CN103926235A - 一种鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，旨在提供一种灵敏度高、易于操作，检测速度快，成本低廉的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，该方法服了鉴别不同菌种的细菌和同种菌种的不同菌株用金属溶胶做增强试剂分辨不清的问题；其技术要点是：该方法是利用希瓦氏菌的金属还原能力将金属离子还原成纳米金属，并将其作为表面增强拉曼散射的活性基底物质，采用拉曼光谱对希瓦氏性菌进行检测，鉴定希瓦氏菌。

Description

一种鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法

技术领域

本发明涉及一种具有金属还原活性的希瓦氏菌的鉴定方法，特别涉及一种利用希瓦氏菌自身金属还原能力制备纳米金属的拉曼光谱鉴定方法。

背景技术

希瓦氏菌是一种异化铁还原菌；异化铁还原被认为生地球上最早的呼吸形式之一，多种古细菌和真菌具有还原Fe(Ⅲ)的能力，被称为铁还原菌。在异化铁还原过程中，微生物利用外界的Fe(Ⅲ)作为呼吸链末端电子受体，氧化体内的基质(电子供体)，实现电子在呼吸链上的传递，从而使Fe(Ⅲ)还原为Fe(Ⅱ)，此过程所释放出来的能量又被微生物所捕获，满足去生长发育的需要。

目前，微生物的检测方法主要有：传统的增殖、分离和血清、生化鉴定方法。其中，酶联免疫吸附法(ELISA)，主要通过细菌表面抗原和试剂盒中的特异性结合作用；聚合酶链式反应(PCR)法，以核酸分子为探针高灵敏的检测技术等等。这些方法虽然都较为灵敏、稳定，但是由于需要较长时间进行样品前处理，给快速检测带来了一些问题，因此，快速简易、提高检测效率、降低检测限是我们将要研究内容。表面增强拉曼(SERS)技术，作为一种光谱技术，是1974年由Fleischmann等人发现的，由于这种技术具有高灵敏性、简便前处理、低扫描时间和水干扰小的特点，已经被大量用于实际检测中。

在检测微生物领域，SERS已经表现出现对于传统检测方法的突出的优越性，特别是在增强底物与细菌的结合方式上，SERS独特的技术性和多样的增强制备手段为成功实现SERS超灵敏、快速检测微生物打下了坚实的基础。

增强底物与细菌的结合包括细胞外增强和细胞内增强。目前，细胞外的SERS增强手段已经比较丰富和成熟。目前有应用的SERS增强方式，可以分为三个部分：(1)利用纳米技术获得SERS活性基底，常用的为一些贵金属纳米粒子所构成的纳米胶体，然后将制好的菌体与纳米胶体混合，细菌就能够吸附或者靠近金属表面，使得拉曼信号得到增强。从获得的表面增强拉曼光谱中可以分析得出，各种细菌所独有的表面成分或特殊形态学结构信息。金属溶胶体系具有制备简单和SERS增强效果好等优点，其表面增强拉曼散射效应与溶胶纳米粒子的种类、粒径、粒子间距、激发光的波长等因素有关。但由于颗粒尺寸不均一和形状的无规则性而导致较差的稳定性和重现性，而且有研究表明在鉴别同种菌种的不同菌株，甚至是部分不同菌种的细菌时会得到相同的拉曼光谱图。(2)使细菌分布在银和金等纳米粒子构成的活性膜上得到增强。(3)形成有序纳米粒子自组装阵列使胞外拉曼信号得到增强。(2)和(3)这两种细胞外SERS增强虽然使得重现性和灵敏度都有很大的改善，但是制备基底的过程相对(1)要复杂很多。

Roger M.Jarvis和Royston Goodacre2008年3月26日在化学会评论发表用SERS表征和鉴别细菌，但是该文明确指出了用化学方法合成的纳米银难以将有的菌区分开，(Roger M.Jarvis^*and Royston Goodacre，Characterisation and identification of bacteria using SERS，Received14thJanuary2008，First published as an Advance Article on the web26th March2008，DOI:10.1039/b705973f)。并且，纳米银的合成较为复杂，所需成本也比较高，比如，用还原剂还原银的化合物而制备纳米银粉的方法，是在溶液中加入分散剂，以水合肼、硼氢化钠、次亚磷酸钠、葡萄糖、抗坏血酸、双氧水等作还原剂还原银的化合物反应中，分散剂可控制反应的过程，降低银粒子的表面活性，从而控制生成的银微粒在钠米数量级。常用的分散剂有PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、PVA(聚乙烯醇)、明胶等。

另外，目前还没有文献报道用拉曼方法鉴定该菌是否是金属还原活性菌，从而把金属还原活性菌与非金属还原菌鉴别和区别开来，也无文献鉴定和区分不同的具有金属还原活性的菌。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于，提出一种利用希瓦氏菌的自身金属还原能力将金属还原能力将金属离子还原成纳米金属，采用拉曼光谱对希瓦氏性菌进行检测，该方法具有灵敏度高易于操作，检测速度快，成本低廉，克服了鉴别不同菌种的细菌和同种菌种的不同菌株用金属溶胶做增强试剂分辨不清的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的：该方法是利用希瓦氏菌的自身金属还原能力将金属离子还原成纳米金属，并将其作为表面增强拉曼散射的活性基底物质，采用拉曼光谱对希瓦氏菌进行检测，鉴定希瓦氏菌。

上述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，所述的金属离子为金离子或者银离子或者铜离子或者铂离子或者铟离子或者镍离子或者钯离子或者钌离子或者铑离子或者铁离子或者钴离子的其中之一。

上述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，所述的纳米金属为纳米金或者纳米银或者纳米铜或者纳米铂或者纳米铟或者纳米镍或者纳米钯或者纳米钌或者纳米铑或者纳米铁或者纳米钴的其中之一。

上述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，采用拉曼光谱对希瓦氏菌进行检测的方法是将希瓦氏菌的自身金属还原能力合成纳米金属滴在硅片上，自然挥干，进行拉曼光谱测试。

上述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，所述的拉曼光谱的检测条件为：激光波长：632.8nm，激光功率为0.24mW，采集时间为10-60s；检测范围是400～2000cm^-1；光斑直径100μm，得到待测试样的SERS谱图。

上述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，所述的希瓦氏菌是具金属还原活性的希瓦氏奥奈达菌MR-1或者脱色希瓦氏菌S12或者腐败希瓦菌200。

上述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，所述的希瓦氏菌的自身金属还原能力还原纳米金属的方法，依次包括下述步骤：

1)称取体积比1:10的活化菌株标准样品和盐溶液，加入到的LB液体培养基中定溶，在25-35℃恒温摇床中培养10～40小时；

2)再在3-5℃条件下离心5-10min，收集底部沉淀，并用双蒸水洗涤后收集的沉淀；

3)将步骤2)得到的沉淀与双蒸水混合均匀，制成待测样品。

进一步的，上述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，所述的活化菌株标准样品为OD₆₀₀＝1.0的活化菌株标准样品。

进一步的，上述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，步骤2)所述的摇床转速160rpm，步骤3)所述的离心转速为3000rpm。

进一步的，上述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，所述的盐溶液的浓度为0.3～10.0mM。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案利用希瓦氏菌的自身金属还原能力，在其细胞表面将盐还原成纳米金属粒作为表面增强活性基底，以拉曼光谱对电活性菌进行检测，经对检测结果进行与非金属还原活性菌对比，实现对希瓦氏金属还原活性菌的鉴别。

该方法无需专门合成纳米金属，节约了资源与生产成本，降低了能耗，提高了纳米金属的生物相容性，并且灵敏度高，克服难以用化学方法合成的纳米银将菌类分开的问题，以及鉴别不同菌种的细菌和同种菌种的不同菌株用金属溶胶做增强试剂的拉曼现有技术中的不足。并且易于操作，检测速度快，成本低廉。

附图说明

图1是在细胞外还原银纳米颗粒的SEM图及能谱图；

图2是银溶胶作为活性基底鉴定不同细菌的拉曼光谱图；

图3是细菌胞外还原纳米银颗粒鉴别不同细菌种属的拉曼光谱图。

其中：1、沙门氏菌；2、希瓦氏奥奈达菌MR-1；3、腐败希瓦菌200；4、枯草杆菌；5、脱色系瓦氏菌S12；6、大肠杆菌。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次数的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1

本发明提出的一种鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，该方法依次包括下述步骤：

1、微生物标准样品的制备

取待测细菌菌种在LB固体培养基上于30-37℃划线培养24-48h，其后挑去分散的单一菌落置于水中振荡，分别接种于100mL LB液体培养基中，并置于160rpm，30℃恒温摇床中培养20小时后，将菌体在无菌水中洗涤，并用蒸馏水将活化的细菌调节浓度为(OD600＝1.0)，制成活化细菌菌株标准样品；制得活化菌株标准样品；

所述的待测细菌菌株为1、沙门氏菌；2、希瓦氏奥奈达菌MR-1；3、腐败希瓦菌200；4、枯草杆菌；5、脱色系瓦氏菌S12；6、大肠杆菌。

2、细菌-Ag样品制备条件的优化

取步骤(1)中获得的菌液(OD600＝1.0)10～100mL(优选50mL)和10mL0.3～10.0mM(优选5mM)硝酸银溶液加入到新鲜LB液体培养基中，定容为120mL，并置于160rpm，30℃恒温摇床中培养10～40小时后(优选20小时)，得到的样品在3000rpm，4℃条件下离心8min，收集底部沉淀，并用双蒸水洗涤沉淀2次，得到沉淀于200μL双蒸水混合制成待测样品，并在震荡仪上混合均匀，制成待测细菌样品。

3、拉曼光谱仪检测条件的设定

被测菌种拉曼光谱的收集

将步骤(2)中所得的混合待测样品，滴在硅片上，自然挥干，置于拉曼光谱仪中按照步骤(3)进行拉曼光谱测定，拉曼光谱仪的检测条件设为：激光波长为632.8nm，激光功率为0.24mW，采集时间为10-60s；光斑直径100μm，检测范围是400～2000cm^-1。

扫描得到的光谱图进行分析对比。

数据处理

将拉曼光谱图和SEM图进行结合对比分析(参阅图1至图3)，通过各种细菌的拉曼光谱图各峰值鉴别不同种属的细菌。

图2是6个不同属的细菌的SERS图谱的对比。从图中可以看出它们有一些相对较高的峰653cm^-1，741cm^-1，801cm^-1，924cm^-1，1002cm^-1，1027cm^-1，1080cm^-1，1498cm^-1，1628cm^-1左右的峰。分别归属是～653cm^-1处为鸟嘌呤的归属，～741cm^-1处为和环呼吸有关的腺嘌呤，～1002cm^-1是苯丙氨酸(对称环呼吸模式)，1628cm^-1是酰胺Ⅰ(不饱和脂质)，同样的，类似的峰627cm^-1，657cm^-1，732cm^-1，791cm^-1，959cm^-1，1014cm^-1，1133cm^-1，1215cm^-1，1247cm^-1，1335cm^-1，1371cm^-1，1459cm^-1，1547cm^-1，1585cm^-1，1627cm^-1，1701cm^-1能在图中容易发现，这些峰同样也与不同的功能团相关：1003cm^-1，1239cm^-1和1590cm^-1处是蛋白质或氨基酸的归属，713cm^-1和1322cm^-1是核酸的归属，1239cm^-1和1450cm^-1是来自脂质的归属，928cm^-1是碳水化合物的归属。

6种细菌中包括有5种革兰氏阴性菌(大肠杆菌，希瓦氏奥达奈菌MR-1，腐败希瓦菌200沙门氏菌，脱色系瓦氏菌S12)和1种革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)。比较属于革兰氏阴性菌的沙门氏菌和属于革兰氏阳性菌的枯草芽孢杆菌，它们有着不同的细胞壁结构，但是用银溶胶作为增强试剂得到的表面增强拉曼图谱，如图却是十分相似；比较同属于革兰氏阴性菌的大肠杆菌和希瓦氏奥达奈MR-1这两种不同属的细菌，它们的表面增强拉曼光谱图谱也几乎没有区别，只有特征峰的强度有所不同。

从图3中可以看到一些较高的特征峰：627cm^-1，653cm^-1，732cm^-1，791cm^-1，961cm^-1，1007cm^-1，1100cm^-1，1142cm^-1，1228cm^-1，1268cm^-1，1335cm^-1，1375cm^-1，1461cm^-1，1545cm^-1，1583cm^-1，1633cm^-1。对比三种希瓦氏菌的特征峰的归属，653cm^-1是鸟嘌呤(CS)的归属，732cm^-1是腺嘌呤的归属，961cm^-1处是δ(C＝C)的归属，1335cm^-1处是蛋白质色氨酸的归属，1461cm^-1处是代表蛋白质的-CH变形。三种希瓦氏菌的银胶表面增强拉曼图谱都十分相似，通过此方法，并不能有效地将同种属不同亚种的细菌鉴别出来。

图3中的6种菌，其中三种希瓦氏菌是具有金属还原活性的异化铁还原菌，均具有胞外呼吸能力，但是研究的大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和沙门氏菌却没有这特性。从图中明显可见大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和沙门氏菌没有拉曼信号，另外三种希瓦氏菌都有显著特征峰出现。

大肠杆菌与希瓦氏菌都是革兰氏阴性菌，两者最大的差异在于，由于希瓦氏菌属是异化铁还原菌，可以进行微生物胞外呼吸。微生物胞外呼吸是一种新型的微生物能量代谢方式，是指异化铁还原菌在细胞内彻底氧化有机物产生电子，经过胞内呼吸链传递到胞外的电子受体，并在此过程中获得能量以维持自身生长的过程。

实施例2

本发明提出的另一种鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，该方法依次包括下述步骤：

1、微生物标准样品的制备

活化待测细菌菌株，培养后，将菌体在无菌水中洗涤，并用蒸馏水将活化的细菌调节浓度为(OD600＝1.0)，制成活化细菌菌株标准样品；

2、细菌-纳米Au样品制备条件的优化

取步骤(1)中获得的菌液(OD600＝1.0)10～100mL(优选30mL)和10mL～100-300uM(优选200uM)四氯金酸三水合物加入到新鲜LB液体培养基中，定容为120mL，并置于160rpm，30℃恒温摇床中培养10～40小时(优选20小时)后，得到的样品在3000rpm，4℃条件下离心8min，收集底部沉淀，并用双蒸水洗涤沉淀2次，得到沉淀于200μL双蒸水混合制成待测样品，并在震荡仪上混合均匀，制成待测细菌样品。

3、拉曼光谱仪检测条件的设定

被测菌种拉曼光谱的收集

将步骤(2)中所得的混合待测样品，滴在硅片上，自然挥干，置于拉曼光谱仪中按照步骤(3)进行拉曼光谱测定，拉曼光谱仪的检测条件设为：激光波长为632.8nm，激光功率为0.24mW，采集时间为10-60s；光斑直径100μm，检测范围是400～2000cm^-1，再对扫描得到的光谱图进行分析对比。

实施例3

本发明提出的另一种鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，该方法依次包括下述步骤：

1、微生物标准样品的制备

取待测细菌菌种在LB固体培养基上于30-37℃划线培养24-48h，其后挑去分散的单一菌落置于水中振荡，分别接种于100mL LB液体培养基中，并置于160rpm，30℃恒温摇床中培养20小时后，将菌体在无菌水中洗涤，并用蒸馏水将活化的细菌调节浓度为(OD600＝1.0)，制成活化细菌菌株标准样品；制得活化菌株标准样品；

所述的待测细菌菌株为1、沙门氏菌；2、希瓦氏奥奈达菌MR-1；3、腐败希瓦菌200；4、枯草杆菌；5、脱色系瓦氏菌S12；6、大肠杆菌。

2、细菌-纳米铜样品制备条件的优化

取步骤(1)中获得的菌液(OD600＝1.0)10～100mL(优选30mL)和10mL0.3～10.0mM(优选1mM)CuCl₂加入到新鲜LB液体培养基中，定容为120mL，并置于160rpm，30℃恒温摇床中培养10～40小时(优选20小时)后，得到的样品在3000rpm，4℃条件下离心8min，收集底部沉淀，并用双蒸水洗涤沉淀2次，得到沉淀于200μL双蒸水混合制成待测样品，并在震荡仪上混合均匀，制成待测细菌样品。

3、拉曼光谱仪检测条件的设定

被测菌种拉曼光谱的收集

将步骤(2)中所得的混合待测样品，滴在硅片上，自然挥干，置于拉曼光谱仪中按照步骤(3)进行拉曼光谱测定，拉曼光谱仪的检测条件设为：激光波长为632.8nm，激光功率为0.24mW，采集时间为10-60s；光斑直径100μm，检测范围是400～2000cm^-1，再对扫描得到的光谱图进行分析对比。

由于不同的细菌种类在它们的细胞生物化学成分方面有所不同，每个分子都有一个特征光谱，并且希瓦氏金属还原活性菌能够在细胞内还原种类繁多的高价金属离子，例如在细胞内将Ag(Ⅰ)、Au(Ⅲ)、Cu(II)还原为零价金属形成金属颗粒胶体。在外环境是Ag(Ⅰ)条件下得到的银颗粒沉淀在细胞外。通过拉曼光谱仪检测出分子与纳米金属颗粒结合后的特征电磁波，鉴定不同的金属还原活性菌。

本发明以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，做出若干修改，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，其特征在于，该方法是利用希瓦氏菌的金属还原能力将金属离子还原成纳米金属，并将其作为表面增强拉曼散射的活性基底物质，采用拉曼光谱对希瓦氏性菌进行检测，鉴定希瓦氏菌。

2.根据权利要求1所述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，其特征在于，所述的金属离子为金离子或者银离子或者铜离子或者铂离子或者铟离子或者镍离子或者钯离子或者钌离子或者铑离子或者铁离子或者钴离子的其中之一。

3.根据权利要求1所述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，其特征在于，所述的纳米金属为纳米金或者纳米银或者纳米铜或者纳米铂或者纳米铟或者纳米镍或者纳米钯或者纳米钌或者纳米铑或者纳米铁或者纳米钴的其中之一。

4.根据权利要求1所述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，其特征在于，采用拉曼光谱对希瓦氏菌进行检测的方法是将希瓦氏菌的自身金属还原能力合成纳米金属滴在硅片上，自然挥干，进行拉曼光谱测试。

5.根据权利要求1所述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，其特征在于，所述的拉曼光谱的检测条件为：激光波长：632.8nm，激光功率为0.24mW，采集时间为10-60s；检测范围是400～2000cm^-1；光斑直径100μm，得到待测试样的SERS谱图。

6.根据权利要求1所述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，其特征在于，所述的希瓦氏菌是具有金属还原活性的希瓦氏奥奈达菌MR-1或者脱色希瓦氏菌S12或者腐败希瓦菌200。

7.根据权利要求1所述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，其特征在于，所述的希瓦氏菌的自身金属还原能力还原纳米金属的方法，依次包括下述步骤：

1)称取体积比1:10的活化菌株标准样品和盐，加入到的LB液体培养基中定溶，在25-35℃恒温摇床中培养10～40小时；

2)再在3-5℃条件下离心5-10min，收集底部沉淀，并用双蒸水洗涤后收集的沉淀；

3)将步骤2)得到的沉淀与双蒸水混合均匀，制成待测样品。

8.根据权利要求7所述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，其特征在于，所述的活化菌株标准样品为OD₆₀₀＝1.0的活化菌株标准样品。

9.根据权利要求7所述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，其特征在于，步骤2)所述的摇床转速160rpm，步骤3)所述的离心转速为3000rpm。

10.根据权利要求7所述的鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法，其特征在于，所述的盐溶液的浓度为0.3～10.0mM。