CN115097130A - 一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速定性‑定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，具体涉及生物医药分析检测技术领域。该检测方法同时提供了一种毛细玻璃管内表面抗体的偶联方法和与毛细玻璃管结合起到信号放大以提高检测灵敏度的免疫纳米材料Fe3O4@MoS2。该检测方法利用毛细玻璃管作为载体，将毛细玻璃管内壁偶联目标待测物抗体，基于纳米材料Fe3O4@MoS2的光热效应和拟酶特性，将目标待测物抗体修饰到免疫纳米材料Fe3O4@MoS2使其可以特异性捕获目标待测物，为提高检测方法的灵敏度奠定基础，而且简化了目前新型冠状病毒的复杂检测过程，缩短了检测时间，且无需专业操作人员，成本较低，有望实现基层化推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药分析检测技术领域，具体涉及到新型冠状病毒SARS-CoV-2的快速定性-定量检测方法。
背景技术
冠状病毒(CoV)是一类可以在野生动物、家畜以及人群当中引起广泛传播的呼吸道传染疾病，轻度会引起类似于流感的肠道以及呼吸道疾病，重度会引起感染者呼吸道衰竭甚至威胁生命。根据报道，目前已有七种冠状病毒物种可引起人类感染，其中HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和HCoV-OC43四种通常在免疫功能正常的个体中只会引起感冒症状。而SARS-CoV(严重急性呼吸系统综合症冠状病毒)和MERS-CoV(中东呼吸综合征冠状病毒)则是起源于人畜共患，并会导致人类严重呼吸道疾病和引起死亡的两种病毒。
SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)，被标记为冠状病毒病19(COVID-19)，并称之为新冠肺炎。冠状病毒感染后严重的会引起的以肺部病变为主的急性呼吸道传染病，包括急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性心肌损伤、难以纠正的代谢性酸中毒以及严重的并发症，甚至导致死亡。
毛细管因其提取痕量样品(低至μL级)的卓越能力以及高灵敏度和简单性而引起了相当大的兴趣。毛细管有望成为实现高灵敏度测定、现场检测和系统小型化的理想基板。例如： 2018年，陈小强等人提出了一种超灵敏且高度可重复的SERS毛细管平台，通过涂覆核壳卫星微球，用于血清中甲氨蝶呤的现场检测，通过简单的“吸气测量”模式快速分析甲氨蝶呤，而无需复杂的采样和分离过程，证明了在资源有限的环境中POC分析的潜在生物适用性。 2019年，于严等人通过使用静电力将Au NRs涂覆到毛细玻璃管内壁上，制造了共振可调谐 SERS活性毛细管，毛细管成功应用于苹果表面原位硫素的原位检测，与传统方法相比，采样过程提供了操作的便利性。上述基于毛细玻璃管开发的检测器件，具有优良的原位检测效果，可快速捕获目标物，背景干扰小。截至目前毛细玻璃管法用于检测新冠病毒还未被开发，因此，有必要开发研究一种利用毛细玻璃管快速定性-定量检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，同时提供了一种毛细玻璃管内表面抗体的偶联方法和与毛细玻璃管结合起到信号放大以提高检测灵敏度的免疫纳米材料Fe3O4@MoS2。该检测方法利用毛细玻璃管作为载体，基于纳米材料Fe3O4@MoS2的光热效应和拟酶特性，将目标待测物抗体修饰到免疫纳米材料 Fe3O4@MoS2使其可以特异性捕获目标待测物，为提高检测方法的灵敏度奠定基础，而且简化了目前新型冠状病毒的复杂检测过程，缩短了检测时间。
采用的具体技术方案为：
一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，包括以下步骤：
S1毛细玻璃管内壁偶联目标待测物抗体，具体操作方法为：
S1.1毛细玻璃管内壁表面预处理
先用清洁剂和去离子水对毛细玻璃管内壁超声清洗，干燥无水后，再用N2吹扫；将吹扫干净的毛细玻璃管置于Piranha溶液下清洗得到羟基化表面，然后用乙醇和水交替超声清洗，干燥无水后，再用N2吹扫；随后将刻蚀后的毛细玻璃管插入到APTES的乙醇溶液中反应，对毛细玻璃管内壁氨基化；然后用乙醇和去离子水清洗毛细玻璃管，干燥无水后，再用N2吹扫；
S1.2毛细玻璃管内壁表面抗体的偶联
将目标待测物抗体加到聚苯乙烯样品管中，将S1.1处理好的毛细玻璃管插到抗体溶液中吸取抗体溶液孵育，用BSA封闭处理，并用缓冲液冲洗毛细玻璃管，洗去未结合的抗体。
S2制备免疫纳米材料Fe3O4@MoS2
将目标待测物抗体加入到纳米材料Fe3O4@MoS2溶液中反应，反应后加入BSA溶液封闭，缓冲液洗涤，得到抗体-Fe3O4@MoS2的复合物，即免疫纳米材料Fe3O4@MoS2；
S3检测目标待测物，具体操作方法为直接检测法或间接检测法：
直接检测法分为定量检测目标待测物或定性检测目标待测物：
定量检测目标待测物：将S1制得的内表面修饰有目标待测物抗体的毛细玻璃管插入到目标待测物溶液中孵育，用PBS缓冲液洗去未结合的待测物；然后将捕获到目标待测物的毛细玻璃管插入到免疫纳米材料Fe3O4@MoS2中孵育，用PBS缓冲液冲洗；待其干燥后用激光器照射毛细玻璃管头部0.5cm处，照射前后的温度变化通过热成像仪记录；利用温度变化值与目标待测物建立标准工作曲线，用于目标物定量检测；
定性检测目标待测物：将S1制得的内表面修饰有目标待测物抗体的毛细玻璃管插入到目标待测物溶液中孵育，用PBS缓冲液洗去未结合的待测物；然后将捕获到目标待测物的毛细玻璃管插入到免疫纳米材料Fe3O4@MoS2中孵育，用PBS缓冲液冲洗；待其干燥后插入TMB 显色液中，观察颜色变化，用于目标物定性检测；
间接检测法分为定量检测目标待测物或定性检测目标待测物：
定量检测目标待测物：将S2制得的免疫纳米材料Fe3O4@MoS2加到目标待测物溶液中摇晃孵育，磁吸分离，缓冲液重悬，将S1制得的内表面修饰有目标待测物抗体的毛细玻璃管插入到重悬溶液中孵育，用PBS缓冲液冲洗；待其干燥后用激光器照射毛细玻璃管头部0.5cm 处，照射前后的温度变化通过热成像仪记录；利用温度变化值与目标待测物建立标准工作曲线，用于目标物定量检测；
定性检测目标待测物：将S2制得的免疫纳米材料Fe3O4@MoS2加到目标待测物溶液中摇晃孵育，磁吸分离，PBS缓冲液重悬，将S1制得的内表面修饰有目标待测物抗体的毛细玻璃管插入到重悬溶液中孵育，用缓冲液冲洗；待其干燥后插入TMB显色液中，观察颜色变化，用于目标物定性检测。
作为进一步的优选，所述S1.1中，所用Piranha溶液是98vol％H2SO4和30vol％H2O2按体积比7:3混合制得；APTES的乙醇溶液体积为APTES：乙醇：水＝1：10：0.3。
作为进一步的优选，所述TMB显色液由3,3',5,5'-四甲基联苯胺、H2O2和醋酸缓冲溶液组成；其中，3,3',5,5'-四甲基联苯胺浓度为0.6mmol/L、H2O2浓度为2.5mmol/L、醋酸缓冲溶液为0.01mol/L，pH值为4.00，显色时间为20min。
作为进一步的优选，所述S3中，毛细玻璃管在目标待测物溶液中孵育条件为室温环境，孵育时间为5min；在免疫纳米材料Fe3O4@MoS2中孵育条件为室温，孵育时间为5min；PBS 缓冲液浓度为0.01mol/L，冲洗3次。
作为进一步的优选，所述S3中，免疫纳米材料Fe3O4@MoS2在目标待测物溶液中孵育条件为室温环境，孵育时间为5min；磁吸分离时间为5min，PBS重悬液为0.01mol/L；毛细玻璃管在目标待测物重悬溶液中孵育条件为室温环境，孵育时间为5min，PBS缓冲液浓度为0.01 mol/L，冲洗3次。
作为进一步的优选，所述待检测目标物为新型冠状病毒SARS-CoV-2，但是并不限于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2，对其他冠状病毒的检测同样可以适用。
作为进一步的优选，检测新型冠状病毒SARS-CoV-2时，所述S1.1中，超声清洗时间10 min，毛细玻璃管干燥温度为80℃，干燥时间1h，N2吹扫10min；毛细玻璃管内表面羟基化过程是在Piranha溶液中反应时间为2h，反应温度为37℃，乙醇和去离子水水超声清洗时间为5min，干燥温度为80℃，干燥时间1h，N2吹扫10min；毛细玻璃管内表面氨基化过程是将羟基化毛细玻璃管置于APTES的乙醇溶液中密闭反应，反应时间2.5h，反应温度为40℃，然后将多余溶液去除，将毛细玻璃管用乙醇超声清洗5min，再用去离子水冲洗3次，干燥温度为80℃，干燥时间1h，再用N2吹扫10min。
作为进一步的优选，检测新型冠状病毒SARS-CoV-2时，所述S1.2中，目标待测物抗体为SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1，SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1溶液的用量为10μL，浓度为3.0μg/mL；孵育条件为37℃，孵育时间为1.5h，封闭液BSA用量为20μL，浓度为2％；PBS缓冲液浓度为0.01mol/L，冲洗3次。
作为进一步的优选，检测新型冠状病毒SARS-CoV-2时，所述S2中反应条件为室温震荡反应8h，纳米材料Fe3O4@MoS2用量为1ml，浓度为1mg/mL，目标待测物抗体为SARS-CoV-2冠状病毒抗体-2，SARS-CoV-2冠状病毒抗体-2，用量为10μL，加入到纳米材料Fe3O4@MoS2溶液中所形成的浓度为10.0μg/mL；BSA封闭液用量为200μL，浓度为2％，封闭时间30min；用PBS缓冲液浓度为0.01mol/L，洗涤3次，得到的免疫纳米材料Fe3O4@MoS2在4℃保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明利用毛细玻璃管作为载体，基于纳米材料Fe3O4@MoS2的光热效应和拟酶特性组建灵敏、快速的定性-定量检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法，该检测方法简化了目前新型冠状病毒的复杂检测过程，缩短检测时间，直接检测法定量检测的总检出时间为11min，间接检测法定量检测的总检出时间为20min，无需专业操作人员，成本较低，有望实现基层化推广；
本发明提供了一种毛细玻璃管内表面抗体的偶联方法，将目标待测物抗体修饰到毛细玻璃管内表面使其可以特异性捕获目标待测物，为提高检测方法的灵敏度奠定基础；
本发明还提供了一种与毛细玻璃管结合起到信号放大提高检测灵敏度免疫纳米材料 Fe3O4@MoS2抗体的偶联方法。将目标待测物抗体修饰到免疫纳米材料Fe3O4@MoS2使其可以特异性捕获目标待测物，为提高检测方法的灵敏度奠定基础。
附图说明
图1是本发明实施例中基于免疫纳米材料Fe3O4@MoS2的毛细玻璃管法检测冠状病毒的流程示意图。
图2是本发明实施例中毛细玻璃管内壁偶联抗体浓度的优化图。
图3是本发明实施例中免疫纳米材料Fe3O4@MoS2偶联抗体浓度的优化图。
图4是本发明实施例中直接检测法中的温度升高值ΔT与SARS-CoV-2刺突蛋白溶液浓度的标准曲线。
图5是本发明实施例中间接检测法中的温度升高值ΔT与SARS-CoV-2刺突蛋白溶液浓度的标准曲线图。
具体实施方式
附图仅用于示例性说明；应当理解，文件中所提到的实施例仅仅用来解释本发明，是为了便于描述本发明和简化描述，因此，不能理解为对本发明的限制。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。本发明以下实验以检测新型冠状病毒SARS-CoV-2为例对本发明进行阐述，SARS-CoV-2 刺突蛋白为购买的标准品，相当于新型冠状病毒SARS-CoV-2，但不局限于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2(SARS-CoV-2刺突蛋白)，对其他的冠状病毒的检测同样也有有益效果。
一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，具体包括以下步骤：
S1毛细玻璃管内表面抗体的偶联办法
S1.1毛细玻璃管内表面处理
先用清洁剂和去离子水对毛细玻璃管(0.1*10cm)内壁超声清洗10min，除去表面污垢， 80℃干燥1h无水后，再用N2吹扫10min；将吹扫干净的毛细玻璃管置于Piranha溶液下，毛细管内液面高度0.5cm，37℃清洗2h得到羟基化内表面，然后用乙醇和水交替超声清洗5min 至表面pH为中性，80℃干燥1h无水后，再用N2吹扫10min；随后将刻蚀后的毛细玻璃管插入到3-氨丙基三乙氧基硅烷((3-aminopropyl)triethoxysilane，APTES)的乙醇溶液中保持毛细玻璃管内部液面高度0.5cm，40℃下，密闭反应2.5h，对毛细玻璃管内壁氨基化；然后用乙醇和去离子水超声清洗毛细玻璃管5min，去除残留的APTES，80℃干燥1h无水后，再用 N2吹扫10min；
S1.2毛细玻璃管内表面抗体的偶联
将SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1溶液10μL加到聚苯乙烯样品管中，将处理好的毛细玻璃管插到抗体溶液中吸取抗体溶液，37℃下孵育1.5h，用2％的BSA封闭液20μL封闭30min，并用0.01mol/L的PBS缓冲液冲洗毛细玻璃管3次，洗去未结合的抗体。
S1.3毛细玻璃管内表面抗体修饰量的优化
将SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1修饰到毛细玻璃管内表面以特异性捕获SARS-CoV-2，毛细玻璃管内表面偶联的抗体量会直接影响对SARS-CoV-2的捕获效率，从而对检测方法的灵敏度产生影响。
本发明将FITC-IgG修饰到毛细玻璃管内表面对抗体用量进行优化。FITC-IgG抗体的浓度范围为2.0～5.0μg/mL，在这个范围内选取不同浓度的荧光FITC-IgG抗体(0.2、0.5、1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0μg/mL)10μL与毛细玻璃管在37℃下孵育1.5h，用0.01mol/L的PBS缓冲液冲洗毛细玻璃管3次，洗去未结合的抗体。通过蔡司Axio Imager 2对毛细管前端荧光强度进行观察，并借助软件Image J分析抗体修饰量的多少，由图2可以看出，随着抗体浓度的增加，其荧光强度也在逐渐增加。当荧光抗体浓度在3.0μg/mL时，平均荧光灰度值与最大值接近，随着浓度的增加，荧光灰度值变化不明显。
因此，优化后的SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1溶液浓度为3.0μg/mL。
S2免疫纳米材料Fe3O4@MoS2的制备方法
纳米材料Fe3O4@MoS2通过偶联的SARS-CoV-2冠状病毒抗体-2捕获SARS-CoV-2从而结合到毛细玻璃管内表面，纳米材料Fe3O4@MoS2偶联SARS-CoV-2冠状病毒抗体-2的量将会影响到毛细玻璃管内表面的纳米材料Fe3O4@MoS2的量，最终会对升温效果和TMB显色效果产生影响，从而影响检测方法的灵敏度，因此需要优化与纳米材料Fe3O4@MoS2孵育的 SARS-CoV-2冠状病毒抗体-2浓度的大小。
将不同浓度的SARS-CoV-2冠状病毒抗体-2溶液10μL加入到1ml纳米材料Fe3O4@MoS2溶液中后抗体浓度分别为1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL，室温震荡反应8h，反应完成后加入2％的BSA封闭溶液200μL封闭处理30min，用0.01mol/L的PBS缓冲液洗涤3次，得到抗体-Fe3O4@MoS2的复合物。将偶联SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1的毛细玻璃管插入到含有SARS-CoV-2刺突蛋白的溶液室温孵育5min后，用0.01mol/L的PBS缓冲液洗去未结合的SARS-CoV-2刺突蛋白；然后将捕获到SARS-CoV-2刺突蛋白的毛细玻璃管插入到不同 SARS-CoV-2冠状病毒抗体-2浓度修饰的免疫纳米材料Fe3O4@MoS2中室温孵育5min，用 0.01mol/L的PBS缓冲液冲洗；待其干燥后用808nm激光器照射毛细玻璃管头部0.5cm处，照射前后的温度变化通过热成像仪记录。由图3可以看出，随着SARS-CoV-2冠状病毒抗体-2 浓度的增加，温度升高值ΔT是逐渐升高的，浓度为10.0μg/mL时，ΔT最大，再增加浓度时，ΔT不再继续上升反而会下降一点。因此，优化后的SARS-CoV-2冠状病毒抗体-2浓度为10.0 μg/mL。
S3 SARS-CoV-2刺突蛋白的捕获与检测方法，具体操作方法为直接检测法或间接检测法：
直接检测法分为定量检测SARS-CoV-2或定性检测SARS-CoV-2：
定量检测SARS-CoV-2：如图1所示，将制得的内表面修饰有SARS-CoV-2冠状病毒抗体 -1的毛细玻璃管插入到SARS-CoV-2样本溶液中室温孵育5min，用0.01mol/L的PBS缓冲液洗去未结合的待测物；然后将捕获到SARS-CoV-2刺突蛋白的毛细玻璃管插入到免疫纳米材料 Fe3O4@MoS2中室温孵育5min，用0.01mol/L的PBS缓冲液冲洗；待其干燥后用808nm激光器照射毛细玻璃管头部0.5cm处，照射前后的温度变化通过热成像仪记录；利用温度升高值ΔT 与SARS-CoV-2刺突蛋白溶液浓度建立标准工作曲线，用于SARS-CoV-2定量检测，ΔT的计算公式为：
ΔT＝ΔT1-ΔT0；
其中，ΔT为温度升高值，ΔT0为空白(未添加SARS-CoV-2)样品激光照射前后温度升高值，ΔT1为添加SARS-CoV-2样品后激光照射前后的温度升高值。
为了消除非特异性吸附到毛细玻璃管内表面的纳米材料Fe3O4@MoS2的影响，应将空白(未添加SARS-CoV-2)样品激光照射前后的温度升高值(ΔT0)从添加SARS-CoV-2样品后激光照射前后的温度升高值(ΔT1)中扣除。如图4中所示，ΔT的变化与SARS-CoV-2刺突蛋白浓度在0.1～0.8ng/ml范围内呈现线性相关关系(横坐标分别选取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8ng/ml为点，得到ΔT与SARS-CoV-2刺突蛋白浓度的线性关系方程， y＝11.02527x+13.31766)，再根据公式LOD＝3σ/k计算得到检测限。其中σ为空白样品的标准偏差，k为斜率，计算得检测限为62.7pg/ml。
定性检测SARS-CoV-2：将制得的内表面修饰有SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1的毛细玻璃管插入到SARS-CoV-2样本溶液中室温孵育5min，用0.01mol/L的PBS缓冲液洗去未结合的 SARS-CoV-2；然后将捕获到SARS-CoV-2刺突蛋白的毛细玻璃管插入到免疫纳米材料Fe3O4@MoS2中室温孵育5min，用0.01mol/L的PBS缓冲液冲洗；待其干燥后插入TMB显色液中，观察颜色是否变蓝色以及蓝色的程度变化，用于SARS-CoV-2刺突蛋白定性检测。结果显示，SARS-CoV-2刺突蛋白肉眼可见的最低检出浓度为0.5ng/ml。
间接检测法分为定量检测SARS-CoV-2或定性检测SARS-CoV-2：
定量检测SARS-CoV-2：如图1所示，将制得的1mg/mL的免疫纳米材料Fe3O4@MoS2 10μL加到SARS-CoV-2样本溶液中室温摇晃孵育5min，磁吸分离5min，0.01mol/L的PBS缓冲液重悬后，将制得的内表面修饰有SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1的毛细玻璃管插入到重悬溶液中室温孵育5min，用PBS缓冲液冲洗；待其干燥后用808nm激光器照射毛细玻璃管头部0.5cm处，照射前后的温度变化通过热成像仪记录；利用温度升高值ΔT与SARS-CoV-2刺突蛋白溶液浓度建立标准工作曲线，用于SARS-CoV-2定量检测。如图5所示，ΔT与SARS-CoV-2刺突蛋白浓度在0.02～0.1ng/ml范围内呈现线性相关关系(横坐标分别选取0.02、0.04、0.06、 0.08、0.10ng/ml为点，得到ΔT与SARS-CoV-2刺突蛋白浓度的线性关系方程， y＝127.81086x-0.44028)，再根据公式LOD＝3σ/k计算得到检测限。其中σ为空白样品的标准偏差，k为斜率，计算得检测限为5.41pg/ml。
定性检测SARS-CoV-2：将制得的1mg/mL的免疫纳米材料Fe3O4@MoS2 10μL加到SARS-CoV-2样本溶液中室温摇晃孵育5min，磁吸分离5min，0.01mol/L的PBS缓冲液重悬后，将制得的内表面修饰有SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1的毛细玻璃管插入到重悬溶液中室温孵育5min，用PBS缓冲液冲洗；待其干燥后插入TMB显色液中，观察颜色是否变蓝色以及蓝色的程度变化，用于SARS-CoV-2定性检测。结果显示，SARS-CoV-2刺突蛋白肉眼可见的最低检出浓度为0.15ng/ml。
采用所述的快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法检测其他冠状病毒，参照检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法，只需更换相应病毒的检测抗体对，ΔT的变化与其他冠状病毒的浓度标准曲线图做适应性调整，在此不做重复描述。
本发明中用到的化学试剂等物品如果没有明确说明，皆采用现有技术中常规的试剂，未述及的方法采用现有技术。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所示的实验例是为了帮助读者理解本发明的原理，应理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其他各方面变形，这些变形仍然在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1毛细玻璃管内壁偶联目标待测物抗体，具体操作方法为：
S1.1毛细玻璃管内壁表面预处理
先用清洁剂和去离子水对毛细玻璃管内壁超声清洗，干燥无水后，再用N2吹扫；将吹扫干净的毛细玻璃管置于Piranha溶液下清洗得到羟基化表面，然后用乙醇和水交替超声清洗，干燥无水后，再用N2吹扫；随后将刻蚀后的毛细玻璃管插入到APTES的乙醇溶液中反应，对毛细玻璃管内壁氨基化；然后用乙醇和去离子水清洗毛细玻璃管，干燥无水后，再用N2吹扫；
S1.2毛细玻璃管内壁表面抗体的偶联
将目标待测物抗体加到聚苯乙烯样品管中，将S1.1处理好的毛细玻璃管插到抗体溶液中吸取抗体溶液孵育，用BSA封闭处理，并用缓冲液冲洗毛细玻璃管，洗去未结合的抗体；
S2制备免疫纳米材料Fe3O4@MoS2
将目标待测物抗体加入到纳米材料Fe3O4@MoS2溶液中反应，反应后加入BSA溶液封闭，缓冲液洗涤，得到抗体-Fe3O4@MoS2的复合物，即免疫纳米材料Fe3O4@MoS2；
S3检测目标待测物，具体操作方法为直接检测法或间接检测法：
直接检测法分为定量检测目标待测物或定性检测目标待测物：
定量检测目标待测物：将S1制得的内表面修饰有目标待测物抗体的毛细玻璃管插入到目标待测物溶液中孵育，用PBS缓冲液洗去未结合的待测物；然后将捕获到目标待测物的毛细玻璃管插入到免疫纳米材料Fe3O4@MoS2中孵育，用PBS缓冲液冲洗；待其干燥后用激光器照射毛细玻璃管头部0.5cm处，照射前后的温度变化通过热成像仪记录；利用温度变化值与目标待测物建立标准工作曲线，用于目标物定量检测；
定性检测目标待测物：将S1制得的内表面修饰有目标待测物抗体的毛细玻璃管插入到目标待测物溶液中孵育，用PBS缓冲液洗去未结合的待测物；然后将捕获到目标待测物的毛细玻璃管插入到免疫纳米材料Fe3O4@MoS2中孵育，用PBS缓冲液冲洗；待其干燥后插入TMB显色液中，观察颜色变化，用于目标物定性检测；
间接检测法分为定量检测目标待测物或定性检测目标待测物：
定量检测目标待测物：将S2制得的免疫纳米材料Fe3O4@MoS2加到目标待测物溶液中摇晃孵育，磁吸分离，缓冲液重悬，将S1制得的内表面修饰有目标待测物抗体的毛细玻璃管插入到重悬溶液中孵育，用PBS缓冲液冲洗；待其干燥后用激光器照射毛细玻璃管头部0.5cm处，照射前后的温度变化通过热成像仪记录；利用温度变化值与目标待测物建立标准工作曲线，用于目标物定量检测；
定性检测目标待测物：将S2制得的免疫纳米材料Fe3O4@MoS2加到目标待测物溶液中摇晃孵育，磁吸分离，PBS缓冲液重悬，将S1制得的内表面修饰有目标待测物抗体的毛细玻璃管插入到重悬溶液中孵育，用缓冲液冲洗；待其干燥后插入TMB显色液中，观察颜色变化，用于目标物定性检测。
2.根据权利要求1所述的一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，其特征在于，所述S1.1中，所用Piranha溶液是98vol％H2SO4和30vol％H2O2按体积比7:3混合制得；APTES的乙醇溶液体积比为APTES：乙醇：水＝1：10：0.3。
3.根据权利要求1所述的一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，其特征在于，所述TMB显色液由3,3',5,5'-四甲基联苯胺、H2O2和醋酸缓冲溶液组成；其中，3,3',5,5'-四甲基联苯胺浓度为0.6mmol/L、H2O2浓度为2.5mmol/L、醋酸缓冲溶液为0.01mol/L，pH值为4.00，显色时间为20min。
4.根据权利要求1所述的一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，其特征在于，所述S3中，毛细玻璃管在目标待测物溶液中孵育条件为室温环境，孵育时间为5min；在免疫纳米材料Fe3O4@MoS2中孵育条件为室温，孵育时间为5min；PBS缓冲液浓度为0.01mol/L，冲洗3次。
5.根据权利要求1所述的一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，其特征在于，所述S3中，免疫纳米材料Fe3O4@MoS2在目标待测物溶液中孵育条件为室温环境，孵育时间为5min；磁吸分离时间为5min，PBS重悬液为0.01mol/L；毛细玻璃管在目标待测物重悬溶液中孵育条件为室温环境，孵育时间为5min，PBS缓冲液浓度为0.01mol/L，冲洗3次。
6.根据权利要求1至5任一项所述的一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，其特征在于，所述待检测目标物为新型冠状病毒SARS-CoV-2。
7.根据权利要求6所述的一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，其特征在于，所述S1.1中，超声清洗时间10min，毛细玻璃管干燥温度为80℃，干燥时间1h，N2吹扫10min；毛细玻璃管内表面羟基化过程是在Piranha溶液中反应时间为2h，反应温度为37℃，乙醇和去离子水水超声清洗时间为5min，干燥温度为80℃，干燥时间1h，N2吹扫10min；毛细玻璃管内表面氨基化过程是将羟基化毛细玻璃管置于APTES的乙醇溶液中密闭反应，反应时间2.5h，反应温度为40℃，然后将多余溶液去除，将毛细玻璃管用乙醇超声清洗5min，再用去离子水冲洗3次，干燥温度为80℃，干燥时间1h，再用N2吹扫10min。
8.根据权利要求6所述的一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，其特征在于，所述S1.2中，目标待测物抗体为SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1，SARS-CoV-2冠状病毒抗体-1溶液的用量为10μL，浓度为3.0μg/mL；孵育条件为37℃，孵育时间为1.5h，封闭液BSA用量为20μL，浓度为2％；PBS缓冲液浓度为0.01mol/L，冲洗3次。
9.根据权利要求6所述的一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法，其特征在于，所述S2中反应条件为室温震荡反应8h，纳米材料Fe3O4@MoS2用量为1ml，浓度为1mg/mL，目标待测物抗体为SARS-CoV-2冠状病毒抗体-2，SARS-CoV-2冠状病毒抗体-2，用量为10μL，加入到纳米材料Fe3O4@MoS2溶液中所形成的浓度为10.0μg/mL；BSA封闭液用量为200μL，浓度为2％，封闭时间30min；用PBS缓冲液浓度为0.01mol/L，洗涤3次，得到的免疫纳米材料Fe3O4@MoS2在4℃保存。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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