JP2003524177A

JP2003524177A - 選別及び診断のための細胞に基づく高処理量検定の方法及び装置

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Publication number: JP2003524177A
Application number: JP2001562163A
Authority: JP
Inventors: ジョンキャセルズ; ポールマーティン; ダーリンディズリー
Original assignee: ザテクノロジーパートナーシップパブリックリミテッドカンパニー
Priority date: 2000-02-25
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2003-08-12
Also published as: US20030100024A1; WO2001063245A3; EP1257804A2; WO2001063245A2; GB0004529D0; AU3396401A

Abstract

(57)【要約】生きている又は死んでいる細胞の形態の変化又は細胞内事象を検出して定量化する検定を実行する方法。本方法は、細胞を単一サンプル又はサンプルアレーで解析用表面上に提示する段階、及び、細胞上又は細胞内部に包含された細胞構造と取り込まれた又は付随した粒子又は分子とに対して蛍光を発するように標識を付ける手段を設ける段階を含む。細胞は、細胞を照らして細胞上又は細胞内で蛍光を励起させるために検出システムを用いて走査され、少なくとも１つの放射帯域において線振幅データを生成するために、細胞から受光した光に対する線形の一連の強度値を各細胞に亘って１０ミクロン以下の間隔で取得する。閾値アルゴリズムが適用され、測定された背景信号からの任意の摂動である、線振幅データ上の各特徴の始めと終わりを判断する。１つ又はそれ以上の放射帯域に対して各特徴の判断された線振幅データが処理され、領域比強度、ピーク強度、半幅、半幅比強度、全強度、ピーク比、変曲比、一次元ガウス適合度、二次元ガウス適合度、又は、これらの値の数学的組合せのうちの少なくとも１つに対する値を生成する。生成された値又はその値の組み合わせのうちの少なくとも１つを使用して、検出された特徴が細胞であるか又は細胞でないかを判断し、更に、各細胞をその形態学的状態及び／又は細胞内プロセスの存在に従って特徴づける。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は細胞に基づく検定法に関する。

【０００２】（背景技術）細胞又は細胞以下のレベルで細胞の生理学的変化を特徴づける能力は、新薬発
見及び臨床診断の両方において重要である。新薬発見に有効な手法は、病気で示
唆される個々の分子の相互作用（例えば、タンパク質対配位子相互作用）の分離
、及び、これらの相互作用を制御するか又は乱す分子活動を判断する検定法の構
築である。高処理量選別には、候補薬品として立証し得る、又は、より一般的に
は薬品の基礎を形成し得る化学的構成要素に関して手がかりを提供することにな
る化合物を調査するそのような検定に対して、個別に大量の化合物（おそらく１
００万単位）の試験を伴う。

【０００３】研究者が、多分子相互作用、及び、ある場合には薄膜や細胞小器官などの超分
子物理構造との相互作用を必要とする細胞内の高度に複雑なプロセスを伴う病気
に注意を転じているために、新薬発見はますます複雑になってきている。多くの
新しい目標は、少数の分子のみによる細胞無しの相互作用検定法に容易に変形す
ることができない。これは、完全な分子相互作用又はシグナル経路が未知であり
、相互作用する分子を細胞から機能的な形態で分離することができず、成分から
検定法を構築する適切な方法がないか、又は、細胞内の物理的構造がプロセスの
一部の役割をするからであろう。ゲノミクスの出現により、研究者は、細胞に遺
伝子を直接導入するか又は細胞の遺伝子を直接制御することによって、病気の仕
組みを究明できるようになった。その結果、現代の新薬発見に適合する速さで（
１日あたり１０万個程度のサンプル）、多数の個別細胞又は細胞内のプロセスの
変化を定量化することができることが必要である。

【０００４】新薬発見の研究者は、これらのより複雑なプロセスを制御するか又はそれに影
響を与えることになる薬を発見する手段として、全細胞に対する化合物及び生理
学的条件の効果をある期間研究してきた。最も一般的な細胞に基づく検定法にお
いては、サンプル中の多数の細胞に対して一括信号が取得される。個々の細胞自
体は観察されない。一般的な例は、いくつかのレポーター遺伝子検定法であろう
。例えば、細胞中の緑色蛍光タンパク質の発現は、数万の細胞を包含するウェル
全体の総蛍光性を低解像度の検出器を用いて測定することによって判断すること
ができる。同様に、βガラクトシダーゼの発現は、細胞を解析し、ウェル全体の
発光を測定するために発光検定で解放された酵素の活動を測定することにより一
般的に測定される。

【０００５】研究者は、細胞自体よりも小さな物理的形態又はプロセスを伴う細胞の変化を
判断することにますます興味を持っている。例には、神経細胞上の神経突起の成
長のような細胞の分化、転写調節因子の細胞質から核内への転座のような細胞よ
りも小さな転座、壊死又は枯死を介する細胞の変化、又は、枯死細胞の食菌作用
のような１つの細胞の別の細胞との相互作用が含まれる。ガン細胞の分化（又は分化の欠如）又は多核化のような病気を示す細胞変化を
検出する必要がある細胞の診断には同様の要件が存在する。

【０００６】細胞又は細胞構造に対する形態学的又は生理学的変化を調査する通常の手法は
顕微鏡の使用である。問題の形態に標識を付けるために蛍光染色液を使用するこ
とにより、顕微鏡の感度は大幅に向上する。細胞の顕微鏡検査は、本質的に遅い
技術である。処理量の向上は、顕微鏡から画像を捕捉するＣＣＤカメラと、細胞
を解析し測定するための画像解析ソフトウエアとの使用によって得られてきた。
カメラ装備の顕微鏡及びその派生物が長年の間存在していた。これらは、個々の
細胞の画像を捕捉し、画像を処理し、細胞自体の変化又は蛍光標識の局所化又は
転移による細胞の差異を記録することができる。

【０００７】カメラ装備の顕微鏡に使用されるＣＣＤカメラの画素は１００万に達する場合
がある。しかし、これは、個々の細胞上の情報を提供するのに十分な解像度で約
１平方ミリメートルの画像を捕捉するのに単に十分なだけである。検査用サンプ
ルは、顕微鏡スライド又はマイクロタイター・プレートのウェルとして提示され
る。顕微鏡のスライド又はマイクロタイター・プレートの選択は、多くの製造業
者が長い間多重ウェル顕微鏡スライド（例えば、イングランド所在のヘンドレー
・エセックス製）、又は、水晶やガラスやプラスチック製の底部を有する特製低
部透明プレートを提供してきたことによる２次的な問題である。本質的に、全て
の顕微鏡に基づく画像化システムは、その走査領域が小さいので、一度に１つの
ウェルを読むことに限定される。単一ウェルにおいて画像を捕捉する方法は、反
復を通じて容易に拡張され、多重ウェルから画像を一度に１つづつ捕捉すること
ができることはどの同業者にとっても明白である。実際に、マイクロタイター・
プレートは、４つの標準顕微鏡スライドのフットプリントに基づいており、電動
式ＸＹステージでサンプルを１つのスライドから次のスライドに指標を付けるも
の（例えば、イングランド、ケンブリッジ所在のプライオアが供給するものなど
）、又は、１つのウェルから次のウェルに指標を付けるものは、顕微鏡用にかな
りの期間市販されてきた。細胞を識別し、細胞上又は細胞内の種々の蛍光プロー
ブの分布を測定するためのデジタル画像化の使用に関する従来技術の大きな集合
がある。いくつかの例としては、「サイトメトリー」１０、１９８９年、２５６
〜２６２ページに掲載のＬｅｅ他による論文「蛍光プローブを使用する希少事象
検出のためのデジタル顕微鏡システム」、「サイトメトリー」１０、１９８９年
、２５６〜２６２ページに掲載のＭｅｓｋｅｒ他による論文「画像解析を使用す
る免疫細胞化学的に染色された希少事象の検出」、及び、「サイトメトリー」１
５、１９９４年、１９９〜２０６ページに掲載のＰｌｏｅｍ−Ｚａａｉｊｅｒ
ＪＪ他による論文「末梢血液における希少ウイルス抗原陽性細胞検出のための自
動化画像血球計算」がある。ＷＯ９４１１８４１及びＷＯ８７０２８０２には、
高処理量選別に対して開発又は適用し得る細胞解析のためのシステムが説明され
ている。米国特許第５９８９８３５号には、転座を測定するために、前述の従来
技術に従って顕微鏡の対物レンズ及びカメラを使用するシステムの画像解析方法
への応用が説明されている。フローサイトメトリー用の細胞又は細胞小器官を染色するために開発された方
法及び試薬が、固形相サイトメトリー（画像解析を含む）に対して容易に適用さ
れる場合があり、また、試薬がいくつかの市販品から容易に入手されることも長
い間認識されてきた。重要な利点は、固形相サイトメトリーにより活発な付属細
胞が測定できることである。

【０００８】カメラ装備の顕微鏡に基づく自動又は半自動のシステムは、第２の選別、組織
学、免疫細胞化学、血球計算法、及び、組織病理学に対して非常に有効なツール
であることが立証されてきたが、それらは、８時間に１万個以上のサンプル処理
量が要求されることがある高処理量選別及び診断学への適用に関して重大な欠点
を有する。この理由は次の通りである。第１に、電荷結合素子カメラ（ＣＣＤ）の解像度
は有限である。現在利用できる最大のＣＣＤは、約１００万ピクセルであり、従
って、視野と解像度の間に妥協点が存在する。これは、一般に、解像度４ミクロ
ンに対して視野は良くてもわずか１平方ルーイン（ｒｕｉｎ）であることを意味
する。これは、一度にほぼ１００個の細胞の低解像度画像を取得するのに単に十
分なだけであり、いくつかの種類の検定において統計的に有意な結果を取得する
には不十分である。微小ウェル中で細胞を培養する場合、細胞がウェルの隅に集
まるのが一般的である。これは、通常、ＣＣＤ画像化システムがウェルの大多数
の細胞を観察しないことになることを意味する。視野を狭くすると解像度が増加することになり、細胞のサイズ及び形状特徴の
精密な測定が十分にできるようになるが、一度に観測できる細胞の数が更に減少
することになる。

【０００９】第２に、ＣＣＤ画像化システムは、多重ウェル形式（スライド又はマイクロプ
レート）の１つのウェルしか一度に画像化することができない。従って、スライ
ド又はプレートの全てのウェルを網羅するためには、スライド又はプレートを一
度に１つのウェルづつ動かさなければならない。この機械的な動きは比較的遅く
、処理能力を更に低減する。ＣＣＤの感度は、インテグレーション時間及び感度間のトレードオフである。
ＣＣＤカメラは、光電子増倍管よりも相当に感度が悪い。例えば、光電子増倍管
は、単一光子からの光を測定することができ、走査システムにおいてフルオレセ
インの最低で１００個の分子からの放射を１マイクロ秒未満で測定することがで
きる。これら低レベルの光における検出を達成するために、ＣＣＤカメラを用い
て３０分以上程度に亘って集積するのが普通である。従って、ＣＣＤに基づく画
像化システムは、高速度が要求される場合に低いレベルの光で定量的な測定を行
うには感度が不十分である（例えば、発現量が低く、おそらく細胞あたりわずか
５，０００レセプタである細胞上の細胞表面レセプタに結合された標識の付いた
配位子）。中間レベルの光においてすら、ＣＣＤは、１秒にわずか１フレームし
か取らないであろう。ＣＣＤアレーは、急速な移行期や時間分解蛍光技術（ナノ
秒からマイクロ秒までのサンプリング速度）の測定を実行するのに十分な速度で
領域を繰り返し走査することができない。

【００１０】ＣＣＤに基づく画像化システムの更なる欠点は、各ピクセルが一度に検出でき
るのが１色だけということである。多色画像は、ＣＣＤアレーの前にフィルタホ
イールを使用し、異なるフィルタを使用して多重フレームをとることによって得
られるであろう。これにより読み込み時間が長くなり、測定中にサンプルが動い
たり（液体中の自由細胞はそのようになりやすい）、又は、染料の転座が急速に
起こる（高速イオンチャンネル検定）場合、スペクトル情報が失われる。多重Ｃ
ＣＤアレーは、画像を多色で収集するのに使用できるが、検出器間の完全なピク
セル配列を達成すること、又は、真の同時多重波長検出をすることができない。
ＣＣＤアレーは、可視領域に亘って均一な感度を示さない。真の同時スペクトル
測定を行うためには、低信号レベルにおける背景除去は非常に重要である。

【００１１】米国特許第５，６６３，０５７号には、固形サポート上の微生物を素早く検出
する装置と方法が説明されている。この特許における方法は、微生物を数えるこ
とを意図しているが、一般的に生物細胞を自動的に計数するために使用してもよ
い。これは、哺乳類の細胞を検出して計数し、ガラス面又は薄膜面上の約３、１
００万個の細胞（「サイトメトリー」２７、３３６〜３４４ページ（１９９７年
）、Ｍｉｇｎｏｎ−Ｇｏｄｅｆｒｏｙ他）の単一走査における希少事象を選出す
る装置の使用によって確認される。

【００１２】（発明の開示）本発明によると、生きているか又は死んでいる細胞の形態の変化又は細胞内事
象を検出して定量化する検定を実行する方法が提供され、本方法は、細胞を単一サンプル又はサンプルアレーで解析用表面上に提示する段階と、オプションとして、生きている細胞を維持する環境を設ける段階と、前記細胞上又は細胞内部に包含された細胞構造と、取り込まれた又は付随した
粒子又は分子とに対して蛍光を発するように標識を付ける手段を設ける段階と、前記細胞上又は細胞内で蛍光を励起するために前記細胞を照らすことが可能な
検出システムを用いて前記細胞を走査し、少なくとも１つの放射帯域において線
振幅データを生成するために、各細胞に亘って線形の一連の強度値を１０ミクロ
ン以下の間隔で取得する段階と、測定された背景信号からの任意の摂動である、前記線振幅データ上の各特徴の
始めと終わりを判断する閾値アルゴリズムを適用する段階と、領域比強度、ピーク強度、半幅比強度、全強度、ピーク比、変曲比、一次元ガ
ウス適合度、二次元ガウス適合度、又は、これらの値の任意の数学的組合せのう
ちの少なくとも１つに対する値を生成するために、１つ又はそれ以上の放射帯域
に対して各特徴の前記判断された線振幅データを処理する段階と、検出された特徴が細胞であるか又は細胞でないかを判断し、更に、各細胞をそ
の形態学的状態及び／又は細胞内プロセスの存在に従って特徴づけるために、生
成された値又はその値の組み合わせのうちの少なくとも１つを使用する段階と、前記表面に定義した領域に付随し、アレー又は個別ウェルに定義した位置に対
応するグループに前記データを分割し、細胞の異なる母集団、又は、定義領域又
はサンプルにおける細胞母集団の特徴の変化を判断する段階と、を含む。

【００１３】細胞は、顕微鏡スライド又は底部透明マイクロタイター・プレートのような任
意の適切な表面上に提示し得る。細胞は、乾燥状態で提示されてもよく、又は、
生きている細胞を維持するために液体中に浸積されるであろう。処理は、オプシ
ョンとして、生きている細胞を維持するために、温度制御、湿度制御、及び、ガ
ス制御（例えば、炭素ガス濃縮空気）を有するチャンバで行われてもよい。細胞
、組み込まれた又は付随した粒子、又は、細胞構造は、生物学的分子（例えば、
蛍光標識の付いた配位子又は抗体）に付着された蛍光体の吸光度の任意の単一又
は組合せによる組み込みにより、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質
）の組み込み又は生成により、酵素の作用（例えば、生存力染色）による蛍光染
色の生成により、また、細胞上に吸収されたか又は細胞内に移送された、又は、
小さな染色細胞の取り込みを通じてより大きな細胞内に組み込まれた染料（例え
ば、カルシウムチャンネル染料又は薄膜染料）により蛍光性にされるであろう。

【００１４】照明光はレーザビームによって発生されてもよい。受光される光は、細胞から
の蛍光によって生成され、１つ又はそれ以上の光電子増倍管などの光電性検出器
によって収集される。レーザビームは、検出器において連続振幅読取値を得るた
めに、サンプルに亘ってラスター走査される。検出器からの信号は、好ましくは
、サンプル地点のレーザスポットがデジタルサンプル間でその直径よりも少ない
量だけ進むことになるように、ある周波数でデジタル／アナログ変換器によって
サンプリングされる。ラスター走査の各線は、レーザスポットの直径を超えない
量だけ進められるであろう。本検出システムは、代替的に、白色光又は放電光の光源及びＣＣＤカメラのよ
うな線振幅データを発生することができるどのようなシステムであってもよい。対応する装置もまた提供される。

【００１５】本発明は、細胞の形態変化又は細胞内プロセスの変化を高速かつ高感度で測定
する手段と、更に、これらの変化を多重放射波長で同時に測定する手段とを提供
する。本発明は、多重ウェルの通常６万個にも及ぶ全ての細胞の特徴を一度の走
査で測定し、これらの細胞に対する定量的データを提供する手段を提供する。本
発明により検出及び測定することができる形態学的変化は、以下に限定されない
が、有糸分裂、神経突起生長、細胞表面変化、及び、壊死／枯死に起因する収縮
を含む。本発明によって検出及び測定することができる細胞内プロセスは、以下
に限定されないが、核及び小器官転座、ミトコンドリア追跡、及び、細胞又は異
物の食菌作用を含む。本発明の特別な目的は、線振幅のみの解析から、従って画
像の作成又は処理の必要なしに、形態学的変化又は細胞内プロセスについての情
報を得ることである。本発明はまた、装置にとって小さすぎて完全に解像できな
い特徴（例えば、レーザスポットの直径と同じサイズか又はそれよりも小さい）
に基づいて細胞を特徴づける手段を提供する。ここで、添付図面を参照して本発明の実施例を以下に説明する。

【００１６】（発明を実施するための最良の形態）図１は、「ＣｈｅｍｓｃａｎＲＤＩ」（フランス所在のケムネックス・ＳＡ
製）として市販されている米国特許第５６６３０５７号の装置を示す。これは、
レーザビーム２を放射するレーザ１を備えている。レーザ光は、ビーム拡大器３
を通過し、走査ミラー４及び走査レンズ５によってＸ及びＹ方向に走査される。
すなわち、ビームは、サンプルホルダー７をラスター走査する。サンプルホルダ
ーを位置合わせするために焦点チューブ６が使用される。放射光線は、１対のフ
ィルタセットを通過して２つの光電子増倍管検出器８まで進む。検出器からの信
号は、信号増幅器１０とデジタル信号処理装置１１とを有する電子システム９に
送られ、得られたデータは、更なる解析のためにコンピュータ１２に転送される
。この種の装置は、本発明に従う装置をもたらすように適合させることができる
。本発明による装置において、光電子増倍管前置増幅器８は、高取得、低ノイズ
、及び、線形応答をもたらすために改良される。サンプリング・エレクトロニクス装置９は、５メガヘルツのサンプリングをも
たらし、走査ミラー４の制御により、ミクロン以下の線対線の走査線増分の達成
が可能となる。ＰＭＴ（光電子増倍管）信号の変化率に基づく改良された動的閾
値は、動的閾値に加えて閾値のスイッチを切るように設定する選択可能な「最大
特徴長さ」と共にソフトウエア１２に存在する。

【００１７】大量の入手データに対処するための高度なデータ処理と併せて、装置用の制御
及び解析ソフトウエアは、コンピュータが本発明の方法に必要なパラメータを計
算することを可能にする。本発明の方法は、様々な固形サポート７上で実行され
てもよい。実用的なサポート７には、薄膜、顕微鏡スライド、及び、マイクロタ
イター・プレートが含まれる。本発明の方法は、最初は、上方から読み取るガラ
ス製顕微鏡スライド上で実施された（標準のスライドホルダー付属品が利用可能
である）。画像解析及び顕微鏡法においては、顕微鏡スライド及びマイクロタイ
ター・プレートに対して、システムが１つのウェルから別のウェルに自動的に指
標を付けることができるようにＸＹステージを使用することが標準的に行われて
いる。マイクロタイター・プレートにおいて測定をいくつかのウェルに亘って自
動的に行うことができるように、この方法には、その後、ＸＹステージが更に追
加された。マイクロタイター・プレートを読む時、底部透明マイクロタイター・
プレートを使用して下からの照明及び検出を可能にするために、走査ヘッドは反
転された。本発明中のビーム拡大器３は、焦点の電子制御を可能にする電動式ビーム拡大
器望遠鏡である。サンプルに焦点が確実に合うように、独自の追加システムを含
むことができる（図示しない）。装置はまた、追加の第３の検出器チャンネルを
有する。

【００１８】本発明を使用して、照明に使用されたレーザスポットの直径よりも小さい細胞
及び別々の対象を検出して特徴づけることが可能である。図２は、走査時に、例
えばミクロン単位で走査方向にサンプルが取られる方法と、各走査線が前の線と
重なる様子とを明らかにしている。本発明は、調査中の細胞又は細胞よりも小さ
い対象の輪郭又は画像を考慮せずに、走査手段によって得られた線振幅から複雑
な形態的又は細胞内プロセスを推測することができることを教示している。細胞
及び細胞プロセスの様々な特徴は、ソフトウエアで計算されたデータから得られ
る量を適用することによって判断されるであろう。これらの量については以下に
説明される。

【００１９】対象の解析この処理段階は、走査中に見つけられた対象を特徴づける。対象に対して収集
された生データは、特徴の集合から成る。これらは、対象を貫通するスライスで
あり、対象に亘って測定された強度を包含する。各特徴と共に記憶されているの
は、特徴以前のノイズの基準線である（図７）。対象に関する下記特徴の１つ又はそれ以上が計算される。すなわち、「高さ」
、「幅」、「全強度」、「ピーク強度」、「平均強度」、「最小基準線」、「Ｓ
／Ｐ比」、「Ｔ／Ｐ比」、「Ｔ／Ｓ比」、「半幅」、「比強度（半幅）」（「Ｈ
／Ｗ比強度」とも呼ばれる）、「比強度（領域特異的）」（「サンプル比強度」
とも呼ばれる）、「一次元ガウス適合度」、「二次元ガウス適合度」、「ピーク
」（「ピーク比」とも呼ばれる）、「変曲」（「変曲比」とも呼ばれる）、及び
、結合／自由である。

【００２０】高さこれは、ミクロンで表した対象の高さである。これは、対象に含まれる線の数
と線の間隔（垂直解像度）との積である。図８を参照されたい。高さ＝線の数＊線の間隔幅これは、ミクロンで表した対象の幅である。これは、一番左側の特徴から一番
右側の特徴の端までのサンプル数とサンプル間隔（水平間隔）との積である。図
９を参照されたい。サンプル数＝一番右側−一番左側幅＝サンプル数＊サンプル間隔

【００２１】全強度これは、対象の境界の内部で測定された強度の全ての総計である（図１０を参
照されたい）。全強度＝各対象で見つけられた全ての強度の総計ピーク強度これは、対象中の最大サンプルの強度である（図１１を参照されたい）。平均強度これは、強度の平均値である。（図１２を参照されたい。）平均強度＝全強度／サンプル数最小基準線（第１、第２、及び、第３）これは、閾値点における対象の特徴の最も低い基準線である（図１３を参照さ
れたい）。

【００２２】Ｓ／Ｐ、Ｔ／Ｐ、及び、Ｔ／Ｓ比これらの値により、対象の色彩比を比較することができる。各標識は、別の色
彩比を生成することになる固有スペクトルを有する（図１４を参照されたい）。これらの比の各々は、各チャンネルの強度を総計し、次に適切に割り算するこ
とによって計算される。強度の総計を計算する時、基準線値が引き算され、対象
が据えられるノイズフロアに無関係の全強度を与える。第１強度の総計＝強度の総計−基準線第２強度の総計＝強度の総計−基準線第３強度の総計＝強度の総計−基準線Ｓ／Ｐ＝（第２強度の総計）／（第１強度の総計）Ｔ／Ｐ＝（第３強度の総計）／（第１強度の総計）Ｔ／Ｓ＝（第３強度の総計）／（第２強度の総計）

【００２３】半幅これは、強度がピークの半分に低下する点の対象の幅である（図１５を参照さ
れたい）。これはまた、対象の支配的な特徴に対して計算されてもよい。比強度（半幅）これは、対象のピーク強度をその半幅で割り算したものである。比強度（半幅）＝ピーク強度／半幅比強度（領域特異的）これは、図１７に示すように、対象のピーク強度を対象のサンプル数で割り算
したものである。比強度（領域特異的）＝ピーク強度／サンプル数

【００２４】一次元ガウス適合度これは、理想的なガウス形状に対する支配的な特徴（ピーク強度を包含するも
の）のガウス適合度である。得られた値は、０から４０９５の範囲でスケーリン
グされ、０は完全適合を示す。二次元ガウス適合度これは、理想的なガウス形状に対する対象内の各特徴のピークのガウス適合度
である。得られた値は、０から４０９５の範囲でスケーリングされ、図１８に示
すように、０は完全適合を指示する。

【００２５】ピークこれは、図１９に示すように、対象の各特徴内で見つけられたピーク数の平均
である。ピーク＝ピークの総数／線の数変曲これは、図２０に示すように、対象の各特徴内で見つけられた変曲数の平均で
ある。変曲＝変曲の総数／線の数結合／自由これは、ピーク強度（基準線を引いた）を基準線で割り算したものである。こ
れにより、蛍光がどの程度対象又は細胞に結合されたか、及び、どの程度結合さ
れないで残っているかという尺度がもたらされる（図２１）。結合／自由＝（ピーク強度−基準線）／基準線

【００２６】識別この段階の処理は、走査中に見つけられた対象を結果と結果無しとの２つのグ
ループに分類する。識別は、対象の特徴が特定の境界内にあるか検査することを
伴う。対象がいずれかの境界検査に不合格の場合、それは、定義された分類に属
するものとして分類されない。図２２は、サンプル中に見つけられた全ての対象
に対して測定された１つのパラメータのヒストグラムを示す。左側の母集団に包
含される対象は、この場合「結果」として分類される。対象はまた、右側の母集
団に属するとして分類されてもよいことを見ることができる。本発明のシステム及び方法により、次の対象特徴に対して識別を実行すること
ができる。すなわち、「高さ」、「幅」、「ピーク強度」、「Ｓ／Ｐ比」、「Ｔ
／Ｐ比」、「半幅」、「比強度（半幅）」（「Ｈ／Ｗ比強度」とも呼ばれる）、
「比強度（領域特異的）」（「サンプル比強度」とも呼ばれる）、「二次元ガウ
ス適合度」、「ピーク」（「ピーク比」とも呼ばれる）、及び、「変曲」（「変
曲比」とも呼ばれる）である。

【００２７】ウェル解析本発明はまた、サンプル又はウェルの全ての対象に関する母集団ヒストグラム
を生成することができる。ウェルの主要な特徴は次の通りである。・「結果の数」・「平均全強度」・「平均ピーク強度」・「平均二次元ガウス形」・「平均半幅比強度」・平均ピーク比・平均半幅・平均Ｔ／Ｐ比・平均変曲比・平均Ｓ／Ｐ比これらの特徴の全ては、識別処理によりウェル内で結果として分類された全て
の対象の集合から計算される。

【００２８】結果の数これは、識別処理によって結果として分類された対象の数である。平均ピーク強度これは、ウェル内の全ての結果対象の平均ピーク強度である。平均全強度これは、ウェル保持器内の全ての結果対象の平均全強度である。平均二次元ガウス形これは、ウェル内の全ての結果対象の平均二次元ガウス形値である。平均半幅比強度（Mean Specific Half Width Intensity）これは、ウェル内の全ての結果対象の平均半幅比強度である。上述の測定値は
、更に組み合わされるか又は改良することができ、本発明の方法によって得られ
た生データは、追加の計算によって抽出し得る情報を包含することを理解するこ
とができる。ここで、本発明は実施例を参照して以下に説明される。

【００２９】実施例１本発明の装置を使用し、５メガヘルツのサンプリング速度、６ミクロンのレー
ザスポット、及び、２メートル／秒の走査速度を使用して、０．４ミクロンごと
に検定サンプルが取られた。低ノイズ線形エレクトロニクス装置は、小さな信号
変曲を精密に測定できる高品質の振幅信号を提供した。本発明の方法は、細胞質
から核への蛍光タンパク質又は蛍光標識付きタンパク質のような蛍光分子の転座
の測定に適用された。転座したタンパク質はまた、蛍光標識の抗体を使用して視
覚化されてもよい。図３は、本装置を使用して走査された細胞の線振幅を示す。
線振幅プロットの左の図は、細胞の走査モードを示す。予め転座された細胞（上
のプロット）は、細胞本体（細胞質）における蛍光分子の存在と、核が存在する
であろう場所に相当する信号の「空洞」とに対応する固有の線振幅形状を有する
ことを見ることができる。核は、蛍光分子を殆ど包含しない。後で転座した細胞
は、強度が小さい細胞質と、標識された核に相当する強いピークとに対応する明
確に異なる線振幅信号（中間のプロット）を示す。検定は、最初に弁別手段を設
定することによって実行され、細胞の線振幅と線対線相関とに基づいて（「画像
」の輪郭に基づくのではなく）細胞を見つけて分離する。上述の特定の測定値は
、細胞特徴の定量的測定値を与えるために組み合わせることができる。本実施例
の場合、転座の程度は、細胞の比強度を線振幅から測定することによって判断す
ることができる。後で転座した細胞に対する予め転座した細胞の比は、容易に判
断することができる。図３の下のプロットは、転座の尺度として母集団の平均半
幅比強度を使用し、本発明の方法が転座の時間的推移を辿る様子を示している。
細胞を予め転座した状態にあるか又は後で転座した状態にあるかによって分類し
、その結果、非レスポンデント細胞に対するレスポンデント細胞の比を計算する
こともまた可能である。

【００３０】実際には、測定を実行するために精密な細胞の輪郭を取得する必要はない。検
定の処理能力は、対象物がおそらく細胞であると識別するのにちょうど十分な程
度走査の線対線の間隔を大きくすることによって大幅に上げることができる。細
胞よりも小さなプロセス（この場合転座）は、核からの信号を細胞からの信号か
ら分離することに頼ることなく、細胞を全体として考えることにより線振幅信号
から測定することができる。この実施例は、レーザ走査システムはレーザビーム
よりも小さな細胞以下の特徴を完全に分解できないが、取得された信号には、細
胞よりも小さな特徴及び処理を測定するための十分な振幅情報が含まれているこ
との証明を与える。

【００３１】この技術は、米国特許第５６６３０５７号の走査法と組み合わせると、更に高
速の測定速度を達成することを可能にする。所定の走査速度に対して、走査時間
は、線対線の間隔によって決まる。本発明の装置は、３８４−ウェルのマイクロ
プレート（図４）のうちの１６個のウェル、又は、１５３６−ウェルのプレート
のうちの６４個のウェルに相当する４００平方ミリメートルを一度に走査するこ
とができ、１つのウェルから次のウェルに指標を付ける顕微鏡に基づく技術より
もはるかに高速である。６４個のウェルに関するデータは一度に収集され、各ウ
ェルの結果は、コンピュータによって計算される。線対線の間隔を大きくするこ
とによって、６４個のウェルを２分未満で読み取ることが可能であり、高処理量
選別の要件に合致する１日あたり６万から１０万検定の処理量の可能性を与える
。更に、良好で統計的に有意なデータを収集するために、十分な数の細胞が測定
されることが極めて重要である。これは、１つの化合物の活性を他の数万の化合
物に対して測定することが必要な高処理量選別においては特に重要である。これ
には、複製データセット間の良好な変動係数（ＣＶ）が必要である。本発明は、
通常、どのウェルにおいても５００〜１０００個の細胞を走査することができ（
典型的な画像化法のわずか１００個に対して）、実質的にウェル内の全ての細胞
を検出することもまた保証する（隅においてさえも）。高感度のＰＭＴ検出器に
より、普通の処理量で稼動するカメラで達成できるものよりも大きさのオーダー
が約３ほど小さい蛍光分子（レポーターなど）の測定が可能である。本発明が３つ又はそれ以上の放射波長の同時情報を提供することができ、更に
、多重検定又は細胞内部のいくつかの特徴の判断を一度にできるようにするため
に異なる標識で標識付けされた特徴又は細胞を独立に測定し得るように、各放射
波長を本発明の方法により独立に処理してもよいこともまた理解されるであろう
。

【００３２】実施例２本発明の方法は、ＰＣ１２細胞からの神経突起生長の測定に適用された。神経
突起は、細胞やレーザビームよりもはるかに小さく、直径がわずか１ミクロンの
ものもある。図５は、神経成長因子（ＮＧＦ）が付加されたＰＣ１２細胞の母集
団に適用された本発明の方法を示す。６日後、細胞の２つの母集団があり、１つ
は分化されず、大部分は、神経突起生長により分化された。分化の程度は、２つ
の母集団の固有ガウス適合度、多重ピーク比、サンプルの幅、及び、線振幅の変
曲数を考慮することによって測定することができる。線振幅からのこれらの測定
値の任意の組合せを分化の定量的尺度として使用してもよい。図５（下部）は、
ガウス適合度パラメータヒストグラムにおける２つの母集団の明白な分離を示す
。

【００３３】走査の線対線の間隔が十分に狭い場合、各細胞の表示を三次元で生成すること
も可能である（図６）。これにより、分化を特徴づける本方法の能力が確認され
る。レーザスポットの直径は、細胞自体に比べてそれほど小さくなく（おそらく、
小さな細胞の直径の３分の１）、神経突起のような小さな特徴よりもはるかに大
きいので、線振幅及び三次元プロットが細胞の正確な複製ではないことに留意す
る必要がある。各個別の種類の細胞及び蛍光性特徴が矛盾しない信号又はサイン
を与える限り、これは、検定において測定をするのに必要ではない。しかし、必
要な場合には、細胞のより正確な表現をフーリエ逆重畳法によって形成すること
が可能である。

【００３４】本発明の方法は、線振幅のみの処理により細胞の形態学的変化や細胞内処理を
判断するのに適用された。更に、本発明の方法は、本装置には小さすぎて完全に
解像することができない形態学的特徴や細胞以下の転座が存在する可能性が高い
ことを示すことができる。特定の実施例においては、以下を使用する。核転座又は他の転座事象を表示するための、細胞に亘って最も強度の高い線振
幅プロットの半幅比強度及び／又はピーク強度。神経突起生長などの細胞分化を表示するための、線振幅の一次元ガウス形状及
び／又は二次元ガウス形状の使用。細胞分化の第２の尺度としてピーク比及び／又は変曲比の使用（神経突起が発
達する時、ＰＣ１２細胞の分化に対するピーク比及び変曲比の増加が観測された
）。１つの放射チャンネル（例えば赤色チャンネル）のピーク強度及び／又はピー
ク比及び／又は変曲比を別の放射チャンネル（例えば緑色チャンネル）のピーク
強度及び／又はピーク比及び／又は変曲比と比較することにより、対照色（例え
ば緑色）で染色したマクロファージにおける１つ又はそれ以上の組み込まれた蛍
光染色細胞（この場合、赤色）の存在を表示するための、１つの放射チャンネル
（例えば、赤色放射）のピーク強度及び／又はピーク比及び／又は変曲比の使用
。この比は、マクロファージによって組み込まれた細胞の数の尺度を与える。母集団において有糸分裂を受けている細胞数を計数するための、ピーク比及び
／又は半幅の使用。より大きな半幅は、有糸分裂を受けている細胞に対応する。
より高いピーク比及び／又は変曲比は、分割が進んだ段階にある細胞を示してい
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明を使用するように適合し得る装置の概略図である。

【図２】図１の装置の走査処理を示す図である。

【図３】核転座検定を実行する間の本発明の出力を示す一連のグラフである。

【図４】多重対象ウェルを同時走査する間の本発明の出力を示す図である。

【図５】細胞分化による本発明の出力を示す図である。

【図６】本発明によって生成された例示的な三次元表現を示す図である。

【図７】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図８】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図９】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図１０】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図１１】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図１２】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図１３】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図１４】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図１５】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図１６】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図１７】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図１８】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図１９】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図２０】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図２１】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

【図２２】本発明によって判断することができる値を示す概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者マーティンポールイギリスケンブリッジシャーダックスフォードレイセイズウェイ 24エイ (72)発明者ディズリーダーリンイギリスベッドフォードシャーエルユー３１エヌキューラトングラハムガーデンズ 16 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 DA02 EA01 FA01 FA02 FA06 HA01 HA02 JA02 KA09 LA02 LA03 NA01 NA02 NA05 2G045 AA24 CB01 FA12 FA16 FB12 GC15 4B029 AA07 BB01 CC01 FA01 4B063 QA01 QA18 QA19 QA20 QQ05 QR66 QS03 QS39 QX02 【要約の続き】値又はその値の組み合わせのうちの少なくとも１つを使用して、検出された特徴が細胞であるか又は細胞でないかを判断し、更に、各細胞をその形態学的状態及び／又は細胞内プロセスの存在に従って特徴づける。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生きているか又は死んでいる細胞の形態の変化又は細胞内事
象を検出して定量化する検定を実行する方法であって、前記細胞を単一サンプル又はサンプルアレーで解析用表面上に提示する段階と
、前記細胞上又は細胞内部に包含された細胞構造と、取り込まれた又は付随した
粒子又は分子とに対して蛍光を発するように標識を付ける手段を設ける段階と、前記細胞上又は細胞内で蛍光を励起するために前記細胞を照明する検出システ
ムを用いて前記細胞を走査し、少なくとも１つの放射帯域において線振幅データ
を生成するために、細胞から受光した光に対する線形の一連の強度値を各細胞に
亘って１０ミクロン又はそれ以下の間隔で取得する段階と、測定された背景信号からの任意の摂動である、前記線振幅データ上の各特徴の
始めと終わりを判断する閾値アルゴリズムを適用する段階と、領域比強度、ピーク強度、半幅、半幅比強度、全強度、ピーク比、変曲比、一
次元ガウス適合度、二次元ガウス適合度、又は、これらの値の数学的組合せのう
ちの少なくとも１つに対する値を生成するために、１つ又はそれ以上の放射帯域
に対して各特徴の前記判断された線振幅データを処理する段階と、検出された前記特徴が細胞であるか又は細胞でないかを判断し、更に、各細胞
をその形態学的状態及び／又は細胞内プロセスの存在に従って特徴づけるために
、生成された値又はその値の組み合わせのうちの少なくとも１つを使用する段階
と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】前記受光した光は、蛍光によって発生されることを特徴とす
る請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記照明する光は、レーザビームによって発生されることを
特徴とする請求項１又は請求項２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】前記照明する光は、白熱光源、不活性ガス放電ランプ、又は
、金属蒸気アークランプによって発生されることを特徴とする請求項１又は請求
項２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】前記受光した光は、１つ又はそれ以上の光電子増倍管によっ
て測定されることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項６】前記受光した光は、１つ又はそれ以上の光電性半導体によっ
て測定されることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項７】前記受光した光は、１つ又はそれ以上の電荷結合素子（ＣＣ
Ｄ）アレーによって測定されることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項８】前記レーザは、受光した光の強度の連続した測定値を前記検
出器により線振幅データとしてもたらすことができるように、前記サンプルを線
形方式で走査することを特徴とする請求項１から請求項３、及び、請求項５から
請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】前記検出器からの信号は、前記レーザのスポットが前記サン
プルを横切って１つのレーザスポットの直径を移動するのに要する時間と同等か
又はそれ未満の速度でデジタル的にサンプリングされることを特徴とする請求項
８に記載の方法。
【請求項１０】前記ＣＣＤアレーからのデジタル信号は、ストリームとし
て出力され、線振幅データをもたらすことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】光の１つよりも多い波長が受光されることを特徴とする請
求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】受光した波長の各々は、別々に処理されることを特徴とす
る請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】一定又は動的な閾値アルゴリズムは、前記データにおける
特徴の始まりと終わりを判断するために前記線振幅データに対して適用されるこ
とを特徴とする請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】前記判断する手段は、ピーク強度、幅、平均強度、最小基
準線、Ｓ／Ｐ比、Ｔ／Ｐ比、Ｔ／Ｓ比、半幅、ピーク比の数、変曲比、半幅比強
度、及び、前記線振幅で検出された各特徴に対して理想ガウス形状への適合度を
表す値のうちの少なくとも１つを判断することを特徴とする請求項１から請求項
１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】隣接する走査線の対応する位置で見出された特徴は、対象
又は細胞のＹ座標をその対象を通る線の数の関数又は同等距離として表現し得る
ように、前記データにおいて対象として関連付けられることを特徴とする請求項
１から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】二次元ガウス適合度は、隣接する走査線上の対象又は細胞
を表す特徴の集合に対して判断してもよいことを特徴とする請求項１５に記載の
方法。
【請求項１７】前記測定値は、前記線振幅からの１つ又はそれ以上の計算
されたパラメータに対する最小値及び最大値の集合を含み前記形態の差異又は細
胞内事象の発生に対応するフィンガープリントの手段により、細胞を１つの母集
団又は別の母集団に属するものとして特徴づけるために使用されることを特徴と
する請求項１３から請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】特徴走査線の最も高い振幅を示す前記半幅比強度は、細胞
の細胞質から細胞核の中への蛍光分子の核転座の程度に対する尺度として使用さ
れることを特徴とする請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】前記特徴走査線の最も高い振幅を示す前記半幅比強度は、
細胞質から細胞内の小器官又はミトコンドリアの中への蛍光分子の転座の程度に
対する尺度として使用されることを特徴とする請求項１から請求項１８のいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項２０】前記特徴走査線の最も高い振幅を示す前記ピーク強度は、
細胞の細胞質から細胞核の中への蛍光分子の核転座の程度に対する尺度として使
用されることを特徴とする請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の方法
。
【請求項２１】前記特徴走査線の最も高い振幅を示す前記ピーク比、及び
／又は、前記変曲比、及び／又は、前記一次元又は二次元ガウス適合度は、細胞
の一般的分化の程度の尺度として使用されることを特徴とする請求項１から請求
項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】前記特徴走査線の最も高い振幅を示す前記ピーク比、及び
／又は、前記変曲比、及び／又は、前記一次元又は二次元ガウス適合度は、神経
突起が成長している細胞の分化の程度に対する尺度として使用されることを特徴
とする請求項１から請求項２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】１つの放射帯域に対する前記特徴走査線の前記ピーク比、
及び／又は、前記変曲比、及び／又は、前記ピーク強度は、別の細胞によって組
み込まれた粒子又は細胞の数の尺度を提供するために、別の放射帯域に対する前
記特徴走査線の前記ピーク比、及び／又は、前記変曲比、及び／又は、前記ピー
ク強度と比較されることを特徴とする請求項１から請求項２２のいずれか１項に
記載の方法。
【請求項２４】１つの放射帯域に対する前記特徴走査線の前記ピーク比、
及び／又は、前記変曲比、及び／又は、前記ピーク強度は、娘細胞に遺伝したミ
トコンドリアの数の尺度を提供するために、別の放射帯域に対する前記特徴走査
線の前記ピーク比、及び／又は、前記変曲比、及び／又は、前記ピーク強度と比
較されることを特徴とする請求項１から請求項２３のいずれか１項に記載の方法
。
【請求項２５】前記特徴走査線の最も高い振幅を示す前記ピーク比、及び
／又は、前記変曲比、及び／又は、前記一次元又は二次元ガウス適合度、及び／
又は、前記半幅、及び／又は、前記幅は、枯死又は壊死の尺度として使用される
ことを特徴とする請求項１から請求項２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】前記特徴走査線の最も高い振幅を示す前記ピーク比、及び
／又は、前記変曲比、及び／又は、前記一次元又は二次元ガウス適合度は、細胞
分裂の段階の尺度として使用されることを特徴とする請求項１から請求項２５の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】分析中の前記細胞は、細胞の構成要素内への蛍光タンパク
質の組み込み、細胞による蛍光タンパク質の生成、蛍光薄膜染料の使用、蛍光抗
体の使用、蛍光配位子の使用、蛍光核酸の使用、蛍光遺伝子酵素基質の使用、又
は、イオンチャネル染料の使用のうちの任意の１つ又はそれ以上により蛍光性に
されることを特徴とする請求項１から請求項２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】前記細胞は、顕微鏡スライド、マイクロタイター・プレー
ト、又は、バイオチップ上に提示されることを特徴とする請求項１から請求項２
７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】生きている細胞を維持する環境が設けられることを特徴と
する請求項１から請求項２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】生きているか又は死んでいる細胞の形態の変化又は細胞内
事象を検出して定量化する検定を実行する装置であって、細胞を単一サンプル又はサンプルアレーで解析用表面上に提示する手段と、検出システムと、前記細胞上又は細胞内で蛍光を励起するために前記細胞を照明する前記検出シ
ステムを用いて前記細胞を走査し、少なくとも１つの放射帯域において線振幅デ
ータを生成するために、細胞から受光した光に対する線形の一連の強度値を各細
胞に亘って１０ミクロン又はそれ以下の間隔で取得する手段と、測定された背景信号からの任意の摂動である、前記線振幅データ上の各特徴の
始めと終わりを判断する閾値アルゴリズムを適用する手段と、領域比強度、ピーク強度、半幅、半幅比強度、全強度、ピーク比、変曲比、一
次元ガウス適合度、二次元ガウス適合度、又は、これらの値の数学的組合せのう
ちの少なくとも１つに対する値を生成するために、１つ又はそれ以上の放射帯域
に対して各特徴の前記判断された線振幅データを処理する手段と、検出された前記特徴が細胞であるか又は細胞でないかを判断し、更に、各細胞
をその形態学的状態及び／又は細胞内プロセスの存在に従って特徴づけるために
、生成された値又はその値の組み合わせのうちの少なくとも１つを使用する手段
と、を含むことを特徴とする装置。
【請求項３１】前記検出手段は、レーザビームを含むことを特徴とする請
求項３０に記載の装置。
【請求項３２】前記検出手段は、白熱光源、不活性ガス放電ランプ、又は
、金属蒸気アークランプを含むことを特徴とする請求項３０に記載の装置。
【請求項３３】前記受光した光は、１つ又はそれ以上の光電子増倍管によ
って測定されることを特徴とする請求項３０から請求項３２のいずれか１項に記
載の装置。
【請求項３４】前記受光した光は、１つ又はそれ以上の光電性半導体によ
って測定されることを特徴とする請求項３０から請求項３２のいずれか１項に記
載の装置。
【請求項３５】前記受光した光は、１つ又はそれ以上の電荷結合素子（Ｃ
ＣＤ）アレーによって測定されることを特徴とする請求項３０から請求項３２の
いずれか１項に記載の装置。
【請求項３６】光の１つよりも多い波長を受光するように配置されること
を特徴とする請求項３０から請求項３５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３７】受光した波長の各々は、別々に処理されることを特徴とす
る請求項３６に記載の装置。