CN102115778A - 食源性致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种食源性致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法。该方法为：采用金或银纳米溶胶作为增强试剂，以表面增强拉曼光谱对食源性致病菌进行检测，经对检测结果进行聚类分析，实现对食源性致病菌的鉴别。本发明方法灵敏度高，选择性好，易于操作，检测速度快，成本低廉，可实现食源性致病菌的大规模在线检测，适于在食品安全、环境监测等技术领域广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种食源性致病菌的检测方法，尤其涉及一种利用表面增强拉曼光谱和聚类分析对食源性致病菌进行鉴别的方法。
背景技术
食源性致病菌是引起食物中毒的主要原因之一，不仅导致人类多种疾病的发生，而且严重威胁着人们的健康并造成经济损失。据世界卫生组织估计，全球每年有数十亿人感染上食源性疾病。美国“9.11”事件后，世界各地对生物恐怖事件给予了极大的关注，由此建立对食源性致病菌的鉴定和检测方法势在必行。一般来说，造成食源性疾病的致病菌层出不穷，但尤以沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌为最。如何快速而准确地检测这些致病菌，是有效遏制食源性疾病、确保食品安全的首要任务。
现有的常规食品微生物检测方法包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴别实验，或者是通过聚合酶链式反应(PCR)实现的。虽然这些检测方法十分专业和经典，但其步骤复杂、耗时较长，成本高，且其最主要的不足之处在于必须进行预增菌，而从取样到确定是定性还是定量鉴别微生物，最低需要一天以上的时间，因此难以适应飞速发展的现代食品生产和流通的需要。
发明内容
本发明的目的在于提出一种的食源性致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其灵敏度高，易于操作，检测速度快，成本低廉，可实现大规模的在线检测，从而克服了现有技术中的不足。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
一种食源性致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于，该方法为：采用金或银纳米溶胶作为增强试剂，以表面增强拉曼光谱对食源性致病菌进行检测，经对检测结果进行聚类分析，实现对食源性致病菌的鉴别。
进一步地讲，该方法具体为：
取食源性致病菌中的至少一种制成活化菌株标准样品，并将活化菌株标准样品与金或银纳米溶胶充分混合后以拉曼光谱进行检测，其后将检测结果进行聚类分析，并由此鉴别食源性致病菌的种属；
所述食源性致病菌至少包括沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌；
所述金或银纳米溶胶的使用量与致病菌的用量在1毫摩尔∶100活菌数～1毫摩尔∶30000活菌数之间。
该方法包括如下步骤：
(1)活化菌株标准样品的制备
取食源性致病菌中的至少一种的菌种在LB固体培养基上于30-37℃划线培养24-48h，其后挑取分散的单一菌落置于水中振荡，而后在5000-10000rmp离心处理5-30min，离心沉淀物经洗涤后，制成活化菌株标准样品，所述食源性致病菌至少包括沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌；
(2)拉曼光谱检测
将拉曼光谱表面增强试剂与上述活化菌株标准样品以1毫摩尔∶100活菌数～1毫摩尔∶30000活菌数的用量比例混合、振荡，使两者充分结合，而后以拉曼光谱进行检测；
(3)数据处理
将标准样品的拉曼光谱检测结果进行聚类分析，由此鉴别食源性致病菌的种属。
步骤(2)中拉曼光谱仪的测定条件设为：激光功率范围：20-300mw，扫描时间：2-20s。
步骤(2)中活化菌株标准样品与增强试剂混合、振荡的时间为2-60s。
步骤(3)中是通过比对食源性致病菌的拉曼光谱图中各峰峰值来鉴别食源性致病菌种属的。
所述金纳米溶胶的制备方法为：
将0.30-1.50mg/mL氯金酸钾溶液置入温度为105-135℃的条件下煮沸，加入的柠檬酸钠溶液浓度为0.1wt％-10wt％，煮沸5-95min，制得金纳米溶胶。
更进一步地讲，该方法包括如下具体步骤：
(1)活化菌株标准样品的制备
至少取沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的菌种分别在LB固体培养基上于30-37℃划线培养24-48h，其后挑取分散的单一菌落置于水中振荡，而后在5000-10000rmp离心处理5-30min，离心沉淀物经洗涤后，制成至少四种活化菌株标准样品；
(2)拉曼光谱检测
将拉曼光谱表面增强试剂与上述活化菌株标准样品混合、振荡，使两者充分结合，而后以拉曼光谱进行检测；
(3)数据处理
将各标准样品的拉曼光谱检测结果进行聚类分析，由此建立可用于鉴别和区分食源性致病菌的种属的聚类分析图；
(4)参照步骤(2)的操作，以拉曼光谱检测一种以上未知菌种样品，将所得拉曼光谱检测结果与步骤(2)所得上述标准样品的拉曼光谱检测结果和步骤(3)所得聚类分析图进行比对，从而鉴定未知菌种的种属。
附图说明
图1是四种食源性致病菌的表面增强拉曼光谱比较图；
图2是未知的18株细菌样品拉曼光谱数据的聚类分析图；
以上图中所示I为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、II为沙门氏菌(Salmonella spp)、III为埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)、IV为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
具体实施方式
本案发明人经长期研究和实践发现，由于不同的细菌种类在它们的细胞生物化学成分方面有所不同，每个分子都有一个特征光谱，可以通过拉曼光谱仪检测出分子的特征电磁波。利用拉曼光谱能同时获得完整活细胞内4种主要生物大分子结构及其变化的直接证据，包括核酸的磷酸骨架，脱氧核糖(或核糖)和碱基：蛋白质的主、侧链；脂膜的脂肪酸碳链氢链的反式和扭曲构象以及各种不同构象的碳水化合物等。因而，可以根据它们的拉曼光谱就可以鉴别出细菌的种类。
根据上述发现，本案发明人提出了基于表面增强拉曼光谱的食源性致病菌鉴别方法，其技术方案大致如下：
(1)微生物样品的制备
活化食源性致病菌菌株，培养后将菌体在蒸馏水中洗涤，制成活化食源性致病菌菌株标准样品，完毕后待进样。
(2)增强试剂制备条件的优化
本发明可选取金纳米溶胶、银纳米溶胶或其它类似试剂作为增强试剂。其中，金纳米溶胶及银纳米溶胶可采用本领域技术人员习知的方法制备。例如，金纳米溶胶可采用柠檬酸钠还原氯金酸或其盐类的方法制备，而银纳米溶胶可采用以NaBH4还原可溶性银盐的方法制备。
(3)拉曼光谱仪进样条件的设定
(4)被测菌种拉曼光谱的收集
将步骤(1)中制备的活化菌株标准样品与步骤(2)中的增强试剂按合适比例(这个比例以获得较好的拉曼光谱表面增强率为宜)混合，振荡结合一定时间(至样品中的细菌与纳米粒子充分结合为宜)，置于拉曼光谱仪之中按照步骤(3)进行测定，扫描得到的光谱图经处理后转换为可供数据处理的数据表待后续数据处理。
(5)数据处理
将拉曼光谱图的数据进行聚类分析，通过各食源性致病菌标准样品的拉曼光谱图各峰峰值鉴别不同种属的食源性致病菌。
前述的步骤可分别优选为：
微生物样品的制备：菌种在LB固体培养基上划线培养，30-37℃下培养24-48h，用无菌接种环挑取分散的单一菌落，置于蒸馏水中振荡，5000-10000rmp离心5-30min，重复三次操作，而后以水洗涤，完毕。
增强试剂制备条件的优化：采用纳米金作为增强试剂，油浴升温至105-135℃左右加入0.30-1.50mg/mL氯金酸钾溶液待沸腾，加入的柠檬酸钠溶液浓度为0.1％-10％(质量百分比)，煮沸反应时间为5-95min。
进样条件：拉曼光谱仪测定条件设定为：激光功率范围：20-300mw，扫描时间：2-20秒。各细菌样品与金溶胶混合体积比为1∶1-1∶5，二者混合时间保持一致，为2-60s。
数据处理方法：采用SPSS(SPSS公司)、SAS软件(SAS Institute Inc.)或其他类似软件对拉曼光谱图数据通过聚类分析，从而进行食源性致病菌的鉴别。
下面结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案做详细说明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
实施例1：利用表面增强拉曼光谱鉴别四种食源性致病菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella spp)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)，其过程为：
取上述四种致病菌的冻存菌种接种至TSB离心管中活化，在30-37℃活化至少24h，待TSB浑浊，接种至LB固体培养基平板上划线，在37℃培养24h～48h形成分散的菌落，用无菌接种环挑取单一菌落至装有4mL蒸馏水的离心管中振荡混浊，于冷冻离心机8500rmp离心5min，重复3次以上，取沉淀以水洗涤完毕待进样。取按照前述优化条件制备的金纳米溶胶500μL与300μL前述菌体标准样品分别于进样瓶中混合8s，拉曼测定200mw，10s得到光谱图，按照上述操作每株细菌样品，收集图谱，进行数据处理得到图1，该图中，500cm-1左右的峰是蛋白质肽类的S-S键伸缩振动；550cm-1左右是碳水化合物的特征峰；1330cm-1左右的峰应是腺嘌呤的特征峰——类似于DNA的谱图；1125cm-1特征峰的出现表明纳米颗粒可能进入细菌细胞壁后造成DNA的变性；其余大部分的峰可能是细胞壁中蛋白质、肽类和氨基酸；最强的730cm-1左右的峰归属于肽聚糖结构中NAG成分，也有可能是FAD的倍频峰；金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌是革兰氏阳性菌，其细胞壁更厚更粗糙，金纳米颗粒进入细胞可能性较低，由1330cm-1峰的强度相吻合；沙门氏菌和埃希氏大肠杆菌是革兰氏阴性菌，其细胞壁比阳性菌更薄，其脂质双分子层的振动峰强度较小。
实施例2：利用表面增强拉曼光谱鉴别未知的食源性致病菌样品
本实施例按照上述方法取未知的18株食源性致病菌样品分别进样，收集所得拉曼光谱图谱，将光谱数据进行SPSS软件处理得到聚类分析结果，再将光谱数据及聚类分析结果与前述标准样品的光谱图及聚类分析结果比对，并由此确定了其中标号为14、16的样品，3、4、9、10、12、13、17、18的样品，1、5、7、11的样品以及2、6、8、15的样品分别为单增李斯特菌、沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，从而实现了未知食源性致病菌样品种属的鉴定。
当然，本实施例的过程仅用以说明本发明的技术方案，本领域技术人员根据本发明的启示，亦可很容易想到对除上述四种食源性致病菌之外的其他多种细菌以类似的方法进行区分和鉴定。但是，凡本领域技术人员因本发明所涉及之技术启示，而采用等同替换或等效变形方式形成的技术方案均落在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种食源性致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于，该方法为：采用金或银纳米溶胶作为增强试剂，以表面增强拉曼光谱对食源性致病菌进行检测，经对检测结果进行聚类分析，实现对食源性致病菌的鉴别。
2.根据权利要求1所述的食源性致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于，该方法具体为：
取食源性致病菌中的至少一种制成活化菌株标准样品，并将活化菌株标准样品与金或银纳米溶胶充分混合后以拉曼光谱进行检测，其后将检测结果进行聚类分析，并由此鉴别食源性致病菌的种属；
所述食源性致病菌至少包括沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌；
所述金或银纳米溶胶的使用量与致病菌的用量在1毫摩尔∶100活菌数～1毫摩尔∶30000活菌数之间。
3.根据权利要求1或2所述的食源性致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)活化菌株标准样品的制备
取食源性致病菌中的至少一种的菌种在LB固体培养基上于30-37℃划线培养24-48h，其后挑取分散的单一菌落置于水中振荡，而后在5000-10000rmp离心处理5-30min，离心沉淀物经洗涤后，制成活化菌株标准样品，所述食源性致病菌至少包括沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌；
(2)拉曼光谱检测
将拉曼光谱表面增强试剂与上述活化菌株标准样品以1毫摩尔∶100活菌数～1毫摩尔∶30000活菌数的用量比例混合、振荡，使两者充分结合，而后以拉曼光谱进行检测；
(3)数据处理
将标准样品的拉曼光谱检测结果进行聚类分析，由此鉴别食源性致病菌的种属。
4.根据权利要求3所述的食源性致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于，步骤(2)中拉曼光谱仪的测定条件设为：激光功率范围：20-300mw，扫描时间：2-20s。
5.根据权利要求3所述的食源性致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于，步骤(2)中活化菌株标准样品与增强试剂混合、振荡的时间为2-60s。
6.根据权利要求3所述的食源性致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于，步骤(3)中是通过比对食源性致病菌的拉曼光谱图中各峰峰值来鉴别食源性致病菌种属的。
7.根据权利要求1或2所述的食源性致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于，所述金纳米溶胶的制备方法为：
将0.30-1.50mg/mL氯金酸钾溶液置入温度为105-135℃的条件下煮沸，加入的柠檬酸钠溶液浓度为0.1wt％-10wt％，煮沸5-95min，制得金纳米溶胶。
8.根据权利要求3所述的食源性致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于，该方法包括如下具体步骤：
(1)活化菌株标准样品的制备
至少取沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的菌种分别在LB固体培养基上于30-37℃划线培养24-48h，其后挑取分散的单一菌落置于水中振荡，而后在5000-10000rmp离心处理5-30min，离心沉淀物经洗涤后，制成至少四种活化菌株标准样品；
(2)拉曼光谱检测
将拉曼光谱表面增强试剂与上述活化菌株标准样品混合、振荡，使两者充分结合，而后以拉曼光谱进行检测；
(3)数据处理
将各标准样品的拉曼光谱检测结果进行聚类分析，由此建立可用于鉴别和区分食源性致病菌的种属的聚类分析图；
(4)参照步骤(2)的操作，以拉曼光谱检测一种以上未知菌种样品，将所得拉曼光谱检测结果与步骤(2)所得上述标准样品的拉曼光谱检测结果和步骤(3)所得聚类分析图进行比对，从而鉴定未知菌种的种属。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110706 |