CN110161012A - 一种基于表面增强拉曼散射-激光诱导击穿光谱联用的细菌快速检测方法 - Google Patents

一种基于表面增强拉曼散射-激光诱导击穿光谱联用的细菌快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种采用SERS检测细菌的样品处理方法，步骤如下：1)取待检样品，收集菌体，采用水分散，得菌液；2)在步骤1)所得菌液中，加入硝酸银，混匀后，再加入硼氢化钠，生成银纳米粒子，得细菌与银纳米粒子共存的溶胶；3)取步骤2)得到的溶胶，滴在疏水性硅片上，自然蒸发，即可。本发明还公开了一种采用SERS‑LIBS联用技术检测细菌的方法。本发明的样品处理方法可以提高拉曼光谱的重现性和稳定性，应用前景优良。

Description

一种基于表面增强拉曼散射-激光诱导击穿光谱联用的细菌 快速检测方法
技术领域
本发明属于细菌检测领域，涉及一种基于表面增强拉曼散射-激光诱导击穿光谱联用的细菌快速检测方法
背景技术
快速准确检测食物和水中的细菌对食品安全和人类健康具有至关重要的作用，目前人们已开发了大量细菌检测的方法，包括培养法，免疫检测法，分子检测法，以及光谱法等。培养法作为细菌检测的经典方法，主要依赖于微生物的生长，存在检测周期长的问题。免疫检测法如酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA)虽然具有特异性强的优点，但是所需要的单克隆抗体不易制备且易失活，其成本也较高。分子检测法如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)灵敏度和特异性较高、检测时间短，但是假阳率较高，样本通常需要预处理提取DNA或RNA、仪器和试剂成本较高等。尽管细菌检测方法多种多样，但是实现快速准确检测仍然是一个挑战。
表面增强拉曼散射光谱(Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS)，由于具有巨大的信号增强、荧光淬灭、及水相容性等优点，而且能够在数秒之内获取生物细胞的指纹光谱，因此成为细菌鉴别的理想方法。SERS主要依靠贵金属纳米结构的局域表面等离子体共振在纳米结构表面产生局部电磁场实现拉曼增强，但是这种局部电场随距离衰减，因此在采用SERS进行细菌检测时，贵金属纳米粒子(通常为银纳米粒子(AgNPs)或金纳米粒子(AuNPs))与细菌细胞间的靠近程度十分关键。研究者通常将细菌与银或金溶胶混合后再通过无机盐诱导聚集使纳米粒子与细菌细胞紧密结合，然而这种方法无法保证纳米粒子在细菌细胞上均匀分布，因此重现性和稳定性差。此外，因为SERS属于一种近场现象，拉曼增强程度受多种因素影响，因此采用SERS进行定量分析仍然具有较大难度。
激光诱导击穿光谱(Laser Induced Breakdown Spectroscopy,LIBS)是基于高功率脉冲激光与物质相互作用产生瞬态等离子体，通过分析等离子体发射光谱中原子、离子特征谱线，实现对待测物元素定性与定量分析的一种光谱技术，而目前还没有将其与SER结合用于细菌的定性定量检测。
发明内容
本发明的目的是克服SERS在细菌检测中存在的问题，提供一种基于表面增强拉曼散射-激光诱导击穿光谱联用的细菌快速检测方法。
本发明首先通过原位合成方式在菌液中制备银纳米粒子作为SERS活性物质，然后通过自然蒸发原位合成的样品，使纳米粒子在从不同空间位置向细菌细胞聚集形成三维热点并获取细菌的拉曼光谱，最后待样品干燥后采用LIBS获取细菌中矿物元素信息，并建立矿物元素原子发射光谱与细菌浓度间的定量关系，从而实现细菌的定性定量分析。
本发明采用SERS检测细菌的样品处理方法，步骤如下：
1)取待检样品，收集菌体，采用水分散，得菌液；
2)在步骤1)所得菌液中，加入硝酸银，混匀后，再加入硼氢化钠，生成银纳米粒子，得细菌与银纳米粒子共存的溶胶；
3)取步骤2)得到的溶胶，滴在疏水性硅片上，自然蒸发，即可。
步骤1)中，所述收集菌体是取待检样品，进行细菌培养，离心，取菌体。
步骤1)中，所述菌液的浓度4～6×103–107CFU/mL，优选为5×107CFU/mL。
步骤2)中，所述硝酸银的浓度为0.05～0.15mol/L，优选为0.1mol/L；所述硼氢化钠的浓度为0.1～0.3mol/L，优选为0.2mol/L。
步骤2)中，所述硝酸银与菌液的体积比为100～200:1,优选为150:1；所述硼氢化钠与菌液的体积比为100～200:1,优选为150:1。
步骤3)中，所述疏水性硅片按照如下方法制备：硅片先后在丙酮和水中超声，然后浸泡在浓H2SO4和H2O2的混合溶液中并加热至80～100℃保持20～40分钟，用水洗净后，浸泡在HF溶液中使其表面生成Si-H键，吹干，即可得到疏水性硅片。
优选地，在丙酮和水中超声的时间为10min，超声频率为40KHz；所述浓H2SO4和H2O2的比例为3:1，浓H2SO4的浓度为98％，H2O2的浓度为30％；所述加热至90℃保持30分钟；所述HF溶液的浓度为5％。
本发明还提供了一种采用SERS定性检测细菌的方法，步骤如下：
a、采用前述样品处理方法处理样品，其中，自然蒸发的时间为0～30分钟；
b、激光聚焦，采集拉曼光谱。
步骤b中，拉曼光谱的积分时间为20秒。
本发明还提供了一种样品中细菌的定量检测方法，步骤如下：
(1)取细菌，分散于水中，制成不同浓度的菌液，作为标准品；
(2)按照前述样品处理方法处理标准品，液滴完全干燥后，残留圆斑，在圆斑上采集20～50个位点，每个位点累积5发激光得到一个LIBS光谱图，然后对20～50个位点的光谱图进行平均得到LIBS光谱，建立菌液浓度与LIBS光谱的标准曲线；
(3)取待检样品，按照前述样品处理方法处理样品，液滴完全干燥后，残留圆斑，在圆斑上采集20～50个位点，每个位点累积5发激光得到一个LIBS光谱图，然后对20～50个位点的光谱图进行平均得到LIBS光谱，根据步骤(2)的标准曲线确定待检样品的菌液浓度。
所述硝酸银、硼氢化钠均为分析纯。
所述硅片为单面抛光方形硅片，P\N型均可，大小为0.8cm*0.8cm，电阻率为0.01-0.02Ω.cm。
本发明优点在于：
本发明的样品处理方法可以提高拉曼光谱的重现性和稳定性。
LIBS首次用于细菌的定量分析，可以实现细菌的快速定量分析。
SERS结合LIBS技术实现细菌快速定性定量分析。
本发明样品中细菌的定量检测方法操作简单，准确性好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为金黄色葡萄球菌五次实验所测得SERS光谱标准化处理后的结果。
图2为金黄色葡萄球菌在硅片上的LIBS光谱。
图3为大肠杆菌ATCC25922五次实验所测得SERS光谱标准化处理后的结果。
图4为大肠杆菌ATCC25922在硅片上的LIBS光谱
图5为金黄色葡萄球菌，大肠杆菌ATCC25922，大肠杆菌K12，鼠伤寒沙门氏杆菌基于SERS光谱分类结果。
图6为金黄色葡萄球菌，大肠杆菌ATCC25922基于LIBS光谱定量分析结果。
具体实施方式
实施例1本发明检测方法
LIBS-Raman联用装置的参数：用于激发拉曼散射的连续激光器为半导体泵浦全固态激光器，其输出波长为532nm，功率为50-400mW。用于LIBS的脉冲激光器为调Q式Nd:YAG激光器，其输出波长为1064nm，脉冲重复频率1-20Hz，单脉冲最大能量为100mJ。
进行拉曼测试时，激光功率通过衰减片衰减至15mW，物镜是10倍，光谱仪狭缝为25um，拉曼扫描范围500-2000cm-1，分辨率约为4-7cm-1；进行LIBS实验时，脉冲激光器的脉冲能量为30mJ,脉冲激光器重复频率为10Hz光谱仪为带ICCD的中阶梯光谱仪，延迟时间为1μs，门宽为10μs。
1)细菌培养：将已知菌株接种在25mL胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)中，于37℃振荡培养10小时，取5mL培养后的菌液在6000rpm离心5min中，并用超纯水洗涤三次，最后分散在超纯水中，测定OD600并通过平板计数确定细菌浓度。
2)疏水基底制备：本发明采用硅片作为基底负载样品进行SERS及LIBS检测，为防止样品扩散导致信号强度减弱，需事先对硅片进行疏水化处理，即将硅片先后在丙酮和水中超声(40KHz)10分钟，然后浸泡在浓H2SO4(98％)和H2O2(30％)体积比为3:1的混合溶液中并加热90℃保持30分钟，用去离子水洗净后，浸泡在5％HF溶液中30分钟使其表面生成Si-H键，最后氮气吹干即可得到疏水性硅片。
3)细菌原位合成AgNPs：取1mL步骤1)分散在超纯水中的细菌(菌液的浓度为5×107CFU/mL)于1.5mL离心管中，加入10μL 0.1mol/L硝酸银(0.1M)，涡旋混匀静止10分钟后，加入10μL 0.2mol/L硼氢化钠，翻转离心管在细菌菌液原位生成AgNPs。
4)SERS及LIBS检测：取5-10μL步骤3)中原位合成AgNPs的样品，滴在步骤2)所制备的疏水性硅片上形成液滴，AgNPs在自然蒸发条件下及毛细力驱动下从液滴空间不同方位向细菌细胞壁靠近而形成三维热点，当液滴自然蒸发15-30分钟至一定体积后，将激光聚焦至硅片表面并集中在液滴顶点，设置积分时间为20秒，采集细菌的拉曼光谱。当液滴完全干燥后残留直径为2-4mm的圆斑，在圆斑上采集20～50个位点，每个位点累积5发激光得到一个LIBS光谱图，然后对20～50个位点的光谱图进行平均得到细菌的LIBS光谱。
实施例2本发明定性检测细菌
1)细菌培养：将未知菌株接种在25mL胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)中，于37℃振荡培养10小时，取5mL培养后的菌液在6000rpm离心5min中，并用超纯水洗涤三次，最后分散在超纯水中，测定OD600并通过平板计数确定细菌浓度。
2)疏水基底制备：本发明采用硅片作为基底负载样品进行SERS及LIBS检测，为防止样品扩散导致信号强度减弱，需事先对硅片进行疏水化处理，即将硅片先后在丙酮和水中超声(40KHz)10分钟，然后浸泡在浓H2SO4(98％)和H2O2(30％)体积比为3:1的混合溶液中并加热90℃保持30分钟，用去离子水洗净后，浸泡在5％HF溶液中30分钟使其表面生成Si-H键，最后氮气吹干即可得到疏水性硅片。
3)细菌原位合成AgNPs：取1mL步骤1)分散在超纯水中的细菌(菌液的浓度为5×107CFU/mL)于1.5mL离心管中，加入10μL 0.1mol/L硝酸银(0.1M)，涡旋混匀静止10分钟后，加入10μL 0.2mol/L硼氢化钠，翻转离心管在细菌菌液原位生成AgNPs。
4)SERS及LIBS检测：取5-10μL步骤3)中原位合成AgNPs的样品，滴在步骤2)所制备的疏水性硅片上形成液滴，AgNPs在自然蒸发条件下及毛细力驱动下从液滴空间不同方位向细菌细胞壁靠近而形成三维热点，当液滴自然蒸发15-30分钟至一定体积后，将激光聚焦至硅片表面并集中在液滴顶点，设置积分时间为20秒，采集细菌的拉曼光谱。当液滴完全干燥后残留直径为2-4mm的圆斑，在圆斑上采集20～50个位点，每个位点累积5发激光得到一个LIBS光谱图，然后对20～50个位点的光谱图进行平均得到细菌的LIBS光谱。将细菌的LIBS光谱与已知细菌的LIBS光谱比对，确定待检细菌的种类。
实施例3本发明定量检测细菌
(1)取一定体积浓度已知菌液，分散于超纯水中，制成浓度为5×10～5×107CFU/mL的菌液，作为标准品；
(2)取0.8cm*0.8cm的硅片，先后采用丙酮和水超声洗涤10分钟，然后浸泡在浓H2SO4(98％)和H2O2(30％)体积比为3:1的混合溶液中并加热90℃保持30分钟，用去离子水洗净后，浸泡在5％HF溶液中30分钟使其表面生成Si-H键，最后氮气吹干得到疏水性硅片。
(3)细菌原位合成AgNPs：取1mL标准品于1.5mL离心管中，加入10μL 0.1mol/L硝酸银，涡旋混匀静止10分钟后，加入10μL 0.2mol/L硼氢化钠，翻转离心管在细菌菌液原位生成AgNPs。
(4)SERS及LIBS检测：取5-10μL步骤3)中原位合成AgNPs的样品，滴在步骤(2)所制备的疏水性硅片上形成液滴，AgNPs在自然蒸发条件下及毛细力驱动下从液滴空间不同方位向细菌细胞壁靠近而形成三维热点，当液滴自然蒸发15-30分钟至一定体积后，将激光聚焦至硅片表面并集中在液滴顶点，设置积分时间为20秒，采集细菌的拉曼光谱。当液滴完全干燥后残留直径为2-4mm的圆斑，在圆斑上采集20～50个位点，每个位点累积5发激光得到一个LIBS光谱图，然后对20～50个位点的光谱图进行平均得到细菌的LIBS光谱，建立菌液浓度与LIBS光谱的标准曲线；
(5)取待测样品饮用水1mL，按照步骤(3)原位合成AgNPs，取5-10μL原位合成AgNPs的样品，滴在步骤(2)所制备的疏水性硅片上形成液滴，AgNPs在自然蒸发条件下及毛细力驱动下从液滴空间不同方位向细菌细胞壁靠近而形成三维热点，当液滴自然蒸发15-30分钟至一定体积后，将激光聚焦至硅片表面并集中在液滴顶点，设置积分时间为20秒，采集细菌的拉曼光谱。当液滴完全干燥后残留直径为2-4mm的圆斑，在圆斑上采集20～50个位点，每个位点累积5发激光得到一个LIBS光谱图，然后对20～50个位点的光谱图进行平均得到细菌的LIBS光谱，再根据步骤(2)的标准曲线计算待检样品的细菌浓度。
待检样品加水分散后的菌体浓度经计算后在4～6×103–107CFU/mL范围之外，需重新取样，调整加水量，使按照步骤(5)得到的菌液浓度在4～6×103–107CFU/mL范围之内。
以下通过实验例的方式进一步说明本发明的有效性：
实验例1：以金黄色葡萄球菌为例
1)取10μL金黄色葡萄球菌冻存液，加至25mL TSB培养基中，于37℃振荡培养10小时，取5mL培养后的菌液在6000rpm离心5min中，并用超纯水洗涤三次，最后分散在超纯水中，测定OD600并通过平板计数确定细菌浓度。
2)取0.8cm*0.8cm的硅片，先后采用丙酮和水超声洗涤10分钟，然后浸泡在浓H2SO4(98％)和H2O2(30％)体积比为3:1的混合溶液中并加热90℃保持30分钟，用去离子水洗净后，浸泡在5％HF溶液中30分钟使其表面生成Si-H键，最后氮气吹干得到疏水性硅片。
3)取1mL步骤1)中分散在超纯水中的金黄色葡萄球菌于1.5mL离心管中，加入10μL0.1mol/L硝酸银，涡旋混匀静止10分钟后，加入10μL 0.2mol/L硼氢化钠，翻转离心管在细菌菌液原位生成AgNPs。
4)取5μL步骤3)中原位合成AgNPs的样品，滴在步骤2)所制备的疏水性硅片上形成液滴，当液滴自然蒸发15-30分钟至一定体积后(剩余体积约为原体积的1/3)，将激光聚焦至硅片表面并集中在液滴定点，设置积分时间为20秒，采集细菌的拉曼光谱，重复5次实验将得到拉曼光谱进行标准化，得到金黄色葡萄球菌的SERS光谱(见图1)。
当液滴完全干燥后残留直径为3mm的圆斑，在圆斑上采集20个位点，每个位点累积5发激光得到一个LIBS光谱图，然后对20个位点的光谱图进行平均得到金黄色葡萄球菌的LIBS光谱(见图2)。
从图1和图2可见：通过金黄色葡萄球菌的SERS光谱和LIBA光谱，可以以其为标准定性检测金黄色葡萄球菌。
实验例2：以大肠杆菌ATCC25922为例
1)取10μL大肠杆菌ATCC25922冻存液，加至25mL TSB培养基中，于37℃振荡培养10小时，取5mL培养后的菌液在6000rpm离心5min中，并用超纯水洗涤三次，最后分散在超纯水中，测定OD600并通过平板计数确定细菌浓度。
2)取0.8cm*0.8cm的硅片，先后采用丙酮和水超声洗涤10分钟，然后浸泡在浓H2SO4(98％)和H2O2(30％)体积比为3:1的混合溶液中并加热90℃保持30分钟，用去离子水洗净后，浸泡在5％HF溶液中30分钟使其表面生成Si-H键，最后氮气吹干得到疏水性硅片。
3)取1mL步骤1中分散在超纯水中的大肠杆菌ATCC25922于1.5mL离心管中，加入10μL 0.1mol/L硝酸银，涡旋混匀静止10分钟后，加入10μL 0.2mol/L硼氢化钠，翻转离心管在细菌菌液原位生成AgNPs。
4)取5μL步骤3)中原位合成AgNPs的样品，滴在步骤2)所制备的疏水性硅片上形成液滴，当液滴自然蒸发15-30分钟至一定体积后(剩余体积约为原体积的1/3)，将激光聚焦至硅片表面并集中在液滴定点，设置积分时间为20秒，采集细菌的拉曼光谱(见图3)。当液滴完全干燥后残留直径为3mm的圆斑，在圆斑上采集20个位点，每个位点累积5发激光得到一个LIBS光谱图，然后对20个位点的光谱图进行平均得到大肠杆菌ATCC25922的LIBS光谱(见图4)。
从图3和图4可见：通过大肠杆菌的SERS光谱和LIBA光谱，可以以其为标准定性检测大肠杆菌。
实验例3以金黄色葡萄球菌，大肠杆菌ATCC25922，大肠杆菌K12，鼠伤寒沙门氏杆菌为例
1)分别取10μL金黄色葡萄球菌，大肠杆菌ATCC25922，大肠杆菌K12，鼠伤寒沙门氏杆菌冻存液，加至25mL TSB培养基中，于37℃振荡培养10小时，取5mL培养后的菌液在6000rpm离心5min中，并用超纯水洗涤三次，最后分散在超纯水中，测定OD600并通过平板计数确定细菌浓度。
2)取0.8cm*0.8cm的硅片，先后采用丙酮和水超声洗涤10分钟，然后浸泡在浓H2SO4(98％)和H2O2(30％)体积比为3:1的混合溶液中并加热90℃保持30分钟，用去离子水洗净后，浸泡在5％HF溶液中30分钟使其表面生成Si-H键，最后氮气吹干得到疏水性硅片。
3)取一定体积步骤1)中分散在超纯水中的菌液于1.5mL离心管中，用超纯水稀释为1mL，使其浓度为5×10～5×107CFU/mL，然后加入10μL 0.1mol/L硝酸银，涡旋混匀静止10分钟后，加入10μL 0.2mol/L硼氢化钠，翻转离心管在细菌菌液原位生成AgNPs。
4)取5μL步骤3)中原位合成AgNPs，浓度为5×107CFU/mL的样品，滴在步骤2)所制备的疏水性硅片上形成液滴，将激光聚焦至硅片表面并集中在液滴定点，设置积分时间为20秒，采集细菌的拉曼光谱，当液滴完全干燥后，记录细菌的LIBS光谱。将所得到的细菌拉曼光谱进行标准化后，采用主成分分析(PCA)对不同菌株进行分类(见图5)；取5μL步骤3)中原位合成AgNPs，浓度为5×10～5×107CFU/mL的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌ATCC25922，滴在步骤2)所制备的疏水性硅片上形成液滴，待液滴完全干燥后进行LIBS定量分析，以镁元素在279.55nm发射谱线的峰面积与细菌浓度建立对应关系(见图6)。
从图5和图6可见：本发明方法不仅可以对不同细菌进行分类鉴定，还可以定量检测。
实验例4细菌定量检测验证
(1)取一定体积浓度已知菌液，分散于超纯水中，制成浓度为5×10～5×107CFU/mL的菌液，作为标准品；
(2)取0.8cm*0.8cm的硅片，先后采用丙酮和水超声洗涤10分钟，然后浸泡在浓H2SO4(98％)和H2O2(30％)体积比为3:1的混合溶液中并加热90℃保持30分钟，用去离子水洗净后，浸泡在5％HF溶液中30分钟使其表面生成Si-H键，最后氮气吹干得到疏水性硅片。
(3)细菌原位合成AgNPs：取1mL标准品于1.5mL离心管中，加入10μL 0.1mol/L硝酸银，涡旋混匀静止10分钟后，加入10μL 0.2mol/L硼氢化钠，翻转离心管在细菌菌液原位生成AgNPs。
(4)SERS及LIBS检测：取5-10μL步骤3)中原位合成AgNPs的样品，滴在步骤(2)所制备的疏水性硅片上形成液滴，AgNPs在自然蒸发条件下及毛细力驱动下从液滴空间不同方位向细菌细胞壁靠近而形成三维热点，当液滴自然蒸发15-30分钟至一定体积后，将激光聚焦至硅片表面并集中在液滴顶点，设置积分时间为20秒，采集细菌的拉曼光谱。当液滴完全干燥后残留直径为2-4mm的圆斑，在圆斑上采集20～50个位点，每个位点累积5发激光得到一个LIBS光谱图，然后对20～50个位点的光谱图进行平均得到细菌的LIBS光谱，建立菌液浓度与LIBS光谱的标准曲线；
(5)用0.22μm微孔滤膜过滤一定体积的待测样品湖水、自来水和饮用水，分别加入浓度已知的菌液，制成浓度为0～1×107CFU/mL的加标待测液。
(6)将步骤(5)加标待测液按照步骤(3)原位合成AgNPs，取5-10μL原位合成AgNPs的样品，滴在步骤(2)所制备的疏水性硅片上形成液滴，AgNPs在自然蒸发条件下及毛细力驱动下从液滴空间不同方位向细菌细胞壁靠近而形成三维热点，当液滴自然蒸发15-30分钟至一定体积后，将激光聚焦至硅片表面并集中在液滴顶点，设置积分时间为20秒，采集细菌的拉曼光谱。当液滴完全干燥后残留直径为2-4mm的圆斑，在圆斑上采集20～50个位点，每个位点累积5发激光得到一个LIBS光谱图，然后对20～50个位点的光谱图进行平均得到细菌的LIBS光谱，再根据步骤(2)的标准曲线确定加标待测液的菌液浓度，结果见表1。
表1实际水样分析结果
从表1可见，不同水源对细菌的SERS鉴定没有影响，LIBS定量检测准确度在81.0-101.7％。本发明可以用于细菌定量检测。
综上，本发明将SERS与LIBS相结合，提高了拉曼光谱的重现性和稳定性，实现了细菌的快速的定性定量分析。本发明样品中细菌的定量检测方法操作简单，准确性好。

Claims (10)

1.一种采用SERS检测细菌的样品处理方法，其特征在于：步骤如下：
1)取待检样品，收集菌体，用水分散，得菌液；
2)在步骤1)所得菌液中，加入硝酸银，混匀后，再加入硼氢化钠，生成银纳米粒子，得细菌与银纳米粒子共存的溶胶；
3)取步骤2)得到的溶胶，滴在疏水性硅片上，自然蒸发，即可。
2.根据权利要求1所述的样品处理方法，其特征在于：步骤1)中，所述收集菌体是取待检样品，进行细菌培养，离心，取菌体。
3.根据权利要求1所述的样品处理方法，其特征在于：步骤1)中，所述菌液浓度4～6×103–107CFU/mL，优选为5×107CFU/mL。
4.根据权利要求1所述的样品处理方法，其特征在于：步骤2)中，所述硝酸银的浓度为0.05～0.15mol/L，优选为0.1mol/L；所述硼氢化钠的浓度为0.1～0.3mol/L，优选为0.2mol/L。
5.根据权利要求1所述的样品处理方法，其特征在于：步骤2)中，所述硝酸银与菌液的体积比为100～200:1,优选为150:1；所述硼氢化钠与菌液的体积比为100～200:1,优选为150:1。
6.根据权利要求1所述的样品处理方法，其特征在于：步骤3)中，所述疏水性硅片按照如下方法制备：硅片先后在丙酮和水中超声，然后浸泡在浓H2SO4和H2O2的混合溶液中并加热至80～100℃保持20～40分钟，用水洗净后，浸泡在HF溶液中使其表面生成Si-H键，吹干，即可得到疏水性硅片。
7.根据权利要求6所述的样品处理方法，其特征在于：在丙酮和水中超声的时间为10min，超声频率为40KHz；所述浓H2SO4和H2O2的比例为3:1，浓H2SO4的浓度为98％，H2O2的浓度为30％；所述加热至90℃保持30分钟；所述HF溶液的浓度为5％。
8.一种采用SERS定性检测细菌的方法，其特征在于：步骤如下：
a、采用权利要求1～7任意一项所述方法处理样品，其中，自然蒸发的时间为0～30分钟；
b、激光聚焦，采集拉曼光谱。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤b中，拉曼光谱的积分时间为20秒。
10.一种样品中细菌的定量检测方法，其特征在于：步骤如下：
(1)取细菌，分散于水中，制成不同浓度的菌液，作为标准品；
(2)按照权利要求1、4～7任意一项所述方法处理标准品，液滴完全干燥后，残留圆斑，在圆斑上采集20～50个位点，每个位点累积5发激光得到一个LIBS光谱图，然后对20～50个位点的光谱图进行平均得到LIBS光谱，建立菌液浓度与LIBS光谱的标准曲线；
(3)取待检样品，按照权利要求1、4～7任意一项所述方法处理样品，液滴完全干燥后，残留圆斑，在圆斑上采集20～50个位点，每个位点累积5发激光得到一个LIBS光谱图，然后对20～50个位点的光谱图进行平均得到LIBS光谱，根据步骤(2)的标准曲线确定待检样品的菌液浓度。
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