CN109444418A - 一种动物孕酮化学发光检测试剂盒 - Google Patents

一种动物孕酮化学发光检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种动物孕酮化学发光检测试剂盒，该试剂盒包括：包被了孕酮单克隆抗体的毛细管、酶结合物、发光底物和清洗液。本发明检测效率高、灵敏性高、特异性强、自动化程度高，操作简单快速且检测范围广、无污染，能有效改善目前市面上产品的不足，而且保质期长。本发明应用于检测动物血清或血浆中孕酮的浓度。

Description

一种动物孕酮化学发光检测试剂盒
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，尤其涉及一种动物孕酮化学发光检测试剂盒。
背景技术
孕酮(P4)是一种生殖激素，参与调控哺乳动物的发情、生殖细胞的增长、性行为的产生、受精、胚胎的附植、胎儿的发育等，对于动物的正常生殖具有重要作用。孕酮常被作为发情、妊娠状态判断的指标之一。宠物市场迅速发展，动物养殖、动物医疗均需对动物的发情状态进行检测，确定动物的排卵时间，提高动物繁殖能力，降低空怀率。
目前常用的孕酮检测方法有放射免疫分析法，ELISA技术，胶体金层析诊断技术。色谱法作为检测血清中孕酮的标准方法，在准确性、选择性、重复性、灵敏度方面具有无可比拟的优势，但同时也存在一些局限性：仪器贵、操作技术要求高，需要复杂的前处理等。因此，色谱法在临床检测中不能满足快速、简便、低成本、高通量等要求。中国专利公开号为CN104655846A的专利申请公开了一种检测孕酮的酶联免疫试剂盒及其检测方法，此发明应用于检测鸡肉组织中孕酮残留量，以酶标板为反应载体，利用辣根过氧化物酶体系检测样本中孕酮含量。中国专利公开号为CN102095866A的专利申请公开了一种孕酮化学发光定量检测试剂盒，此发明应用于人用体外诊断，以微孔板为反应载体，利用辣根过氧化物酶体系检测样本中孕酮含量。
1、上述孕酮检测方法只能应用于药物残留或人体诊断，而不能用于检测动物血清或血浆中的孕酮。
2、放射免疫分析法检测周期长，有效期短，且易造成放射性污染。酶联免疫分析法自动化程度低，且反应时间较长，检测效率较低。
发明内容
为解决上述现有技术的不足，提供一种动物孕酮化学发光检测试剂盒。此检测试剂盒检测效率高、灵敏性高、特异性强、自动化程度高，操作简单快速且检测范围广、无污染，能有效改善目前市面上产品的不足，而且保质期长。本发明应用于检测动物血清或血浆中孕酮的浓度。
为了达到上述技术目的，本发明所采用的技术方案是：
一种动物孕酮化学发光检测试剂盒，其特征在于：包被了孕酮单克隆抗体的毛细管、酶结合物、发光底物和清洗液，
所述毛细管为高精度毛细管，其外径为1.18±0.02mm，内径为0.7±0.005m、长度为30±1mm；材质为高硼硅3.3玻璃。
所述毛细管通过修饰剂修饰，使得毛细管上带有活性基团Ⅰ。
所述活性基团Ⅰ为氨基、羧基、羟基、巯基、醛基、环氧基、氰酸酯基、异氰酸酯基、氰基、异氰基、马来酰胺氨基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、酚羟基或者酚羟基衍生基团中的一种。
所述孕酮单克隆抗体自带活性基团Ⅱ或经过修饰剂修饰获得活性基团Ⅱ。
所述活性基团Ⅱ为氨基、羧基、巯基或羟基。
包被了孕酮单克隆抗体的毛细管是通过孕酮单克隆抗体上的活性基团Ⅱ与毛细管上的活性基团Ⅰ在偶联剂的作用下偶联后获得的。
所述偶联剂优选为碳二亚胺、戊二醛、SMCC或者SMCC的衍生物。
所用到的修饰剂优选为SATA、DTT、TCEP、2-MEA或2-IT。
所述孕酮单克隆抗体为孕酮人工完全抗原免疫动物得到的单克隆抗体。
孕酮人工完全抗原由孕酮半抗原与BSA偶联得到。
所述包被了孕酮单克隆抗体的毛细管是通过如下方法制成的，所述方法包括修饰孕酮单克隆抗体步骤、修饰毛细管步骤、包被步骤和封闭步骤；
所述修饰孕酮单克隆抗体步骤具体为：将修饰剂与孕酮单克隆抗体混合反应，反应完成后去掉修饰剂，使得孕酮单克隆抗体连上活性基团Ⅱ；
所述修饰毛细管步骤具体为：将毛细管浸泡在修饰剂中，使得毛细管上带有活性基团Ⅰ；
所述包被步骤具体为：
活化：活化的方式有三种：第一种：用偶联剂活化修饰后的毛细管，第二种：用偶联剂活化修饰后的孕酮单克隆抗体，第三种，在包被液中加入偶联剂；
配制包被液：当活化采用第一种方式，配制包被液具体为：将修饰后的孕酮单克隆抗体稀释至为5～30µg/mL，制成包被液Ⅰ；当活化采用第二种方式，配制包被液具体为：将活化后的孕酮单克隆抗体稀释至为5～30µg/mL，制成包被液Ⅱ；当活化采用第三种方式，配制包被液具体为：将偶联剂和缓冲液混合制成活化缓冲液，然后用活化缓冲液将修饰后的孕酮单克隆抗体稀释至为5～30µg/mL，制成包被液Ⅲ；
偶联：当活化采用第一种方式，具体的偶联为：将活化后的毛细管浸泡在包被液Ⅰ中，偶联完成后，清洗并干燥毛细管，获得包被了孕酮单克隆抗体的毛细管；当活化采用第二种方式，具体的偶联为：将修饰后的毛细管浸泡在包被液Ⅱ中，偶联完成后，清洗并干燥毛细管，获得包被了孕酮单克隆抗体的毛细管；当活化采用第三种方式，具体的偶联为：将修饰后的毛细管浸泡在包被液Ⅲ中，偶联完成后，清洗并干燥毛细管，获得包被了孕酮单克隆抗体的毛细管；
所述封闭步骤具体为：
用1～5%（在封闭液中的质量体积百分比）的 BSA或1～5%（在封闭液中的质量体积百分比）的脱脂奶粉溶于0.01～0.1M的Tris-HCl（0.01～0.1M的Tris-HCl配制方法为：称取1.57～15.76 g Tris-HCl溶于1 L注射水）中，制成封闭液；将包被后的毛细管浸泡在封闭液中，封闭温度为37 ℃，封闭时间为2～4 h，封闭完成后，清洗并干燥毛细管，所述封闭液的pH为7.2～7.8；
偶联步骤和封闭步骤中清洗毛细管时用清洗剂清洗，清洗剂为0.02 M～0.2 M PBS，pH为7.2～7.8，含0.01～0.1% （体积百分比）Tween 20；
封闭后的包被了孕酮单克隆抗体的毛细管真空包装在温度为2～8℃的条件下保存。
所述酶结合物为孕酮人工完全抗原偶联碱性磷酸酶产物或孕酮衍生物偶联碱性磷酸酶产物。
所述酶结合物通过如下方法制成：该方法包括修饰孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物步骤、活化步骤、偶联步骤、纯化步骤和稀释步骤；
所述修饰孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物步骤具体为：利用修饰剂修饰孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物，使得孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物连上氨基、羧基、巯基或羟基；
所述活化步骤具体为：利用偶联剂活化碱性磷酸酶、孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物；
所述利用偶联剂活化碱性磷酸酶、孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物，是指用偶联剂活化碱性磷酸酶、孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物的氨基、羧基、巯基或羟基。
所述偶联步骤具体为：将修饰后的孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物与活化后的碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物；或者将活化后的孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物与碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物；
所述纯化步骤具体为：将偶联后的酶结合物过凝胶柱，然后进行纯化；
所述稀释步骤具体为：用0.02 M～0.2 M，pH为7.2～7.8 的Tris-HCl将纯化后的酶结合物稀释至浓度为0.5～5µg/mL的酶结合物。
还包括防腐步骤，防腐步骤具体为：在稀释后的酶结合物中加入BSA或酪蛋白，Tween 20和防腐剂制成最终的酶结合物，分装，密封，在温度为2～8℃的条件下保存；在最终的酶结合物中，BSA或酪蛋白的质量体积百分比为0.1～5%，Tween 20的体积百分比为0.01～0.1%，防腐剂的体积百分比为0.01～0.05%。
所述发光底物为：APS-5。该底物与碱性磷酸酶（ALP）混合后，碱性磷酸酶磷酸根水解，底物立即发生分解反应释放出光子，在特定的碱性磷酸酶浓度范围内，释放的光子数量与溶液中碱性磷酸酶的浓度成正比，因此APS-5可以用于碱性磷酸酶的定量检测。此底物灵敏度高，可持续稳定高效地发光。分装，密封，2～8℃避光保存。
所述清洗液通过如下方法配制而成：将Tween 20、曲拉通、 NaCl和防腐剂，溶于0.02 M～0.2 M 的Tris-HCl中，制成清洗液，所述清洗液中Tween 20 的体积百分比为0.01～0.1%，曲拉通的体积百分为0.01～0.1%，：NaCl的质量体积百分比为0.85～0.9%，防腐剂的体积百分比为0.01～0.05%，所述清洗液的pH为7.2～7.8。
使用本发明测定动物血清或血浆中孕酮浓度的具体步骤为： 将2～8℃保存的试剂盒恢复至室温后，取出已包被的玻璃毛细管，接触血清或血浆，通过自身的虹吸作用使玻璃毛细管充满血清或血浆，放入全自动化学发光免疫分析仪检测发光值，再利用内置校准曲线计算出动物血清或血浆中孕酮的浓度。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果：
本试剂盒以玻璃毛细管为反应载体，利用全自动化学发光免疫分析平台，实现全自动化学发光检测，检测过程不需要人工操作。本试剂盒的玻璃毛细管以化学键的形式与孕酮单克隆抗体偶联，并不依靠物理吸附作用包被，其提高了抗体包被的稳定性，且这种化学键的偶联方式并不破坏抗体的生物活性。由于毛细管具有虹吸作用，因此加样操作更简单、快捷，不需要用移液器等辅助工具。本试剂盒的酶结合物稳定，2～8℃可长期保存。本试剂盒的发光底物平台期长且稳定，能有效降低加入发光底物后等待检测产生的时间差异带来的误差。本试剂盒检测过程涉及的孵育、清洗、加酶、清洗、加发光底物等步骤，均由仪器自动完成，因此重复性能够得到保证。
本试剂盒的有效期长达18个月，超过了市面上大部分胶体金检测卡、ELISA试剂盒能达到的有效保存期，稳定性更好。已包被玻璃毛细管和酶结合物性能稳定，有效期内包被抗原、酶结合物的降解率均小于10%。本试剂盒灵敏度高，特异性强。线性范围为0.01～500ng/mL，与进口试剂盒比对，相关性在0.95以上。试剂盒批内批间CV均小于10%。
附图说明
图1为2-IT（Traut’s Reagent）修饰示意图；
图2为SMCC活化偶联示意图；
图3为碳二亚胺偶联示意图；
图4为戊二醛偶联示意图。
具体实施方式
本试剂盒包括包被了孕酮单克隆抗体的毛细管、酶结合物、发光底物和清洗液。本试剂盒各组分的制备方法如下。
毛细管包被孕酮单克隆抗体
本发明以高精度毛细管为载体，利用修饰剂使毛细管，让毛细管上带有氨基、羧基、羟基、巯基、醛基、环氧基、氰酸酯基、异氰酸酯基、氰基、异氰基、马来酰胺氨基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、酚羟基，及其衍生基团中的一种，再利用偶联剂与待包被的蛋白偶联。
孕酮单克隆抗体通过自身活性基团或经过修饰获得的活性基团，包括氨基、羧基、巯基、羟基等，利用偶联剂与毛细管上的活性基团偶联，获得已包被孕酮单克隆抗体的毛细管。应用的偶联剂包括但不限于碳二亚胺，戊二醛，SMCC。修饰剂包括但不限于SATA、DTT、TCEP、2-MEA，2-IT等。孕酮单克隆抗体为孕酮人工完全抗原免疫小鼠或其他动物得到的单克隆抗体。孕酮人工完全抗原由孕酮半抗原与BSA偶联得到。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所用实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
包被了孕酮单克隆抗体的毛细管的制备：
修饰孕酮单克隆抗体，在蛋白氨基处连上巯基：
待包被孕酮单克隆抗体浓度为2mg/mL，2-IT，使用量为孕酮单克隆抗体摩尔量的2倍，二者混合于0.01M PBS (pH为8)，室温反应0.5h。过脱盐柱除去未反应的2-IT，并更换缓冲液为0.01M PBS(pH为6.5)。
通过修饰剂将毛细管连上氨基，利用SMCC或其衍生物活化修饰后毛细管上的氨基：
SMCC首先溶于二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺或其他有机溶剂，再溶于0.01M PBS(pH为7)，加入已修饰的毛细管并浸没，SMCC浓度为0.1mg/mL。室温反应15min。用0.02 M Tris-HCl (pH为7.2)终止，干燥。
SMCC活化后的毛细管与已修饰有巯基的孕酮单克隆抗体偶联。
修饰后连上巯基的孕酮单克隆抗体用0.02M PBS (pH为7.2)配制成浓度为5µg/mL的待包被蛋白溶液，加入SMCC活化毛细管并浸没。室温反应0.5h。用清洗剂清洗、干燥。包被孕酮单克隆抗体的毛细管用1% （BSA占封闭液的质量体积百分比）BSA溶于0.01M Tris-HCl(pH为7.2)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为2 h。封闭后用清洗剂清洗、干燥，真空包装2～8℃保存。所用到的清洗剂为0.02 M PBS(pH为7.2)，含0.01% （体积百分比）Tween 20。
酶结合物的制备：
酶结合物为孕酮人工完全抗原偶联碱性磷酸酶的产物。
修饰孕酮人工完全抗原，在蛋白氨基处连上巯基。孕酮人工完全抗原的浓度为2mg/mL，2-IT使用量为孕酮人工完全抗原摩尔量的2倍，二者混合于0.01M PBS(pH为8)，室温反应0.5h。过脱盐柱除去未反应的2-IT，并更换缓冲液为0.01M PBS(pH为6.5)。
利用SMCC或其衍生物活化碱性磷酸酶上的氨基。碱性磷酸酶的浓度为3mg/mL，SMCC使用量为碱性磷酸酶摩尔量的5倍，二者混合于0.01M PBS(pH为7)，室温反应0.5 h。脱盐柱除去未反应的SMCC。
巯基化的孕酮人工完全抗原与SMCC活化后的碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物。巯基化的孕酮人工完全抗原与SMCC活化后的碱性磷酸酶偶联时，摩尔量为1:1，偶联温度为2℃，偶联时间为12 h。过凝胶柱，纯化偶联产物，并更换缓冲液为0.02 M Tris-HCl(pH为7.2)，收集孕酮人工完全抗原偶联碱性磷酸酶产物，稀释至浓度为0.5µg/mL的酶结合物，加入0.1%（所占酶结合物的质量体积百分比） BSA，0.01% （所占酶结合物的体积百分比）Tween 20,并添加0.01% （所占酶结合物的体积百分比）防腐剂，分装，密封，2～8℃保存。
发光底物的制备：
本试剂盒的发光底物为（4-氯苯巯基）（10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基）磷酸二钠盐（APS-5）。该底物与碱性磷酸酶（ALP）混合后，碱性磷酸酶磷酸根水解，底物立即发生分解反应释放出光子，在特定的碱性磷酸酶浓度范围内，释放的光子数量与溶液中碱性磷酸酶的浓度成正比，所以可以用于碱性磷酸酶的定量检测。此底物灵敏度高，可持续稳定高效地发光。分装，密封，2～8℃避光保存。
清洗液的制备：
清洗液配制：0.01% （所占清洗液的体积百分比）Tween 20，0.01%（所占清洗液的体积百分比）曲拉通，0.85%（所占清洗液的质量体积百分比）NaCl，0.01%（所占清洗液的体积百分比） 防腐剂，溶于0.02 M Tris-HCl(pH为7.2)。分装，密封，2～8℃保存。
上述步骤所得产品分装后即为半成品。抽检合格后组装成试剂盒成品，成品通过抽检合格后方可出厂。
操作步骤：
将2～8℃保存的试剂盒恢复至室温后，取出已包被的毛细管，接触血清或血浆，通过自身的虹吸作用使毛细管充满血清或血浆，放入全自动化学发光免疫分析仪检测发光值，再利用内置校准曲线计算出动物血清或血浆中孕酮的浓度。
实施例2
与实施例1的差别仅在于利用孕酮单克隆抗体上SMCC活化后的氨基，与毛细管修饰的巯基偶联，获得已包被孕酮单克隆抗体的毛细管。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，不同的是：通过碳二亚胺将孕酮单克隆抗体的羧基与氨化玻璃毛细管上的氨基偶联，获得已包被孕酮单克隆抗体的毛细管。辅助试剂为N-羟基琥珀酰亚胺，提高中间反应产物的稳定性。
利用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化孕酮单克隆抗体上的羧基：
待活化孕酮单克隆抗体浓度为1 mg/mL，碳二亚胺浓度为1 mM，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为2 mM，缓冲液为0.01～0.1M MES(pH为5)。室温反应15 min。过脱盐柱除去未反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并更换缓冲液为0.01M PBS(pH为7.0)。
活化后的孕酮单克隆抗体用0.01M PBS(pH为7.0)配制成浓度为5µg/mL的待包被蛋白溶液，加入已修饰有氨基的毛细管并浸没。室温反应15 min。用0.02 M Tris-HCl (pH为7.2)终止，干燥。包被孕酮单克隆抗体的毛细管用1% （质量体积百分比）BSA溶于0.01MTris-HCl (pH为7.2)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为2 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.02 M PBS(pH为7.2)，含0.01%（体积百分比） Tween 20。
实施例4
本实施例与实施例3基本相同，与实施例3的差别仅在于利用孕酮单克隆抗体的氨基与毛细管修饰的羧基偶联，获得已包被孕酮单克隆抗体的毛细管。
实施例5
本实施例与实施例1基本相同，不同的是：碳二亚胺浓度为0.2mM，缓冲液为0.01M MES(pH为5)，配制成活化缓冲液：
孕酮单克隆抗体用活化缓冲液配制成浓度为5µg/mL的待包被蛋白溶液，加入氨化毛细管，室温反应0.5 h。用0.02 M Tris-HCl (pH为7.2)终止，干燥。包被孕酮单克隆抗体的毛细管用1% （质量体积百分比）脱脂奶粉溶于0.01M Tris-HCl (pH为7.2)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为2 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.02 M PBS(pH为7.2)，含0.01% （体积百分比）Tween 20。
实施例6
本实施例与实施例1基本相同，不同的是：通过戊二醛将孕酮单克隆抗体的氨基与毛细管修饰的氨基偶联：
戊二醛用0.01M PBS(pH为7配制成浓度为1% 的活化缓冲液，加入修饰有氨基的毛细管并浸没，室温反应2h。用0.01PBS(pH为7)清洗干燥。将孕酮单克隆抗体用0.01M PBS(pH为7)配制成浓度为5µg/mL的待包被蛋白溶液，加入戊二醛处理后的氨化毛细管并浸没，室温反应2h。用0.02 M Tris-HCl (pH为7.2)终止用清洗剂清洗，干燥。包被孕酮单克隆抗体的毛细管用1% （质量体积百分比）脱脂奶粉溶于0.01M Tris-HCl (pH为7.2)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为2h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.02 M PBS(pH为7.2)，含0.01% （体积百分比）Tween 20。
实施例7
本实施例与实施例1基本相同，与实施例1的差别仅在于酶结合物是利用孕酮人工完全抗原SMCC活化后的氨基，与碱性磷酸酶修饰后得到的巯基偶联，获得的偶联产物。
实施例8
本实施例与实施例1基本相同，不同的是：酶结合物是通过碳二亚胺将孕酮人工完全抗原的羧基与碱性磷酸酶的氨基偶联，获得的偶联产物，辅助试剂为N-羟基琥珀酰亚胺，提高中间反应产物的稳定性：
利用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化孕酮人工完全抗原上的羧基。孕酮人工完全抗原浓度为1mg/mL，碳二亚胺浓度为1 mM，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为2 mM，缓冲液为0.01MMES(pH为5)。室温反应15min。过脱盐柱除去未反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并更换缓冲液为0.01M PBS(pH为7.0)。加入摩尔量1:1的碱性磷酸酶，混匀，室温反应2 h。加入终浓度为10 mM的羟胺终止。过凝胶柱，纯化偶联产物，并更换缓冲液为0.02 M MTris-HCl(pH为7.2)，收集孕酮人工完全抗原偶联碱性磷酸酶产物，稀释至浓度为0.5µg/mL的酶结合物，加入0.1% （质量体积百分比）BSA或酪蛋白，0.01% （体积百分比）Tween 20,并添加0.05%（体积百分比） 防腐剂，分装，密封，2～8℃保存。
实施例9
本实施例与实施例8基本相同，与实施例8的差别仅在于，酶结合物是利用孕酮衍生物的氨基与碱性磷酸酶的羧基偶联，获得的偶联产物。
实施例10
包被了孕酮单克隆抗体的毛细管的制备：
修饰孕酮单克隆抗体，在蛋白氨基处连上巯基：
待包被孕酮单克隆抗体浓度为4mg/mL，2-IT使用量为待包被孕酮单克隆抗体摩尔量的20倍，二者混合于0.1M PBS(pH为9)，室温反应1.5 h。过脱盐柱除去未反应的2-IT，并更换缓冲液为0.1M PBS(pH为7.5)。
通过修饰剂将毛细管连上氨基，利用SMCC或其衍生物活化修饰后毛细管上的氨基：
SMCC首先溶于二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺或其他有机溶剂，再溶于0.1M PBS(pH为9)，加入已修饰的毛细管并浸没，SMCC浓度为2mg/mL。室温反应60 min。用0.2 M Tris-HCl (pH为7.8)终止，干燥。
SMCC活化后的毛细管与已修饰有巯基的孕酮单克隆抗体偶联。修饰后连上巯基的孕酮单克隆抗体用0.2 M Tris-HCl (pH为7.8)配制成浓度为30µg/mL的待包被蛋白溶液，加入SMCC活化毛细管并浸没。室温反应2 h。用清洗剂清洗、干燥。包被抗原的毛细管用5%（质量体积百分比）BSA溶于0.1M Tris-HCl (pH为7.8)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为4h。封闭后用清洗剂清洗、干燥，真空包装2～8℃保存。所用到的清洗剂为0.2 M PBS(pH为7.8)，含0.1% （体积百分比）Tween 20。
酶结合物的制备：
酶结合物为孕酮衍生物偶联碱性磷酸酶的产物。
修饰孕酮衍生物，在蛋白氨基处连上巯基。孕酮衍生物的浓度为4mg/mL，2-IT使用量为孕酮衍生物摩尔量的20倍，二者混合于0.1M PBS(pH为9)，室温反应1.5 h。过脱盐柱除去未反应的2-IT，并更换缓冲液为0.1M PBS(pH为7.5)。
利用SMCC活化碱性磷酸酶上的氨基。碱性磷酸酶的浓度为5mg/mL，SMCC使用量为碱性磷酸酶摩尔量的20倍，二者混合于0.1M PBS(pH为8)，室温反应1 h。脱盐柱除去未反应的SMCC。
巯基化的孕酮衍生物与SMCC活化后的碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物。巯基化的孕酮衍生物与SMCC活化后的碱性磷酸酶偶联时，摩尔量为1:1，偶联温度为8℃，偶联时间为18 h。过凝胶柱，纯化偶联产物，并更换缓冲液为0.2 M Tris-HCl(pH为7.8)，收集孕酮衍生物偶联碱性磷酸酶产物，稀释至浓度为5µg/mL的酶结合物，加入5%（质量体积百分比）BSA， 0.1% （体积百分比）Tween 20,并添加0.05% （体积百分比）防腐剂，分装，密封， 2～8℃保存。
发光底物的制备：
本试剂盒的发光底物为4-氯苯巯基10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基磷酸二钠盐（APS-5）。该底物与碱性磷酸酶（ALP）混合后，碱性磷酸酶磷酸根水解，底物立即发生分解反应释放出光子，在特定的碱性磷酸酶浓度范围内，释放的光子数量与溶液中碱性磷酸酶的浓度成正比，所以可以用于碱性磷酸酶的定量检测。此底物灵敏度高，可持续稳定高效地发光。分装，密封，2～8℃避光保存。
清洗液的制备：
清洗液配制： 0.1% （体积百分比）Tween 20， 0.1%（体积百分比）曲拉通， 0.9%（质量体积百分比）NaCl， 0.05% （体积百分比）防腐剂，溶于0.2 M Tris-HCl(pH为7.8)。分装，密封，2～8℃保存。
实施例11
包被了孕酮单克隆抗体的毛细管的制备：
修饰孕酮单克隆抗体，在蛋白氨基处连上巯基：
待包被孕酮单克隆抗体浓度为3mg/mL，2-IT使用量为待包被孕酮单克隆抗体摩尔量的10倍，二者混合于0.08M PBS(pH为8.5)，室温反应1 h。过脱盐柱除去未反应的2-IT，并更换缓冲液为0.06M PBS(pH为7)。
通过修饰剂将毛细管连上氨基，利用SMCC或其衍生物活化修饰后毛细管上的氨基：
SMCC首先溶于二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺或其他有机溶剂，再溶于0.05M PBS(pH为8)，加入已修饰的毛细管并浸没，SMCC浓度为1mg/mL。室温反应40 min。用0.1 M Tris-HCl (pH为7.5)终止，干燥。
SMCC活化后的毛细管与已修饰有巯基的孕酮单克隆抗体偶联。修饰后连上巯基的孕酮单克隆抗体用0.08 M Tris-HCl (pH为7.6)配制成浓度为25µg/mL的待包被蛋白溶液，加入SMCC活化毛细管并浸没。室温反应1.5 h。用清洗剂清洗、干燥。包被抗原的毛细管用3%（质量体积百分比）脱脂奶粉溶于0.04M Tris-HCl (pH为7.4)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为3 h。封闭后用清洗剂清洗、干燥，真空包装2～8℃保存。所用到的清洗剂为0.1 M PBS(pH为7.6)，含0.07% （体积百分比）Tween 20。
酶结合物的制备：
酶结合物为孕酮人工完全抗原偶联碱性磷酸酶产物。
修饰孕酮人工完全抗原，在蛋白氨基处连上巯基。孕酮人工完全抗原的浓度为2.5mg/mL，2-IT使用量为孕酮人工完全抗原摩尔量的16倍，二者混合于0.06M PBS(pH为8.8)，室温反应1.2 h。过脱盐柱除去未反应的2-IT，并更换缓冲液为0.06M PBS(pH为7)。
利用SMCC衍生物活化碱性磷酸酶上的氨基。碱性磷酸酶的浓度为3.5mg/mL，SMCC使用量为碱性磷酸酶摩尔量的15倍，二者混合于0.08M PBS(pH为7.5)，室温反应0.8 h。脱盐柱除去未反应的SMCC。
巯基化的孕酮人工完全抗原与SMCC活化后的碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物。巯基化的孕酮人工完全抗原与SMCC活化后的碱性磷酸酶偶联时，摩尔量为1:1，偶联温度为7℃，偶联时间为15 h。过凝胶柱，纯化偶联产物，并更换缓冲液为0.08 M Tris-HCl(pH为7.6)，收集孕酮人工完全抗原偶联碱性磷酸酶产物，稀释至浓度为4µg/mL的酶结合物，加入4% （质量体积百分比）酪蛋白， 0.05% （体积百分比）Tween 20,并添加0.03% （体积百分比）防腐剂，分装，密封，2～8℃保存。
发光底物的制备：
本试剂盒的发光底物为（4-氯苯巯基）（10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基）磷酸二钠盐（APS-5）。该底物与碱性磷酸酶（ALP）混合后，碱性磷酸酶磷酸根水解，底物立即发生分解反应释放出光子，在特定的碱性磷酸酶浓度范围内，释放的光子数量与溶液中碱性磷酸酶的浓度成正比，所以可以用于碱性磷酸酶的定量检测。此底物灵敏度高，可持续稳定高效地发光。分装，密封，2～8℃避光保存。
清洗液的制备：
清洗液配制：0.08% （体积百分比）Tween 20，0.06%（体积百分比）曲拉通，0.88%（质量体积百分比）NaCl，0.04% （体积百分比）防腐剂，溶于0.18 M Tris-HCl(pH为7.5)。分装，密封，2～8℃保存。
实施例12
本实施例与实施例3基本相同，不同的是：
待活化孕酮单克隆抗体浓度为10 mg/mL，碳二亚胺浓度为5 mM，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为10 mM，缓冲液为0.1M MES(pH为7)。室温反应60 min。过脱盐柱除去未反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并更换缓冲液为0.1M PBS(pH为7.5)。活化后的孕酮单克隆抗体用0.1M PBS(pH为7.5)配制成浓度为30µg/mL的待包被蛋白溶液，加入已修饰有氨基的毛细管并浸没。室温反应60 min。用0.2 M Tris-HCl (pH为7.8)终止，干燥。包被抗原的毛细管用5%（质量体积百分比） BSA溶于0.1M Tris-HCl (pH为7.8)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为4 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.2 M PBS(pH为7.8)，含0.1%（体积百分比） Tween 20。
实施例13
本实施例与实施例3基本相同，不同的是：待活化孕酮单克隆抗体浓度为8 mg/mL，碳二亚胺浓度为4 mM，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为6 mM，缓冲液为0.05M MES(pH为6)。室温反应30min。过脱盐柱除去未反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并更换缓冲液为0.06M PBS(pH为7.2)。活化后的孕酮单克隆抗体用0.06M PBS(pH为7.2)配制成浓度为15µg/mL的待包被蛋白溶液，加入已修饰有氨基的毛细管并浸没。室温反应45 min。用0.08 M Tris-HCl (pH为7.6)终止，干燥。包被抗原的毛细管用3% （质量体积百分比）脱脂奶粉溶于0.06M Tris-HCl (pH为7.5)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为3 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.1 M PBS(pH为7.6)，含0.06% （体积百分比）Tween 20。
实施例14
本实施例与实施例5基本相同，不同的是：碳二亚胺浓度为2 mM，缓冲液为0.1M MES(pH为7)，配制成活化缓冲液：
孕酮单克隆抗体用活化缓冲液配制成浓度为30µg/mL的待包被蛋白溶液，加入氨化毛细管，室温反应1 h。用0.2 M Tris-HCl (pH为7.8)终止，干燥。包被抗原的毛细管用5% （质量体积百分比）BSA溶于0.01～0.1M Tris-HCl (pH为7.8)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为4 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.2 M PBS(pH为7.8)，含0.1%（体积百分比） Tween 20。
实施例15
本实施例与实施例5基本相同，不同的是：碳二亚胺浓度为1mM，缓冲液为0.8M MES(pH为6)，配制成活化缓冲液：
孕酮单克隆抗体用活化缓冲液配制成浓度为25µg/mL的待包被蛋白溶液，加入氨化毛细管，室温反应0.8h。用0.1 M Tris-HCl (pH为7.6)终止，干燥。包被抗原的毛细管用4%（质量体积百分比）脱脂奶粉溶于0.06M Tris-HCl (pH为7.6)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为3 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.1 M PBS(pH为7.6)，含0.08% （体积百分比）Tween 20。
实施例16
本实施例与实施例6基本相同，不同的是：戊二醛用0.1M PBS(pH为8)配制成浓度为5%（体积百分比）的活化缓冲液，加入已修饰有氨基的毛细管并浸没，室温反应4 h。用0.1MPBS(pH为8)清洗干燥。将孕酮单克隆抗体用0.1M PBS(pH为8)配制成浓度为30µg/mL的待包被蛋白溶液，加入戊二醛处理后的氨化毛细管并浸没，室温反应4 h。用0.2 M Tris-HCl(pH为7.8)终止用清洗剂清洗，干燥。包被孕酮单克隆抗体的毛细管用5% （质量体积百分比）脱脂奶粉溶于0.1M Tris-HCl (pH为7.8)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为4 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.2 M PBS(pH为7.8)，含0.1% （体积百分比）Tween 20。
实施例17
本实施例与实施例6基本相同，不同的是：戊二醛用0.06M PBS(pH为7.5)配制成浓度为3%（体积百分比） 的活化缓冲液，加入已修饰有氨基的毛细管并浸没，室温反应3 h。用0.06M PBS(pH为7.5)清洗干燥。将孕酮单克隆抗体用0.08M PBS(pH为7.6)配制成浓度为15µg/mL的待包被蛋白溶液，加入戊二醛处理后的氨化毛细管并浸没，室温反应3.5 h。用0.12M Tris-HCl (pH为7.5)终止用清洗剂清洗，干燥。包被孕酮单克隆抗体的毛细管用3%（质量体积百分比）BSA溶于0.07M Tris-HCl (pH为7.4)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为2.5 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.12 M PBS(pH为7.6)，含0.05% （体积百分比）Tween 20。
实施例18
本实施例与实施例8基本相同，不同的是：孕酮人工完全抗原浓度为10 mg/mL，碳二亚胺浓度为5 mM，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为10 mM，缓冲液为0.1M MES(pH为7)。室温反应60min。过脱盐柱除去未反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并更换缓冲液为0.1M PBS(pH为7.5)。加入摩尔量1:1的碱性磷酸酶，混匀，室温反应4 h。加入终浓度为20 mM的羟胺终止。过凝胶柱，纯化偶联产物，并更换缓冲液为0.2 M Tris-HCl(pH为7.8)，收集孕酮人工完全抗原偶联碱性磷酸酶产物，稀释至浓度为5µg/mL的酶结合物，加入5%（质量体积百分比）酪蛋白， 0.1%（体积百分比） Tween 20,并添加0.05% （体积百分比）防腐剂，分装，密封， 2～8℃保存。
实施例19
本实施例与实施例8基本相同，不同的是：孕酮人工完全抗原浓度为8 mg/mL，碳二亚胺浓度为4 mM，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为6 mM，缓冲液为0.05M MES(pH为为6)。室温反应55min。过脱盐柱除去未反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并更换缓冲液为0.07M PBS(pH为7.3)。加入摩尔量1:1的碱性磷酸酶，混匀，室温反应3.8h。加入终浓度为15 mM的羟胺终止。过凝胶柱，纯化偶联产物，并更换缓冲液为0.18 M Tris-HCl(pH为7.6)，收集孕酮人工完全抗原偶联碱性磷酸酶产物，稀释至浓度为3µg/mL的酶结合物，加入3%（质量体积百分比） BSA，0.08% （体积百分比）Tween 20,并添加0.03% （体积百分比）防腐剂，分装，密封，2～8℃保存。
英语缩写解释：
SMCC：4-(N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯
SATA：N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸酯
DTT：二硫苏糖醇
TCEP：三(2-羧乙基)膦
2-MEA：2-巯基乙胺盐酸
2-IT：2-亚氨基硫烷盐酸盐
PBS：磷酸盐缓冲液
MES：2-吗啉乙磺酸缓冲液
Tween：吐温
Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，Tris-HCl缓冲液中仅含有Tris，用氢氧化钠调节pH
APS-5：（4-氯苯巯基）（10-甲基-9，10-二氢化吖啶亚甲基）磷酸二钠盐
BSA：牛血清白蛋白。

Claims (10)

1.一种动物孕酮化学发光检测试剂盒，其特征在于：包括包被了孕酮单克隆抗体的毛细管、酶结合物、发光底物和清洗液。
2.根据权利要求1所述的一种动物孕酮化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述毛细管通过修饰剂修饰，使得毛细管上带有活性基团Ⅰ；所述活性基团Ⅰ为氨基、羧基、羟基、巯基、醛基、环氧基、氰酸酯基、异氰酸酯基、氰基、异氰基、马来酰胺氨基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、酚羟基或者酚羟基衍生基团中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的一种动物孕酮化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述孕酮单克隆抗体自带活性基团Ⅱ或经过修饰剂修饰获得活性基团Ⅱ，所述活性基团Ⅱ为氨基、羧基、巯基或羟基。
4.根据权利要求3所述的一种动物孕酮化学发光检测试剂盒，其特征在于：包被了孕酮单克隆抗体的毛细管是通过孕酮单克隆抗体上的活性基团Ⅱ与毛细管上的活性基团Ⅰ在偶联剂的作用下偶联后获得的。
5.根据权利要求4所述的一种动物孕酮化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述偶联剂为碳二亚胺、戊二醛、SMCC或者SMCC的衍生物。
6.根据权利要求3所述的一种动物孕酮化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述修饰剂为SATA、DTT、TCEP、2-MEA或2-IT。
7.根据权利要求1所述的一种动物孕酮化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述包被了孕酮单克隆抗体的毛细管是通过如下方法制成的，所述方法包括修饰孕酮单克隆抗体步骤、修饰毛细管步骤、包被步骤和封闭步骤；
所述修饰孕酮单克隆抗体步骤具体为：将修饰剂与孕酮单克隆抗体混合反应，反应完成后去掉修饰剂，使得孕酮单克隆抗体连上活性基团Ⅱ；
所述修饰毛细管步骤具体为：将毛细管浸泡在修饰剂中，使得毛细管上带有活性基团Ⅰ；
所述包被步骤具体为：
活化：活化的方式有三种：第一种：用偶联剂活化修饰后的毛细管，第二种：用偶联剂活化修饰后的孕酮单克隆抗体，第三种，在包被液中加入偶联剂；
配制包被液：当活化采用第一种方式，配制包被液具体为：将修饰后的孕酮单克隆抗体稀释至为5～30µg/mL，制成包被液Ⅰ；当活化采用第二种方式，配制包被液具体为：将活化后的孕酮单克隆抗体稀释至为5～30µg/mL，制成包被液Ⅱ；当活化采用第三种方式，配制包被液具体为：将偶联剂和缓冲液混合制成活化缓冲液，然后用活化缓冲液将修饰后的孕酮单克隆抗体稀释至为5～30µg/mL，制成包被液Ⅲ；
偶联：当活化采用第一种方式，具体的偶联为：将活化后的毛细管浸泡在包被液Ⅰ中，偶联完成后，清洗并干燥毛细管，获得包被了孕酮单克隆抗体的毛细管；当活化采用第二种方式，具体的偶联为：将修饰后的毛细管浸泡在包被液Ⅱ中，偶联完成后，清洗并干燥毛细管，获得包被了孕酮单克隆抗体的毛细管；当活化采用第三种方式，具体的偶联为：将修饰后的毛细管浸泡在包被液Ⅲ中，偶联完成后，清洗并干燥毛细管，获得包被了孕酮单克隆抗体的毛细管；
所述封闭步骤具体为：
用BSA或脱脂奶粉溶于Tris-HCl中，制成封闭液；将包被后的毛细管浸泡在封闭液中，封闭2～4 h后，清洗并干燥毛细管。
8.根据权利要求1所述的一种动物孕酮化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述酶结合物为孕酮人工完全抗原偶联碱性磷酸酶获得的产物或孕酮衍生物偶联碱性磷酸酶获得的产物。
9.根据权利要求1所述的一种动物孕酮化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述酶结合物通过如下方法制成：该方法包括修饰孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物步骤、活化步骤、偶联步骤、纯化步骤和稀释步骤；
所述修饰孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物步骤具体为：利用修饰剂修饰孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物，使得孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物连上氨基、羧基、巯基或羟基；
所述活化步骤具体为：利用偶联剂活化碱性磷酸酶、孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物；
所述偶联步骤具体为：将修饰后的孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物与活化后的碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物；或者将活化后的孕酮人工完全抗原或孕酮衍生物与碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物；
所述纯化步骤具体为：将偶联后的酶结合物过凝胶柱，然后进行纯化；
所述稀释步骤具体为：用0.02 M～0.2 M，pH为7.2～7.8 的Tris-HCl将纯化后的酶结合物稀释至浓度为0.5～5µg/mL的酶结合物。
10.根据权利要求9所述的一种动物孕酮化学发光检测试剂盒，其特征在于：还包括防腐步骤，防腐步骤具体为：在稀释后的酶结合物中加入BSA或酪蛋白，Tween 20和防腐剂制成最终的酶结合物，分装，密封，在温度为2～8℃的条件下保存；在最终的酶结合物中，BSA或酪蛋白的质量体积百分比为0.1～5%，Tween 20的体积百分比为0.01～0.1%，防腐剂的体积百分比为0.01～0.05%。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115097130A (zh) * 2022-05-17 2022-09-23 中国石油大学(华东) 一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105181680A (zh) * 2015-09-28 2015-12-23 成都博奥新景医学科技有限公司 一种三聚氰胺的磁珠分离化学发光免疫检测方法
CN107091923A (zh) * 2017-06-02 2017-08-25 成都普利泰生物科技有限公司 一种毛细管化学发光检测装置及其检测方法
CN107607702A (zh) * 2017-07-21 2018-01-19 上海科华生物工程股份有限公司 甾醇类半抗原‑碱性磷酸酶交联物的制备方法及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105181680A (zh) * 2015-09-28 2015-12-23 成都博奥新景医学科技有限公司 一种三聚氰胺的磁珠分离化学发光免疫检测方法
CN107091923A (zh) * 2017-06-02 2017-08-25 成都普利泰生物科技有限公司 一种毛细管化学发光检测装置及其检测方法
CN107607702A (zh) * 2017-07-21 2018-01-19 上海科华生物工程股份有限公司 甾醇类半抗原‑碱性磷酸酶交联物的制备方法及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
冯燕: "SMCC法抗体定向偶联技术的优化与应用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（医药卫生科技辑）》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115097130A (zh) * 2022-05-17 2022-09-23 中国石油大学(华东) 一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法
CN115097130B (zh) * 2022-05-17 2024-03-19 中国石油大学(华东) 一种快速定性-定量检测冠状病毒的毛细玻璃管检测方法

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