ES2305992T3

ES2305992T3 - Kit diagnostico.

Info

Publication number: ES2305992T3
Application number: ES05028091T
Authority: ES
Inventors: Ilse Dr. Chudoba; Thomas Dr. Loerch; Andreas Dr. Plesch; Gabriele Dr. Senger
Original assignee: Metasystems Hard and Software GmbH
Current assignee: Metasystems Hard and Software GmbH
Priority date: 1998-02-16
Filing date: 1999-02-10
Publication date: 2008-11-01
Anticipated expiration: 2019-02-10
Also published as: ATE333515T1; EP1672083A1; JP4137269B2; PT957176E; JP2000201699A; ES2270544T3; DK0957176T3; US7050911B1; EP0957176A1; EP0957176B1; DE59914764D1; DE59913678D1; ATE395436T1; US20060122788A1; EP1672083B1

Abstract

Un uso de un kit diagnóstico que contiene al menos dos juegos diferentes de moléculas detectoras marcadas, en el que respectivamente al menos dos juegos son específicos para una determinada región en las moléculas diana y los marcadores de las respectivas moléculas detectoras de estos juegos específicos para una determinada región en las moléculas diana son diferentes, en un método para la detección de modificaciones en biopolímeros como moléculas diana, que comprende las etapas: (a) realización de reacciones de enlace entre las moléculas detectoras de los diferentes juegos y las moléculas diana, uniéndose las respectivas moléculas detectoras marcadas de al menos dos juegos de tal modo a una determinada región de las moléculas diana, que se solapan los diferentes marcadores de las respectivas moléculas detectoras, (b) registro de las intensidades o las relaciones de intensidad de los diferentes marcadores con el uso de un dispositivo de exploración, con el que se registran las intensidades o las relaciones de intensidad de los marcadores en las regiones de marcadores solapantes y no solapantes de las respectivas moléculas detectoras en sentido longitudinal de las moléculas diana, y (c) evaluación de las intensidades o las relaciones de intensidad registradas, dividiendo la molécula diana en varios segmentos pequeños y asignando un color falso a cada uno de estos segmentos en base a las relaciones relativas de intensidad con un programa de cálculo adecuado.

Description

Kit diagnóstico.

La presente invención se refiere a un método para la detección de modificaciones en biopolímeros, particularmente en ADN cromosómico, con el uso de dos o varios juegos diferentes de moléculas detectoras marcadas así como un kit diagnostico para la detección de estas modificaciones.

La representación de cromosomas humanos se ha realizado hasta ahora con técnicas de bandeo, que permiten una identificación específica de los cromosomas mediante bandas claras y oscuras (por ejemplo "bandeo G, bandeo Q, bandeo R" (G-banding, Q-banding, R-banding). Estas técnicas de bandeo se basan en los métodos que se desarrollaron por Caspersson et al. (Exp. Cell Res. 60, 1970, 315-319), Sumner et al. (Nature 232, 1971, 31), Seabright et al. (Lancet 2, 1971, 971-972) y Dutrillaux et al. (C R Acad. Sci. Paris, 272, 1971, 3638-3640). Sin embargo, con estos métodos no se puede definir la identidad de bandas cromosómicas individuales en cada caso, dado que todas las bandas de todos los cromosomas aparecen solamente o bien claras o bien oscuras. Esto se evidencia como una desventaja considerable, dado que los cromosomas pueden ser morfológicamente muy diferentes de célula a célula y de tejido a tejido y presentan en ciertas circunstancias translocaciones (por ejemplo, en tumores), cuya detección puede ser de importancia particular para la persona que se tiene que examinar. Esto es válido, por ejemplo, para la realización del deseo de tener hijos con translocaciones equilibradas (intercambios de parte del cromosoma) de un progenitor, para la identificación de la causa de malformaciones en niños con y sin retraso mental y para el diagnostico de leucemias y otros tumores, que presentan a menudo modificaciones cromosómicas especificas de importancia diagnostica y terapéutica.

Como propuesta para la solución de esta problemática se describió por primera vez la hibridación in situ por fluorescencia (FISH) de forma practicable rutinariamente por Pinkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 1986, 2934-2938). Con este método se pueden representar hoy en día todos los cromosomas humanos de una metafase con colores respectivamente distintos mediante la utilización de bibliotecas de ADN específicas de cromosomas (chromosome painting, 24-colour-FISH, Schröck et al., Science 273, 1996, 496-497; Speicher et al. Nature Genet. 12, 1996, 368-375), y mediante la utilización de vectores, por ejemplos, cósmidos, Pac o YAC, que pueden contener cantidades variables de ADN humano, se puede comprobar la integridad de regiones cromosómicas específicas de nuevo con técnicas multicolor por medio de FISH. De este modo también se pueden identificar partes de genes y elementos de ADN repetitivos con respecto a su localización cromosómica y a su existencia o ausencia. Sin embargo, una representación de varios colores ("multicolor") hasta ahora no es posible para segmentos cromosómicos a nivel de bandas.

El documento WO 97/40191 describe un método de imagen espectral para la detección y para el análisis de diferentes fluorocromos en el bandeo a color de cromosomas (compárese, por ejemplo, con el "Resumen" y la reivindicación 1) y Müller, S et al, 1997 (Hum Genet (1997) 100:271-278) describe un método en el que se hibridan in situ dos juegos marcados con diferentes fluorocromos de sondas de ADN subregionales (juego de ADN) sobre cromosomas en metafase humanos. (Compárese por ejemplo con el "Resumen").

De este modo, la presente invención tiene el objetivo de preparar un método nuevo o mejorado para la detección particularmente de modificaciones en ADN cromosómico, que debe posibilitar una representación multicolor a nivel de banda.

Este objetivo se resuelve mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones de la presente invención.

Particularmente se proporciona un método de un kit diagnóstico que contiene al menos dos juegos diferentes de moléculas detectoras marcadas, donde respectivamente al menos dos juegos son específicos para una región determinada en las moléculas diana y los marcadores de las respectivas moléculas detectoras de estos juegos específicos para una determinada región en las moléculas diana son diferentes, en un método para la detección de modificaciones en biopolímeros como moléculas diana, que comprende las etapas:

(a): realización de reacciones de enlace entre las moléculas detectoras de los diferentes juegos y las moléculas diana, uniéndose las respectivas moléculas detectoras marcadas de al menos dos juegos de tal modo a una región determinada de las moléculas diana, que se solapan los diferentes marcadores de las respectivas moléculas detectoras,

(b): registro de las intensidades o las relaciones de intensidad de los diferentes marcadores con el uso de un dispositivo de exploración, con el que se registran las intensidades o las relaciones de intensidad de los marcadores en las regiones de marcadores solapantes y no solapantes de las respectivas moléculas detectoras en sentido longitudinal de las moléculas diana, y

(c): evaluación de las intensidades o las relaciones de intensidad registradas, dividiendo la molécula diana en varios segmentos pequeños y asignando un color falso a cada uno de estos segmentos en base a las relaciones relativas de intensidad con un programa de cálculo adecuado.

La expresión "biopolímeros como moléculas diana" significa ADN, preferiblemente ADN cromosómico, ARN o polipéptidos. Las moléculas diana se pueden disponer o inmovilizar de forma correspondiente antes de la realización del uso de acuerdo con la invención, por ejemplo, mediante separación electroforética en gel en una matriz adecuada o mediante fijación o disposición de, por ejemplo, cromosomas metafásicos o de núcleos interfásicos sobre un soporte adecuado.

La expresión "moléculas detectoras marcadas" significa ácidos nucleicos o anticuerpos que comprenden respectivamente al menos un marcador. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Las expresiones "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" o "sondas de ácido nucleico" significan moléculas de ácido nucleico nativas, semisintéticos o modificados a partir de desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos y/o nucleótidos modificados como aminonucleótidos o nucleótidos [\alpha-S]-trifosfato. En una realización preferida de la presente invención, los ácidos nucleicos proceden de ADN cromosómico de, por ejemplo, mamíferos como homo sapiens sapiens. El ADN cromosómico como moléculas detectoras se encuentra en vectores, por ejemplo, cósmidos o YAC, o procede de bibliotecas de ADN cromosómico o específicas de región cromosómica, que se pueden obtener, por ejemplo, por métodos de microdisección o clasificación por citometría de flujo activada por láser de cromosomas específicos y, si es necesario, amplificación posterior mediante, por ejemplo, DOP-PCR.

El término "marcador" significa átomos o moléculas adecuados, detectables directamente o indirectamente, que se incluyen en las moléculas detectoras o están unidos a las mismas. Son marcadores adecuados, por ejemplo, los que comprenden colorantes fluorescentes acoplados a nucleótidos y/o, por ejemplo, biotina y/o digoxigenina y/o nucleótidos marcados con isótopos radiactivos. En una realización preferida, el compuesto marcador es un colorante fluorescente con una diferencia suficiente para la selección de pequeñas cantidades de sustancia en el comportamiento fluorescente de los espectros de emisión, como por ejemplo, cumarinas y rodaminas y/o la semivida de fluorescencia como, por ejemplo, isotiocianatos fluorescentes y/o avidinas marcadas con quelato de europio y/o marcadas con porfirina.

La expresión "reacción de enlace" significa una hibridación, preferiblemente una hibridación in situ, o una reacción antígeno/anticuerpo, dependiendo de la selección de las moléculas detectoras y/o de las moléculas diana. La expresión "hibridación in situ" significa la adición como molécula detectora de una sonda de ADN/ARN obtenida sintéticamente y provista de marcadores biológicos, físicos o químicos para la detección a secuencias de ADN/ARN nativas presentes en la naturaleza, consiguiéndose la adición mediante desnaturalización y renaturalización de los ácidos nucleicos correspondientes. Naturalmente, estas sondas de ADN/ARN contienen al menos un segmento de secuencia apto para la hibridación con una secuencia de ADN/ARN de la molécula diana, como un cromosoma. Este segmento de secuencia comprende una región de secuencia específica, presente de forma individual, de preferiblemente 100 a 1000 pares de bases de longitud de la molécula detectora, que se une a una región complementaria de la molécula diana a una temperatura adecuada, preferiblemente de 50ºC o inferior, y con una concentración salina adecuada, que contiene preferiblemente 50-300 mmol/l de iones monovalentes y 0-10 mmol/l de iones bivalentes, con formación de enlaces de puente de hidrógeno. La reacción de enlace de los respectivos juegos de moléculas detectoras marcadas se puede realizar de forma simultánea o sucesiva.

La expresión "juego de moléculas detectoras" significa moléculas detectoras que son específicas para una región determinada de las moléculas diana. Este juego de moléculas detectoras puede ser, por ejemplo, ADN cromosómico que se encuentra en vectores o una biblioteca de ADN específica de cromosoma. El marcado de las moléculas detectoras en el juego puede ser igual o diferente, por ejemplo, puede contener tres marcadores diferentes.

La expresión "al menos dos o varios juegos diferentes de moléculas detectoras marcadas" significa la existencia de al menos un par de juegos diferentes, donde los juegos de este par, en una zona o región determinada de las moléculas diana, se unen de tal modo que se solapan al menos los marcadores diferentes de las respectivas moléculas detectoras, preferiblemente los sitios de unión de las respectivas moléculas detectoras de estos diferentes juegos. Esta característica de acuerdo con la invención de un par de juegos diferentes significa que las respectivas moléculas detectoras en los diferentes juegos de un par, que se produce u obtiene por solapamiento de esta región determinadas de las moléculas diana, se pueden usar como patrón o para ensayos comparativos con muestras procesadas correspondientemente de pacientes. En una realización de acuerdo con la invención, las moléculas detectoras de un juego están configuradas preferiblemente de tal modo que después de la hibridación, las moléculas detectoras, con concentración modificada de forma continua, preferiblemente a modo de una distribución gaussiana, están unidas en sentido longitudinal a las moléculas diana, por ejemplo, cromosomas.

La evaluación cualitativa y cuantitativa de los enlaces obtenidos por los diferentes marcadores de las moléculas detectoras se puede usar, con el uso de un equipo de exploración o de un dispositivo para la exploración dirigida, por ejemplo, a lo largo de o en el sentido longitudinal del cromosoma que se tiene que estudiar. Un equipo de exploración de este tipo es, por ejemplo, un microscopio de fluorescencia. Por los marcadores físicos y/o químicos y/o biológicos de las moléculas detectoras, que se han unido a las moléculas diana deseadas, se pueden registrar mediante el equipo de exploración señales formadoras de imágenes por una unidad de procesamiento de imágenes, por ejemplo, una cámara CCD, que procesa de manera adecuada, asistida por ordenador, las señales individuales de los diferentes marcadores. Con esta unidad de procesamiento de imágenes acoplada al dispositivo de exploración se pueden registrar las intensidades o las relaciones de intensidad de los diferentes marcadores en las regiones de marcadores solapantes o no solapantes de las respectivas moléculas detectoras preferiblemente en sentido longitudinal de las moléculas diana, particularmente de cromosomas metafásicos fijados, y se pueden evaluar tanto de forma cualitativa como cuantitativa.

El uso de acuerdo con la invención se puede utilizar particularmente para la comprobación o exclusión de modificaciones cromosómicas en la genética humana, como recolocaciones equilibradas de cromosomas, que de forma conocida son de gran importancia para la realización del deseo de tener hijos en portadores de una modificación de este tipo, modificaciones equilibradas y no equilibradas de cromosomas como causa de malformaciones y/o retraso mental, y en el diagnóstico de tumores, tanto de tumores sólidos como de neoplasias hematológicas (AML, ALL, MDS, entre otros),por un lado para la detección de modificaciones conocidas, relevantes para el pronóstico, por otro lado, para la determinación de otras modificaciones hasta ahora desconocidas.

Un objeto adicional de la presente invención es una corrección automática por adición de una sonda de ADN localizada.

En el caso de la exploración de muestras específicas de regiones de cromosoma marcadas con diferentes fluorocromos, tal como se utilizan para el método del bandeo multicolor, se usa una cámara CCD monocroma en combinación con filtros de fluorescencia específicos. Las señales de los fluorocromos individuales se registran sucesivamente como imágenes individuales y posteriormente se componen en una imagen a color. A este respecto no se puede evitar un desplazamiento de la posición de las imágenes individuales entre sí debido a influencias ópticas de los filtros (diferentes errores de cuña óptica, desplazamiento paralelo por ligera inclinación de la trayectoria de los rayos). No es posible una corrección interactiva o automática con la precisión necesaria, por ejemplo, por una correlación de las imágenes individuales, dado que las sondas que se solapan en todo caso parcialmente no presentan estructuras comunes que se puedan utilizar para un solapamiento posterior. Cada ligero desplazamiento conduce en la evaluación de las relaciones de intensidad a artefactos en el patrón de bandeo.

La corrección automática se posibilita añadiendo una sonda de ADN localizada, que está marcada de manera simultánea con todos los fluorocromos usados de acuerdo con el método. De este modo se dispone de una estructura idéntica en todas las imágenes individuales para la corrección automática de la posición. La corrección de la posición se puede realizar, por ejemplo, por una determinación del punto principal de la intensidad de la sonda en cada imagen individual y desplazamiento relativo posterior de las imágenes individuales de tal modo que los puntos principales de las imágenes individuales se encuentren en la misma posición.

Mediante la utilización de dos sondas diferentes también se pueden detectar y corregir giros de las imágenes entre sí.

La utilización de incluso más sondas posibilita básicamente la corrección de transformaciones de posición más complejas que la traslación y la rotación, como por ejemplo, modificaciones de escala.

Además puede ser ventajoso en una realización preferida adicional de la presente invención añadir sondas de calibración (sondas de ADN o partículas fluorescentes) de intensidad conocida, que pueden servir para la normalización de las intensidades de las señales de fluorescencia que se tienen que evaluar.

Además puede ser ventajoso en una realización preferida adicional de la presente invención añadir sondas de ADN cuyas localizaciones exactas en el interior del genoma sean conocidas y que se puedan usar para establecer la relación entre bandas de color y las bandas ISCN.

Las Figuras muestran:

La Figura 1 es una representación fotográfica para la evaluación cualitativa y cuantitativa de la localización de coloraciones específicas de región en el cromosoma 5. En la parte superior de esta Figura se representa de manera gráfica la distribución de las moléculas detectoras marcadas en sentido longitudinal del cromosoma así como las intensidades de los diferentes marcadores de las moléculas detectoras.

La Figura 2 es una representación tabular del patrón de marcado del segmento de cromosoma específico de región del cromosoma 5 representado en la Figura 1. Cy5, TR (Texas Red), Cy5.5, SO (Spectrum Orange), SG (Spectrum Green) son los diferentes colorantes fluorescentes que se han usado para el marcado de las bibliotecas de ADN específicas de región individuales. La asignación se caracteriza mediante un cuadrado relleno (\blacksquare). Los marcados que se producen mediante el solapamiento de las bibliotecas de ADN en la región correspondiente se indican mediante un cuadrado vacío (\Box).

La Figura 3 muestra respectivamente los cromosomas 5 normales homólogos de dos placas de metafase diferentes con bandeo multicolor. La representación hace evidente que el patrón de bandeo en los cromosomas homólogos es idéntico y también se puede reproducir de placa de metafase a placa de metafase.

La Figura 4 muestra una representación fotográfica de una FISH-multicolor de una placa de metafase con modificaciones cromosómicas complejas.

La Figura 5 muestra los cromosomas 5 en un caso de leucemia mielocítica aguda. En el lado derecho se representa respectivamente el cromosoma 5 normal, el cromosoma en el lado izquierdo muestra una deleción intersticial en el brazo largo.

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El siguiente ejemplo explica la invención.

Ejemplo

Se produjeron, para el patrón de bandas multicolor del cromosoma 5, en total 7 bibliotecas de microdisección específicas de región de cromosoma (Meltzer et al., Nature Genet. 1, 1992, 24-28). Para esto se dividió el brazo p del cromosoma 5 en dos regiones, el brazo que, en cuatro. Se aislaron por región de cromosomas respectivamente 8-10 fragmentos con una aguja de vidrio fina del portaobjetos bajo el microscopio (Senger et al., Hum. Genet. 84, 1990, 507-511). Se amplificó el ADN obtenido de este modo por una DOP-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con oligonucleótidos degenerados, Telenius et al., Genomics 13, 1992, 718-725; Zhang et al., Blood 81, 1993, 3365-3371). Se marcaron en una reacción posterior estas bibliotecas de ADN específicas de región de cromosoma parcialmente de forma directa con fluorocromos, que se encuentran acoplados a nucleótidos (por ejemplo, Spectrum Orange-dUTP, Spectrum Green-dUTP, ambos de Vysis, y Texas Red-dUTP, Molecular Probes). Por otra parte se marcaron las bibliotecas de ADN con nucleótidos, que están acoplados a haptenos (por ejemplo, dUTP-biotina y dUTP-digoxigenina, Boehringer, Mannheim). Después de realizarse la hibridación, se pueden detectar los haptenos con reactivos de detección adecuados (por ejemplo, avidina-Cy5, Amersham e IgG anti-digoxigenina, Boehringer, Mannheim, que está acoplado a Cy5.5, kit de marcado con mAb, Amersham).

La hibridación, las etapas de lavado y la detección se realizan de acuerdo con protocolos convencionales (Senger et al., Cytogenet, Cell. Genet. 64, 1993, 49-53).

El análisis se realiza por ejemplo con un microscopio de fluorescencia, que está equipado con juegos de filtros adecuados. Por cada canal cromático se registran imágenes por separado, que posteriormente se pueden procesar con un ordenador.

Un rasgo característico de las sondas de colores parciales que se obtienen mediante microdisección, es una señal de fluorescencia que va atenuándose continuamente en las zonas del borde. Mediante solapamiento simultáneo de las sondas y, por tanto, de las señales de fluorescencia de dos sondas de colores parciales adyacentes se produce una relación que se modifica de forma continua de las intensidades de fluorescencia a lo largo del cromosoma 5. Si se distribuye un cromosoma coloreado de este modo en varios (20-25) segmentos pequeños, por un programa de cálculo se puede asignar a cada de uno de estos sectores, basándose en las intensidades relativas de fluorescencia de todos los fluorocromos usados, un color falso. Mediante esta adjudicación se produce un patrón de banda coloreado a lo largo de un cromosoma, en este caso, del cromosoma 5. En el caso de todas las hibridaciones adicionales con el mismo juego de muestras puede usarse la misma combinación de relación de fluorescencia y colores falsos.

Dado que la hibridación se comporta de manera lo suficientemente constante, se puede reproducir incluso el patrón de bandas de forma correspondiente (Figura 3). No se observa en este caso ninguna perdida de la capacidad de resolución en cromosomas más cortos, tal como se conoce de los métodos de bandeo habituales hasta ahora (por ejemplo bandeo GTG). Se consigue un patrón reproducible para el cromosoma 5 de al menos 25 bandas. Esto corresponde a un nivel de bandas de aproximadamente 550 bandas por juego haploide de cromosomas.

Con la ayuda de este método es posible detectar modificaciones en cromosomas independientemente de su estado de condensación. Esto es importante incluso en la citogenética de tumores. Los cromosomas de tumor muestran a menudo una resolución baja del patrón de bandas, por lo que se dificulta considerablemente un reconocimiento de modificaciones cromosómicas. Por tanto, se ha de suponer que hay las modificaciones citogenéticas hasta ahora desconocidas en tumores, que posiblemente representan un factor de pronóstico importante y, por tanto, puede tener importancia, por ejemplo, para una terapia adaptada al riesgo. De acuerdo con la invención también pueden conseguirse en cromosomas de tumor después de la hibridación con el juego de muestras descrito con más detalle anteriormente al menos 25 bandas para el cromosoma 5 (Figura 5).

Claims

1. Un uso de un kit diagnóstico que contiene al menos dos juegos diferentes de moléculas detectoras marcadas, en el que respectivamente al menos dos juegos son específicos para una determinada región en las moléculas diana y los marcadores de las respectivas moléculas detectoras de estos juegos específicos para una determinada región en las moléculas diana son diferentes, en un método para la detección de modificaciones en biopolímeros como moléculas diana, que comprende las etapas:

(a): realización de reacciones de enlace entre las moléculas detectoras de los diferentes juegos y las moléculas diana, uniéndose las respectivas moléculas detectoras marcadas de al menos dos juegos de tal modo a una determinada región de las moléculas diana, que se solapan los diferentes marcadores de las respectivas moléculas detectoras,

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las moléculas detectoras marcadas se seleccionan de ácidos nucleicos o anticuerpos.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que los respectivos juegos de ácidos nucleicos proceden de diferentes bibliotecas de ADN específicas de región de cromosoma.

4. El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada juego de moléculas detectoras contiene uno o varios marcadores diferentes.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el marcador comprende un colorante fluorescente.

6. El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se añade al menos una sonda de ADN marcada con al menos dos de los N fluorocromos usados para la detección de un desplazamiento relativo provocado de forma óptica de la información de imagen de los fluorocromos y para la corrección de su posición.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que se añade al menos una sonda de ADN marcada con todos los N fluorocromos utilizados para la corrección simultánea de la posición de todos los fluorocromos.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que están marcadas N-1 sondas de ADN con respectivamente dos fluorocromos adecuados y la corrección de la posición se realiza por pares.

9. El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se añaden sondas de calibración de intensidad conocida o constante reproducible para la normalización de las intensidades de señal.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que las sondas de calibración son sondas de ADN marcadas con fluorescencia.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que las sondas de calibración son partículas marcadas con fluorescencia.

12. El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que se añaden sondas de ADN adicionales para una asignación directa de bandas de color a la nomenclatura ISCN.

13. El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 a 12, en el que estas sondas se usan al mismo tiempo para la corrección de la posición y/o la normalización de la intensidad.

14. El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13 para la detección de modificaciones cromosómicas en genética humana y en el diagnóstico de tumores.