JPH03255365A - 生物標本の複数の光学的特性を測定する方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はたとえば血球などの細胞集団のような生物標本
の複数の光学的特性を、生物標本を走査するコンピュー
タ制御された計測器を用いて高速度で測定することに関
する。

疋ｉ罠艶 このようなコンピュータ制御された計測器の実施例は、
フローシトメータ（ｆｌｏｗ　ｃｙＬｏｍｅｔｅｒ）、
自動血球分析計（ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ　ｘｉｓｌｙｘ
ｅｒ）および血球差動分類器（ｂｌｏｏｄ　　ｃｅｌｌ
　　ｄｉｆｆｅｒｅｎ口１１ｅｌｘｓｓｉｆｉｅｒ）を
含む。

７０−シトメー夕は検査領域を通過する単一縦列流とな
る細胞流体懸濁に焦点を合わせる計測器である。焦点を
合わせた光ビームはこの領域内の細胞を照明しかつ計測
器はたとえば複数波長の吸収、角度の関数としての散乱
および波長または偏光のいずれかの関数としての蛍光の
ような光と細胞との光学的相互作用を測定する。この種
の計測器はたとえば染色によって化学処理された細胞以
外に活動細胞の研究をも可能にする。７０−シトメ！・
り技術はある種の成分または組織でとくに細胞表面に存
在するものを毎秒１，０００以上細胞数という細胞速度
で定量的に特徴づけすることを可能にする。

血球分析計は代表例では種々のタイプの白血球細胞を自
動的に分類しかつ標本内の異常細胞はすべて識別しカウ
ントするところのコンピュータ制御顕微鏡からなる。こ
のような自動化計測器を用いても、オペレータは細胞を
手動でのぞいたり、目視形態学観察をするために分析計
を一時的に停止したりまたは異常細胞を再びより詳細に
調べたりすることができる。自動カウントの間、遭遇し
たすべての異常血球のＸ−Ｙ座標が記憶される。

したがってオペレータは、観察モードにして異常細胞を
自動的にまたは個々に拾い出して焦点を合わせてこれら
の細胞をテレビ画面に映し出したりあるいは両眼顕微鏡
で観察したりすることができる。

血球差動分類器は代表例ではステップモーターで駆動さ
れるステージ（載物台）を有するコンピュータ制御顕微
鏡からなる。キセノンアーク灯のような光源が細胞を照
明し、分類器はシリコン７オトダイオードアレイのよう
な種々のセンサを用いて細胞と光との間の光学的相互作
用を測定する。

与えられた領域内のすべての細胞は同時に照明される。

発明の要約 一般的に本発明は、細胞集団の各々の複数成分を正確に
推定しかつその多数の形態学的特性を特徴づける光学的
データを発生する方法および装置を特色とする。この方
法は、 細胞集団内の異なる位置を表わす異なるディジタルデー
タサンプルを形成するために細胞集団をビームで走査す
るステップおよび手段と；ディジタルデータをたとえば
コンピュータの記憶装置内に記憶するステップおよび手
段と；集団内で１つの細胞を、たとえば記憶ディジタル
データから取得されたディジタルデータを所定のしきい
値と比較することによって特定するステップおよび手段
と； その特定された細胞の周りに近傍を規定するステップお
よび手段と； 近傍の外側の位置に対応する記憶ディジタルデータを基
にしてその近傍内のすべてのサンプル点に対するバック
グラウンドレベルすなわち個々のバックグラウンドレベ
ルを推定するステップおよび手段と；および 光学的データを発生するために近傍に対応する前記ディ
ジタルデータサンプルの各々を推定バックグラウンドレ
ベルで補正するステップおよび手段と； を含む。本発明で使用されるビームはたとえばレーザ光
線、Ｘ線または赤外線などの電磁放射線である。

サンプル補正ステップは近傍内の記憶ディジタルデータ
サンプルの各々から対応バックグラウンドを減算するこ
とによって行ってもよい。

用語「ディジタルデータサンプル」は、コンピュータの
記憶装置内に記憶可能でありかつビームで走査されたと
きに標本内の細胞集団からのアナログ光信号からサンプ
リングされるディジタル情報を意味する。光学的データ
はディジタルデータをバックグラウンドに対して補正し
て得られる。光学的データをさらに処理すると、細胞成
分の正確な測定に使用されかつ細胞形態学の代表値とし
て使用可能な細胞集団の対応の光学的および形態学的特
性値が発生される。

ここで使用される用語「成分」は、たとえばＤＮＡまた
はＲＮＡのような細胞の特定の部分または成分を意味す
る。本発明は細胞または細胞集団内の特定成分の量を実
際量の約２−３％内の精度で求めることが可能である。

用語「近傍」は、ディジタルデータを含むようにオペレ
ータによって規定されかつ統計的には巣−細胞に対応す
るように設定されたサンプル点の特定領域を意味する。

すなわち平均的には、近傍内にはただ１つの細胞のみが
特定されよう。このような近傍のサイズは、標本内の細
胞のサイズに応じてオペレータが変更可能である。近傍
は、各近傍内のすなわち個々には各細胞に対するバック
グラウンドを求めることによって細胞成分の正確な推定
を可能にするのに使用される。バックグラウンドレベル
は顕微鏡スライドのような観察面の場所によって変わる
ので、多数の異なる細胞に対して１つのバックグラウン
ドレベルが使用されるよりはこの方法のほうがより高い
精度を可能にする。

本発明はまた、 細胞集団内で異なる位置を表わす異なるディジタルデー
タサンプルを形成するために細胞集団を細胞とサイズが
同等なスポットサイズを有するビームで走査するステッ
プおよび手段であって、ここでサンプリング速度はスポ
ットが連続するサンプリング位置間を走査される時間当
りの走行距離がスポットサイズとほぼ等しくなるように
して細胞集団をビームで走査するステップおよび手段と
；および 次に集団内の細胞を特徴づける光学的データを発生する
ためにディジタルデータを処理するステップおよび手段
と； を含む細胞集団を特徴づける光学的データを発生する方
法および装置を特色とする。ここで使用される用語「同
勢な」は、走査される細胞のサイズと同じ桁の大きさ以
内にあることを意味する。

一般に、細胞を表わすのに必要なサンプル点の数はｌ走
査に沿って採取されるサンプル数と走査数との積に等し
い。従来技術のようにたとえば０．５　ミクロンという
小スポットが使用されるときは、１００ミフロンＸＩミ
クロンの細胞領域内の成分を正確に表わすのに約４００
サンプルが必要となる。

本発明によれば、スポットサンプルの直径は１０ミクロ
ンのオーダーでありかつサンプリングはスポットが連続
するサンプリング位置の間で走査される時間当りの走行
距離がスポットサイズとほぼ等しくなるような速度で行
われる。これは精度を落とすことなく小スポットサイズ
よりも約４００９の速さでサンプルを処理するという有
利性を与える。

サイズを小さくしかつサンプリング速度を上げると、そ
れだけこの有利性は少なくなる。

この方法はまた、走査速度の変化について補正された光
学的データを発生するために、近傍値を、ビームが各位
置を通過して走査されるときの速度に比例する速度正規
化係数を乗算するステップを含んでもよい。

他の態様において本発明は、 細胞集団を走査内の各サンプルの位置の関数として走査
するのに使用される所定入射照度を有するビームの実際
照度を測定するステップおよび手段と： 細胞集団内の異なる位置を表わす異なるディジタルデー
タサンプルを形成するために細胞集団をビームで走査す
るステップおよび手段と；ディジタルデータをたとえば
記憶装置内に記憶するステップおよび手段と； 走査内の各サンプルの位置のビーム照度測定値を用いて
記憶ディジタルデータを正規化するステップおよび手段
と；および 次に集団内の細胞を特徴づける補正光学的データを発生
するために正規化されたディジタルデータを処理するス
テップおよび手段と； を含む細胞集団を特徴づける補正光学的データを発生す
る方法および装置を特色とする＃実際ビーム照度はたと
えばフオトマルチプライア（光電子倍増管）のようなセ
ンサで測定可能である。

本発明はまた、 細胞集団内の異なる位置を表わす異なるディジタルデー
タサンプルを形成するために面上の細胞集団を与えられ
た照度を有するビームで走査するステップおよび手段と
： ディジタルデータをたとえば記憶装置内に記憶するステ
ップおよび手段と； 照度補正データを発生するために細胞のない面の領域を
走査するステップおよび手段と；照度補正データから照
度正規化データを発生しかつ照度正規化データを記憶装
置内に記憶するステップおよび手段と； 集団内で１つの細胞を、たとえばディジタルデータを所
定のしきい値と比較することによって特定するステップ
および手段と； その特定された細胞の周りに近傍を規定するステップお
よび手段であって、その近傍が近傍内のディジタルデー
タサンプルから取得される光学的データを含むようにこ
の近傍を規定するステップおよび手段と；および 補正された光学的データを発生するために近傍内の光学
的データをたとえば光学的データに照度正規化係数を乗
算することによって補正するステップおよび手段と； を含む細胞集団を特徴づける補正された光学的データを
発生する方法および装置を特色とする。

細胞のない面は、均一な蛍光染料面、染料充満キュベツ
トまｔ；は均一散乱面を含む補正用スライドでよい。

他の実施態様において、処理ステップは、走査速度の変
化について補正された光学的データを発生するために、
ディジタルデータに、ビームが各位置によって走査され
るときの速度に比例する速度正規化係数を乗算すること
を含んでもよい。

この方法はまたさらに、 近傍の外側の位置にある各光学的パラメータに対応する
記憶ディジタルデータを基にして個々の近傍に対するバ
ックグラウンドレベルを推定するステップと；および 光学的データを発生するために、たとえば近傍内のサン
プルの各々から対応の近傍バックグラウンドレベルを減
算することによって近傍に対応するディジタルデータサ
ンプルの各々を補正するステップと； を含む。上記方法は各々に対して、近傍のためのバック
グラウンドレベルは、近傍内の各サンプルの各光学的パ
ラメータについての近傍に隣接する実際の位置に対応す
る記憶装置内の最小ディジタルデータサンプル値を見出
すことによるか、または記憶された近傍の外側の複数の
ディジタルデータサンプル値を平均することによって決
定することができる。典型的には、用語「隣接する」は
近傍の境界から５走査分以内を意味する。

さらに他の実施態様においては、ディジタルデータが取
得された時刻にほぼ対応する時刻が同期ディジタル時刻
データとして記録かつ記憶され、これにより各サンプル
は対応ディジタル時刻点を有する。ここで使用される用
語「ディジタルデータが取得された時刻にほぼ対応する
時刻」は与えられた走査のストリップが完了した時刻を
意味する。細胞集団はまた可動面上に載置され、走査は
可動面のステップ運動に同期して行われおよび１つのサ
ンプルに対応する位置が発生されたディジタル位置デー
タから取得してもよく、その結果各サンプルは対応のデ
ィジタル時刻点および位置を有する。可動面は、顕微鏡
スライド、細胞が中に挿入されるキュベツトまたは細胞
をその上またはその中に載置可能な任意の他の可動面で
よい。上記のすべての方法および装置の可動面上の細胞
は目視で観察することが可能である。

他の実施態様において、細胞集団を再走査するステップ
と；新しいディジタルデータ、位置データおよび時刻デ
ータを発生するステップと：および細胞集団内の変化を
求めるために新しいデータを前の走査から得られた対応
データと比較するステップとを追加してもよい。

上記方法および装置の他の実施態様においては、１つの
細胞は、ビームが最初に接触する細胞の縁に対応するデ
ィジタルデータサンプルを検出することによって特定す
ることができる。他の実施態様においては、近傍の中心
がはじめは最初の縁サンプル上に置かれる。本方法はさ
らに、近傍内の最大ディジタルデータサンプルを求めお
よび次に近傍に対するバックグラウンドレベルを推定す
る前に近傍の中心を最大サンプルに移動するステップを
含んでもよい。

本発明はまた、 細胞集団内の異なる位置を表わす異なるディジタルデー
タサンプルのセットを形成するために細胞集団をビーム
で走査するステップおよび手段とディジタルデータをた
とえば記憶装置内に記憶するステップおよび手段と； 集団内で１つの細胞を、たとえばディジタルデータを１
セットの所定のしきい値と比較することによって特定す
るステップおよび手段と；その特定された細胞の周りに
咳近傍を規定するステップおよび手段と； その近傍に対するパラメータのための光学的近傍値を発
生するために近傍内のすべての光学的デ−タサンプルの
合計を求めるステップおよび手段と： 各パラメータに対するしきい値の上側または下側のいず
れにあるかを示すサンプルの２進近傍パターンを発生す
るために近傍内の各パラメータサンプルを１セットの所
定しきい値と比較するステップおよび手段と； 光学的近傍値および２進近傍パターンを記憶装置内に記
憶するステップおよび手段と；および各細胞に対し、光
学的近傍値に対応する光学的特性および２進近傍パター
ンに対応する形態学的特性を発生するステップおよび手
段と；を含む複数の細胞特性を測定する方法および装置
を特色とする。

光学的特性は、近傍に対応する細胞の光学的特性値を発
生するために１つ以上の光学的近傍値に対して数学関数
を適用することによって発生してもよい。形態学的特性
は、近傍に対応する細胞の形態学的特性値を発生するた
めに１つ以上の光学的近傍値に対してブール関数を適用
することによって発生してもよい。

用語「光学的近傍値」はあるパラメータに対する与えら
れた近傍内のすべての光学的データの合計を意味する。

次にこの光学的近傍値はそのまま使用してもまたは集団
の細胞に対応する特定の細胞成分に比例する光学的特性
値を発生するためにさらに処理してもよい。用語「２進
近傍パターン」は、単一近傍すなわち細胞に対応する記
憶装置内ワードパターンを示し、これは１つの近傍内の
各サンプル点をしきい値と比較してもしその点が与えら
れたしきい値を超えていればｒｌＪをまたそうでなけれ
ば「０」を記録することによって発生される特定のパラ
メータを示す。各点をテストすることによって「１」ま
たは「０」のメモリワードが発生され、これが２進近傍
パターンである。

このパターンは、細胞の形態学的特性値を発生するよう
にさらに処理することができる。

これらの方法の各々はさらに、 その近傍の外側の位置に対応するディジタルデータを基
にしてその近傍に対する１セットのバッタグラウンドレ
ベルを推定するステップと；および 光学的データを発生するためにその近傍に対応するディ
ジタルデータサンプルの各々からこの近傍バックグラウ
ンドレベルを減算するステップとを含むことができる。

本発明はまた、 細胞を走査される細胞とサイズが同等なビームスポット
で照明するために電磁放射線ビームを発生するビーム源
であり、スポットが細胞を照明した結果として光信号が
発生される前記ビーム源と細胞がその上に載せられる面
と； スポットをビーム源から面上の細胞へ導くための光路と
； スポットが面上の複数の細胞上を通過するようにビーム
源と細胞との間の光路内に挿入されてスポットを面上で
走査させるためのスキャナと：光信号を測定する１つ以
上のセンサと：光信号を特定速度でサンプリングしかつ
ディジタルデータを形成するように配置されたアナログ
ディジタル変換器であって：ここでスポットが連続する
サンプリング位置間を走査される時間当りの走行距離が
スポットサイズとほぼ等しくなるようなサンプリング速
度が設定されるところのアナログ−ディジタル変換器と
； 記憶装置内のディジタルデータを補正し、個々の細胞の
複数の成分に対応する補正データ点から光学的特性値を
発生しおよび複数の細胞形態学的特性を求めるために光
学的特性値を処理するデータプロセッサと；および 変換器によって形成されたディジタルデータを記憶する
記憶装置と： を含む複数の細胞特性を測定する装置を特色とする。

他の実施態様において、本発明による装置およびすべて
の方法において使用されるスポットサイズは３ないし５
０ミクロンでありかつスポットサイズは走査される細胞
のサイズと同等になるように調節可能である。さらに、
ビームの波長分布はデータプロセッサによって制御可能
である。

本発明による装置のスキャナは共振検流計スキャナでよ
い。さらに、細胞がその上に載せられる面は、顕微鏡ス
ライド、細胞が中に挿入されるキュベツトまたは細胞を
その上またはその中に載置可能な任意の他の面でよい。

上記装置および方法の他の実施態様において、細胞集団
は可動面に載置され、走査は可動面のステップ運動に同
期して行われおよび１つのサンプルに対応する位置をそ
こから取得することができるディジタル位置データが発
生されてもよい。

上記方法および装置のいずれかにおいて細胞およびビー
ムによって形成されるディジタルデータはアナログ光信
号のセットから取得してもよい。

さらにこれらの光信号は、蛍光、前方角光散乱、消光ま
たは広角光散乱でよい。

他の実施態様において本発明はまた、細胞集団の多数の
ｌＩｍ胞がある与えられたパラメータについて一定の光
学値を有する細胞集団を特徴づける補正された光学的デ
ータを発生する方法を特色とする。この方法は、各走査
線に沿ってビーム照度差および集光差に対して補正をす
る。この方法は、細胞集団内の走査線に沿った異なる位
置を表わす異なるディジタルデータサンプルを形成する
ために走査線に沿って細胞集団をビームで走査するステ
ップと： ディジタルデータを記憶するステップと：この集団内で
１つの細胞を特定するステップとその特定された細胞の
周りに近傍を規定することであって、その近傍が近傍内
の記憶ディジタルデータサンプルから取得される光学的
データを含むようにこの近傍を規定するステップと；そ
の近傍内で最大ディジタルデータサンプルを求めめかつ
近傍の中心をこの最大ディジタルデータサンプルに移動
するステップと； この中心が移動された近傍に対する光学的近傍値を発生
するために中心が移動された近傍内のすべての光学的デ
ータ値の合計を求めるステップとモード光学値を形成す
るために発生頻度が最も大きい光学的近傍値を求めるス
テップと；モード光学値の周りの所定範囲内に光学的近
傍値を有する細胞のサブ集団を選択するステップと走査
線に沿った細胞仁愛の関数としてサブ集団内の細胞の平
均光学的近傍値の１セットを求めるステップと； 照度正規化係数を発生するために走査線に沿った各位置
のための平均光学値に対するモード光学値の比に等しい
補正係数の配列を計算するステップと；および 走査線に沿っｊ；異なる位置にある各細胞に対する光学
的近傍値に対応の照度正規化係数を乗算することによっ
てその細胞に対する光学的データを補正するステップと
； を含む。用語「モード光学値」は完全なサンプルラン（
実行）において最も頻繁に発生し７た光学的近傍値を示
す。用語「照度正規化係数」は走査線に沿った各位置の
ための全細胞の平均光学的近傍値に対するモード光学値
の比に等しい補正係数の配列を示す。

他の実施態様において本発明はまた、細胞集団を特徴づ
ける補正された光学的データを発生する方法を特色とす
る。この方法は、 走査線に沿った異なる位置を表わす異なるディジタル補
正データサンプルを形成するために走査線に沿って既知
の一定のパラメータを含む補正粒子の集団をビームで走
査するステップと；ディジタル補正データを記憶するス
テップと；集団内で１つの補正粒子を特定するステップ
とその特定された粒子の周りに近傍を規定するステップ
であって、その近傍が近傍内の記憶ディジタル補正デー
タサンプルから取得される光学的補正データを含むよう
にこの近傍を規定するステップと； その近傍内で最大ディジタル補正データサンプルを求め
かつ近傍の中心をこの最大ディジタル補正データサンプ
ルに移動するステップと；この中心が移動された近傍に
対する光学的近傍補正値を発生するために中心が移動さ
れた近傍内のすべての光学的補正データ値の合計を求め
るステップと： モード光学的補正値を形成するために発生頻度が最も大
きい光学的補正近傍値を求めるステップと： 走査線に沿った粒子位置の関数として粒子の平均光学的
補正近傍値の１セットを求めるステップと； 照度正規化係数を発生するために走査線に沿った各位置
のための平均光学的補正値に対するモード光学的補正値
の比に等しい補正係数の配列を計算するステップと； 細胞集団内の走査線に沿った異なる位置を表わす異なる
ディジタルデータサンプルを形成するために走査線に沿
って細胞集団をビームで走査するステップと； ディジタルデータを記憶するステップと；記憶ディジタ
ルデータから光学的データを取得するステップと；およ
び 走査線に沿った異なる位置にある各細胞に対する光学的
データに対応の照度正規化係数を乗算することによって
その細胞に対する光学的データを補正するステップと： を含む。

本発明のその他の特徴および利点は、好ましい実施例に
関する以下の説明から明らかになろう。

実施例 機械系および光学系 第１図を参照すると、測定器１０は、光源１２、共振検
流計のようなミラースキャナ目、外照明顕微鏡１６、ス
テップモータ制御ステージＩＳ、光センサ２０、２２．
２４．２６および以下に説明する種々の付属光学部品を
含む。光源１２は光Ｈａを出し、光ビーム＋２ａはスキ
ャナ口で反射されて走査ビームＨｂを形成し、これによ
り最終的に光源１２は標本平面または面２１上に一定直
径またはサイズの走査スポットＢｅを照射する。標本平
面または面２１はステージＩＩ上に配置される。光源１
２は用途に応じて、たとえばヘリウムネオン、アルゴン
イオン、ヘリウムカドミウムまたは固体レーザなどの種
類のレーザである。ある用途に対しては２種類以上のレ
ーザを使用してもよい。この場合には複数ビームは同軸
となるようにダイクロイックミラーを使用して結合され
る。場合によってはコンピュータ制御のもとで、レーザ
ビームの強さを制御したりまたはそれらのシャッタを制
御したりすることが好ましいことがある。複数の波長を
有するレーザを用いてもよく、この場合には特定波長を
選択するためにコンピュータ制御されたフィルタ、プリ
ズムまたはブラッグセル（Ｂｔｉ（にｃｅｌｌ）を使用
するのが好ましい。

ダイクロイックミラー３０を通過後、レーザビームは２
枚のレンズ３２および３４によって顕微鏡１６の外照明
視野絞り３６上に結像される。共振スキャナ口がレンズ
３２および３４の間に配置されかつ電気駆動によりビー
ムを視野絞り上で走査させる。レンズ３２および３４の
焦点距離および検流計駆動電圧に比例するスキャナＨの
偏向角は視野絞り３６シたがって標本面２１上のスポッ
トサイズおよび走査長さを制御する。スキャナは８００
ＨＺで駆動され、標本面上のスポットサイズは１０ミク
ロンであり、また標本面上の走査長さは１２０ミクロン
である。これらは公称値であって、この値は対物レンズ
３９を支持する顕微鏡ノーズピース３８をユーザが回す
ことによって変更することができ、もし倍率を公称倍率
２０Ｘから他の高い倍率へ上げればスポットサイズおよ
び走査長さは減少し一方倍率を下げればそれらは増大す
る。

標本を照明しかつ蛍光または散乱光をのぞき接眼レンズ
４０またはフィルムあるいはビデオカメラ４２に伝達す
るのに外照明が使用される。光伝達組立体４４は、のぞ
き通路内にダイクロイックミラーまたは部分あるいは金
銀メツキミラーならびに光学フィルタを含んでもよい。

これらの組立体は交換式であって、本実施例に使用され
る顕微鏡はこれらの組立体を交換するための可動ロッド
を含んでいる。

標本面２には組織または細胞標本がその上に載せられる
スライドかまたは細胞標本がその中に注入されるキュベ
ツトでよい。ざらに顕微鏡１６は倒立ｌＩ歎鏡でもよく
また標本面！３は活動細胞を含む容器または皿でもよい
。光学式測定器は標準または倒立Ｊｌｌ微鏡のいずれを
も受は入れるように設計されている。

標本の細胞は、それらの光散乱特性を変えたりまたはそ
れらに蛍光を発光させたりするために染色してもよい。

各細胞の散乱または蛍光は、１）ＤＮＡまたは蛋白質の
ような特定細胞成分、あるいは２）特定細胞抗原にのみ
結合する１つ以上の蛍光化抗体の量、のいずれかに関係
する。

標本の走査ビームに対する相対位置はＸおよびＹ方向ス
テップモータ４６．４１によって制御される。

これらのモータは、スポットサイズの何分の１からスポ
ットサイズまでの範囲のサイズでステップ状に駆動され
る。このステップサイズはコンピュータプログラムで制
御される。ステージにはセンサも設けられ、センサはコ
ンピュータＪこステージの「ホーム」位置すなわち基準
位置を指示しかつステージの走行を制限するための信号
を提供する。

各ラン（すなわち走査ストリップの群）の最初は必ずま
たランの途中では定期的にステージをホーム位置に移動
することにより標本面上の与えられた細胞の絶対位置を
得ることが可能であり、これによりそれらの細胞を手動
で再びのぞいたりまたは再測定したりすることができる
。通常使用ではステージはモータに付属のノブにより手
動で動かすことができる。ステージはまた、ボタン、ジ
厘イスティックまたは特定プログラム画面付コンピュー
タマウスにより手動で制御することも可能である。顕微
鏡１６の焦点はノブ６２により手動で合わせることがで
きる。

標本から前方方向に散乱された光は主として細胞サイズ
に関係するが、これは細胞を染色することによって変更
できる。この散乱光は顕微鏡の集光レンズ４！とダイク
ロイックミラーまたは部分銀メツキミラー５０とを通過
して２つのセンサ２０上に結像されるが、２つのセンサ
２０は電気的に接続されているが入射走査ビーム画像を
それらの間で通過させるように相互に間隔をなしている
。したがって軸方向光路から前方方向に標本によって散
乱された光のみがセンサ２０によって集められる。部分
銀メツキミラーまたはダイクロイックミラーＳｏはもし
それらが適切に選択されると照度を著しく低下させるこ
とはないので、顕微鏡の標本の照明に通常は標準照明＠
Ｈが使用可能である。ミラー５０は顕微鏡のサブステー
ジ照明器に直接装着されている組立体内に組み込んでも
よく、この場合ミラー５０は十分に小さいのでコンデン
サの焦点合わせを妨害することはない。センサ！Ｏから
の信号は増幅されて以下に詳細に説明するデータ取得回
路の１つの入力となる。図示されていないが、消光を測
定するために入射走査ビームから光を集めるようにセン
サ２０の後部または下部に追加のセンサを置いてもよい
。

顆粒細胞は光を斜向角度に散乱するので、血液顆粒細胞
のようなあるタイプの細胞を識別するのに細胞からＩＯ
度方向に散乱される光が使用される。

斜向散乱光はライトパイプとして作用する標本スライド
またはキュベツトにより捕らえられ、またスライドある
いはキュベツトの縁に置かれたセンサ２！によって検知
される。このセンサはステージ上でスライドまたはキュ
ベツトに接して装着され、その増幅信号はデータ取得回
路の二次入力として利用される。このセンサも同様に通
常の顕微鏡の使用を妨害することはない。

後方すなわち１１０度方向に散乱された光および蛍光は
開口数の大きい対物レンズ３８によって集められ、レン
ズ３５．３４および３２を逆に通過してダイクロイック
ミラーシ艦に結像されるが、ダイクロイックミラー５４
はもし後方散乱が測定されないならば長波長の蛍光を反
射しまたもし後方散乱が測定されるならばレーザ光波長
のある部分を反射するように設計されている。ダイクロ
イックミラー３０はほとんどすべてのレーザ波長を通過
する。ダイクロイックミラー５４は、レーザ波長の後方
散乱と長波長の蛍光とを測定するように光を２つの部分
に分割するかまたは光を２つの異なる波長の蛍光に分割
する。ミラー５４は部分銀メツキしてすなわちもし用途
が蛍光の偏光解消を測定することを必要とするならば偏
光に基づいて反射させたり透過させたりすることができ
る。ミラー５４は入射エネルギーの一部を反射し、適切
な帯域波長を有するフィルタ５６を通過させてフォトマ
ルチプライア２４に導く。ミラー５ｇも同様に残りのエ
ネルギーを反射し、フィルタ６０を通過させてフオトマ
ルチプライア２６に導く。２つの７オトマルチプライア
からの信号は増幅されてデータ取得回路の追加の入力と
なる。

図にはアパーチャ（Ｍ口）が示されていないが、レンズ
およびミラーの面から反射される迷光を減少するためｌ
：実際には種々の場所にアパーチャが使用されている。

電気−機械系 第２図を参照すると、電気−機械系は、光センサ２０．
　Ｈ１２４および２６、スキャナドライバ１０および顕
微鏡ステージ１１からコンピュータ８１へ信号を入力す
る手段とおよびコンピュータからｍ微鏡ステージ目を動
かすＸ方向ステップモータ４６およびＹ方向ステップモ
ータ４７へ信号を出力する手段とを提供する。これは、
４つのアナログ電圧を受取り、アナログ−ディジタル変
換器Ｂｏａで１００，０ＨＨｘ以下の速度でそれらをデ
ィジタル化しおよびこれによって得られた出力コンピュ
ータワードを直接記憶アクセス（ｄｔｎａ）制御のもと
でコンピュータ記憶装置に記憶させる市販の回路基板ｇ
ｏで達成される。回路基板１０はまた、ステージから制
限値を提供するディジタル値を入力８ト」０から受取り
およびステージを制御するディジタル出力値をライン！
２−１０４上に提供する。回路基板１０はまた、フオト
マルチプライア（光検知器）ハおよび２６への供給電圧
を制御するのに使用される２つのアナログ電圧値をも制
御する。詳細は以下に説明する。

一実施例においては、回路基板私Ｏは１０！１６［８Ｍ
コンパチブルコンピュータのスロットの１つに差し込ま
れる　Ｄａｔａ　Ｔｒｉｉｓｌａｔｉｏｓ　Ｍｏｄｅｌ
　ＨＩ３　（マールポロ（Ｍａｒｌｂｏｒａｗ（ｂ）、
ニューヨーク）である。

コンピュータは第２１３ｏにおいてブロックＨで示され
ている。

ざらに、フォトマルチプライア２４および２６は蛍光ま
たは後方散乱を検知するのｊこ使用されおよび光センサ
２０および２２は標本からの前方および斜向散乱放射を
検知するのに使用されるが、各々はそねぞれの増＠器７
６、Ｈ１７１および７（に接続されている。これらの増
幅器は、アナログ信号入力！０６．１０８、ｌｉｅおよ
び＋１２において回路基板３０に−１０ないし＋１０ボ
ルトの信号レベルを提供するように適切なゲインを有す
る。回路１２ないし７６は−］０ポルト付近１こり、Ｃ
，ｒ無信号」レベルを有するり、Ｃ，演算増幅器または
計器増幅器である。以下に説明するように、走査ミラー
Ｈの位置を、センサによって取得されかつディジタルデ
ータの流れに変換されたデータと同期させることが必要
である。ディジタルデータの流れは各々が６４，０００
ワードの２ブロツクとして記憶可能である。同期化過程
のために回路ｆ８のり、Ｃ，レベルは最初Ｏポルトに設
定されているので、負の同期パルスは容易に検知される
。

同期は％スキャナフッを介して走査ミラーＨの運動を制
御するスキャナミラードライバ７０によって発生される
方形波パルス同期信号によって達成される。この信号は
回路１１４によってパルスに変形され、また一実施例で
はこれがセンサ２Ｇからのセンサ信号に加えられる。こ
れはこのセンサ入力のディジタル化分解能を２だけ低下
されるが、同期のために別々のデータチャネルが必要で
はない。

もちろん、この同期信号はｆｆ１Ｊ側の入力信号として
使用してもよい。入力１１２における信号はセンサ２０
の前方散乱信号であり、パルス信号は（第６図に示すよ
うに）ｌ走査端部付近で負の方向に加えられる。以下の
説明かられかるように、この負のパルスはプログラムに
よって検知されかつコンビ二一夕の記憶装置内に記憶さ
れたディジタルデータを適切に同期させるのに使用され
る。サンプリング速度は、各テストに対してユーザがプ
ロトコル（手順）を定義できるようにする初期化プログ
ラムを介してユーザにより設定される。プロトコルはモ
ニタ画面であり、オペレータはこれを用いて、サンプリ
ング速度とおよび走査領域、し、きい値などの種々のテ
ストパラメータとを設定する。ディジタル化されたパラ
メータの数もまた表示され、増幅器ゲイン設定および入
力と出力との関係がリニアであるか対数関係であるかを
追加パラメータとして使用可能である。

回路基板１６ノデイジタル出力！２、ｇ４．９６．９８
゜１００、１０２および１０４のレベルはコンピュータ
プログラムの制御を受ける。ディジタル入力Ｈ１８４，
１６，１８および９０は、同様にプログラム制御によっ
て決定される特定時刻に読み取られる。これらの出力お
よび入力は、Ｘ方向ステップモータ４６およびＹ方向ス
テップモータ４γを介して顕微鏡ステージの運動を制御
するのに使用され、これらのステップモータ４６および
４１の各々はそれぞれトランスレータ回路１１６および
１１７によって駆動される。顕微鏡ステージにはリミッ
トスイッチが設けられていて、これらのリミットスイッ
チはステージがＸ方向およびＹ方向のステージの走行限
界に到達したときにリミットを指示する。これらのスイ
ッチはラインＨａ−＋１ｄに信号を発生し、これらの信
号はそれぞれ回路基板８０の入力８２ないし８８として
使用される。入力９θはスキャナドライバ７０からパル
スを検知する。ここには図示されていないが、特定の光
源、シャッタまたはフィルタ位置を制御することによっ
て光源の波長を制御するために追加のディジタル出力を
使用してもよい。

プログラム制御ステージ運動は第３図のフローチャート
に示すような以下に記載のシーケンスを実行するように
設計されている。まずユーザがテストを初期化すると、
両方のステップモータは特定の「ホーム」位置に移動さ
れる。これは、ステージがホーム位置に到達したことを
入力ｓ２および■が指示するまでライン９４および１０
０にオン−オフパルスを与えるというプログラムサブル
ーチンを呼び出すことによって達成される。ＯＲゲート
１１８は信号を出力９４から入力１１６ａへ直接通過さ
せる。プログラム制御を受けて出力９６および１０２は
、入力１１６ｂおよび１１１ｂｉ：おいて受は取られる
信号を形成することによって適当なステージ方向を形成
するように設定される。ステージがホーム位置に到達す
るとただちにＹ方向ステップモータにパルスが送られて
これによりステージ１１を最初のＹ位置に移動し、次に
サブルーチンが呼び出されて信号を出力ｇ６に切り換え
ることによってステージをＸ方向布に移動させる。一実
施例において、出力９４のパルス速度は、典型的には１
００パルス（またはステップ）という固定された合計パ
ルス数（または距離）に対して約１００ｐｐｓ（パル１
７秒）から１００ｐｐｓまでランプアップ（傾斜上昇）
される。これがランプアップ数である。この固定のラン
プアップはプログラムによりまたは市販のランプアップ
制御器回路（メトロバイト（１ｌｅｔｒｏ−ｂｙｔｔ）
、タウントン（Ｔｓｕｎｔｏｎ）、マサチューセッツ）
によって調節可能でもある。

プログラムはランプアップの終了時にスキャナ周波数で
ある１ＤＤｐｐｓの速度を形成し、したがってこのとき
にはステップモータは全速のステッピング速度で運動す
る。ステップサイズは、モータ４６の全まｔ；は半ステ
ツプを形成するように入力１１６Ｃを介してトランスレ
ータ回路１１６を制御する出力９８におけるレベルに応
じて５または１０ミクロンのいずれかあるいはその他の
サイズであってよい。

その後出力９２は、ＡＮＤゲート１２０に入力を与えて
これによりステップモータがミラースキャナドライバ７
０の同期出力によって直接駆動され、この結果ステージ
ＩＢをたとえば各走査サイクルに対して１ステツプとい
う　８００ステップ／秒の速度でＸ方向布にステップさ
せる。スキャナドライバ７０によって発生される、ステ
ッピング運動に垂直な走査運動と結合されたステッピン
グ運動は第４図に示す走査パターンを形成する。第４図
において、走査は左のホーム位置からスタートし、１走
査ストリツプの終端に到達するまで長さｒｌＪの前方お
よび逆走査が形成される。このようなストリップは典型
的には２５ＯＧの前方走査とＮｅｏの逆走査とを含む。

プロトコルを介したユーザの制御のもとてスキャナ速度
のステップモータ速度に対する比を他の比とする追加の
回路をドライバ７０とトランスレータ回路ＩＩ＆との間
に設けてもよい。

プロトコルの追加のパラメータはＸ方向走査距離である
。この距離はｌ走査距離を決定する。この長さは、測定
されたパラメータ数に走査ストリップ当りのデータ値の
全数を乗算することによってデータバッファに必要なサ
イズを計算するのに使用可能である。回路基板８Ｇは入
力をディジタル化し、それらをバッファに記憶し、そし
てバッファが充満したときフラッグ（識別）を戻す。こ
のとき出力９２は、Ｘ方向ステップモータの制御をミラ
ードライバ７Ｇからゲート＋２０およびＩｌｌを介して
プログラム制御出力９４へ渡すように設定される。次に
Ｘ方向ステップモータはたとえば１６０ステツプという
固定ランプアップ数に等しいパルスまたはステップ数の
間において停止に至るまで速度がランプダウン（傾斜下
降）される。２つのバッファ内のディジタルデータは以
下の説明のように全走査の終端において処理してもよい
し、またはディジタル化されつつあるときに処理しても
よい。この走査ストリップの終了時に、ステップモータ
４７はステージをＹ方向に動かし、これにより新しい走
査ストリップのランが可能である。出力＋００は入力１
１７ａへパルスを送ってモータをステッピングさせるの
に使用され；出力１０２は運動がＹ方向の正であるか負
であるかを決定しまた出力＋０４はステップのサイズ（
５またはＩｆ１ミクロン）を決定して信号を入力１１γ
Ｃに送る。同様にしてより小さい運動またはより大きい
運動がプロトコル制御のもとて使用可能である。

Ｙ方向ステップモータ４７をステッピングさせて第４図
に示すように標本をＹ方向に「上」または「下」へ走査
長さＬの６０％に勢しい距離だけ移動した後に、Ｘ方向
ステップモータ目がある速度でランプアップされてＸの
距離だけ移動されそしてランプダウンされて停止すると
いう上記の手順が反復されるが、ステージは逆にＸ方向
左へ移動される。Ｙ方向ステップの数Ｍはプログラムに
よってカウントされ、適切なプロトコルパラメータを介
してユーザによって決定されたＹの距離（Ｊ５−えられ
たＭ）に到達したときテストは終了される。

系の設定および補正 プログラムをスタートするときにユーザは、プロトコル
を、ディスク記憶装置上に記録されたそのときに修正可
能な１セットの名前付プロトコルから選ぶかまたは新し
いプロトコルを発生するかのいずれかであるかを問い合
わせされる。プロトコルは１セットのパラメータであり
かつサンプルに対して実行されるべきテストに関する人
口統計的情報である。人口統計的情報は、サンプルのタ
イプ、サンプルの数または名前およびサンプルに関する
任意のコメントを示す。テストに関する細胞カウントと
ともにプロトコルはデータおよびテスト条件を適切に識
別してテスト結果の各セットとともに記憶される。プロ
トコルパラメータは＝１）走査領域の４つのスタートお
よび終点の座標およびＸ方向およびＹ方向のステップサ
イズ、２）アナログデータ取得速度、 ３）各走査線に沿って処理されるサンプル点の数、 ４）各パラメータに対して、その名前、そのゲイン、細
胞検出のためのしきい値レベル、各細胞の形態学的ワー
ド（２進近傍パターン）を発生するのに使用される形態
学的しきい値、細胞の中心を見出すのにどのパラメータ
が使用されるかを示すフラッグおよびフラッグの値がテ
スト中にモニター上のどこに表示されるか、 ５）近傍のサイズ（近傍は以下に説明する概念である）
、 ６）テストが終了されるときの最大細胞カウント、 ７）完全走査の数、および ８）テストデータが記憶されているファイルの接頭名、 である。

テストの任意のシーケンスを始める前に、ユーザは以下
にさらに詳細に説明される方法によって１セットの補正
データを作り出すことを要求されよう。ユーザは前に行
われた補正用のラン（実行）から記憶された補正データ
を選択することができるし、または新しい補正データを
発生することもできる。もし新しい補正データが希望さ
れるならば、ユーザは細胞のないテスト標本の一部分を
選択するかまたは細胞のない標本を使用してそれを顕微
鏡ステージ上に置き、走査されるべきその領域が細胞ま
たはｍ胞の残骸を含まないことを１！察する。走査長さ
の上での各パラメータの出力は峙間の関数として連続的
に補正の間にモニター画面上に表示されかつステージ位
置は手動で制御可能である。これらのバックグラウンド
値を求めるために、バックグラウンド補正走査の開始点
を基点とし、ｌＯＯのオーダーの固定された走査数に対
してＹ方向ステップモータの１つの位置およびＸ方向ス
テップモータの１つ以上の位置におけるパラメータの値
がディジタル化される。一実施例において、これは、ス
テージがＸ方向に２．３ステツプだけ移動しその間に同
様に全体的にブランクな（サンプルがない）領域の上を
連続的に上下に走査することによって達成される。走査
サンプル点位置の斉々のパラメータ値はすべての走査上
にわＩ；り平均される。平均値およびそれらの変動値は
モニター画面上に表示されてこれによりオペレータは機
械が適切な値の範囲で作動しているかどうかを判定する
ｌ：めのチエツクができる。変動係数は測定値をその測
定値の平均で割り算した標準偏差である。これらの値は
列として記憶装置内に記憶され、必要なときに細胞パラ
メータ値を計算するのに使用される。

ユーザは同様に２回目の補正ランを開始することができ
、この場合にテスト標本は蛍光または散乱のような光信
号を提供する。たとえば、染色された研磨面スライドを
使用してもよい。これは上記のように独立的に走査され
てサンプル点の各々に対し１つ以上のパラメータの１セ
ットの正規化係数が取得される。補正用スライドは２回
走査され、２回目はビーム源がブロックされているので
、正規化係数は照明ビームがある場合と照明ビームがな
い場合との光信号の差に等しい。これは照明がないとき
でさえも存在する系内のり、Ｃ，およびその他の信号ノ
イズを消去する。与えられたパラメータが正規化されな
いならばその係数は１である。これらの正規化係数は、
たとえばスライド上のｌＩＢ！１１の位置、入射レーザ
光線の変動または細胞成分に関係しないその他の変動に
よる細胞から受は取られた光信号の変動に対してデータ
値を補正するのに使用される。次にこれらの係数がデー
タ点に乗算されて最終測定値からこれらの変動の影響を
除去する。

使用されるたいていの走査の場合、各走査長さしの端部
付近ではビームの速度が低下し、停止しおよび次の走査
長さＬを開始する前に反対方向に向きを変えるので、そ
の付近の細胞に対しては多くのサンプルがディジタル化
されるために、各走査に沿った異なる速度を考慮して同
様に正規化係数に速度正規化係数を乗算してもよい。速
度補正係数は、走査長さの中心からサンプル点までの距
離のコサイン（ｃＯＳ）であり、この速度補正係数に各
サンプル点に対する正規化係数が乗算され且つ配列とし
て記憶され、後に各細胞パラメータ走査値を計算すると
きに各サンプル点の値を正規化するのに使用される。

他の実施例において、最初の装置の補正はサンプルラン
の間に作動する自己補正の方法によって省略できる。こ
の方法は細胞のないテスト標本の一部分を走査する必要
性または任意の特定の補正用スライドの使用を回避する
。この方法はサンプルを横切る各走査線（長さし）に沿
ってビーム照度差および集光差に対して補正すべき光学
的データを補正するのに使用される照度正規化係数を発
生する。正規化係数を発生するためにサンプルの細胞が
使用されるときは、この方法は自己補正的である。しか
しながら代替態様においては、この方法では最初のラン
において補正粒子を使用することができ、この場合に照
度正規化係数を発生するために、サイズまたは蛍光のよ
うな多数の既知の一定パラメータの１つの一定光学値に
対して補正粒子が走査される。

この方法はたとえば静止状態にある細胞のＤＮＡ値まｔ
；は細胞のサイズのようなあるパラメータに対してサン
プルのＩ／ａ胞集団が一定の光学値を有する多数の細胞
を含むときに使用可能である。補正されるデータにおい
て約３％の精度を達成するには、この一定パラメータ値
を有する集団の約１．０００細胞が走査されカウントさ
れなければならない。

たとえば典型的な細胞集団においては、これらの細胞の
大部分は静止状７１１　（Ｇ　ｏ）にあり、この場合に
すべての細胞は同じＤＮＡ値を有する。理想的な集団測
定においては、この特定のパラメータに対して実質的に
多数の細胞がすべて同じ値を有するであろう。この理想
状態を目標として、できるだけこの理想的な結果に近い
分布を有するデータの新しいセットを得るｔ；めに光学
的データは照度正規化係数によって補正される。正規化
係数が形成されてそれが現在のサンプルおよび次のサン
プルに適用されるかまたはそれまでのすべてのランから
形成された正規化係数を基にして各々新しいサンプルラ
ンが補正可能である。

特にこの補正方法は、以下に示すように（第９図に示す
ように）行われる：サンプルの細胞が走査されるとき、
各細胞に対して特に光学的近傍値を含むデータリストが
発生され（ステップ３００）および１つ以上の選定パラ
メータに対しで走査線に沿った細胞の中心を表わす選定
パラメータに対する最大値の位置が決定される（ステッ
プ３０２）　。

次に近傍の中心がこの最大値に移動される（ステップ３
０４）。この実施例においては、照度正規化ファクター
を乗算する前に光学的近傍値は他の係数に対しては補正
されていない。次に完全なサンプルランに対して発生頻
度が最も大きい光学的近傍値が求められ、これが「モー
ド光学値」として指定される（ステップ１０６）。次に
光学的近傍値が検査され、選択された細胞のサブ集団を
発生するためにモード光学値のプラス／マイナスｒＤ」
の所定の範囲内に光学的近傍値を有するすべての細胞が
選択される（ステップ３０Ｂ）。次にこの細胞のサブ集
団は、走査線に沿った各細胞の最大値または中心の位置
または画素位置の関数として分類される（ステップ３１
０）。Ｄの値はユーザによって規定され、典型的にはモ
ード光学値の２ないし６％の範囲に設定される。この範
囲があまりにも広く選択されると、一定値を有しない細
胞を選択することになり、もしこの範囲があまりにも小
さすぎると、正確な平均値を形成するのに十分な細胞が
選択されないであろう。均一であることがわかっている
補正粒子が使用されるとき、すべての粒子は同一である
のでモード光学補正値の周りの所定範囲内に粒子のサブ
集団を選択する必要はない。

次に走査線に沿った各画素位置に対する選択された細胞
のサブ集団の平均光学値が求められる（ステップ３Ｉ２
）。その後書走査線に対して走査線に沿った各位置まｔ
；は画素位置に対する１つの補正係数を含む照度補正係
数の配列が計算される（たとえば３０サンプルの走査長
さしに沿ってＩＢ画素を使用することが好ましいときは
ＩＩの係数が存在するであろう）（ステップ３０）。配
列内の補正係数は、付属パラメータの平均光学値に対す
る補正モード光学値の比に等しい。この配列が照度正規
化係数である。

補正係数の配列は一次元であって、その中では配列は走
査線に沿った光励起または集光の変動に対して補正する
。しかしながら二次元系に対する配列を発生するために
も同様にこの方法が使用できる。たとえば現在の走査ビ
ームに垂直な方向のある範囲にわたる各走査が行われた
のちには、顕微鏡のステージを動かさないでレーザビー
ムを増分的に移動してもよい。この範囲の終端において
、ビーム運動はＯにリセットされかつステージはある増
分だけ移動されているであろう。この場合に、得られた
光学的データはピーク位置すなわち二次元の細胞の中心
によって決定されるように補正されるであろう。

各パラメータに対するすべての合計値すなわち光学的近
傍値は次に、各細胞に対するピーク画素位置を見出すこ
とによっておよび光学的近傍値に各パラメータのための
その走査線位置に対する正規化係数を乗算することによ
って各走査線に沿った照度差に対して補正される（ステ
ップ３１６）　。

これは光学的データの補正セットを発生する。

この過程はデータが安定するまで複数回繰り返すことが
好ましい。これは最初のランによって発生された補正光
学的データを２回目およびそれ以降の補正のためのベー
スとして使用することによつて達成される。言い換える
と、補正方法は新しくかつより正確な照度正規化係数を
発生するために、コンピュータの記憶装置内に記憶され
ている最初の補正光学的データに適用され、次に第２回
目のより正確な補正光学的データセットを発生するため
にこの新たなかつより正確な照度正規化係数に最初の補
正光学的データが乗算される。この過程が数回繰り返さ
れるが、データは約３回の繰り返し後に安定するはずで
ある。照度正規化係数は次のサンプルランの光学的デー
タに直接適用できあるいはこの係数はこの方法を各ラン
に適用し、前のランの係数からの補正係数の最終セット
を平均化しそしてこの平均化されたセットを次のランに
適用することによってこのファクターは更新することが
できる。

光信号データの取得 プロトコルを選択しかつ測定器を補正したのちに、オペ
レータは１つ以上のデータ取得ランを初期化することが
できる。これらのランの目的は、プロトコル内に定義さ
れたテストスライドの領域を走査すること、スライド上
の細胞のうちオペレータによってプロトコル内に設定さ
れた与えられたパラメータに対するしきい値基準に適合
するすべての細胞を見出すことおよびプロトコルの各パ
ラメータ、測定時刻およびホーム仁愛に対する各細胞の
ＸおよびＹ方向位置に対する補正光学的および形態学的
値を含むところの見出された各細胞に対するリストを発
生することである。ユーザはテスト標本をステージ上に
置きかつコンピュータキーボード上のキーをたたくこと
によってランを始動する。第３図の７０−チャートは上
記のような一般的な機械的光信号データ取得ループを示
す。

プログラムはステージをホーム位置に駆動させ次にステ
ージをテスト領域上に移動させる。ステージが動くとき
、ビームが前後に走査されて第４図に示すような走査経
路を形成する。各Ｘ方向走査ストリップに対しては、一
連のディジタルデータサンプル値を形成するために、標
本によって提供される各パラメータの光信号値はアナロ
グ−ディジタル（Ａ／Ｄ）変換器により、プロトコルに
よって設定されｔ：サンプリング速度でディジタル化さ
れる。典型的にはＮｏ、０００のこのような光学的信号
値がディジタル化され３秒以内にバッファメモリ内に記
憶される。典型的には各走査は２０サンプルを含み、し
たがって５ないし１０ミクロンのステップを有する２な
いし４のパラメータに対応する１゜０００ないし６，０
００の前方および逆走査はスライドカバーガラスと同じ
オーダーの大きさの長さをカバーする。データの取得と
処理とは順次にまたは同時に行ってよい。

スポットサイズとサンプリング速度との間の関係 記載の実施例においては、光学系は、標本面ｘｉにおけ
る走査レーザビームスポットＨｃのスポットサイズが回
転ノーズピース内にｚＯｘの顕微鏡対物レンズが使用さ
れるときに約１０ミクロンとなるように設計されている
。スポットサイズは、５ミクロンのスポットを形成する
ためにはノーズピースを４０Ｘに回転することによりま
た２０ミクロンのスポットを形成するにはＩＯＸに回転
することによって変化可能である。

ビームＢｂは面２ｇの上を走査するときに、測定器の光
センサ２Ｇ、　Ｈ１２４，２６の各々によって連続する
光学的アナログの流れが形成される。第５８図ないし第
５ｄ図は蛍光センサからのアナログ光学データがＡ／Ｄ
変換器によってどのようにサンプリングされるかを図で
示す。第５ａ図は成分のベースレベルを表わすレベルＣ
を有する細胞からの蛍光信号および成分変動ＣＩおよび
Ｃ２を表わすレベルを有する細胞からの蛍光信号の仮定
的なプロフィルを示す。第５ｂ図は走査スポット照度プ
ロフィルを示す。スポットの「サイズ」は正規分布曲線
の０．５乗点で測定される。第５Ｃ図は不適切なサンプ
リングを有する蛍光信号のディジタル化示を示し、第５
ｄ図は本発明によるサンプリングを有する蛍光信号のデ
ィジタル表示を示す。

矢印はサンプリング間隔を示す。

ユーザは、これらの連続な光学的アナログデータの流れ
の各々がサンプリングされ、Ａ／Ｄ変換器によって変換
されかつディジタルデータ値としてコンピュータ記憶装
置内に記憶される速度を定義することができる。この速
度はハードウェアプロトフルを用いて１００，０００サ
ンプル／秒の最大速度まで設定可能である。典型的な実
験では、毎秒Ｈ，ＯＯＧの二重パラメータサンプルの速
度が使用され、すなわち２つのアナログデータストリー
ムが各々３１１５マイクロ秒でサンプリングされる。

走査ビームＩＴｏの速度は共振スキャナ７０の共振層波
数によって固定される。このようなスキャナは２．４１
）Ｏ）ｌ　、までの周波数のものが市販されている。

一実施例は１０８Ｈｔのスキャナを使用し、すなわち走
査ビームＨｂは各々、距離「Ｌ」の走査長さを有して１
秒間に１００回前方および逆方向に移動し、ビームが走
査長さＬの一方の端部から他方の端部へＣＯＳ速度プロ
フィルをもって６２５ミリ７秒かかつて移動する（６２
Ｓマイクロ秒７３１．２５マイクロ秒−２０走査点数／
走査長さ）。レーザビームの走査経路を第４図に示す。

第５ｂ図に示すように、標本面２１上の走査スボツＨ″
２ｂの照度プロフィルは正規分布（ガウス分布）をなし
ている。標本からの光信号を連続走査することによって
任意のセンサから発生されたアナログデータは正規分布
照度曲線と所望の細胞成分信号の分６とのコンボリュー
ション（かけ合わせ）、すなわち２つの分布は１つが適
切にシフトされたときにかけ合わされる。

蛍光染色細胞が走査される場合を考えてみよう。

蛍光の仮定的プロフィルが第５ａ図に示され、第５ａ図
は細胞成分のベースレベルによる蛍光レベルをＣで示し
成分変動による蛍光レベルをＣＩおよびＣ１で示す。も
しサンプリング速度が小さくてビームがアナログデータ
の流れがサンプリングされる位置の間のスポット幅より
も大きく動くならば、蛍光信号の情報のいくつかは失わ
れるであろう。線セグメントに沿った染料の量を求めよ
うとするためには、ディジタルサンプルがあとで付は加
えられるであろう。サンプリングが少ないときすなわち
サンプリングの頻度が小さすぎる場合には、小さすぎる
サンプリング速度のために第５Ｃ図に示すようにアナロ
グデータに対応するディジタルデータ内に「隙間」を形
成することから得られた値のセットはビーム照度プロフ
ィルの分布と染料の分布とのコンボリューションを示し
ていないであろう。これらのサンプルの合計値はベース
レベルＣの部分を十分に示しておらずまたさらに成分変
動Ｃ２に基づく実際の増加を示す情報がベースレベル蛍
光Ｃを示す２つのピークの間で失われている。標本平面
内の連続するサンプルの間隔がスポットサイズ以下であ
るようにサンプリング速度が決められた場合には、１ス
ポツトサイズ離れた正規分布スポットが加え合わせられ
たときそれらは走査線に沿って均等な分布を形成するの
で、第５ｄ図に示すように標本のすべての部分は均等に
表わされるであろう。これは、１つの「スポットサイズ
」だけ離れているときは正規分布曲線は十分に重なるの
で、スポットが加え合わせられたとき全体は正規分布曲
線の最大値すなわちピーク値と等しくなるからである。

細胞標本はスポット間隔に十分近くサンプリングされる
ので蛍光センサかものサンプルが加え合わせられたとき
、適切な補正を行えばそれは細胞内のその成分の分布ま
たはスライド上の細胞の位置にかかわらず細胞成分の正
確な量を与えるであろう。

記載の実施例はアナログデータをディジタル値に変換す
るためにデータ・トランスレージ５ン（ＤａＬａＴｒａ
ａｓｌｉｔｉｏｍ　；　Ｄ　Ｔ）から市販されている回
路カードを使用する。この回路カードは直接記憶アクセ
ス（ｄｍａ）を利用し、この直接記憶アクセスにおいて
ＤＴカードは４つのアナログ信号以下の各々を所定速度
で連続的にサンプリングするようにプログラムによって
設定されている。このＤＴカードは同様にこれらのアナ
ログサンプルの各々を同等なディジタルデータ値に変換
しかつ信号サンプルの各セットを所定のスタート記憶位
置を有する連続的な記憶位置に記憶し、所定数の記憶位
置（バッファ）がディジタル値でいっばいになったとき
に作業を完了する。

プログラムは、サンプリングされるべき信号、サンプリ
ング速度、最初の記憶位置およびバッツアサイズを規定
することによってこのアナログーデイジタル変換作業を
設定する。１つの完全なＸ方向ストリップは、生データ
から１つのバッチ内のりストデータに処理されるので、
バッファサイズはストリップ内の走査数（典型例ではｘ
、５ｏＯ）に走査内のサンプル数（典型例では２０）を
乗じそれに実験において使用される光信号の数（典型例
では２ないし４）を掛けた値に等しくなければならない
；すなわちバッファサイズは約１ｅｆｔ、Ｇｏｏとなる
。

バッファがいっばいになると、プログラム制御は、細胞
を見出し、それらのピーク値を見出しおよびそれらの光
学的および形態学的特性値を求めるという機能に引き渡
される。この時点において、その中に典型的にはｔｏｏ
、０ｆＩＯのオーダーの連続的な値を有するバッファが
存在する。ｄ　ｍ　ａ作業およびリスト値決定作業は同
様にオーバーラツプさせることができる。

ディジタルデータ処 ディジタルデータサンプル値がいったんコンピュータ記
憶装置（バッファ）内に記憶されると、データをたとえ
ばバックグラウンドに対して補正し、データをその他の
補正をしおよび希望の光学的および形態学的特性値を発
生する種々のプロトコル制御機能によって処理される。

これらの機能ステップを第７図のフローチャートに示す
。

最初のデータ処理プログラム機能ステップ、第７図の２
００は、ストリップ内の各前方走査（典型的にはストリ
ップ当り！、５０Ｇ）の始点を位置決めする。第６図に
示すように、信号の１つ、代表的には前方散乱信号、は
それに対して十分な振幅、期間および負の極性を有する
同期パルスを加えているので、それはすべての正常信号
から区別することができる。同期パルスはミラー走査ド
ライバ７Ｇから直接取得され、各前方走査に対し１回、
各走査に対して同じ時刻にかつその始点付近に発生する
ので、このパルスは実際のデータを妨害することはない
。記載の実施例において、２０サンプル走査（すなわち
走査長さＬ当り２０のサンプルが存在する）の中間（約
Ｈ）のサンプル点のみが使用され、これらを「ポイント
」と呼ぶことにしよう。

３０サンプル走査長さは約１３ポイントを有するであろ
う。プログラムは最初バッファの連続する記憶位置を探
索して同期信号の形状にマツチするこれらの値のシーケ
ンスを求め、これらの位置のすべてに対するポインタの
表を作成する。各データポイント値のスタート位置が、
バッファ内におけるこれらのポインタ位置の各々からの
既知の変位に固定される。同期信号と走査位置との関係
が固定されるので、各走査のスタート位置はマークする
ことができ、データバッファ値は各々プログラム内に保
持されている適当な記録によって特定の走査位置と関連
させることができる。

各パラメータに対する隣接点のグループは同期信号から
のそれらの距離に応じて記憶装置内に位置付けされる。

もしパラメータが連続的に、すなわちパラメータＡに対
してポイント１１パラメータＢに対してポイント１、パ
ラメータＡに対してポイント２というように、採取され
るならば、隣接点のこれらのグループは記憶装置内にす
べての他のサンプルを含むであろう（２つのパラメータ
に対して）。

プログラムによって呼び出される次の機能ステップ、第
７図の２０２、は細胞を見出すためのものである。個々
の細胞を位置付けするこの事象は「細胞見出し」と呼ば
れる。この機能は各走査のポイントの各々の探索によっ
て、あるパラメータに対するプロトコルしきい値を超え
るところのそのパラメータに対する値（それのバックグ
ラウンド値が減算されている）を見出させる。したがっ
て任意の１つのパラメータはその細胞によって引き起こ
されるその与えられたパラメータの信号値の増加によっ
て細胞を見出すのに使用することができる。

バックグラウンド値は上記の補正領域から求めることが
できまたはバックグラウンド値は１つ以上前または後の
近傍内の走査の同じ位置内におけるサンプルを平均する
かまたはその最小値を求めるかのいずれかによって発生
することができる。

最初プログラムは、走査ストリップの一部すなわち最初
の約５０走査のポイントに対する最初のバックグラウン
ド値の表を計算し、これにより各バラメータ信号に対す
るすべてのポイントの最小値を求めることができる。こ
れらのポイントに対する最初のバックグラウンド値は表
の中に記憶される。

本発明のプロトコルパラメータの１つは近傍のサイズで
ある。近傍は値Ｎを有し、Ｎは典型的には５ポイント付
近にあるがユーザによってテスト内の細胞のサイズおよ
び濃度に調節される。近傍は統計的にただ１つの細胞の
みを有するように設定される。

細胞見出し機能において、第７図における別個のステッ
プ２０４は見出された各細胞の周りの近傍を規定する。

近傍値Ｎは見出された細胞の濁りの領域（ポイント×走
査）を規定しこの領域内において見出された他の細胞は
拒否され、すなわち与えられた近傍内に単一の細胞が見
出されると次の細胞の見出しは近傍の外側になければな
らない。

近傍の終端後にスキップ（飛び越し）される走査の数は
典型的には３である。同様に、データ値は近傍内でのみ
加算されるので、細胞見出しはいっばいの近傍よりも少
ないものからなる走査縁におけるサンプルの領域内では
可能ではない。データを含む現在のリアルタイムはコン
ピュータクロックからとられかつ細胞リスト内に記憶さ
れる。バックグラウンドのサンプルポイント数に等しく
かつ近傍の次の走査の数にも等しいＮの値はプロトコル
内に規定される。Ｎは近傍の中心を規定しやすくするた
めに奇数であることが好ましい。

次の機能ステップ２１）６はＮ前方走査のＮポイントに
沿ったすべての値、すなわち細胞見出しの位置に中心が
置かれた１つの近傍内のすべての値を比較して、そのポ
イントの最大値から、プロトコルに規定された信号パラ
メータの１つに対するその対応ポイントバックグラウン
ド値を減算した値を求める。最大値は細胞の中心および
細胞見出しの新しい位置を規定する。ステップ２０７に
おいて近傍の中心が再び求められる。走査数、ポイント
数およびストリップ数はすべてメインの細胞リストファ
イル内に記憶され、コンピュータのシステムタイムとと
もにこの新しい細胞位置を規定する。

次のステップ２０１において現在の近傍の始点の直前の
近傍の外側で終わっている走査のセット数（典型的には
５）を用いることによって各パラメータ信号に対するサ
ンプルの最小値を求めることにより、各近傍に対するポ
イントバックグラウンド値の新しい組が計算される。デ
ィジタルデータポイントからこのバックグラウンド値を
差し引くことによってコンピュータ記憶装置内に光学的
データポイントが発生される。

補正ランおよびプログラムによって求められる照度、速
度およびバックグラウンドはすべて、次のステップ２１
０において各パラメータに対する各ポイント値にポイン
ト照度補正係数および速度補正係数の配列を乗算するこ
とによって考慮されている。第７図の次の機能ステップ
２１２はその細胞に対するピーク値の位置に中心が置か
れた規定された近傍の各サンプルに対する各パラメータ
のすべての補正光学的データ値を合計する。この合計値
が光学的近傍値である。上記の自己補正法においては、
この光学的近傍値は最初照度または速度に対して補正は
されていないが次のステップで補正される。

この実施例においては、各方向において採取される細胞
のサンプル数は細胞のその方向の投影長さをその方向の
スポットサイズで割った値より大きいので、これらのサ
ンプルが合計されたときその結果は正確にその細胞パラ
メータの積分値を表わしかつ与えられた細胞成分の絶対
量に直接関係付けることができる。これは、入射光ビー
ムのスポットサイズ以下に等しい距離だけ離れてサンプ
ルが採取されるという原理に基づいている。サンプリン
グ速度、ステップサイズおよび近傍のサイズはすべてプ
ロトフルにおいて特定のテストでテストされる細胞の速
度、精度およびサイズにテストを調節するように選択さ
れる。

プログラムは次のステップ２目において、ディジタル化
２道近傍パターンすなわちその形状を示す各細胞に対す
る形態学的ワードを発生する。近傍内の各ポイントは各
パラメータに関してプロトコル内に設定されたそのパラ
メータの「形ｆｉ学的しきい値」と比較される。その値
が形態学的しきい値を超える各点に対しては、記憶装置
内の形態学的ワードの特定位置がＯから１にセットされ
、そのワードは１だけシフトされる。もししきい値を超
えていなければ、その位置は０のままでありかつワード
は１だけシフトされる。したがって各ａｒｔｓの各パラ
メータはｍａのディジタルイメージを含む近傍の領域（
ポイントＸ走査）に長さが等しいワードを発生するのに
使用される。実際には、このワードのサイズは記憶スペ
ースを節約するためにポイント数より小さくすることが
できる。最後のステップ２１６においてこれらのワード
は、ステップ１１０において発生された近傍値に対する
データ、走査の時刻および細胞の位置データとともに各
細胞に対するリスト内に記憶される。

光学的および形態学的パラメータの表示上記の機能セッ
トは１つのＸ方向ストリップを表わすバッファ内の各細
胞見出しに対して繰り返される。２つのパラメータの光
学的特性値（光学的近傍値から発生される）またはｙｆ
３１１学的特性値（２進近傍パターンから発生される）
はドツトとしてモニター画面上に表示され、ドツトのＸ
方向位置は１つのパラメータに比例しまたドツトのＹ方
向位置は２番目のパラメータに比例する。特定数Ｋ（典
型的には５００）の細胞が見出されるかまたは特定数の
Ｙステップ（Ｍ）が到達されたとき、ＦランＪは完了さ
れかつ各細胞に対する値のリストがコンピュータの固定
ディスクのファイル内に書き込まれる。この装置は同様
に任意の数Ｐのバス（通過）に対してランを繰り返しす
なわち再走査するようにプログラムされている。

ランを繰り返すために、ｌＩＩ微鏡大鏡ステージ初のＸ
方向ストリップの走査を開始するように移動され、上記
ステップのすべてが繰り返される。同時に、他のプログ
ラム機能がステージの位置を制御する。最初のバスｌ；
おけると同様に、ステージは上記のように、まずホーム
位置に移動され、次に最初のスタート位置に移動されて
位置を追跡しながら走査速度にランプアップされ、Ｘ方
向のストリップを横切りながら同期化ステップに移動さ
れ、停止まで速度がランプダウンされそしてＹ方向にス
テップされる。このように細胞の同じ標本の走査を繰り
返すことによって、オペレータは個々の細胞内の動的変
化を観察できる。

上記のように発生されたデータのリストは後にまたは上
記データ取得プログラムのストリップの間でランするこ
とができるデータ表示プログラムによって処理すること
ができる。このプログラムの主な特色は以下のとおりで
ある。

「データプロトコル」を用いることによって、ユーザは
、１つまたは２つの光学的近傍値、形態学的ワードまた
はタイムパラメータに数学関数を適用することによって
計算される特性のリストを規定することができる。光学
的特性はたとえば、１つのパラメータに対する光学的近
傍値（たとえばＤＮＡのピコグラム数に変換可能な値）
、２つのこのような値の比、タイムまたは形態学的ワー
ドすなわち２進近傍パターンの１ビツトのすべての合計
（細胞領域）とすることができる、これらの特性は細胞
サブ集団をカウントしそれらをモニター画面上に表示す
るための細胞選択のシーケンスのためのベースとして使
用される。

画面は２つの選択特性の各々に対応する軸を有するモニ
ター上に発生される。各細胞は画面上にドツトとして表
示され、軸上のドツトの位置は特性に比例しドツトの色
はその画面位置に発生する細胞数に比例する。たとえば
ユーザ制御マウスを使用すれば、ユーザは画面の特定領
域を多角形で囲むことができる（これは追加領域に拡張
できる）、。

最初の画面の特性と同じでもまたは異なってもよい２つ
の追加の特性がデータプロトコル内に指示される。その
特性が第１の画面の多角形領域内にある細胞はカウント
されてその座標が第２の特性のセットである１２の画面
上に表示される。多数、たとえば６個、の多角形が第２
の画面上に描かれ、これらの領域の各々内の細胞がカウ
ントされる。

第８図に示すように、カウント数が画面上でそれらの対
応領域のそばに表示される。

取得された特性の連続したカウントに基づいて細胞のサ
ブ集団をカウントするほかに、ユーザは特定データを任
意の特性セットの等角投影または等高線図を含む種々の
他のフォーマットで表示することができる。第８図に示
すような本発明による測定器の他の態様においては、こ
のプログラムはパラメータ値の特定位置またはセットを
表わすモニター画面上の多角形を発生することができる
。

このプログラムは同時に、その特性が多角形領域内に入
るところの各細胞を特定するように測定器に指示をする
ことができる。すなわち各多角形は、その多角形内の細
胞の各々に共通な特定の特性を示すサンプル内の細胞の
サブ集団を含む。各細胞は目視観察用の顕微鏡対物レン
ズ３９の下へ自動的に位置決めされるので、集団内のそ
の細胞に対応する画面上のドツトは（第８図の右下側の
多角形に示すように）そこに中心を置く点滅サークルに
よってマークされる。

各Ｘ方向ストリップを完成したのちに、完成細胞パラメ
ータに対する値が合計されてモニター画面上に表示され
る。各テストの間、ユーザは２つのパラメータの値によ
って規定される位置におけるスクリーン上のドツトとし
てまたはもし２つより多いパラメータが使用されるなら
ば２つのこのようなパターンとして表示される各細胞を
観察する。これらのグラフの軸にはプロトコルパラメー
タ名が記入されている。本発明によれば、見出された細
胞の位置は同様に画面上の追加グラフ上にドツトで表示
することができる。固定数の細胞、典型的には約！ｉ０
Ｑ　、が見出されたのちに、これらの細胞に対するデー
タリストがプロトコルの見出しを含むディスクファイル
内に記憶される。全領域が走査されるかまたはプロトコ
ルの最大細胞カウント数に到達するかのいずれかが起き
たのちには、残りの細胞データは全ＪＩＩｌ胞カウント
の次のリストファイル内に記憶される。ユーザは走査を
１回以上繰り返すためにプログラムを呼び出すことがで
きる。これらの次のバスにおいて、上記機能のすべてが
細胞見出しの作業例外とともに反復される。第１のバス
から見出されたすべての細胞の位置は記憶装置の表の中
に読み込まれ、これらの位置はピーク値見出しルーチン
のスタート位置を指示するのに適当な時刻に使用される
。この新しい時刻は新しいリスト内に記憶されすべての
他の機能は最初のバスと同一である。

データ解析 本発明のプログラムによって得られた結果は典型的には
１，０００ないし１０．Ｇｏｏの細胞に対するデータの
セットを含むファイルである。これらのデータ値は７０
−シトメトリの文献に記載の任意のプログラムと同一の
解析および表示プログラムへのインプットとして使用さ
れる。これらのプログラムは、次のテキスト内に記載さ
れている：Ｍｅ１１ｍｅｄ他、［７０−シトメトリおよ
び分類（Ｆｌａｗ　Ｃｙｔｏ＋１ｅＬｒ７　ｓａｄ　５
ａｒｔｉａ（）　Ｊ　　（Ｊｏｈｎ　　ＷｉｌＢ＆　５
ｏｎｓ、　Ｈγ９年、第２０章）または　Ｓｋｍｐｉｒ
＊、　　Ｉｌ、。

「寮用フローシトメトリ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ｆｌ
ｏｗＣｙｔｏｍｅｒｙ）　Ｊ　（ムＪ、Ｌｉ５ｓ、ＮＩ
Ｓ年、第５章）。

しかしながら、形態学的特性、時刻および位置を示す本
発明のモニター画面表示は、本発明の他の特色である。

たとえば、時刻は散乱あるいは蛍光パラメータとともに
１つの追加のパラメータとしてグラフ上に表示すること
もできるし、またはパラメータの特定の機能を時間変動
しきい値に対してテストしあるいは実験またはテストを
実行するための時間関数として表示することもできる。

時間は同様に時間の経過をマークするために画面上のド
ツトまたは等高カラーを修正することによって表示する
ことができる。そのパラメータの領域を表示する合計１
ビツトカウントのような形態学的ワードの機能は任意の
パラメータのように使用することができる。形態学的値
およびデータから得られる極めて多数の合計パラメータ
は、スライド上の特定の細胞タイプまたは病理学的細胞
を識別するという最終目標を達成するために、パターン
認識または人工知能に記載の技術を用いればよ（分析す
ることができることを意図している。

分析プログラムによって固有のパラメータ値を有する細
胞値がいったん見出されると、テスト標本は顕微鏡ステ
ージ上に置かれ、次にプログラムが呼び出されて検査さ
れるべき細胞のＸ方向およびＹ方向の値のリストを読み
込むことによって順次にこれらの固有の細胞の各々に、
ステージは自動的に中心を合わせることができる。これ
らの細胞の特性はモニター画面上に表示される。ユーザ
はこの画面を用いて、自動データ解析を検査し、細胞を
調べてさらにそれらの病理学的特性を決定し、臨床実験
室における手作業手順の良否をチエツクしまたはクツキ
ーカッターのような装置を用いて注目する細胞を物理的
に分離または分類することができよう。

主として血液リンパ細胞のような活動細胞がテスト中に
ある抗原と反応したときに示す動的挙動は自己免疫疾患
またはがんのような系統的な病理学に対するテストの重
要かつ新しい方法であろう。

上記のようにして、特定の特性を有する細胞が識別され
それらの位置が記憶装置内に記憶可能である。キュベツ
トまたはチャンバー内の標本を再検査しそしてこれらの
特定細胞の新しい値を再計算しリスト化することもでき
る。

本発明による装置は同様に分析の速度を上げるための連
続的な分析技術を意図している。最初のパスの間に見出
される注目する細胞は分析のためにより多くの複雑さと
時間とを特徴とする特性を決定するために、他のパラメ
ータに対してまたはより大きな分解能で検査されよう。

他の実施態様は特許請求の範囲内に記載されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は生物標本の複数の光学的特性の高速度測定装置
の概略図； 第２図は第１図に示す測定器に使用される電気機械回路
のブロック図； 第３図は一般的な光信号データ取得ループのフローチャ
ート； 第４図はレーザビームの走査パターンの概略図第５ａ図
および第５ｄ図は本発明による適切なサンプリング速度
を示す図： 第６図はアナログ光学的データと対応のディジタルデー
タとを示す一連の図； 第７図は記憶装置内に記憶されているデータを処理する
のに使用されるデータ処理機能ステップの７０−チャー
ト； 第８図は前方各散乱値（ｙ軸）に対する実際のテストラ
ンをチャートにした赤色蛍光値（Ｘ軸）図面の浄書（内
容に変更なし） ［図　工］ ［図 ２］ Ｅ図 ５］ 手 続 補 正 書 手 続 補 正 書（方式） ％式％ 生物標本の複数の光学的特性を測定する方法および装置
方法および装置 ７、補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞集団を特徴づける光学的データを発生する方法
   において、この方法が： （ａ）細胞集団内の異なる位置を表わす異なるディジタ
   ルデータサンプルを形成するために細胞集団をビームで
   走査することと； （ｂ）前記ディジタルデータを記憶することと（ｃ）前
   記集団内で１つの細胞を特定することと； （ｄ）その特定された細胞の周りに近傍を規定すること
   と； （ｅ）前記近傍の外側の位置に対応する前記記憶された
   ディジタルデータを基にしてその近傍に対するバックグ
   ラウンドレベルを推定することと；および （ｆ）光学的データを発生するために前記近傍に対応す
   る前記ディジタルデータサンプルの各々を前記推定バッ
   クグラウンドレベルで補正することと； からなるところの細胞集団を特徴づける光学的データを
   発生する方法。 ２、前記サンプル補正ステップが近傍内の前記記憶ディ
   ジタルデータサンプルの各々から対応バックグラウンド
   レベルを減算することを含む請求項１記載の方法。 ３、前記ディジタルデータサンプルが集団内の各細胞の
   複数の形態学的特性を表わす請求項１記載の方法。 ４、前記近傍が与えられた数のサンプル点を含む請求項
   １記載の方法。 ５、前記近傍に対するバックグラウンドレベルが、前記
   近傍内の各サンプル点に対して１つずつの複数の個々の
   バックグラウンドレベルを含む請求項４記載の方法。 ６、前記細胞集団が可動面上にあり、前記走査が前記可
   動面のステップ運動に同期して行われおよび１つのサン
   プルに対応する位置をそこから取得することができるデ
   ィジタル位置データが発生される請求項１記載の方法。 ７、前記可動面上の前記細胞が目視で観察することが可
   能である請求項６記載の方法。 ８、前記近傍のためのバックグラウンドレベルが、前記
   近傍内の各サンプルについての近傍に隣接する実際の位
   置に対応する記憶位置内の最小ディジタルデータサンプ
   ル値を見出すことによって決定される請求項１記載の方
   法。 ９、前記近傍バックグラウンドレベルが、記憶された前
   記近傍の外側のための複数のディジタルデータサンプル
   値の平均を求めることによって決定される請求項１記載
   の方法。 １０、前記細胞集団が可動面上にあり、前記走査が前記
   可動面のステップ運動に同期して行われ、ディジタルデ
   ータが取得された時刻にほぼ対応する時刻が同期ディジ
   タル時刻データとして記録かつ記憶され、および１つの
   サンプルに対応する位置をそこから取得することができ
   るディジタル位置データが発生され、その結果各サンプ
   ルが対応ディジタル時刻点および位置を有する請求項１
   記載の方法。 １１、細胞集団を再走査するステップと；新しいディジ
   タルデータ、位置データおよび時刻データを発生するス
   テップと；および前記細胞集団内の変化を求めるために
   前記新しいデータを前の走査から得られた対応データと
   比較するステップと；をさらに含む請求項１０記載の方
   法。 １２、前記近傍のサイズが単一細胞を統計的に含むよう
   に設定される請求項１記載の方法。 １３、前記特定ステップが前記ビームが最初に接触する
   細胞の縁に対応するディジタルデータサンプルを検出す
   ることを含む請求項１記載の方法。 １４、細胞集団を特徴づける光学的データを発生する方
   法において、この方法が： （ａ）細胞集団内の異なる位置を表わす異なるディジタ
   ルデータサンプルを形成するために細胞集団を細胞とサ
   イズが同等なスポットサイズを有するビームで走査する
   ことであって、ここでスポットが連続するサンプリング
   位置の間を走査される時間当りの走行距離が前記スポッ
   トサイズとほぼ等しくなるように設定されたサンプリン
   グ速度で前記サンプルが取得されるようにして細胞集団
   をビームで走査することと；および （ｂ）集団内の細胞を特徴づける光学的データを発生す
   るためにディジタルデータを処理することと； を含むところの細胞集団を特徴づける光学的データを発
   生する方法。 １５、前記スポットサイズが３ないし５０ミクロンであ
   る請求項１４記載の方法。 １６、前記処理ステップが、前記光学的データを発生す
   るために前記ディジタルデータサンプルをバックグラウ
   ンドレベルで補正することを含む請求項１４記載の方法
   。 １７、細胞集団を特徴づける補正された光学的データを
   発生する方法において、この方法が：（ａ）細胞集団内
   の異なる位置を表わす異なるディジタルデータサンプル
   を形成するために面上の細胞集団を与えられた照度を有
   するビームで走査することと； （ｂ）前記ディジタルデータを記憶することと（ｃ）照
   度補正データを発生するために細胞のない前記面の領域
   を走査することと； （ｄ）前記照度補正データから照度正規化係数を発生し
   かつ前記照度正規化係数を記憶装置内に記憶することと
   ； （ｅ）前記集団内で１つの細胞を特定することと； （ｆ）その特定された細胞の周りに近傍を規定すること
   であって；前記近傍が前記近傍内の前記記憶ディジタル
   データサンプルから取得される光学的データを含むよう
   に該近傍を規定することと；および （ｇ）補正された光学的データを発生するために前記近
   傍内の光学的データを前記照度正規化係数で補正するこ
   とと； を含むところの細胞集団を特徴づける補正された光学的
   データを発生する方法。 １８、前記光学的データ補正ステップが前記光学的デー
   タに前記照度正規化係数を乗算することを含む請求項１
   ７記載の方法。 １９、前記細胞のない面が均一な蛍光染料面を含む補正
   用スライドである請求項１１記載の方法。 ２０、前記細胞のない面が均一な散乱面を含む補正用ス
   ライドである請求項１７記載の方法。 ２１、前記近傍内に含まれている前記光学的データの取
   得が； 前記近傍の外側の位置に対応する記憶ディジタルデータ
   を基にして個々の近傍に対するバックグラウンドレベル
   を推定するステップと；および前記光学的データを発生
   するために各近傍内の前記ディジタルデータサンプルの
   各々を対応の推定バックグラウンドレベルで補正するス
   テップとを含む請求項１１記載の方法。 ２２、（ａ）細胞集団内の異なる位置を表わす異なるデ
   ィジタルデータサンプルを形成するために細胞集団をビ
   ームで走査するステップと； （ｂ）前記ディジタルデータを記憶するステップと； （ｃ）前記集団内で１つの細胞を特定するステップと； （ｄ）その特定された細胞の周りに近傍を規定するステ
   ップであって、前記近傍が前記近傍内の前記記憶ディジ
   タルデータサンプルから取得される光学的データを含む
   ように該近傍を規定するステップと； （ｅ）その近傍に対する光学的近傍値を発生するために
   近傍内のすべての光学的データサンプルの合計を求める
   ステップと； （ｆ）サンプルが予め選択された形態学的しきい値の上
   側または下側のいずれにあるかを示す２進近傍パターン
   を発生するために近傍内の各サンプルを前記しきい値と
   比較するステップと；（ｇ）前記光学的近傍値および２
   進近傍パターンを記憶装置内に記憶するステップと；お
   よび（ｈ）各細胞に対し、前記光学的近傍値に対応する
   光学的特性および前記２進近傍パターンに対応する形態
   学的特性を発生するステップと；からなる細胞特性を測
   定する方法。 ２３、前記光学的特性の発生が： 前記近傍に対応する細胞の光学的特性を発生するために
   １つ以上の前記光学的近傍値に対して数学関数を適用す
   ることを含む請求項２２記載の方法。 ２４、前記形態学的特性の発生が： 前記近傍に対応する細胞の形態学的特性を発生するため
   に１つ以上の前記２進近傍パターンに対してブール関数
   を適用することを含む請求項２２記載の方法。 ２５、前記近傍内に含まれている前記光学的データの取
   得が： 前記近傍の外側の位置に対応する記憶ディジタルデータ
   を基にしてその近傍に対するバックグラウンドレベルを
   推定することと；および 前記光学的データを発生するためにその近傍に対応する
   前記ディジタルデータサンプルを推定バックグラウンド
   レベルで補正することと； を含む請求項２２記載の方法。 ２６、細胞とビームとによって形成される前記ディジタ
   ルデータサンプルがアナログ光学的データから取得され
   る請求項１、１４、１７または２２のいずれかに記載の
   方法。 ２７、前記光学的データが、蛍光、前方角光散乱、消光
   または広角光散乱である請求項２６記載の方法。 ２８、測定すべき細胞を走査される細胞とサイズが同等
   なビームスポットで照明するために電磁放射線ビームを
   発生するビーム源であり、前記スポットが前記細胞を照
   明した結果として光信号が発生される前記ビーム源と； 細胞がその上に載せられる面と； 前記スポットを前記ビーム源から前記面上の細胞へ導く
   ための光路と； 前記スポットが前記面上の複数の細胞上を通過するよう
   に前記ビーム源と細胞との間の前記光路内に挿入されて
   前記スポットを前記面上で走査させるためのスキャナと
   ； 前記光信号を測定するセンサと； 前記光信号を特定速度でサンプリングしかつディジタル
   データを形成するように配置されたアナログ−ディジタ
   ル変換器であって；ここでスポットが連続するサンプリ
   ング位置間を走査される時間当りの走行距離が前記スポ
   ットサイズとほぼ等しくなるように前記サンプリング速
   度が設定されるところの前記アナログ−ディジタル変換
   器と；前記ディジタルデータから光学的データを取得し
   、個々の細胞に対応する前記光学的データから光学的特
   性値を発生し、および細胞特性を求めるために前記光学
   的特性値を処理するデータプロセッサと；および 前記変換器によって形成された前記ディジタルデータを
   記憶する記憶装置と； からなる細胞集団の細胞特性を測定する装置。 ２９、前記スポットサイズが３ないし５０ミクロンであ
   る請求項２８記載の装置。 ３１、前記スキャナが共振検流計スキャナである請求項
   ２８記載の装置。 ３１、前記ビームの波長分布がデータプロセッサによっ
   て制御される請求項２８記載の装置。 ３２、（ａ）細胞集団内の異なる位置を表わす異なるデ
   ィジタルデータサンプルを形成するために細胞集団をビ
   ームで走査するスキャナと； （ｂ）前記ディジタルデータを記憶する記憶装置と； （ｃ）前記集団内で１つの細胞に対応する記憶装置内の
   ディジタルデータサンプルを特定する手段と； （ｄ）その特定された細胞の周りに近傍を規定する手段
   と； （ｅ）前記近傍の外側の位置に対応する記憶ディジタル
   データを基にしてその近傍に対するバックグラウンドレ
   ベルを推定する手段と；および（ｆ）光学的データを発
   生するために近傍に対応する前記ディジタルデータサン
   プルの各々を推定近傍バックグラウンドレベルで補正す
   る手段とからなる細胞集団を特徴づける光学的データを
   発生する装置。 ３３、（ａ）細胞集団内の異なる位置を表わす異なるデ
   ィジタルデータサンプルを形成するために面上の細胞集
   団を与えられた照度を有するビームで走査しかつ照度補
   正データを発生するために細胞のない前記面の領域を走
   査するスキャナと；（ｂ）前記ディジタルデータを記憶
   する記憶装置と； （ｃ）前記照度補正データから照度正規化係数を発生す
   る手段と； （ｄ）前記集団内で１つの細胞に対応する記憶装置内の
   ディジタルデータサンプルを特定する手段と； （ｅ）その特定された細胞の周りに近傍を規定する手段
   であって；前記近傍が前記近傍内の前記記憶ディジタル
   データサンプルから取得される光学的データを含むよう
   に近傍を規定する手段と；および （ｆ）補正された光学的データを発生するために前記近
   傍内の光学的データを前記照度補正正規化係数で補正す
   る手段と； からなる細胞集団を特徴づける補正された光学的データ
   を発生する装置。 ３４、（ａ）細胞集団内の異なる位置を表わす異なるデ
   ィジタルデータサンプルを形成するために細胞集団をビ
   ームで走査するスキャナと； （ｂ）前記ディジタルデータを記憶する記憶装置と； （ｃ）前記集団内で１つの細胞に対応する記憶装置内の
   ディジタルデータサンプルを特定する手段と； （ｄ）その特定された細胞の周りに近傍を規定する手段
   と； （ｅ）その近傍に対する光学的近傍値を発生するために
   近傍内のすべての光学的データサンプルの合計を求める
   加算器と； （ｆ）サンプルが予め選択された形態学的しきい値の上
   側または下側のいずれにあるかを示す２進近傍パターン
   を発生するために近傍内の各サンプルを前記しきい値と
   比較する比較器と； および（ｇ）各細胞に対し、前記光学的近傍値に対応す
   る光学的特性および前記２進近傍パターンに対応する形
   態学的特性を発生する手段と； からなる細胞特性を測定する装置。 ３５、細胞集団内において多数の細胞が一定の光学値を
   有する細胞集団を特徴づける補正された光学的データを
   発生する方法において、 この方法が（ａ）細胞集団内の走査線に沿った異なる位
   置を表わす異なるディジタルデータサンプルを形成する
   ために前記走査線に沿って細胞集団をビームで走査する
   ことと； （ｂ）前記ディジタルデータを記憶することと（ｃ）前
   記集団内で１つの細胞を特定することと； （ｄ）その特定された細胞の周りに近傍を規定すること
   であって、前記近傍が前記近傍内の前記記憶ディジタル
   データサンプルから取得される光学的データを含むよう
   に該近傍を規定することと（ｅ）前記近傍内で最大ディ
   ジタルデータサンプルを求めかつ近傍の中心を前記最大
   ディジタルデータサンプルに移動することと； （ｆ）該中心が移動された近傍に対する光学的近傍値を
   発生するために中心が移動された近傍内のすべての光学
   的データ値の合計を求めることと（ｇ）走査線に沿った
   細胞位置の関数として光学的データを照度差に対して補
   正するための照度正規化係数を発生するために個々の細
   胞を表わす前記光学的データを処理することと； （ｈ）走査線に沿った異なる位置にある各細胞に対する
   光学的近傍値に対応の照度正規化係数を乗算することに
   よってその細胞に対する光学的データを補正することと
   ； を含むところの細胞集団内において多数の細胞が一定の
   光学値を有する細胞集団を特徴づける補正された光学的
   データを発生する方法。 ３６、前記光学的データの前記処理が： （ａ）モード光学値を形成するために発生頻度が最も大
   きい光学的近傍値を求めることと； （ｂ）前記モード光学値の周りの所定範囲内に光学的近
   傍値を有する細胞のサブ集団を選択することと； （ｃ）走査線に沿った細胞位置の関数としてサブ集団内
   の細胞の平均光学的近傍値の１セットを求めることと；
   および （ｄ）照度正規化係数を発生するために走査線に沿った
   各位置のための平均光学値に対するモード光学値の比に
   等しい補正係数の配列を計算することと； を含む請求項５記載の方法。 ３７、前記細胞のサブ集団を選択する光学近傍値の前記
   所定範囲が前記モード光学値のプラス／マイナス２ない
   し６％である請求項３６記載の方法。 ３８、前記細胞のサブ集団が静止相（Ｇ＿０）内にある
   細胞を含む請求項３６記載の方法。 ３９、前記細胞のサブ集団がほぼ同一サイズからなる請
   求項３６記載の方法。 ４０、照度正規化係数を発生するために走査線に沿った
   各位置のための平均光学値に対するモード光学値の比に
   等しい補正係数の配列を計算するステップと；および 走査線に沿った異なる位置にある各細胞に対する光学的
   近傍値に対応の照度正規化係数を乗算することによって
   その細胞に対する光学的データを補正するステップと； が最初に補正された光学的データに対して新しい照度正
   規化係数を計算して前記係数が安定するまで反覆して繰
   り返される請求項３６記載の方法。 ４１、細胞集団を特徴づける補正された光学的データを
   発生する方法において、この方法が： （ａ）走査線に沿った異なる位置を表わす異なるディジ
   タル補正データサンプルを形成するために前記走査線に
   沿って既知の一定のパラメータを含む補正粒子の集団を
   ビームで走査することと； （ｂ）前記ディジタル補正データを記憶することと； （ｃ）前記集団内で１つの補正粒子を特定することと； （ｄ）その特定された粒子の周りに近傍を規定すること
   であって、前記近傍が前記近傍内の前記記憶ディジタル
   補正データサンプルから取得される光学的補正データを
   含むように該近傍を規定することと； （ｅ）前記近傍内で最大ディジタル補正データサンプル
   を求めかつ近傍の中心を前記最大ディジタル補正データ
   サンプルに移動することと； （ｆ）該中心が移動された近傍に対する光学的近傍補正
   値を発生するために中心が移動された近傍内のすべての
   光学的補正データ値の合計を求めることと； （ｇ）走査線に沿った粒子位置の関数として光学的デー
   タを照度差に対して補正するための照度正規化係数を決
   定するために前記光学的補正データを処理することと； （ｈ）細胞集団内の前記走査線に沿った異なる位置を表
   わす異なるディジタルデータサンプルを形成するために
   前記走査線に沿った細胞集団をビームで走査することと
   ； （ｉ）前記ディジタルデータを記憶することと（ｊ）前
   記記憶ディジタルデータから光学的データを取得するこ
   とと；および （ｋ）走査線に沿った異なる位置にある各細胞に対する
   光学的データに対応の照度正規化係数を乗算することに
   よってその細胞に対する光学的データを補正することと
   ； を含むところの細胞集団を特徴づける補正された光学的
   データを発生する方法。 ４２、前記光学的補正データの前記処理が： （ａ）モード光学的補正値を形成するために発生頻度が
   最も大きい光学的補正近傍値を求めることと； （ｂ）走査線に沿った粒子位置の関数として粒子の平均
   光学的補正近傍値の１セットを求めることと；および （ｃ）照度正規化係数を発生するために走査線に沿った
   各位置のための平均光学的補正値に対するモード光学的
   補正値の比に等しい補正係数の配列を計算することと； を含む請求項４１記載の方法。 ４３、見出された各細胞の位置が記録されかつ記憶され
   る請求項１、１４、１７、２２、３５または４１のいず
   れかに記載の方法。 ４４、ディジタルデータが取得された時刻にほぼ対応す
   る時刻が同期ディジタル時刻データとして記録かつ記憶
   され、ここで各サンプルが対応ディジタル時刻点を有す
   る請求項１、１４、１７、２２、３５または４１のいず
   れかに記載の方法。 ４５、前記細胞特定ステップが前記記憶ディジタルデー
   タを所定しきい値と比較することを含む請求項１、１４
   、１１、２２または３５のいずれかに記載の方法。