ES2235882T3 - Hibridacion por fluorescencia comparativa a microseries de oligonucleotidos. - Google Patents

Abstract

Un método para comparar el número de copias de secuencias de ácidos nucleicos en dos o más colecciones de moléculas de ácido nucleico, método que comprende: (a) preparar una primera colección representativa y una segunda colección representativa de secuencias de ácidos nucleicos marcadas, a partir de una primera fuente de ácidos nucleicos y de una segunda fuente de ácidos nucleicos, respectivamente, (i) poniendo en contacto la primera y la segunda fuente con cebadores de PCR que comprenden secuencias presentes en los ácidos nucleicos fuente, y adaptadores que comprenden secuencias que no están presentes en los ácidos nucleicos fuente, produciendo de este modo un juego de ácidos nucleicos amplificados que comprenden secuencias diana; y (ii)poner en contacto el juego de ácidos nucleicos amplificados, producidos en la etapa (i), con cebadores que hibridan de forma específica con los adaptadores, produciendo de este modo, por amplificación de PCR, una primera y una segunda colección de secuencias de ácidos nucleicos marcadas de complejidad reducida, en comparación con la primera fuente de ácidos nucleicos y la segunda fuente de ácidos nucleicos; en donde la primera y segunda colecciones de secuencias de ácidos nucleicos marcadas son distinguibles entre sí; y (b) poner en contacto la primera y la segunda colecciones con una pluralidad de elementos diana que comprenden oligonucleótidos diana unidos a una superficie sólida; en donde la primera colección de secuencias de ácidos nucleicos marcadas comprende una secuencia que hibrida específicamente con un oligonucleótido diana; y en donde la segunda colección de secuencias de ácidos nucleicos marcadas comprende una secuencia que hibrida específicamente con el oligonucleótido diana; y (c) comparar el número de copias, determinando la cantidad de hibridación específica de la primera y segunda colecciones de secuencias de ácidos nucleicos marcadas con los elementos diana.

Description

Hibridación por fluorescencia comparativa a microseries de oligonucleótidos.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a métodos mejorados para detectar y mapear anomalías genéticas asociadas con diversas enfermedades. En particular, se refiere al uso de métodos de hibridación de ácidos nucleicos para comparar números de copias de secuencias particulares de ácidos nucleicos en una colección de secuencias, en relación con el número de copias de estas secuencias en otras colecciones de secuencias.

Numerosos estudios genómicos y genéticos están dirigidos a la identificación de diferencias en la dosificación o expresión de genes entre poblaciones celulares para el estudio y detección de enfermedades. Por ejemplo, muchos tumores malignos implican la ganancia o pérdida de secuencias de ADN, que tiene como consecuencia de activación de oncogenes o la inactivación de genes supresores de tumores. La identificación de los acontecimientos genéticos que dan lugar a la transformación neoplásica y subsiguiente progresión puede facilitar los esfuerzos para definir la base biológica de enfermedades, mejorar el pronóstico de la respuesta terapéutica, y permitir la detección precoz de tumores. Adicionalmente, los problemas genéticos perinatales son, a menudo, consecuencias de la pérdida o ganancia de segmentos cromosómicos, tales como la trisomía del 21 o los síndromes de microdeleciones.

La citogenética es el método tradicional para detectar regiones cromosómicas amplificadas o delecionadas. Métodos más recientes permiten evaluar la cantidad de una secuencia determinada de ácido nucleico usando técnicas moleculares. Estos métodos (por ejemplo, transferencia de Southern) emplean sondas de ADN o ARN clonadas que se hibridan con ADN aislado. La transferencia de Southern y técnicas relacionadas son efectivas incluso si el genoma presenta una fuerte disposición en serie, de manera que se elimina valiosa información sobre el cariotipo. Sin embargo, estos métodos requieren el uso de una sonda específica para la secuencia a analizar. De este modo, es necesario utilizar un número muy elevado de sondas individuales, una cada vez, para analizar la totalidad del genoma de cada muestra, si no se dispone de información previa sobre regiones sospechosas particulares del genoma.

La hibridación genómica comparativa (CGH) es un enfoque reciente para detectar la presencia e identificar la localización de secuencias amplificadas o delecionadas. Véanse, Kallioniemi et al., Science 258: 818-821 (1992) y la Patente de EE.UU. nº 5.665.549. La CGH revela incrementos y reducciones, independientemente del reseriado del genoma. En una implementación de la CGH, se aísla ADN genómico de células de referencia normales, así como de células de ensayo (por ejemplo, células tumorales). Las dos secuencias de ácidos nucleicos se marcan de manera diferencial y, a continuación, se hibridan in situ con cromosomas en metafase de una célula de referencia. Las secuencias repetitivas de los ADN tanto de referencia como de ensayo se eliminan, o se reduce su capacidad de hibridación por algún medio. Es posible identificar rápidamente regiones cromosómicas en las células de ensayo que tienen un número de copias aumentado o disminuido, por medio de la detección de regiones en las que la relación de señal de los dos ADN está alterada. Por ejemplo, las regiones con una reducción del número de copias en las células de ensayo mostrarán una señal relativamente más baja del ADN de ensayo que la referencia, en comparación con otras regiones del genoma. Las regiones con un incremento del número de copias en las células de ensayo mostrarán una señal relativamente más alta del ADN de ensayo.

También se han descrito técnicas de CGH mejoradas. Por ejemplo, la CGH aplicada a series permite una localización más precisa de anomalías cromosómicas que el uso de difusiones de metafase como diana (véase la Patente de EE.UU. nº 5.830.645). La Patente de EE.UU. nº 5.830.645 describe métodos para determinar el número relativo de copias de ácidos nucleicos diana y el mapeo de anomalías cromosómicas asociadas con enfermedades. Los métodos usan ácidos nucleicos diana inmovilizados sobre una superficie sólida, sobre los que se hibrida una muestra que comprende dos conjuntos de ácidos nucleicos marcados de manera diferencial.

Chee et al. (Science 274: 610-614, 1996) describen un programa de marcado de dos colores que permite la comparación simultánea de una diana polimórfica frente a un ADN o ARN de referencia. Fodor et al. (Science 251: 767-773, 1991) describen una combinación de química de fase sólida, grupos protectores fotolábiles y fotolitografía para alcanzar la síntesis química paralela, espacialmente dirigida y orientada a la luz de un conjunto diverso de productos químicos. Schuber et al. (Genome Research 5: 488-493, 1995) describen un método para PCR múltiples basado en el uso de cebadores quiméricos, cada uno de los cuales contiene una región 3' complementaria a sitios de reconocimiento específicos para la secuencia, y una región 5' preparada a partir de una secuencia de 20 nucleótidos no relacionados.

A pesar de estas mejoras, existe la necesidad constante de métodos de mejora del análisis genético, que proporcionen resultados rápidos y fiables. La presente invención se refiere a estas y otras necesidades.

Resumen de la invención

La presente invención ofrece métodos para comparar cuantitativamente el número de copias de una secuencia de ácidos nucleicos en una primera colección de moléculas de ácidos nucleicos marcadas, en relación con el número de copias de esa misma secuencia en una segunda colección de secuencias de ácidos nucleicos marcadas. El método comprende marcar las moléculas de ácidos nucleicos en la primera colección y las moléculas de ácidos nucleicos de la segunda colección con, respectivamente, una primera y una segunda marca. La primera y segunda marcas deben ser distinguibles entre sí. Las colecciones se ponen en contacto con una pluralidad de oligonucleótidos diana (una microserie) bajo condiciones tales que puede producirse la hibridación de los ácidos nucleicos con los elementos diana. Las dos colecciones se pueden poner en contacto con los elementos diana tanto simultáneamente como de forma seriada.

Las dos colecciones de secuencias de ácidos nucleicos marcadas se preparan amplificando específicamente secuencias que hibridan de manera específica con los oligonucleótidos diana de la fuente. Esta amplificación produce una colección representativa de secuencias de ácidos nucleicos, lo que significa que la amplificación es cuantitativa y que da como resultado una colección de complejidad reducida. Como se explica más adelante, una colección representativa de secuencias de ácidos nucleicos es aquella en la que se mantiene la relativa abundancia de secuencias particulares en los ácidos nucleicos de fuente en los ácidos nucleicos marcados que se usan en los ensayos de la invención (es decir, es cuantitativa). Adicionalmente, la colección de secuencias de ácidos nucleicos marcadas presenta una complejidad mucho menor, comparada con las moléculas de ácidos nucleicos de fuente. Esta disminución de la complejidad es ventajosa, porque aumenta la velocidad de hibridación, en comparación con la hibridación que utiliza colecciones altamente complejas de secuencias de ácidos nucleicos marcadas.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para comparar el número de copias de secuencias de ácidos nucleicos en dos o más colecciones de moléculas de ácidos nucleicos, comprendiendo el método: (a) preparar una primera colección representativa y una segunda colección representativa de secuencias de ácidos nucleicos marcadas a partir de una primera fuente de ácidos nucleicos y una segunda fuente de ácidos nucleicos, respectivamente, mediante: (i) la puesta en contacto de la primera fuente y de la segunda fuente con cebadores de PCR que comprenden secuencias presentes en los ácidos nucleicos de fuente, y adaptadores que comprenden secuencias no presentes en los ácidos nucleicos de fuente, produciendo de este modo un conjunto de ácidos nucleicos amplificados que comprenden secuencias diana; y (ii) poner en contacto el conjunto de ácidos nucleicos amplificados, producido en la etapa (i) con cebadores que hibridan específicamente con los adaptadores, produciendo de esta forma, por amplificación de PCR, una primera y una segunda colección de secuencias de ácidos nucleicos marcadas de complejidad reducida, en comparación con la primera fuente de ácidos nucleicos y la segunda fuente de ácidos nucleicos, en las que la primera y segunda colecciones de secuencias de ácidos nucleicos marcadas se distinguen entre sí; y (b), poner en contacto la primera y segunda colecciones con una pluralidad de elementos diana que comprenden oligonucleótidos diana unidos a una superficie sólida; en donde la primera colección de secuencias de ácidos nucleicos marcadas comprende una secuencia que hibrida específicamente con un oligonucleótido diana; y en donde la segunda colección de secuencias de ácidos nucleicos marcadas comprende una secuencia que hibrida específicamente con el oligonucleótido diana; y (c) comparar el número de copias por medio de la determinación de la cantidad de hibridación específica de la primera y segunda colecciones de secuencias de ácidos nucleicos marcadas con los elementos diana.

Los oligonucleótidos diana y las secuencias de ácidos nucleicos marcadas pueden ser, por ejemplo, ARN, ADN o ADNc. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden derivar de cualquier organismo. Habitualmente, el ácido nucleico en los elementos diana y las secuencias de ácidos nucleicos marcadas proceden de la misma especie.

Los elementos diana están dispuestos típicamente en localizaciones discretas separadas sobre una superficie sólida. Los oligonucleótidos diana en un elemento diana son aquellos para los que se desea una información comparativa sobre el número de copias. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden proceder de una localización cromosómica de la que se sabe que está asociada con una enfermedad, se pueden seleccionar para sean representativos de una región cromosómica cuya asociación con una enfermedad se debe ensayar, o pueden corresponderse con genes cuya trascripción se debe analizar.

Después de poner en contacto las secuencias de ácidos nucleicos marcadas con los elementos diana, se determina la cantidad de fijación de cada uno y la relación de fijación para cada elemento diana. Típicamente, cuanto mayor es la relación de fijación a un elemento diana, mayor es la relación del número de copias de secuencias en las dos secuencias de ácidos nucleicos marcadas que se fijan a ese elemento. De este modo, la comparación de las relaciones entre los elementos diana permite la comparación de relaciones de números de copias de diferentes secuencias en las secuencias de ácidos nucleicos marcadas.

Los métodos se llevan a cabo, típicamente, usando técnicas adecuadas para la hibridación de fluorescencia in situ. De esta forma, la primera y segunda marcas son habitualmente marcas fluorescentes.

En una realización típica, se prepara una colección de secuencias de ácidos nucleicos marcadas a partir de una célula, población celular de ensayo, o de un tejido en estudio; y la segunda colección de secuencias de ácidos nucleicos marcadas se prepara a partir de una célula, población celular o tejido de referencia. Células de referencia pueden ser células sanas normales, o pueden proceder de una muestra de tejido enfermo que sirve como estándar para otros aspectos de la enfermedad. Por ejemplo, si el ácido nucleico de referencia es ADN genómico aislado de células normales, entonces el número de copias de cada secuencia en esa colección, en relación a las otras, es conocido (por ejemplo, dos copias de cada secuencia autosómica, y una o dos copias de cada secuencia de cromosomas sexuales, dependiendo del sexo). La comparación de esto con el ADN preparado a partir de una célula de ensayo permite la detección de variaciones con respecto a la normalidad.

De manera alternativa, la colección de referencia de secuencias de ácidos nucleicos marcadas se puede preparar a partir de ADN genómico procedente de un tumor primario, que puede contener variaciones sustanciales en el número de copias entre sus diferentes secuencias, y el ensayo se puede preparar a partir de ADN genómico de células metastáticas de ese tumor, de modo que la comparación muestra las diferencias entre el tumor primario y sus metástasis. Además, ambas colecciones se pueden preparar a partir de células normales. Por ejemplo, la comparación de poblaciones de ARNm entre células normales de diferentes tejidos permite la detección de expresión génica diferencial, que es una característica crítica de la diferenciación de tejidos. De esta forma, en general, los términos ensayo y referencia se usan por comodidad para distinguir las dos colecciones, pero no implican otras características de las secuencias de ácidos nucleicos que contienen.

También se describen kits que comprenden materiales útiles para llevar a cabo los métodos de la invención. Los kits comprenden un soporte sólido que tiene una serie de secuencias de ácidos nucleicos diana unidos al mismo, y un recipiente que contiene secuencias de ácidos nucleicos que representan un genoma de referencia normal, o ADNc de un tipo de célula de referencia, y similares. El kit puede comprender, adicionalmente, dos fluorocromos diferentes, reactivos para marcar los genomas de ensayo, genomas de referencia alternativos, y similares.

Definiciones

El término "complejidad" se utiliza en este documento de acuerdo con el significado convencional del término, establecido por Britten et al., Methods of Enzymol. 29: 363 (1974). Véase, también, Cantor y Schimmel, Biophysical Chemistry: Part III en 1228-1230, para una explicación adicional sobre la complejidad de los ácidos nucleicos.

Las expresiones "que hibridan específicamente con" e "hibridación específica" e "hibridan selectivamente con", como se usan en este documento, se refieren a la unión, duplicación o hibridación de una molécula de ácido nucleico, preferentemente con una secuencia de nucleótidos particular bajo condiciones rigurosas. La expresión "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda hibridará, preferentemente, con su sub-secuencia diana y, en menor grado, o no lo hará en absoluto, con otras secuencias. Una "hibridación rigurosa" y "condiciones de lavado de hibridación rigurosas", en el contexto de la hibridación de ácidos nucleicos (por ejemplo, como en serie, hibridaciones de Southern o Northern), son dependientes de la secuencia y son diferentes bajo distintos parámetros ambientales. Se dispone de una amplia guía sobre la hibridación de ácidos nucleicos en, por ejemplo, Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, NY ("Tijssen"). En general, las condiciones de hibridación y lavado altamente rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC más bajas que el punto de fusión térmico (T_{m}) para la secuencia específica a una potencia iónica y pH definidos. La T_{m} es la temperatura (bajo potencia iónica y pH definidos) a la que 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente compatible. Las condiciones muy rigurosas se seleccionan para que sean iguales a la T_{m} para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que poseen más de 100 residuos complementarios en una serie, o en un filtro en una transferencia de Southern o de Northern, es de 42ºC usando soluciones de hibridación convencionales (véase, por ejemplo, Sambrook (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harnor Press, NY y discusión detallada, más adelante), llevándose a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente rigurosas es NaCl 0,15 M a 72ºC durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado de 0,2x SSC a 65ºC durante 15 minutos (véase, por ejemplo, en Sambrook, obra citada, una descripción del tampón SSC). Un lavado riguroso típico para una hibridación de serie es 50% de formamida, 2X SSC a 35ºC a 60ºC. A menudo, un lavado altamente riguroso va precedido por un lavado menos riguroso, para eliminar la señal de sonda de fondo. Un ejemplo de lavado medianamente riguroso para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1x SSC a 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de baja rigurosidad para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4x a 6x SSC a 40ºC durante 15 minutos.

La expresión "secuencia de ácidos nucleicos marcada", como se usa en este documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico unida a una composición detectable, es decir, una marca. La detección se puede realizar, por ejemplo, por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, físicos o químicos. Por ejemplo, marcas de utilidad incluyen ^{32}P, ^{35}S, ^{3}H, ^{14}C, ^{125}I, ^{131}I; tinciones fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido, rojo Tejas), reactivos electrónicamente densos (por ejemplo, oro), enzimas, por ejemplo, como las habitualmente utilizadas en ELISA (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcas colorimétricas (por ejemplo, oro coloidal), marcas magnéticas (por ejemplo, Dynabeads®), biotina, digoxigenina, o haptenos y proteínas para los que están disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales. La marca se puede incorporar directamente en el ácido nucleico, péptido u otro compuesto diana a detectar, o se puede unir a una sonda o anticuerpo que hibride o se fije a la diana. Un péptido se puede hacer detectable mediante la incorporación de epítopos polipeptídicos predeterminados, reconocidos por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de un par de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, polipéptido activador de la trascripción, dominios de unión de metales, etiquetas de epítopos). La marca se puede unir mediante ramas espaciadoras de diversas longitudes para reducir el potencial impedimento estérico o impacto sobre otras propiedades útiles o deseadas (véase, por ejemplo, Mansfield (1995) Mol Cell Probes 9: 145-156). Se puede observar que también es posible el uso de combinaciones de marcas. De esta forma, por ejemplo, en algunas realizaciones, diferentes secuencias de ácidos nucleicos se pueden marcar con marcas distinguibles (por ejemplo, de diferentes colores).

La expresión "ácido nucleico", como se usa en este documento, se refiere a un desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma de cadena sencilla o doble. La expresión incluye ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares o mejoradas, para los propósitos deseados, como ácido nucleico de referencia. La expresión incluye, asimismo, ácidos nucleicos que son metabolizados de manera similar a los nucleótidos de origen natural, o a velocidades mejoradas en este sentido, para los propósitos deseados. La expresión comprende, igualmente, estructuras semejantes a ácidos nucleicos con una estructura básica sintética. Análogos con una estructura básica de ADN, proporcionados por la invención, incluyen fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosfonato metílico, fosforamidato, fosfotriéster alquílico, sulfamato, 3'-tioacetal, metilen(metilimino), 3'-N-carbamato, carbamato de morfolino, y ácidos nucleicos peptídicos (PNA); véase "Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach", recopilado por F. Eckstein, IRL Press en Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volumen 600, Eds. Baserga and Denhardt (NYAS 1992); Milligan (1993), J. Med. Chem. 36: 1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press). Los PNA contienen estructuras básicas no iónicas, tales como unidades de N-(2-aminoetil)-glicina. Se describen enlaces de fosforotioato en los documentos WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997), Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189-197. Otras estructuras básicas sintéticas incluidas en esta expresión comprenden enlaces de fosfonato metílico o enlaces alternativos de fosfonato metílico y fosfodiéster (Strauss-Soukup (1997), Biochemistry 36: 8692-8698), y enlaces de fosfonato metílico (Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 153-156). La expresión ácido nucleico se utiliza, de manera intercambiable con gen, ADNc, ARNm, cebador de oligonucleótidos, sonda y producto de amplificación.

Una "microserie de ácidos nucleicos" o "serie de ácidos nucleicos" es una pluralidad de elementos diana, cada uno de los cuales comprende un oligonucleótido diana inmovilizado sobre una superficie sólida, con la que hibridan ácidos nucleicos marcados. "Oligonucleótidos diana" de un elemento diana tienen, habitualmente, entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 500 nucleótidos, más habitualmente entre aproximadamente 25 hasta aproximadamente 250 nucleótidos y, típicamente, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. Normalmente, los oligonucleótidos tienen su origen en una región definida del genoma. Los ácidos nucleicos diana de un elemento diana pueden contener, por ejemplo, secuencias de genes específicos o proceder de una región cromosómica de la que se sospecha que está presente con un número de copias aumentado o disminuido en células de interés, por ejemplo, células tumorales. El elemento diana se puede preparar también a partir de ARNm, o ADNc derivado de dicho ARNm, del que se sospeche que sea trascrito a niveles anormales.

De forma alternativa, un elemento diana puede comprender secuencias de ácidos nucleicos de significado o localización desconocida. Una serie de estos elementos podría representar localizaciones que hacen un muestreo, de manera continua o en puntos discretos, cualquier porción deseada de un genoma, incluido, pero sin estar limitado a, un genoma completo, un cromosoma simple, o una porción de un cromosoma. EL número de elementos diana y la complejidad de los ácidos nucleicos en cada uno de ellos determinaría la densidad de muestreo. De manera similar, una serie de elementos diana que comprende ácidos nucleicos de clones de ADNc anónimos (incluidos aquellos que contienen regiones 5' no traducidas o secuencias promotoras), permite la identificación de aquéllos que se podrían expresar de forma diferencial en algunas células de interés, centrando, de este modo, la atención en el estudio de estos genes.

Por lo general, se prefieren elementos diana más pequeños. Típicamente, un elemento diana tendrá un diámetro de aproximadamente 1 mm o menor. En general, los tamaños de los elementos pueden ser desde 1 \mum hasta aproximadamente 3 mm, preferentemente, son de entre aproximadamente 5 \mum y aproximadamente 1 mm. Los elementos diana de las series se pueden disponer sobre la superficie sólida en diferentes densidades. Las densidades de los elementos diana dependerán de una serie de factores tales como la naturaleza de la marca, el soporte sólido, y similares. A este efecto se pueden utilizar también técnicas capaces de producir series de alta densidad (véase, por ejemplo, Fodor (1991), Science 767-773; Johnston (1998), Curr. Biol. 8: R171-R174; Schummer (1997), Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997), Biotechniques 23: 120-124; Patente de EE.UU. nº 5.143.854).

La expresión "número de copias relativo" se refiere al número de copias de una molécula o secuencia de ácido nucleico en relación con el de otra molécula o secuencia, en una única colección de moléculas de ácidos nucleicos. La expresión se puede referir también a una comparación del número de copias de la misma secuencia presente en dos colecciones de moléculas de ácido nucleico.

Una "colección representativa de secuencias de ácidos nucleicos de complejidad reducida" es una colección de secuencias de ácidos nucleicos preparada con el uso de técnicas de amplificación (por ejemplo, PCR), y marcadas de la forma descrita más adelante. Los métodos de amplificación son cuantitativos, de forma que el número de copias relativo de secuencias particulares dentro de un ácido nucleico de fuente se mantiene en las secuencias de ácidos nucleicos amplificadas y marcadas en los ensayos. En el contexto de esta invención, se afirma que una colección de este tipo de secuencias de ácidos nucleicos marcadas es representativa de la fuente de la que ha derivado. Adicionalmente, como resultado de la amplificación específica de secuencias particulares, la complejidad de las secuencias de ácidos nucleicos marcadas es mucho menor que la de la fuente. La complejidad reducida es ventajosa, porque el tiempo de hibridación se acorta en comparación con la hibridación con mezclas más complejas de secuencias de ácidos nucleicos marcadas.

Una "fuente de ácido nucleico" o "ácido nucleico de fuente", como se usa en este documento, es una muestra que comprende ADN o ARN (típicamente humanos) en una forma adecuada para la amplificación en los métodos de la invención. El ácido nucleico puede estar aislado, clonado o amplificado; puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ARNm o ADNc de un cromosoma en particular, o secuencias seleccionadas (por ejemplo, promotores particulares, genes, fragmentos de amplificación o restricción, ADNc, etc.) dentro de amplicones o deleciones particulares, conocidos en la técnica. La muestra de ácido nucleico se puede extraer de células o tejidos particulares. Por ejemplo, la muestra de célula o tejido a partir de la que se prepara la muestra de ácido nucleico se puede tomar de un paciente presuntamente afecto de un cáncer, asociada con la amplificación, deleción o traslocación de amplicón que se detecta. Los métodos de aislamiento de muestras de células o tejidos son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen, pero sin estar limitados a, aspiraciones, cortes de tejido, biopsias de aguja, y similares. Frecuentemente, la muestra será una "muestra clínica", que es una muestra obtenida de un paciente, incluidos los cortes de tejidos tales como cortes congelados o cortes de parafina, obtenidos con fines histológicos. La muestra puede derivar también de sobrenadantes (celulares), o de las propias células de cultivos celulares, células de cultivos de tejidos y otros medios, en los que puede ser deseable detectar anomalías cromosómicas o determinar el número de copias de
amplicones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación esquemática de los métodos de amplificación de PCR de la invención.

Descripción de las realizaciones preferidas

La presente invención proporciona métodos para comparar el número de copias de ácidos nucleicos anormales y el mapeo de anomalías cromosómicas asociados con una enfermedad. Los métodos de la invención utilizan oligonucleótidos diana inmovilizados sobre un soporte sólido, con el que hibridan secuencias de ácidos nucleicos diferencialmente marcadas. Las secuencias de ácidos nucleicos marcadas se preparan amplificando específicamente secuencias que hibridan específicamente (es decir, son sustancialmente idénticas) con las secuencias de oligonucleótidos diana. Típicamente, esto se lleva a cabo usando cebadores de PCR que flanquean las secuencias diana en una colección de secuencias de ácidos nucleicos de fuente (por ejemplo, ADN genómico aislado de células de interés). La hibridación de los ácidos nucleicos marcados con la diana se detecta, entonces, usando técnicas convencionales. Véase la descripción de los sistemas de hibridación basados en serie en Pinkel et al. (1998), Nature Genetics, 20: 207-211, y en la Patente de EE.UU. nº 5.830.645.

En las realizaciones preferidas, ni los elementos diana ni las secuencias de ácidos nucleicos marcadas comprenden secuencias repetitivas de ADN. En consecuencia, los métodos de la presente invención no requieren técnicas diseñadas para inhibir la hibridación de secuencias repetitivas (por ejemplo, uso de ácidos nucleicos bloqueadores, no marcados, enriquecidos para secuencias repetitivas). Por lo tanto, los métodos ofrecen resultados más rápidos que los métodos en los que se encuentran presentes secuencias repetitivas en las secuencias de ácidos nucleicos diana y/o en las secuencias de ácidos nucleicos marcadas.

Los métodos de la invención comparan los números de copias de secuencias capaces de fijarse a los elementos diana. Las variaciones del número de copias, detectables por los métodos de la invención, pueden surgir de diferentes formas. Por ejemplo, el número de copias se puede ver alterado como consecuencia de la amplificación o deleción de una región cromosómica. De manera alternativa, el número de copias se puede reducir por redisposiciones genéticas que alteran las secuencias en las secuencias de ácidos nucleicos marcadas, o en las secuencias de ácidos nucleicos diana, de forma suficiente para reducir su fijación.

Secuencias de ácidos nucleicos diana

Las secuencias de ácidos nucleicos diana de la invención pueden derivar de prácticamente cualquier fuente. Típicamente, las dianas serán moléculas de ácido nucleico derivadas de localizaciones representativas a lo largo de un cromosoma de interés, una región cromosómica de interés, un genoma completo de interés, una biblioteca de ADNc, y similares. Estos oligonucleótidos diana pueden derivar, por ejemplo, de clones genómicos, digestiones de restricción de clones genómicos, clones de ADNc y similares. En algunas realizaciones, las secuencias de ácidos nucleicos diana derivan de una biblioteca de clones que se haya mapeado previamente, abarcando una región particular de interés.

La elección de ácidos nucleicos diana a utilizar puede estar influida por el conocimiento previo de la asociación de un cromosoma o región cromosómica particular con ciertos trastornos patológicos. Por ejemplo, el documento WO 98/02539 describe un amplicón en el cromosoma 20 que está asociado con cáncer. De manera alternativa, utilizando los métodos de la presente invención, se puede efectuar un análisis de un genoma completo para identificar una nueva región sometida a cambios frecuentes en el número de copias. En estas realizaciones, los elementos diana contienen habitualmente secuencias de ácidos nucleicos representativas de localizaciones distribuidas a lo largo de todo el genoma. En algunas realizaciones (por ejemplo, empleando un número elevado de elementos diana de alta complejidad), todas las secuencias del genoma pueden estar presentes en la serie.

Los oligonucleótidos utilizados en las microseries se preparan típicamente usando secuencias que se han mapeado genética o físicamente con anterioridad. Por ejemplo, se pueden usar sitios etiquetados con secuencias (STS) que se utilizan para "etiquetar", o identificar segmentos de ADN particulares en el genoma. Para asignar una designación de STS, cada segmento de ADN clonado se secuencia sobre una región de aproximadamente 200 a 500 pares de bases. Con estos datos de secuencia, se diseñan y ensayan cebadores de PCR para asegurar que se les puede usar para identificar, "etiquetar" o sintetizar esa secuencia particular por amplificación de PCR. El envío de secuencias de segmentos y cebadores, y de las condiciones de ensayo de PCR a bases de datos públicas permite que cualquier persona identifique rápida y convenientemente casi cualquier clon o fragmento genómico. Véase, por ejemplo, Olson, Science 245: 1434-1435 (1989). De manera alternativa, se pueden utilizar etiquetas de secuencias expresadas (EST) para preparar las series de la invención.

En realizaciones preferidas, las secuencias de oligonucleótidos diana carecen de secuencias repetitivas y tienen una composición de bases y una longitud relativamente uniformes. En ausencia de secuencias repetitivas en las secuencias de ácidos nucleicos diana o marcadas, no existe la necesidad de usar medios para inhibir la hibridación de estas secuencias. Dado que la composición de bases y la longitud pueden afectar a la hibridación, la conservación de la uniformidad de estos factores asegura resultados más consistentes entre elementos dentro de una serie.

Preparación de microseries de la invención

Las microseries de la invención comprenden una multiplicidad de diferentes ácidos nucleicos "sonda" o "diana" (u otros compuestos), unidos a una o múltiples superficies (por ejemplo, sólida, membrana, o gel). EN una realización preferida, la multiplicidad de ácidos nucleicos (u otros restos) está unida a una única superficie contigua, o a una multiplicidad de superficies yuxtapuestas entre sí.

En un formato de serie, se puede llevar a cabo un elevado número de diferentes reacciones de hibridación esencialmente "en paralelo". Esto ofrece la posibilidad de realizar evaluaciones rápidas, esencialmente simultáneas, de una variedad de hibridaciones en un solo "experimento". Los métodos para llevar a cabo reacciones en formatos basados en serie son bien conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Pastinen (1997), Genome Res. 7: 606-614; Jackson (1996), Nature Biotechnology 14: 1685; Chee (1995), Science 274: 610; documento WO 96/17958, Pinkel et al. (1998), Nature Genetics 20: 207-211).

Las series, en particular las series de ácidos nucleicos, se pueden producir de acuerdo con una extensa variedad de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, en una realización sencilla, se pueden producir series de "baja densidad" aplicando (por ejemplo, a mano, utilizando una pipeta) diferentes ácidos nucleicos en diferentes localizaciones sobre un soporte sólido (por ejemplo, una superficie de vidrio, una membrana, etc.)

Este sencillo método de aplicación se ha automatizado para producir series aplicadas de alta densidad (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.807.522). Esta patente describe el uso de un sistema automatizado que da golpes ligeros sobre un microcapilar contra una superficie para depositar un pequeño volumen de una muestra biológica. El proceso se repite para generar series de alta densidad.

Las microseries de la invención se pueden producir también usando la tecnología de síntesis de oligonucleótidos. De este modo, por ejemplo, Fodor et al., Science 767-773 (1991), la Patente de EE.UU. nº 5.143.854 y las Publicaciones de Patente PCT números WO 90/15070 y 92/10092, describen el uso de una síntesis de combinación, dirigida por la luz, de series de oligonucleótidos de alta densidad.

En la técnica se conocen muchos métodos para inmovilizar ácidos nucleicos sobre una variedad de superficies sólidas. Se puede emplear una extensa variedad de polímeros orgánicos e inorgánicos, así como otros materiales, tanto naturales como sintéticos, como materiales para la superficie sólida. Superficies sólidas ilustrativas incluyen, por ejemplo, nitrocelulosa, nailon, vidrio, cuarzo, membranas diazotizadas (papel o nailon), siliconas, poliformaldehído, celulosa, y acetato de celulosa. Adicionalmente, se pueden utilizar plásticos tales como polietileno, polipropileno, poliestireno, y similares. Otros materiales que se pueden emplear incluyen papel, cerámica, metales, metaloides, materiales semiconductores, cermet o similares. Además, se pueden utilizar sustancias que forman geles. Estos materiales incluyen, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, gelatinas), lipopolisacáridos, silicatos, agarosa y poliacrilamidas. Cuando la superficie sólida es porosa, se pueden emplear diversos tamaños de poro, dependiendo de la naturaleza del sistema.

En la preparación de la superficie se puede emplear una pluralidad de diferentes materiales, particularmente como laminados, para obtener diversas propiedades. Por ejemplo, se pueden usar proteínas (por ejemplo, albúmina de suero bovino), o mezclas de macromoléculas (por ejemplo, solución de Denhardt) para evitar una unión no específica, simplificar la conjugación covalente, potenciar la detección de señales, o similares. Si se desea la formación de un enlace covalente entre un compuesto y la superficie, la superficie será, habitualmente, polifuncional o tendrá la capacidad de ser polifuncionalizada. Grupos funcionales que pueden estar presentes en la superficie y que se pueden usar para los enlaces pueden incluir ácidos carboxílicos, aldehídos, grupos amino, grupos ciano, grupos etilénicos, grupos hidroxilo, grupos mercapto, y similares. La manera de enlazar una extensa variedad de compuestos a diversas superficies es bien conocida y está ampliamente ilustrada en la bibliografía.

Por ejemplo, se conocen métodos para inmovilizar ácidos nucleicos mediante la introducción de varios grupos funcionales a las moléculas (véanse, por ejemplo, Bischoff (1987), Anal. Biochem., 164: 336-344; Kremsky (1987), Nucl. Acids Res. 15: 2891-2910). Se pueden situar en la diana nucleótidos modificados usando cebadores de PCR que contienen el nucleótido modificado, o por marcado final enzimático con nucleótidos modificados. El uso de soportes de vidrio o membrana (por ejemplo, nitrocelulosa, nailon, polipropileno) para las series de ácidos nucleicos de la invención resulta conveniente, gracias a una tecnología bien desarrollada que emplea métodos manuales y robóticos para disponer dianas a densidades de elementos relativamente altas. Estas membranas están generalmente disponibles y los protocolos y el equipamiento para la hibridación a membranas son bien conocidos.

Se pueden usar elementos diana de diversos tamaños, en el intervalo de 1 mm de diámetro hasta 1 \mum. Se utilizan elementos diana menores que contienen cantidades bajas de ADN concentrado y fijado para hibridaciones de alta complejidad, dado que la cantidad total de muestra disponible para la unión a cada elemento diana será limitada. Por consiguiente, es conveniente tener una pequeña serie de elementos diana que contienen una pequeña cantidad de ADN diana concentrado, de modo que la señal obtenida esté altamente localizada y sea brillante. Esta pequeña serie de elementos diana se usan típicamente en series con densidades mayores que 10^{4}/cm^{2}. Se han descrito métodos relativamente sencillos, capaces de lograr imágenes fluorescentes cuantitativas de superficies de 1 cm^{2}, que permiten la adquisición de datos a partir de un elevado número de elementos diana en una sola imagen (véanse, por ejemplo, Wittrup (1994), Cytometry 16: 206-213; Pinkel et al. (1998), Nature Genetics 20: 207-211).

Las series sobre sustratos de superficies sólidas con una fluorescencia mucho más baja que las membranas, tales como vidrio, cuarzo o perlas pequeñas, pueden alcanzar una sensibilidad mucho mejor. Sustratos tales como vidrio o sílice fundida son ventajosos porque proporcionan un sustrato de muy baja fluorescencia y un ambiente de hibridación de alta eficiencia. La fijación covalente de los ácidos nucleicos diana al vidrio o a la sílice fundida sintética se puede lograr según una serie de técnicas conocidas (anteriormente descritas). Los ácidos nucleicos se pueden acoplar de manera conveniente al vidrio usando reactivos disponibles en el comercio. Por ejemplo, materiales para la preparación de vidrio silanizado con una serie de grupos funcionales están disponibles en el comercio, o se pueden preparar usando técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Gait (1984), Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Wash., D.C.). Las placas de recubrimiento de cuarzo, que poseen una autofluorescencia al menos 10 veces menor que el vidrio, también se pueden silanizar.

De forma alternativa, las dianas también se pueden inmovilizar sobre perlas recubiertas u otras superficies disponibles en el comercio. Por ejemplo, los ácidos nucleicos marcados en el extremo con biotina se pueden unir a perlas recubiertas con avidina, disponibles en el comercio. El anticuerpo de estreptavidina o anti-digoxigenina también se puede fijar a placas de vidrio silanizado por acoplamiento mediado por proteínas, de acuerdo con protocolos convencionales (véase, por ejemplo, Smith (1992), Science 258: 1122-1126). Ácidos nucleicos marcados en el extremo con biotina o digoxigenina se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales. La hibridación con ácidos nucleicos fijados a perlas se logra suspendiéndolos en la mezcla de hibridación, y depositándolos, a continuación, sobre el sustrato de vidrio para su análisis tras el lavado. De manera alternativa, se puede usar partículas paramagnéticas tales como partículas de óxido férrico, con o sin recubrimiento con avidina.

En una realización particularmente preferida, el ácido nucleico diana se aplica sobre una superficie (por ejemplo, una superficie de vidrio o cuarzo). El ácido nucleico se disuelve en una mezcla de agua, dimetilsulfóxido (DMSO) y nitrocelulosa, y se aplica sobre placas de vidrio recubiertas con aminosilano. Se pueden utilizar pequeños tubos capilares para aplicar la mezcla diana.

Preparación de secuencias de ácidos nucleicos marcadas

Al igual que en el caso de las secuencias de ácidos nucleicos diana, en los métodos de la presente invención se puede usar una extensa variedad de ácidos nucleicos como fuente de las secuencias de ácidos nucleicos marcadas. Las secuencias de ácidos nucleicos marcadas se pueden preparar a partir, por ejemplo, de ADN genómico que representa la totalidad del genoma de un organismo, tejido o tipo de célula particular, o puede comprender una porción del genoma tal como un único cromosoma.

Para comparar los niveles de expresión de un gen o genes particulares, las secuencias de ácidos nucleicos marcadas pueden derivar a ARNm o ADNc preparado de un organismo, tejido o célula de interés. Por ejemplo, se puede usar ADNc o ARNm de ensayo, junto con ARNm o ADNc de células de referencia normales, para preparar secuencias de ácidos nucleicos marcadas que hibridan con una serie de oligonucleótidos de una biblioteca de ADNc normalizada. Adicionalmente, las secuencias de ácidos nucleicos marcadas, preparadas a partir de ADN genómico de dos poblaciones celulares, pueden hibridar con una microserie de oligonucleótidos preparada a partir de ADNc para detectar los ADNc que proceden de regiones con un número de copias de ADN variante en el genoma.

Los métodos de la invención son adecuados para comparar el número de copias de secuencias particulares en cualquier combinación de dos o más poblaciones de secuencias de ácidos nucleicos. El experto en la técnica reconocerá que las poblaciones particulares de secuencias de ácidos nucleicos de muestra que se someten a comparación no son críticas para la invención. Por ejemplo, se puede comparar ADN genómico o ADNc de dos especies relacionadas. De manera alternativa, se pueden comparar los niveles de expresión de genes particulares en dos o más tipos de tejido o células. Como se ha señalado anteriormente, los métodos resultan especialmente útiles en el diagnóstico de enfermedades.

Se pueden usar procedimientos convencionales para aislar ácidos nucleicos como fuente de las secuencias de ácidos nucleicos marcadas de la invención (ADN o ARNm) a partir de tejidos apropiados (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1985)). También se pueden usar métodos convencionales para la preparación de ADNc a partir de ARNm.

Las células o tejido particulares a partir de los que se aíslan los ácidos nucleicos fuente dependerán de la aplicación particular. Típicamente, para la detección de anomalías asociadas con el cáncer, se aísla ADN genómico de células tumorales. Para la detección prenatal de enfermedades, se usará tejido fetal.

Como se ha señalado anteriormente, las secuencias de ácidos nucleicos marcadas de la invención se preparan amplificando específicamente secuencias de los ácidos nucleicos fuente. Los medios para la amplificación específica de secuencias deseadas son bien conocidos para el experto en la técnica. Típicamente, se usa la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). De esta forma, se seleccionan cebadores que hibridan con regiones que flanquean las secuencias diana en la microserie. Dado que las cantidades relativas de secuencias que hibridan específicamente con las dianas se analizan en los métodos de la invención, la cantidad de producto de amplificación debe ser proporcional a la cantidad de modelo en la muestra original. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos de amplificación "cuantitativa". Por ejemplo, la PCR cuantitativa puede comprender co-amplificar simultáneamente una cantidad conocida de una secuencia de control, usando los mismos cebadores. Esto ofrece un estándar interno que se puede usar para calibrar la reacción de PCR. De manera alternativa, hay disponibles en el comercio kits para métodos de PCR cuantitativa (por ejemplo, TaqMan® Assay Reagents, disponible en Perkin Elmer/Applied Biosystems). Métodos de PCR cuantitativa se describen en Lie y Petropoulos, Curr Opin Biotechnol 9: 43-48 (1998); Orlando et al., Clin Chem Lab Med 36: 255-269 (1998); e Innis et al. (1990), PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y.).

En los métodos preferidos, los cebadores de PCR contienen una secuencia adaptadora que se encuentra sustancialmente ausente en los ácidos nucleicos fuente (Figura 1). La longitud preferida de los cebadores es, habitualmente, entre aproximadamente 40 y aproximadamente 70 nucleótidos y, típicamente, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 60 nucleótidos. Tras un número limitado de ciclos de amplificación utilizando estos cebadores (normalmente, 2 a aproximadamente 5 ciclos), la amplificación se continúa entonces, usando cebadores que hibridan específicamente con las secuencias adaptadoras. Esta técnica ayuda a garantizar que sólo se amplifican adicionalmente las secuencias diana en los ácidos nucleicos fuente. Además, garantiza que la amplificación es uniforme entre todas las secuencias en el ácido nucleico fuente.

Otros métodos de amplificación adecuados incluyen, pero no están limitados a, la reacción en cadena de ligasa (LCR) (véanse Wu y Wallace (1989), Genomics 4:560; Landergren et al. (1988), Science 241: 1077, y Barringer et al., (1990), Gene 89:117,), amplificación de trascripción (Kwoh et al (1989), Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86: 1173), la replicación de secuencias auto-sustentada (Guatelli et al (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874), PCR dop, y la PCR adaptadora de enlazadores (Klein et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4494), etc.

Marcado de ácidos nucleicos

Las marcas que se usan en la invención se pueden incorporar en los ácidos nucleicos a través de una serie de medios bien conocidos para el experto en la técnica. Los medios de fijar marcas a los ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, traducción de muescas, o marca de los extremos mediante el uso de quinasas en los ácidos nucleicos y subsiguiente fijación (ligamiento) de un enlazador que une el ácido nucleico de muestra a una marca (por ejemplo, un fluoróforo). También se conoce una extensa variedad de enlazadores de marcas a los ácidos nucleicos. Adicionalmente, se puede usar también la intercalación de tinciones y nucleótidos fluorescentes. EN una realización preferida, se incorporan nucleótidos fluorescentes a las secuencias amplificadas, empleando el fragmento Klenow de la ADN-Polimerasa I o Taq ADN-polimerasa, y cebadores para las secuencias adaptadoras.

Marcas detectables adecuadas para ser utilizadas en la presente invención incluyen cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Marcas de utilidad en la presente invención incluyen biotina para teñir con un conjugado de estreptavidina marcado, perlas magnéticas (por ejemplo, Dynabeads®), tinciones fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rojo tejas, rodamina, proteína fluorescente verde, y similares, véase, por ejemplo, Molecular Probes, Eugene, Oregón, EE.UU.), marcas radiactivas (por ejemplo, ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C, o ^{32}P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa del rábano picante, fosfatasa alcalina y otras frecuentemente utilizadas en ELISA), y marcas colorimétricas tales como oro coloidal (por ejemplo, las partículas de oro en un intervalo de tamaño de diámetro de 40-80 nm dispersan la luz verde con una alta eficiencia), o perlas de vidrio o plástico coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.). Las Patentes que describen el uso de estas marcas incluyen las Patentes de EE.UU. números 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.257.149; y 4.366.241.

Se prefiere una marca fluorescente porque proporciona una señal muy potente, con bajo ruido. También es detectable ópticamente con alta resolución y sensibilidad por medio de un rápido procedimiento de análisis. Las muestras de ácidos nucleicos pueden estar marcadas, todas ellas, con una única marca, por ejemplo, una única marca fluorescente. De forma alternativa, en otra realización, diferentes muestras de ácidos nucleicos pueden hibridar simultáneamente, teniendo cada muestra de ácido nucleico una marca diferente. Por ejemplo, una diana podría tener una marca verde fluorescente y una segunda diana podría tener una marca roja fluorescente. La fase de escáner distinguirá los sitios de unión de la marca roja de los que se unen a la marca verde fluorescente. Cada muestra de ácido nucleico (ácido nucleico diana) se puede analizar independientemente de las demás.

Cromógenos adecuados que se pueden emplear incluyen aquellas moléculas y compuestos que absorben luz en un intervalo distinto de longitudes de onda, de modo que se puede observar un color o, de manera alternativa, que emiten luz cuando se les irradia con una radiación de una longitud de onda, o intervalo de longitudes de onda, particular, por ejemplo, fluorescedores.

De manera deseable, los fluorescedores deberán absorber luz por encima de aproximadamente 300 nm, preferentemente alrededor de 350 nm y, más preferentemente por encima de 400 nm, emitiendo habitualmente a longitudes de onda mayores en aproximadamente 10 nm que la longitud de onda de la luz absorbida. Se debe destacar que las características de absorción y emisión de la tinción fijada pueden diferir de las de la tinción no fijada. Por lo tanto, al hacer referencia a los diversos intervalos de longitudes de onda y a las características de las tinciones, se pretenden indicar las tinciones durante su aplicación y no la tinción que no está conjugada y caracterizada en un disolvente arbitrario.

Los fluorescedores se prefieren por lo general porque, mediante la irradiación de un fluorescedor con luz, es posible obtener una pluralidad de emisiones. De esta forma, una única marca puede proporcionar una pluralidad de acontecimientos mensurables.

También se puede proporcionar una señal detectable por fuentes quimio-luminiscentes y bio-luminiscentes. Fuentes quimio-luminiscentes incluyen un compuesto que se excita electrónicamente por una reacción química, pudiendo entonces emitir luz que actúa como señal detectable, o dona energía a un aceptor fluorescente. De manera alternativa, se pueden usar luciferinas junto con luciferasa o lucigeninas para proporcionar bio-luminiscencia.

Las moléculas informadoras con un electrón rotatorio inalterado proporcionan marcas rotatorias que se pueden detectar por espectroscopia de resonancia de rotación electrónica (ESR). Ejemplos de marcas rotatorias incluyen radicales libres orgánicos, complejos de metales de transición, en particular vanadio, cobre, hierro y manganeso, y similares. Ejemplos de marcas rotatorias incluyen radicales libres de nitróxido.

La marca se puede agregar al o a los ácidos nucleicos diana (muestra) antes o después de la hibridación. Las llamadas "marcas directas" son marcas detectables que están unidas o incorporadas directamente al ácido nucleico diana (muestra) antes de la hibridación. Por el contrario, las llamadas "marcas indirectas" se unen al dúplex híbrido después de la hibridación. Con frecuencia, la marca indirecta está unida a un resto de unión que se ha fijado al ácido nucleico diana antes de la hibridación. De este modo, por ejemplo, el ácido nucleico diana puede estar biotinilado antes de la hibridación. Después de la hibridación, un fluoróforo conjugado con avidina se unirá a los dúplex híbridos portadores de biotina, proporcionando una marca que se detecta fácilmente. Para una revisión detallada de los métodos de marcado de ácidos nucleicos y la detección de ácidos nucleicos hibridados marcados, véase Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)).

Las marcas fluorescentes se agregan fácilmente durante una reacción de trascripción in vitro. Así, por ejemplo, se pueden incorporar UTP y CTP marcados con fluoresceína en el ARN producido en una trascripción in vitro.

Las marcas se pueden fijar directamente o a través de un resto enlazador. En general, el punto de fijación de la marca o del enlazador-marca no está limitado a ninguna posición específica. Por ejemplo, una marca puede estar fijada a un nucleósido, nucleótido o análogo de los mismos en cualquier posición que no interfiera con la detección o hibridación deseada. Por ejemplo, determinados Reactivos Label-ON de Clontech (Palo Alto, CA) proporcionan una marca entremezclada a lo largo de toda la estructura básica de fosfato de un oligonucleótido, y el marcado terminal de los extremos 3' y 5'. Como se muestra en los ejemplos de este documento, las marcas pueden estar fijadas en posiciones sobre el anillo de ribosa, o la ribosa se puede modificar o, incluso, eliminar, si se desea. Los restos básicos de los reactivos de marcado útiles pueden incluir aquellos que se producen de forma natural o que se modifican de manera que no interfieran con el propósito con el que se usan. Bases modificadas incluyen, pero no están limitadas a, 7-deaza A y G, 7-deaza-8-aza A y G, y otros restos heterocíclicos.

Es preciso reconocer que las marcas fluorescentes no están limitadas a moléculas orgánicas de especies únicas, sino que incluyen moléculas inorgánicas, mezclas multi-moleculares de moléculas orgánicas y/o inorgánicas, cristales, heteropolímeros, y similares. De esta forma, por ejemplo, se pueden derivatizar fácilmente nanocristales de núcleo-corteza CdSe-CdS, incluidos en una corteza de sílice para acoplarlos a una molécula biológica (Bruchez et al. (1998), Science, 281: 2013-2016). De forma similar, se han acoplado covalentemente puntos cuánticos altamente fluorescentes (selenuro de cadmio recubierto con sulfuro de cinc) a biomoléculas, para usarlas en la detección biológica ultrasensible (Warren y Nie (1998), Science, 281: 2016-2018).

Hibridación de secuencias de ácidos nucleicos marcadas con las dianas

Se compara el número de copias de secuencias particulares de ácidos nucleicos en dos colecciones de secuencias de ácidos nucleicos marcadas, hibridando las secuencias de ácidos nucleicos con la microserie de nucleótidos de la invención. Se determina la intensidad de la señal de hibridación, y la relación de intensidades, producida por las colecciones de cada uno de los elementos diana. Típicamente, cuanto mayor es la relación de las intensidades de las señales en el elemento diana, mayor es la relación del número de copias de secuencias en las dos secuencias de ácidos nucleicos marcadas que se unen a ese elemento. Por consiguiente, la comparación de las relaciones de intensidad de las señales entre los elementos diana permite la comparación de las relaciones del número de copias de diferentes secuencias en las secuencias de ácidos nucleicos marcadas.

En los métodos de la invención se utilizan técnicas de hibridación convencionales. Métodos adecuados se describen en las referencias bibliográficas que detallan técnicas de CGH (Kallioniemi et al., Science 258: 818-821 (1992) y documento WO 93/18186). Existen disponibles diversas guías acerca de técnicas generales, por ejemplo, Tijssen, Hybridization with Nucleic Acid Probes, Partes I y II (Elsevier, Ámsterdam 1993). Para una descripción de técnicas adecuadas para la hibridación in situ, véanse Gall et al., Meth. Enzymol., 21:470-480 (1981) y Angerer et al., en Genetic Engineering: Principles and Methods, Setlow and Hollaender, Eds. Vol. 7, páginas 43-65 (Plenium Press, Nueva York, 1985).

En general, las hibridaciones de ácidos nucleicos comprenden los siguientes pasos principales: (1) inmovilización de las secuencias de ácidos nucleicos diana; (2) tratamiento de pre-hibridación para aumentar la accesibilidad del ADN diana, y para reducir la unión inespecífica; (3) hibridación de la mezcla de secuencias de ácidos nucleicos con el ácido nucleico sobre la superficie sólida; (4) lavados post-hibridación para retirar los fragmentos de ácidos nucleicos no fijados durante la hibridación; y (5) detección de los fragmentos de ácidos nucleicos hibridados. El reactivo utilizado en cada uno de estos pasos y sus condiciones de uso varían en función de la aplicación particular.

Análisis de señales detectables de las hibridaciones

Se pueden usar métodos convencionales para la detección y análisis de señales generadas por los ácidos nucleicos marcados. Los métodos particulares dependerán de las marcas usadas en los ácidos nucleicos marcados. Por lo general, se prefieren las marcas fluorescentes. De este modo, los métodos adecuados en la hibridación de fluorescencia in situ (FISH) resultan apropiados en la presente invención. Por ejemplo, se pueden obtener imágenes de las series de ácidos nucleicos en un microscopio de fluorescencia con un divisor de rayo policromático para evitar las desviaciones de imágenes dependientes del color. Las diferentes imágenes en color se adquieren con una cámara CCD y las imágenes digitalizadas se almacenan en un ordenador. Seguidamente, se utiliza un programa informático para analizar las señales producidas por la serie. Métodos para visualizar imágenes se describen, por ejemplo, en Kallioniemi et al, obra citada, y en el documento WO 93/18186.

Para facilitar la visión de los resultados y mejorar la sensibilidad de detectar pequeñas diferencias en la intensidad de la fluorescencia, se utiliza, preferentemente un sistema de análisis de imágenes digitales. Un sistema preferido es QUIPS (acrónimo de "quantitative image processing system" = sistema cuantitativo de procesamiento de imágenes), que es un sistema automático de análisis de imágenes basado en un microscopio de fluorescencia convencional equipado con una fase, control de foco y rueda de filtro automáticos (Ludl Electronic Products, Ltd., Hawthorne, NY). La rueda de filtro está montada en la vía de excitación de fluorescencia del microscopio para la selección de la longitud de onda de excitación. Filtros especiales (Chroma Technology, Brattleboro, VT) en el bloque dicroico permiten la excitación de las múltiples tinciones, sin que se generen desvíos en los registros de imágenes. El microscopio tiene dos puertos para cámara, uno de los cuales tiene una cámara CCD intensificada (Quantex Corp., Sunnyvale, CA), para mostrar imágenes de vídeo sensibles a alta velocidad, que se utiliza para hallar áreas interesantes en la placa, así como para enfocar. El otro puerto para cámara tiene una cámara CCD refrigerada (modelo 200 de Photometrics Ltd., Tucson, AZ), que se usa para la adquisición real de imágenes con elevada resolución y sensibilidad.

La cámara CCD refrigerada está en interface con un ordenador SUN 4/330 (SUN Microsystems, Inc. Mountain View, CA) a través de un bus VME. La adquisición completa de imágenes multicolores se controla usando un paquete de software de procesamiento de imágenes ZIL-Image (Delft Centre for Image Processing, Delft, Holanda).

Claims (12)

1. Un método para comparar el número de copias de secuencias de ácidos nucleicos en dos o más colecciones de moléculas de ácido nucleico, método que comprende:

(a) preparar una primera colección representativa y una segunda colección representativa de secuencias de ácidos nucleicos marcadas, a partir de una primera fuente de ácidos nucleicos y de una segunda fuente de ácidos nucleicos, respectivamente,

(i)

poniendo en contacto la primera y la segunda fuente con cebadores de PCR que comprenden secuencias presentes en los ácidos nucleicos fuente, y adaptadores que comprenden secuencias que no están presentes en los ácidos nucleicos fuente, produciendo de este modo un juego de ácidos nucleicos amplificados que comprenden secuencias diana; y

(ii)

poner en contacto el juego de ácidos nucleicos amplificados, producidos en la etapa (i), con cebadores que hibridan de forma específica con los adaptadores, produciendo de este modo, por amplificación de PCR, una primera y una segunda colección de secuencias de ácidos nucleicos marcadas de complejidad reducida, en comparación con la primera fuente de ácidos nucleicos y la segunda fuente de ácidos nucleicos;

en donde la primera y segunda colecciones de secuencias de ácidos nucleicos marcadas son distinguibles entre sí; y

(b) poner en contacto la primera y la segunda colecciones con una pluralidad de elementos diana que comprenden oligonucleótidos diana unidos a una superficie sólida;

en donde la primera colección de secuencias de ácidos nucleicos marcadas comprende una secuencia que hibrida específicamente con un oligonucleótido diana; y en donde la segunda colección de secuencias de ácidos nucleicos marcadas comprende una secuencia que hibrida específicamente con el oligonucleótido diana; y

(c) comparar el número de copias, determinando la cantidad de hibridación específica de la primera y segunda colecciones de secuencias de ácidos nucleicos marcadas con los elementos diana.

2. El método según la reivindicación 1, en el que las secuencias de ácidos nucleicos diana son ADN.

3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la primera y segunda secuencias de ácidos nucleicos marcadas comprenden ADN humano.

4. El método según la reivindicación 3, en el que el ADN se prepara a partir de ADNc.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los oligonucleótidos diana tienen una longitud de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 nucleótidos.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el soporte sólido es vidrio.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera y segunda marcas son marcas fluorescentes.

8. El método según la reivindicación 1, en el que la amplificación se lleva a cabo usando cebadores marcados.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las primeras secuencias de ácidos nucleicos marcadas se preparan a partir de ARNm de una célula de ensayo, y las segundas secuencias de ácidos nucleicos marcadas se preparan a partir de ARNm de una célula de referencia.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 5 a 8, en el que las primeras secuencias de ácidos nucleicos marcadas se preparan a partir de ADN genómico de ensayo, y las segundas secuencias de ácidos nucleicos marcadas se preparan a partir de ADN genómico normal de referencia.

11. El método según la reivindicación 10, en el que el genoma de ensayo comprende ácidos nucleicos de tejido fetal.

12. El método según la reivindicación 10, en el que el genoma de ensayo comprende ácidos nucleicos de un tumor.