CN104330399A - 一种原位形成拉曼增强基底检测水中大肠杆菌的方法 - Google Patents
一种原位形成拉曼增强基底检测水中大肠杆菌的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104330399A CN104330399A CN201410687082.1A CN201410687082A CN104330399A CN 104330399 A CN104330399 A CN 104330399A CN 201410687082 A CN201410687082 A CN 201410687082A CN 104330399 A CN104330399 A CN 104330399A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- raman
- thalline
- escherichia coli
- centrifugal 5min
- graphene oxide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发明公开了一种原位形成拉曼增强基底检测水中大肠杆菌的方法，葡萄糖氧化酶和抗大肠杆菌抗体共同修饰的氧化石墨烯特异性结合到大肠杆菌表面；然后加入银纳米种子，利用氧化石墨烯表面的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成过氧化氢，过氧化氢与银离子反应，促进银纳米种子生长，形成银纳米颗粒，并吸附到氧化石墨烯表面，原位形成拉曼增强基底；拉曼报告分子吸附到氧化石墨烯表面；结合银纳米颗粒和氧化石墨烯共同拉曼增强效应，实现对大肠杆菌的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种原位形成拉曼增强基底检测水中大肠杆菌的方法。
背景技术：
全世界每天有11亿人等待安全用水，在发展中国家因饮用水大肠杆菌污染，导致数以万计的人患病。十一五期间，我国突发环境事件中，7成涉及饮用水安全，其中不乏因大肠杆菌污染水体，影响饮用水安全，危害人体健康，阻碍经济、社会的可持续发展。严峻的现实迫使研究者必须开发高效、快速、特异性检测水中大肠杆菌的新方法和新技术，为保障人们用水安全，保护人体健康提供技术支持。
目前，对水环境中大肠杆菌的检测方法主要包括常规培养检测，分子生物学检测、免疫检测等。这些方法虽各具优势，但也存在一些不足。常规培养检测技术要求简单，但首先需要对水体中致病菌进行培养，这个过程至少需要48-72h才能完成，检测耗时、费力。分子生物学检测常通过提取大肠杆菌DNA或者RNA，使用PCR技术对提取的核酸进行特异性扩增，然后通过检测核酸实现对大肠杆菌的检测，该方法检测灵敏度高，特异性强，但无法实现现场分析检测，不能够实时评估水环境污染状况。免疫检测大肠杆菌虽然检测特异性强，但检测灵敏度较低。因此，开发简单、易操作、特异性的检测水中大肠杆菌的方法，对评估水环境污染程度，保障用水安全，促进经济发展起着非常重要的作用。
发明内容：
本发明的目的是克服现有技术中方法的不足，提供一种原位形成拉曼增强基底的方法，利用氧化石墨烯和银纳米颗粒共同表面拉曼增强效应，实现对水中大肠杆菌的信号放大检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案：一种原位形成拉曼增强基底的方法，包括以下步骤：
（1）选择检测大肠杆菌：使用LB培养基培养大肠杆菌，37℃条件下培养过夜，取细菌培养液，4000rpm/min离心5min，去除培养基，然后使用pH7.4 PBS缓冲液重悬菌体，稀释菌体，等待检测；
（2）原位形成拉曼增强基底：修饰有1μg/mL-10μg/mL葡萄糖氧化酶和0.1μg/mL-20μg/mL抗大肠杆菌抗体的0.1μg/mL-1μg/mL氧化石墨烯与大肠杆菌结合，2000rpm/min-3000rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬；加入0.5μg/mL-50μg/mL银纳米种子，氧化石墨烯表面的葡萄糖氧化酶催化1μg/mL-50μg/mL葡萄糖，生成过氧化氢；过氧化氢与10μg/mL-50μg/mL银离子反应，促进银纳米种子生长，形成银纳米颗粒，并吸附到氧化石墨烯表面，原位形成拉曼增强基底；2000rpm/min-3000rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬。
（3）加入10μg/mL-20μg/mL拉曼报告分子，反应10min， 2000rpm/min-3000rpm/min离心5min，收集菌体，使用pH7.4 PBS缓冲液清洗菌体，2000rpm/min-3000rpm/min离心5min收集菌体，使用激光拉曼仪检测拉曼报告分子的拉曼增强信号，拉曼信号强度与大肠杆菌浓度成正相关性，以此实现对水中大肠杆菌的信号放大检测。
本发明利用氧化石墨烯表面的抗大肠杆菌抗体捕捉大肠杆菌，利用氧化石墨烯表面的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成过氧化氢促进银纳米种子生长，形成银纳米颗粒，吸附到氧化石墨烯表面，原位形成拉曼增强基底，利用氧化石墨烯和银纳米颗粒共同表面拉曼增强效应，实现对水中大肠杆菌的信号放大检测。该方法检测灵敏度高，特异性强，可以进行现场分析检测，实时评估水环境污染状况，对评估水环境污染程度，保障用水安全，促进经济发展起着非常重要的作用。
以下结合实施例和附图进一步说明本发明，而非限制本发明。
附图说明
图1为原位形成拉曼增强基底检测水中大肠杆菌原理图；
图2为检测不同浓度大肠杆菌拉曼信号相对强度；
图3为检测相同浓度大肠杆菌和金黄色葡萄球菌拉曼信号相对强度。
具体实施案例：
实施例1
1、大肠杆菌选择：
选取大肠杆菌O157:H7作为实施例检测目标菌。使用LB培养基培养大肠杆菌O157:H7，37℃条件下培养过夜。取1mL细菌培养液，4000rpm/min离心5min，去除培养基，然后使用pH7.4 PBS缓冲液重悬菌体，稀释菌体，最终菌体浓度为104cfu/mL、105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL以方便检测。
2、原位形成拉曼增强基底：
修饰有1μg/mL葡萄糖氧化酶和0.1μg/mL抗大肠杆菌O157:H7抗体的0.1μg/mL氧化石墨烯与大肠杆菌O157:H7结合。2000rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬。
加入0.5μg/mL银纳米种子，氧化石墨烯表面的葡萄糖氧化酶催化1μg/mL葡萄糖，生成过氧化氢；过氧化氢与10μg/mL银离子反应，促进银纳米种子生长，形成银纳米颗粒，并吸附到氧化石墨烯表面，原位形成拉曼增强基底。2000rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬。
3、加入10μg/mL的罗丹明B作为拉曼报告分子，反应10min，利用氧化石墨烯表面积大，吸附性能强的特点，罗丹明B吸附到以氧化石墨烯表面。 2000rpm/min离心5min，收集菌体，使用pH7.4 PBS缓冲液清洗菌体3次后，使用2000rpm/min离心5min收集菌体，使用激光拉曼仪检测罗丹明B的拉曼增强信号，选取1362cm-1峰为检测信号峰。拉曼信号强度与大肠杆菌浓度成正相关性，以此实现大肠杆菌检测。
实施例2
1、大肠杆菌选择：
选取大肠杆菌O157:H7作为实施例检测目标菌。使用LB培养基培养大肠杆菌O157:H7，37℃条件下培养过夜。取1mL细菌培养液，4000rpm/min离心5min，去除培养基，然后使用pH7.4 PBS缓冲液重悬菌体，稀释菌体，最终菌体浓度为104cfu/mL、105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL以方便检测。
2、原位形成拉曼增强基底：
修饰有10μg/mL葡萄糖氧化酶和20μg/mL抗大肠杆菌O157:H7抗体的1μg/mL氧化石墨烯与大肠杆菌O157:H7结合。3000rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬。
加入50μg/mL银纳米种子，氧化石墨烯表面的葡萄糖氧化酶催化50μg/mL葡萄糖，生成过氧化氢；过氧化氢与50μg/mL银离子反应，促进银纳米种子生长，形成银纳米颗粒，并吸附到氧化石墨烯表面，原位形成拉曼增强基底。3000rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬。
3、加入10μg/mL的罗丹明B作为拉曼报告分子，反应10min，利用氧化石墨烯表面积大，吸附性能强的特点，罗丹明B吸附到以氧化石墨烯表面。3000rpm/min离心5min，收集菌体，使用pH7.4 PBS缓冲液清洗菌体3次后，使用3000rpm/min离心5min收集菌体，使用激光拉曼仪检测罗丹明B的拉曼增强信号，选取1362cm-1峰为检测信号峰。拉曼信号强度与大肠杆菌浓度成正相关性，以此实现大肠杆菌检测。
实施例3
1、大肠杆菌选择：
选取大肠杆菌O157:H7作为实施例检测目标菌。使用LB培养基培养大肠杆菌O157:H7，37℃条件下培养过夜。取1mL细菌培养液，4000rpm/min离心5min，去除培养基，然后使用pH7.4 PBS缓冲液重悬菌体，稀释菌体，最终菌体浓度为104cfu/mL、105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL以方便检测。
2、原位形成拉曼增强基底：
修饰有5μg/mL葡萄糖氧化酶和10μg/mL抗大肠杆菌O157:H7抗体的0.5μg/mL氧化石墨烯与大肠杆菌O157:H7结合。2500rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬。
加入30μg/mL银纳米种子，氧化石墨烯表面的葡萄糖氧化酶催化30μg/mL葡萄糖，生成过氧化氢；过氧化氢与30μg/mL银离子反应，促进银纳米种子生长，形成银纳米颗粒，并吸附到氧化石墨烯表面，原位形成拉曼增强基底。2500rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬。
3、加入10μg/mL的罗丹明B作为拉曼报告分子，反应10min，利用氧化石墨烯表面积大，吸附性能强的特点，罗丹明B吸附到以氧化石墨烯表面。2500rpm/min离心5min，收集菌体，使用pH7.4 PBS缓冲液清洗菌体3次后，使用2500rpm/min离心5min收集菌体，使用激光拉曼仪检测罗丹明B的拉曼增强信号，选取1362cm-1峰为检测信号峰。拉曼信号强度与大肠杆菌浓度成正相关性，以此实现大肠杆菌检测(如图2)。
实施例4
1、金黄色葡萄球菌选择：
选取金黄色葡萄球菌作为实施例检测对比菌。使用LB培养基培养金黄色葡萄球菌，37℃条件下培养过夜。取1mL细菌培养液，4000rpm/min离心5min，去除培养基，然后使用pH7.4 PBS缓冲液重悬菌体，稀释菌体，最终菌体浓度为106cfu/mL以方便检测。
2、原位形成拉曼增强基底：
修饰有5μg/mL葡萄糖氧化酶和10μg/mL抗大肠杆菌抗体的0.5μg/mL氧化石墨烯与金黄色葡萄球菌结合。2500rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬。
加入30μg/mL银纳米种子，氧化石墨烯表面的葡萄糖氧化酶催化30μg/mL葡萄糖，生成过氧化氢；过氧化氢与30μg/mL银离子反应，促进银纳米种子生长，形成银纳米颗粒，并吸附到氧化石墨烯表面，原位形成拉曼增强基底。2500rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬。
3、加入10μg/mL的罗丹明B作为拉曼报告分子，反应10min，利用氧化石墨烯表面积大，吸附性能强的特点，罗丹明B吸附到以氧化石墨烯表面。2500rpm/min离心5min，收集菌体，使用pH7.4 PBS缓冲液清洗菌体3次后，使用2500rpm/min离心5min收集菌体，使用激光拉曼仪检测罗丹明B的拉曼增强信号，选取1362cm-1峰为检测信号峰，检测信号强度(如图3)。
Claims (2)
1. 一种原位形成拉曼增强基底检测水中大肠杆菌的方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）选择检测大肠杆菌：使用LB培养基培养，37℃条件下培养过夜，取细菌培养液，4000rpm/min离心5min，去除培养基，使用pH7.4 PBS缓冲液重悬菌体，稀释菌体，等待检测；
（2）原位形成拉曼增强基底：修饰有1μg/mL-10μg/mL葡萄糖氧化酶和0.1μg/mL-20μg/mL抗大肠杆菌抗体的0.1μg/mL-1μg/mL氧化石墨烯与大肠杆菌结合，2000rpm/min-3000rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬；加入0.5μg/mL-50μg/mL银纳米种子，氧化石墨烯表面的葡萄糖氧化酶催化1μg/mL-50μg/mL葡萄糖，生成过氧化氢；过氧化氢与10μg/mL-50μg/mL银离子反应，促进银纳米种子生长，形成银纳米颗粒，并吸附到氧化石墨烯表面，原位形成拉曼增强基底；2000rpm/min-3000rpm/min离心5min，收集菌体，pH7.4 PBS缓冲液重悬；
（3）加入10μg/mL-20μg/mL拉曼报告分子，反应10min， 2000rpm/min-3000rpm/min离心5min，收集菌体，使用pH7.4 PBS缓冲液清洗菌体，2000rpm/min-3000rpm/min离心5min收集菌体，使用激光拉曼仪检测拉曼报告分子的拉曼增强信号，拉曼信号强度与大肠杆菌浓度成正相关性，以此实现对水中大肠杆菌的信号放大检测。
2.根据权利1所述的方法，其特征是，所述的拉曼报告分子为罗丹明B。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410687082.1A CN104330399B (zh) | 2014-11-26 | 2014-11-26 | 一种原位形成拉曼增强基底检测水中大肠杆菌的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410687082.1A CN104330399B (zh) | 2014-11-26 | 2014-11-26 | 一种原位形成拉曼增强基底检测水中大肠杆菌的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104330399A true CN104330399A (zh) | 2015-02-04 |
| CN104330399B CN104330399B (zh) | 2017-01-25 |
Family
ID=52405169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410687082.1A Active CN104330399B (zh) | 2014-11-26 | 2014-11-26 | 一种原位形成拉曼增强基底检测水中大肠杆菌的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104330399B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106442460A (zh) * | 2016-09-05 | 2017-02-22 | 山东师范大学 | 一种金@银纳米颗粒/金字塔形硅三维拉曼增强基底及制备方法和应用 |
| CN109387500A (zh) * | 2018-09-29 | 2019-02-26 | 南京农业大学 | 一种基于磁氧化石墨烯复合金星@金-银合金纳米颗粒对大肠杆菌进行检测的方法 |
| CN110146486A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-08-20 | 西安工程大学 | 一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法 |
| CN110161012A (zh) * | 2018-06-14 | 2019-08-23 | 四川大学 | 一种基于表面增强拉曼散射-激光诱导击穿光谱联用的细菌快速检测方法 |
| CN112033949A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-12-04 | 中国农业大学 | 一种水产品腐败菌的sers生物传感器快速检测方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0818674A2 (en) * | 1996-07-11 | 1998-01-14 | Gregory P. Harhay | Spectroscopic method |
| CN102125056A (zh) * | 2011-01-10 | 2011-07-20 | 中国科学技术大学 | 一种银/石墨烯抗菌复合材料的制备方法 |
| CN103048369A (zh) * | 2013-01-18 | 2013-04-17 | 江南大学 | 一种基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的金黄色葡萄球菌无标记电化学适配体传感器 |
| CN103926235A (zh) * | 2014-05-04 | 2014-07-16 | 广东工业大学 | 一种鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法 |
| CN104068058A (zh) * | 2014-07-01 | 2014-10-01 | 南京林业大学 | 一种氧化石墨烯抑菌复合材料的制备方法 |
-
2014
- 2014-11-26 CN CN201410687082.1A patent/CN104330399B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0818674A2 (en) * | 1996-07-11 | 1998-01-14 | Gregory P. Harhay | Spectroscopic method |
| CN102125056A (zh) * | 2011-01-10 | 2011-07-20 | 中国科学技术大学 | 一种银/石墨烯抗菌复合材料的制备方法 |
| CN103048369A (zh) * | 2013-01-18 | 2013-04-17 | 江南大学 | 一种基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的金黄色葡萄球菌无标记电化学适配体传感器 |
| CN103926235A (zh) * | 2014-05-04 | 2014-07-16 | 广东工业大学 | 一种鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法 |
| CN104068058A (zh) * | 2014-07-01 | 2014-10-01 | 南京林业大学 | 一种氧化石墨烯抑菌复合材料的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 吕璞等: "表面增强拉曼散射技术鉴别大肠杆菌和志贺氏菌的研究", 《中国环境科学》 * |
| 王昶昊等: "单分散性纳米银/氧化石墨烯抗菌复合材料的制备研究", 《化学世界》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106442460A (zh) * | 2016-09-05 | 2017-02-22 | 山东师范大学 | 一种金@银纳米颗粒/金字塔形硅三维拉曼增强基底及制备方法和应用 |
| CN110161012A (zh) * | 2018-06-14 | 2019-08-23 | 四川大学 | 一种基于表面增强拉曼散射-激光诱导击穿光谱联用的细菌快速检测方法 |
| CN109387500A (zh) * | 2018-09-29 | 2019-02-26 | 南京农业大学 | 一种基于磁氧化石墨烯复合金星@金-银合金纳米颗粒对大肠杆菌进行检测的方法 |
| CN109387500B (zh) * | 2018-09-29 | 2021-01-12 | 南京农业大学 | 一种基于磁氧化石墨烯复合金星@金-银合金纳米颗粒对大肠杆菌进行检测的方法 |
| CN110146486A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-08-20 | 西安工程大学 | 一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法 |
| CN110146486B (zh) * | 2019-05-31 | 2021-11-09 | 西安工程大学 | 一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法 |
| CN112033949A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-12-04 | 中国农业大学 | 一种水产品腐败菌的sers生物传感器快速检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104330399B (zh) | 2017-01-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104330399A (zh) | 一种原位形成拉曼增强基底检测水中大肠杆菌的方法 | |
| Vizzini et al. | Electrochemical and optical biosensors for the detection of campylobacter and listeria: An update look | |
| Xie et al. | GeoChip-based analysis of the functional gene diversity and metabolic potential of microbial communities in acid mine drainage | |
| Tiao et al. | Rapid microbial response to the presence of an ancient relic in the Antarctic Dry Valleys | |
| Wang et al. | Transmutation of personal glucose meters into portable and highly sensitive microbial pathogen detection platform | |
| Mirza et al. | New arsenate reductase gene (arrA) PCR primers for diversity assessment and quantification in environmental samples | |
| Thomson et al. | Comparison of methods for processing drinking water samples for the isolation of Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare | |
| Li et al. | Iodide accumulation by aerobic bacteria isolated from subsurface sediments of a 129I-contaminated aquifer at the Savannah River Site, South Carolina | |
| Oladipo et al. | Heavy metal tolerance potential of Aspergillus strains isolated from mining sites | |
| Naderlou et al. | Enhanced sensitivity and efficiency of detection of Staphylococcus aureus based on modified magnetic nanoparticles by photometric systems | |
| Canciu et al. | Modern analytical techniques for detection of bacteria in surface and wastewaters | |
| Stortini et al. | Bio-and biomimetic receptors for electrochemical sensing of heavy metal ions | |
| Li et al. | Abundance and diversity of sulfate-reducing bacteria in high arsenic shallow aquifers | |
| CN103115903B (zh) | 一种微量四环素类抗生素的荧光检测方法 | |
| Tang et al. | A novel colorimetric sensor for Hg 2+ based on hybridization chain reaction and silver nanowire amplification | |
| Gonzalez Garza et al. | Metal-induced production of a novel bioadsorbent exopolysaccharide in a native Rhodotorula mucilaginosa from the mexican northeastern region | |
| Auld et al. | Seasonal variation in an acid mine drainage microbial community | |
| Jia et al. | Extracellular polymeric substances from a fungus are more effective than those from a bacterium in polycyclic aromatic hydrocarbon biodegradation | |
| Carraturo et al. | Evaluation of microbial communities of bottled mineral waters and preliminary traceability analysis using NGS microbial fingerprints | |
| Yan et al. | Ultrasensitive quantification of pathogens in milliliters of beverage by filtration-based digital LAMP | |
| Banihashemi et al. | Detection of viable bacterial pathogens in a drinking water source using propidium monoazide-quantitative PCR | |
| Räsänen et al. | Comparison of culture and qPCR methods in detection of mycobacteria from drinking waters | |
| Maciel et al. | Development of a novel phagomagnetic-assisted isothermal DNA amplification system for endpoint electrochemical detection of Listeria monocytogenes | |
| Hassan et al. | Ample arsenite bio-oxidation activity in Bangladesh drinking water wells: A bonanza for bioremediation? | |
| Wang et al. | Redox of fungal multicopper oxidase: a potential driving factor for the silicate mineral weathering |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201217 Address after: Room 204, No. 158, Yaozhuang Avenue, Yaozhuang Town, Jiashan County, Jiaxing City, Zhejiang Province Patentee after: Jiashan Linhu Xincheng Industrial Co.,Ltd. Address before: No. 2, Taoyuan Road, Yuhu District, Xiangtan City, Hunan Province Patentee before: Hunan University of Science and Technology |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A Method for Detecting Escherichia coli in Water Using Raman Enhanced Substrate Formed in Situ Effective date of registration: 20230313 Granted publication date: 20170125 Pledgee: Industrial and Commercial Bank of China Limited Zhejiang Yangtze River Delta integration demonstration zone sub branch Pledgor: Jiashan Linhu Xincheng Industrial Co.,Ltd. Registration number: Y2023330000516 |