明公开了一种用于检测微生物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法，包括以下步骤：
(1)制备Au-CuFeSe2复合物纳米颗粒，表面吸附待测物抗体即第二一抗(病原菌抗体)，得到信号探针；
(2)组装试纸条主体，在检测区和质控区上分别固定待测物抗体(第一一抗)和二抗；
(3)将信号探针与待测样品液混合后，将试纸条主体的样品垫端插入该混合液中进行层析；
(4)检测
(4.1)比色模式：检测区颜色深度与样品待测物浓度成反比，肉眼定性、灰度分析定量；
(4.2)光热模式：以808nm激光照射检测区并用光热图像采集设备(红外热成像分析仪或手持式红外热成像分析仪或者红外热成像枪)采集温度，根据检测区温度与样品待测物浓度的线性关系进行定量分析。
本发明检测模式灵活、线性范围宽、灵敏性高、特异性好。
以下实施例以鼠伤寒沙门氏菌作为微生物的示例，对整个试纸条的制备、检测装置的使用进行充分详细的说明。
实施例1：对鼠伤寒沙门氏菌的Au-CuFeSe2复合物光热定量双模式试纸条检测
1.试纸材料的制备
1.1制备CuFeSe2纳米晶
采用湿化学方法在水溶液中制备CuFeSe2纳米晶。将39.48mg Se粉分散在100mL超纯水中，然后加入50mg NaBH4，在氮气流保护的环境条件下进行还原。分别制备CuCl2·2H2O(42.62mg)、FeSO4·7H2O(69.75mg)和PTMP-PMAA(400mg)的5ml混合物。待硒粉完全还原后，立即将上述混合物加入硒前体溶液中，形成黑色溶液。将所得溶液以3500rpm的速度通过分子量截止(MWCO)为100kDa的膜进行超滤。上清液用超纯水(MWCO为8-14kDa)透析48小时以去除杂质。纯化后的CuFeSe2NC溶液采用类似的超滤方法浓缩，4℃保存备用。
1.2制备Au-CuFeSe2复合材料
将CuFeSe2分散液稀释至体积分数为10％，取320μL稀释后的CuFeSe2溶液于离心管中，加入20μL浓度为194mmol/L的柠檬酸三钠溶液，混匀后加入50μLHAuCl4溶液(m/v＝1％)，加入超纯水3.59mL然后立即置于涡旋振荡器上，室温下振荡反应10min，溶液颜色由浅棕色变为紫色，即可得到Au与CuFeSe2的复合纳米材料Au-CuFeSe2，该复合材料各项表征如图3所示，其中，图3(A)为CuFeSe2的电镜表征，表明了制备的Au-CuFeSe2复合材料粒径在20nm以下，粒径均匀分布；图3(B)为该复合材料及CuFeSe2的紫外吸收光谱，表明了复合纳米材料Au-CuFeSe2制备成功；图3(C)为该复合材料的电势表征，也表明了复合纳米材料Au-CuFeSe2制备成功。
1.3 Au-CuFeSe2与抗体吸附
取50μLAu-CuFeSe2于离心管中，加入0.1mol/L K2CO3溶液调节体系的pH值至6-8，振荡混匀再加入50μμL 20mg/mL鼠伤寒沙门氏菌抗体，混匀后于37℃偶联30min。反应结束后，加入1％BSA封闭30min，经7000rpm离心30min，去除上清液，再重溶于100μL缓冲液(20mmol/L Na3PO4、5％BSA、0.25％Tween-20、10％蔗糖)中，得到Au-CuFeSe2-mAb混合液，4℃环境中保存备用，图3(C)为电势表征，表明了Au-CuFeSe2与抗体吸附成功。
1.4检测区(T区)溶液的配制
用10mM PBS溶液将鼠伤寒沙门氏菌抗体稀释成0.6mg/mL，得T区溶液。此处的沙门氏菌抗体是与1.3中结合位点不同的沙门氏菌抗体。
1.5质控区(C区)溶液的配制
用10mM PBS溶液将羊抗鼠二抗稀释成0.4mg/mL，得C区溶液。
2.试纸条主体的制备
按照图1的模组合方式，将NC膜粘贴在PVC底板中间，样品垫与吸水垫分别搭接于NC膜左右两端，使其覆压NC膜2mm左右，将搭建好的大卡切割成3mm宽度的纸条，即得到空白试纸条。分别在图1中T区和C区滴加0.5μL T区溶液和0.5μL C区溶液。将点样之后的试纸条放在烘箱中，在37℃条件下干燥60min，于真空袋中保存备用。
3.双模式检测
3.1比色模式检测
将沙门氏菌接种于Luria-Bertani培养基中，37℃培养12小时。通过6500rps离心收集培养的细菌，在室温下放置30分钟。将细胞洗涤3次，然后用10mM PBS稀释到浓度范围为101-108CFU/mL，作为待测液备用。将80μL待测液与10μL Au-CuFeSe2-mAb和10μL运行缓冲液(10mM PBS溶液，含5％蔗糖，1％BSA，1％吐温-20，pH 7.4)在离心管中混合10min，然后将试纸条插入离心管，25min后读取结果。
后续还可以利用Image J软件分析T区灰度值进而读取试纸条的比色结果，对比色结果进行分析，即可制得工作曲线，进行目标物含量的定量判断。
3.2光热模检测式
将沙门氏菌接种于Luria-Bertani培养基中，37℃培养12小时。通过6500rps离心收集培养的细菌，在室温下放置30分钟。将细胞洗涤3次，然后用10mM PBS稀释到浓度范围为101-108CFU/mL，，作为待测液备用。将80μL待测液与10μL Au-CuFeSe2-mAb和10μL运行缓冲液(10mM PBS溶液，含5％蔗糖，1％BSA，1％吐温-20，pH 7.4)在离心管中混合10min，然后将试纸条插入离心管，待试纸干燥后用808nm激光器(功率为1.36W/cm2)照射3min，利用智能手机以及高德智感FLIR E50手持式热成像仪，通过手持式热成像仪监测试纸条T区温度，并且借助智能手机红外热成像软件进行温度记录、监测温度变化。
比色和光热的结果总结如下：
当样品中含有微生物时，T区显紫色(如图4(A))，激发温度升高(如图5(A))；
当样品不含微生物时，T区不显色(如图4(B))，激发温度与室温相近(如图5(B))。
具体的结果显示，比色模式下，当样品中没有鼠伤寒沙门氏菌时，Au-CuFeSe2-检测链无法被T区捕获链捕获，肉眼可见阴性试纸T区无明显颜色变化，如图4(B)所示；
当样品中含有鼠伤寒沙门氏菌时，阳性试纸T区呈现明显紫色，如图4(A)所示。随鼠伤寒沙门氏菌浓度降低T区颜色变浅，当鼠伤寒沙门氏菌浓度降低至1.13×107CFU/mL时T区颜色消失，以此浓度为比色模式检测限。
光热模式下，当样品中没有鼠伤寒沙门氏菌时，Au-CuFeSe2-检测链无法被T区捕获链捕获，因此激光的激发下T区不产生LSPR效应，温度低，如图5(B)所示；
当样品中含有鼠伤寒沙门氏菌时，T区温度随鼠伤寒沙门氏菌浓度升高而升高，如图5(A)所示，检出限为1.2×106CFU/mL。
因此，所构建的双模式纸的检测限可以达到1.2×106CFU/mL。
此外，还可根据检测区温度与样品待测物浓度的线性关系，绘制标准曲线，由该标准曲线可以进行进一步的定量分析。关于标准曲线的绘制方法及其定量分析应用方法均为常规的标曲绘制及使用方法，本实施例在此不做赘述。
实施例2：对鼠伤寒沙门氏菌的Au-CuFeSe2复合物光热定量双模式试纸条进行特异性验证
包括以下步骤：
1.试纸材料的制备
同实施例1
2.试纸条的制备
同实施例1
3.工作曲线绘制
同实施例1
4.样品预处理
大肠杆菌O157∶H7、蜡样芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均接种于Luria-Bertani培养基中，37℃培养12小时。通过6500rps离心收集培养的细菌，在室温下放置30分钟。将细胞洗涤3次，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，作为待测液备用。
5.样品检测
将80μL待测液与10μLAu-CuFeSe2-mAb和10μL运行缓冲液(10mM PBS溶液，含5％蔗糖，1％BSA，1％吐温-20，pH 7.4)在离心管中混合10min，然后进行检测。
5.1比色模式：
将试纸条主体插入离心管，25min后读取比色结果均如图4(B)的阴性样品显色结果。
5.2光热模式：
待试纸干燥后，用808nm激光器(功率为1.36W/cm2)照射3min，利用手机及红外热成像配件监测温度变化，光热模式结果显示均如图5(B)的阴性样品温度分布结果。大肠杆菌O157∶H7、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球试纸的T区均不显色、温度低，特异性识别结果好。由此说明，本申请实施例的双模式试纸条只对鼠伤寒沙门氏菌具有响应，对于其他微生物没有响应，故可以认为，本申请实施例的试纸条对微生物具有检测特异性。
实施例3：鼠伤寒沙门氏菌的光热比色双模式试纸条检测-信号探针干燥在结合垫上
同实施例1，区别在于步骤部分换为信号探针干燥在结合垫上然后再叠加在样品垫和NC膜之间使用(试纸结构如图2)。
具体的步骤3如下：
3.双模式检测
3.1比色模式检测
将鼠伤寒沙门氏菌接种于Luria-Bertani培养基中，37℃培养12小时。通过6500rps离心收集培养的细菌，在室温下放置30分钟。将细胞洗涤3次，然后用10mM PBS稀释到浓度范围为101-108CFU/mL，作为待测液备用。将80μL待测液和20μL运行缓冲液(10mM PBS溶液，含5％蔗糖，1％BSA，1％吐温-20，pH 7.4)在离心管中混合10min，然后将试纸条插入离心管，25min后读取结果。
3.2光热模式检测
将鼠伤寒沙门氏菌接种于Luria-Bertani培养基中，37℃培养12小时。通过6500rps离心收集培养的细菌，在室温下放置30分钟。将细胞洗涤3次，然后用10mM PBS稀释到浓度范围为101-108CFU/mL，，作为待测液备用。将80μL待测液和20μL运行缓冲液(10mMPBS溶液，含5％蔗糖，1％BSA，1％吐温-20，pH 7.4)在离心管中混合10min，然后将试纸条插入离心管，待试纸干燥后用808nm激光器(功率为1.36W/cm2)照射3min，利用智能手机以及高德智感FLIR E50手持式热成像仪，通过手持式热成像仪监测试纸条T区温度，并且借助智能手机红外热成像软件进行温度记录、监测温度变化。
结果显示同实施例1。
当样品中含有微生物时，T区显紫色(如图4(A))，激发温度升高(如图5(A))；
当样品不含微生物时，T区不显色(如图4(B))，激发温度与室温相近(如图5(B))。
同理，本实施例也可根据检测区温度与样品待测物浓度的线性关系，绘制标准曲线，由该标准曲线可以进行进一步的定量分析。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测微生物的Au-CuFeSe2复合物比色-光热双模式试纸条，其特征在于，所述试纸条包含试纸条主体和信号探针，
所述试纸条主体包括底板，在所述底板上沿水平方向依次交叠粘贴有样品垫、NC膜、吸收垫，所述NC膜包括检测区即T区、质控区即C区，所述检测区上固定有第一一抗，所述质控区上固定有二抗；
所述信号探针为吸附有第二一抗的Au-CuFeSe2复合材料；
所述第一一抗、第二一抗均为一抗，所述两种一抗为针对同一种病原菌抗体不同抗原表位的单抗或多抗，所述病原菌抗体包括但不限于鼠伤寒沙门氏菌抗体、沙门氏菌抗体、大肠杆菌抗体；
所述二抗为针对所述一抗来源的二抗，包括但不限于羊抗鼠二抗、兔抗鼠二抗、羊抗兔二抗、驴抗兔二抗。
2.制备如权利要求1所述的试纸条的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)制备Au-CuFeSe2复合材料；
(2)Au-CuFeSe2复合材料与所述第二一抗即mAb的混合液即为信号探针Au-CuFeSe2-mAb；
(3)用PBS溶液将第一一抗稀释，配制成检测区溶液，用PBS溶液将二抗稀释，配制成质控区溶液；
(4)构建试纸条主体：T区滴加或喷涂检测区溶液以固定第一一抗，C区滴加或喷涂质控区溶液以固定二抗，干燥后真空保存备用。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)的具体方法为：采用湿化学方法将在水溶液中制备的CuFeSe2纳米晶分散液进行稀释，取稀释后的CuFeSe2溶液，加入柠檬酸三钠溶液，混匀后加入HAuCl4溶液，加入超纯水，立即置于涡旋振荡器上，室温下振荡反应，溶液颜色由浅棕色变为紫色，得Au-CuFeSe2复合材料，4℃储存备用。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)的具体方法为：取Au-CuFeSe2，加入K2CO3溶液调节体系的pH为6-8，振荡混匀再加入所述第二一抗即mAb，混匀后于37℃下振荡反应，反应结束后，加入载体蛋白封闭，经离心后去除上清液，再重溶于运行缓冲液中，得到Au-CuFeSe2-mAb混合液，4℃保存备用。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，T区滴加或喷涂或喷涂含有0.5-10mg/mL第一一抗的5-20mM PBS溶液，C区滴加或喷涂含有0.05-10mg/mL二抗的5-20mM PBS溶液。
6.一种用于检测微生物的光热检测装置，其特征在于，
当采用比色模式检测时，所述检测装置包括如权利要求1所述试纸条；
当采用光热模式检测时，所述检测装置包括如权利要求1所述试纸条、激光光源、热成像或测温设备及智能显示端，所述检测装置以激光为光源，以所述试纸条中的信号探针为光热转换材料。
7.根据权利要求6所述的检测装置，其特征在于，所述热成像或测温设备包括但不限于手机红外热成像分析配件、红外热成像分析仪或者测温枪，所述智能显示端包括但不限于电脑、智能手机，所述热成像或测温设备采集光热成像照片，并通过与之相连的智能显示端得以输出显示。
8.使用如权利要求6或7所述的试纸条的检测装置的方法，其特征在于，包括以下步骤：待测样品溶于运行缓冲液中，放入信号探针及试纸条主体，采用比色法或光热法进行检测；
当采用比色法检测时，15-30min后直接读取试纸条的比色结果，根据T区显色情况裸眼定性判断，或者利用Image J软件分析T区灰度值进而读取试纸条的定量结果；
当采用光热法检测时，试纸条干燥后置于808nm激光光源下激发，使用热成像或测温设备及智能显示端获取光热成像，读取温度结果；
所述运行缓冲液所述运行缓冲液为包含5-15％蔗糖、1-10％BSA、0.15-1％吐温-20的10mM缓冲液，pH 6.5-8.0，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液中任意一种。
9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述信号探针独立于所述试纸条使用，或干燥在结合垫上后叠加在所述试纸条的样品垫和NC膜之间使用。
10.根据权利要求1所述的试纸条，或权利要求6所述的检测装置，或权利要求8所述的使用方法，其特征在于，C区作为验证试纸结果有效性的参照，始终显紫色；T区的激发温度强度与样品中微生物含量呈正相关，显色强度与样品中微生物含量呈正相关，具体为：；
当样品中含有微生物时，T区显紫色，光热效应强，激发温度升高；
当样品不含微生物时，T区不显色，光热效应弱，激发温度与室温相近。
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| CN109900890A (zh) * | 2019-03-28 | 2019-06-18 | 天津科技大学 | 一种检测小分子物质的黑磷-金纳米粒子复合物光热定量免疫层析试纸条及其制备方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115097130A (zh) * | 2022-05-17 | 2022-09-23 | 中国石油大学(华东) | 一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法 |
| CN115097130B (zh) * | 2022-05-17 | 2024-03-19 | 中国石油大学(华东) | 一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN114280046B (zh) | 2024-01-05 |
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