CN113092395A

CN113092395A - 一种基于咖啡环的细胞快速分类与定量方法

Info

Publication number: CN113092395A
Application number: CN202110354351.2A
Authority: CN
Inventors: 林庆宇; 殷鹏鲲; 康梦珂; 段忆翔
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2021-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2021-07-09

Abstract

本发明公开了一种基于咖啡环的细胞快速分类与定量方法，属于细胞检测领域。本发明关键在于提供了一种细胞悬液咖啡环的LIBS信号采集方法，该方法主要通过是将细胞悬液滴加于单晶硅片，自然干燥，形成咖啡环后，对咖啡环区域内细胞内源性特征元素的进行LIBS信号采集。本发明还提供了一种构建细胞特征性环形印记指纹元素图谱库的方法，以及对应的细胞特征性环形印记指纹元素图谱库。本发明还提供了一种细胞分类方法，它利用样本环形印记指纹元素图谱与前述图谱库的比对，实现细胞分类。本发明还基于细胞悬液咖啡环的LIBS信号采集方法提供了一种细胞定量方法，该方法基于LIBS信号中谱线强度值与细胞浓度间的线性关系，实现定量。

Description

一种基于咖啡环的细胞快速分类与定量方法

技术领域

本发明属于细胞检测领域。

背景技术

细胞的分类和定量，在现代医学检测中应用十分普遍。

细胞分类方法主要包括染色镜检法、流式细胞术、VCS联合检测技术等。其中染色镜检法是利用细胞对酸碱性染料的亲和力或细胞内过氧化物酶活性来对用特定染料进行染色后，在显微镜下区分的方法，该方法仅对某些特定细胞(例如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞)有用，无法对绝大多数细胞进行分类。流式细胞术需对细胞进行荧光抗体的标识，通过流式细胞仪检测带特定荧光的细胞，其无法检测痕量样本，试剂成本较高。VCS联合检测技术是联合使用电阻抗检测细胞体积，电导射频法检测细胞内核，激光散射法检测细胞颗粒特性，其使用较为繁琐。

细胞定量方法主要包括血球计数板计数、电阻抗法、流式细胞术等。血球计数板需要人工计数，效率低下，而电阻抗法和流式细胞术需要的样本量较大，在面临微量样品检测时有一定的难度。

激光诱导击穿光谱(laser-induced breakdown spectroscopy，LIBS)技术是一种用于分析物质所含元素及其含量的光谱学技术，当一束高能脉冲激光聚焦到检测对象上时，会在极短时间内产生高温、高密度的等离子体，冷却时于激发态的原子跃迁会基态发出特定元素的原子谱线，用光谱仪直接收集样品表面等离子体产生的发射谱线信号，在计算机上记录得到特征光谱，可根据发射光谱的强度进行分析。LIBS技术以其快速、痕量、几乎不受样本相态以及元素种类限制等独特优势在多领域都有着广泛的应用。

目前未见将LIBS技术用于细胞分类的应用，但LIBS可用于微量样品中的细胞定量。不过，LIBS技术在进行细胞定量时容易受到咖啡环效应的影响。

咖啡环效应，是指当一滴咖啡(或其他有色液体)滴到平面上后，经过干燥形成印记，印记颜色是不均匀的，边缘部分要比中间更深一些，形成环状斑的现象；所形成的环状斑，即为咖啡环。咖啡环效应的原因是由于液滴边缘的蒸发速率超过中心的蒸发的速率，使液滴中的粒子由中心向周围边缘扩散，颗粒物沉积在固液接触面的边沿。

为了克服咖啡环效应的影响，CN 110927143 A公开了将LIBS检测的样品富集到环形槽中，可以大大降低咖啡环效应造成的富集不均匀问题，但这样的样品载体成本较高。有的检测在采样时避开咖啡环区域，只选择中间相对均匀但细胞数量稀少的区域，但这样做的信噪比很低。

发明内容

本发明要解决的问题是：克服技术偏见，不规避咖啡环，反而利用咖啡环进行LIBS信号采集，进而构建细胞特征性环形印记指纹元素图谱库，得出基于咖啡环的细胞分类与定量方法。

本发明解决技术问题的技术方案具体如下：

一种细胞悬液咖啡环的LIBS信号采集方法，包括如下步骤：

1)用缓冲液洗涤待检细胞2次以上后重悬，得细胞悬液；

2)将细胞悬液滴加于单晶硅片，自然干燥，形成咖啡环；

3)对咖啡环区域内细胞内源性特征元素的进行LIBS信号采集。

进一步地，步骤2)所述单晶硅片经如下方法处理：

(1)依次使用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗5～20min；

(2)用水虎鱼溶液浸泡5～20min；

(3)水清洗2～5次；

(4)将硅片浸泡于3％～8％体积比的氢氟酸中1～10min；

优选地，步骤(1)的清洗时间为10min；

和/或，步骤(2)的浸泡时间为10min；

和/或，步骤(3)清洗3次；

和/或，步骤(4)的氢氟酸浓度为5％体积比；

和/或，步骤(4)的浸泡时间3min。

进一步地，所述细胞内源性特征元素为Ca、Mg或K。

一种细胞特征性环形印记指纹元素图谱库的建立方法，所述方法包括如下步骤：

I.使用前述信号采集方法进行细胞悬液咖啡环的LIBS信号采集；

II.根据LIBS信号中细胞内源性特征元素的谱线强度值绘制特征元素的平面分布热图(heat map)，即环形印记指纹元素图谱；

III.对细胞名称和环形印记指纹元素图谱建立一一对应关系的数据库，即得到细胞特征性环形印记指纹元素图谱库。

前述方法所建立得到的细胞特征性环形印记指纹元素图谱库。

一种细胞快速分类方法，所述方法包括如下步骤：

a.使用前述方法的步骤I和II获得细胞样品的环形印记指纹元素图谱；

b.通过机器学习模型，将步骤a的环形印记指纹元素图谱与权利要求5所述细胞特征性环形印记指纹元素图谱库进行比对。

一种细胞快速定量方法，包括如下步骤：

A、使用前述方法对细胞悬液咖啡环的LIBS信号采集方法进行LIBS信号采集；所述细胞悬液包括浓度已知的细胞标准品和浓度未知的细胞样品；

B、将所采集LIBS信号中细胞内源性特征元素的谱线强度值进行累加；

C、将标准品浓度与对应谱线强度值进行线性拟合，得出标准曲线；并将样品对应谱线强度值代入标准曲线，得到样品内细胞浓度。

一种基于咖啡环的细胞辅助分类系统，所述系统包括：

模块A：咖啡环区域LIBS信号采集模块，负责对细胞悬液液滴干燥后形成的咖啡环区域内细胞内源性特征元素的进行LIBS信号采集，得到环形印记指纹元素图谱；

模块B：细胞特征性环形印记指纹元素图谱库，储存着不同标准细胞株的悬液液滴干燥后形成的咖啡环区域的环形印记指纹元素图谱；

模块C：细胞分类模块，内置具有图片比对功能的机器学习模型，可调取模块B中与模块A当前所得环形印记指纹元素图谱最为接近的1～5张环形印记指纹元素图谱，并输出其在模块B中对应的标准细胞株名称。

进一步地，所述细胞内源性特征元素为Ca、Mg或K；优选地，所述细胞内源性特征元素为Ca。

一种基于咖啡环的细胞定量系统，所述系统包括：

模块A’：咖啡环区域LIBS信号采集模块，负责对不同浓度细胞悬液液滴干燥后形成的咖啡环区域内细胞内源性特征元素的进行LIBS信号采集，累加咖啡环上细胞内源性特征元素的谱线强度值；所述细胞悬液包括浓度已知的细胞标准品和浓度未知的细胞样品；

模块B’：定量模块，负责将模块A’中所得标准品浓度与对应谱线强度值进行线性拟合，得出标准曲线；并将样品对应谱线强度值代入标准曲线，得到样品内细胞浓度。

进一步地，所述细胞内源性特征元素为Ca、Mg或K；优选地，所述细胞内源性特征元素为Mg。

本发明的有益效果：

本发明的LIBS信号采集方法克服了技术偏见，不规避咖啡环，反其道而行之，使液滴形成咖啡环，针对咖啡环区域进行LIBS信号采集，为细胞分类和定量定下基础。

实验发现，针对不同细胞形成的咖啡环进行LIBS信号采集，可得到不同的环形印记指纹元素图谱。根据该发现，本发明提供了细胞特征性环形印记指纹元素图谱库的建立方法，该方法得到的细胞特征性环形印记指纹元素图谱库可用于比对识别细胞类型，实现细胞快速分类。

本发明的细胞快速分类方法，该方法不需要染料或荧光标记抗体，对样品的需求量少，仅需一滴即可完成细胞分类。实验证明，该方法能区分液滴中的正常细胞和癌细胞，以及不同种类的癌细胞。

本发明的细胞定量方法借助咖啡环对细胞的富集，对咖啡环区域进行LIBS采样，累加咖啡环上细胞内源性特征元素的谱线强度值，建立谱线强度值与细胞浓度的线性关系，可实现细胞浓度的精准定量。该线性相关性相比任意取样对应的线性相关性更高，定量更加精准；且咖啡环区域细胞明显更为密集，可提高检测的信噪比。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：细胞分类示意图。

图2：细胞快速定量分析示意图。

图3：技术路线图。LIBS mapping，即基于LIBS对二维平面进行元素信号采集。

图4：细胞样本干燥形成咖啡环的过程。

图5：肿瘤细胞和正常细胞的Ca元素印记指纹图谱比较。其中WRL-68为健康人的肝细胞系，Huh-7为肝癌细胞系，A549为人非小细胞肺癌细胞系。

图6：特征谱线强度与细胞浓度的线性拟合。

具体实施方式

实施例1本发明的细胞快速检测方法

本发明的细胞快速检测方法，包括如下步骤：

1.硅片基底的制备

将8×8mm单晶硅片依次使用丙酮，乙醇和超纯水超声清洗10min，然后用水虎鱼用溶液(即食人鱼洗液)浸泡10min，再用超纯水清洗3次。之后将硅片浸泡在氢氟酸(5％体积比)中3min完成基底的处理，此时硅片表面清洁且具有一定疏水性。

2.细胞悬液的制备

将培养至对数期的细胞用胰酶消化后得到细胞悬液，以1200r/min离心3min得到细胞沉淀，使用缓冲液将细胞重复洗涤2次后重悬，以消除外源Ca、Mg和K的干扰。

3.细胞印记LIBS成像分析

将细胞悬液滴加于硅片基底，自然干燥；由于咖啡环效应的存在，不同种类的细胞由于细胞的形状，大小以及和与基底相互作用不同干燥后会在基底上形成形状及宽度不同的咖啡环，从而产生其独特的“印记指纹图谱”。

3.1对细胞分类

使用LIBS对细胞印记区域进行平面成像分析，对钙、镁和钾等细胞内源性特征元素信号进行采集，可得到咖啡环上的环形印记指纹元素图谱，通过图像比对的机器学习(包括深度学习)算法，可训练出依据环形印记指纹元素图谱识别不同细胞的机器学习模型，进而实现细胞分类。对于区别较大的细胞，例如癌细胞和正常细胞，还能直接通过分辨咖啡环是否弥散，进行辨识：癌细胞形成咖啡环清晰凝实，咖啡环上钙、镁和钾元素信号强；正常细胞咖啡环模糊弥散，咖啡环上钙、镁和钾元素信号弱。

分析流程如图1所示，其中前3步为样品处理，第4步为样品在LIBS成像图，图中信号点为特征元素的信号，可清楚辨别环形印记指纹元素图谱。

3.2对细胞的快速定量

在LIBS采样时，使用旋转位移台使基底旋转，通过对能量，频率，累加次数与延迟的组合与优化，可在一次采样过程中沿环形路径(扫描咖啡环区域)，采集细胞内源性特征元素的谱线信号，将咖啡环上细胞内源性特征元素的谱线强度值进行累加(累加次数根据咖啡环的范围来确定，以完全覆盖咖啡环区域为准)得到细胞内源性特征元素的谱线强度数据(图2)，再通过与细胞悬液标准品浓度进行线性拟合，得到标准曲线，进而实现样品中细胞浓度的定量分析。该方法采集的信号来自细胞分布相对密集的咖啡环区域，能保证信号强度，信噪比高。

本发明分类和定量方法的技术路线图如图3所示。

实验例1对几种细胞的快速分类

1.方法

分别对人正常体细胞和癌细胞进行区分，人正常体细胞为WRL-68人肝细胞系，癌细胞包括Huh-7肝癌细胞系和A549人非小细胞肺癌细胞系。在相同(10⁶cells/mL)的浓度下，取4μL细胞悬液滴到硅片分析基底上，自然干燥后得到细胞在基底上分布的独特指纹图谱(样本干燥形成咖啡环的过程如图4所示，指纹图谱如图5所示)。将硅片基底固定于LIBS检测仪器的载物台上待进一步分析。分别对激光能量，累加次数，延迟时间参数进行条件优化。在40％能量，4次累加，1.5μs延迟时间的最佳测试条件进行光谱采集。在10Hz的激光频率下，采集光谱。扫描速度16min/cm²，单个样本分析时间为6min。进行3次重复实验验证稳定性。以Ca元素为例，提取393.4nm处特征谱线强度绘制分布热图，得到该种细胞的环形印记指纹元素图谱。

2.结果

如图5所示，A549细胞的环形印记指纹元素图谱的环形宽度窄而暗，Huh-7细胞的环形印记指纹元素图谱的环形窄而亮；两种肿瘤细胞的环形区域十分凝实。WRL-68的环形印记指纹元素图谱的环形宽而暗，环形区域松散。

可见，对于上述三种细胞可直接进行人工辨别。据此可预期，通过机器学习算法训练，能够显著提高不同细胞的辨识度，进行多种细胞的分类辨别。

本发明的方法可以实现细胞的快速分类，且免去了常规分类方法所使用的抗体标记。

实验例2细胞浓度和咖啡环上细胞内源性特征元素含量的线性关系

1.方法

取对数生长的A549人非小细胞肺癌细胞，得到浓度为10³-10⁷cells/mL细胞悬液。分别取4μL细胞悬液滴到硅片分析基底上，自然干燥，固定在环形旋转位移台上，沿着环形路径扫描咖啡环区域，采集细胞内源性特征元素的谱线信号，累加细胞内源性特征元素的谱线强度值。分别对激光能量，累加次数，延迟时间参数进行条件优化。在40％能量，100次累加，1.5μs延迟时间的最佳测试条件进行谱线采集以及累加。单个样本分析时间为1min。提取Mg 285.2nm处特征谱线强度与细胞浓度建立对应关系。

2.结果

如图6所示，在细胞浓度10³-10⁷cells/mL的范围内，对特征谱线强度与细胞浓度的关系做线性拟合，发现残差平方和与回归平方和之比R²＝0.9936。体现出良好的线性关系。

相比之下，公开号为CN 110161012 A的专利申请无差别地(而不是选择咖啡环区域)在细菌悬液液滴形成的圆斑上进行LIBS采样，两种菌的浓度和特征谱线强度做线性拟合得到的R²分别为0.973或0.986，其线性相关性不如本发明。该结果说明，本发明对细胞悬液所形成咖啡环进行细胞内源元素的LIBS定量对细胞进行定量的准确度很高。

综上，本发明的细胞分类方法无需标记抗体，可实现细胞的快速分类；本发明的细胞定量方法可实现较高的信噪比，且准确度高。

Claims

1.一种细胞悬液咖啡环的LIBS信号采集方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)用缓冲液洗涤待检细胞2次以上后重悬，得细胞悬液；

2)将细胞悬液滴加于单晶硅片，自然干燥，形成咖啡环；

3)对咖啡环区域内细胞内源性特征元素的进行LIBS信号采集。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述单晶硅片经如下方法处理：

(1)依次使用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗5～20min；

(2)用水虎鱼溶液浸泡5～20min；

(3)水清洗2～5次；

(4)将硅片浸泡于3％～8％体积比的氢氟酸中1～10min；

优选地，步骤(1)的清洗时间为10min；

和/或，步骤(2)的浸泡时间为10min；

和/或，步骤(3)清洗3次；

和/或，步骤(4)的氢氟酸浓度为5％体积比；

和/或，步骤(4)的浸泡时间3min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞内源性特征元素为Ca、Mg或K。

4.一种细胞特征性环形印记指纹元素图谱库的建立方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

I.使用权利要求1～3任一所述方法进行细胞悬液咖啡环的LIBS信号采集；

II.根据LIBS信号中细胞内源性特征元素的谱线强度值绘制特征元素的平面分布热图，即环形印记指纹元素图谱；

5.权利要求4所述方法所建立得到的细胞特征性环形印记指纹元素图谱库。

6.一种细胞快速分类方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

a.使用权利要求4所述方法的步骤I和II获得细胞样品的环形印记指纹元素图谱；

7.一种细胞快速定量方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

A、使用权利要求1所述方法对细胞悬液咖啡环的LIBS信号采集方法进行LIBS信号采集；所述细胞悬液包括浓度已知的细胞标准品和浓度未知的细胞样品；

8.一种基于咖啡环的细胞辅助分类系统，其特征在于：所述系统包括：

9.如权利要求8所述的细胞分类系统，其特征在于：所述细胞内源性特征元素为Ca、Mg或K；优选地，所述细胞内源性特征元素为Ca。

10.一种基于咖啡环的细胞定量系统，其特征在于：所述系统包括：

11.如权利要求10所述的细胞定量系统，其特征在于：所述细胞内源性特征元素为Ca、Mg或K；优选地，所述细胞内源性特征元素为Mg。