ES2606912T3 - Método de transferencia de genes específico para células trofectodérmicas - Google Patents

Abstract

Método para introducir un polinucleótido arbitrario específicamente en una células trofectodérmica no humana, que comprende las etapas de: (a) retirar la zona pelúcida de un blastocisto no humano; y (b) introducir un polinucleótido arbitrario en células trofectodérmicas del blastocisto obtenido en la etapa (a).

Description

Método de transferencia de genes específico para células trofectodérmicas

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para introducir polinucleótidos arbitrarios específicamente en células trofectodérmicas no humanas. La presente invención también se refiere a métodos para producir blastocistos no humanos que comprenden una célula trofectodérmica en la que se ha introducido específicamente un polinucleótido arbitrario.

Técnica anterior

Se conocen métodos para producir ratones transgénicos usando vectores retrovirales (documento no de patente 1) como métodos para introducir genes a nivel individual usando vectores virales. Pueden producirse ratones transgénicos eficazmente mediante el uso de vectores retrovirales; sin embargo, una desventaja es que se produce silenciamiento de la expresión génica como resultado de la metilación de los genes introducidos, o similar (documento no de patente 2).

Puede esperarse la expresión a largo plazo de genes introducidos con el vector de lentivirus que es un vector retroviral, porque permite la integración de genes foráneos en el cromosoma. Además, a diferencia de los vectores retrovirales típicos, los vectores de lentivirus tienen una señal de translocación nuclear, y por tanto pueden introducir genes en células que no están dividiéndose. Cuando se producen ratones transgénicos usando vectores de lentivirus, aumenta la eficacia de producción y no se produce silenciamiento de genes en la expresión génica a largo plazo (documentos no de patente 3 a 5).

En estos métodos de producción de ratones transgénicos, se introducen genes en óvulos fertilizados infectados con la mayoría de vectores virales. Además, estos métodos introducen genes tanto en la placenta como en el embrión, y por tanto se consideran técnicas excelentes en estudios de desarrollo.

[Documento de no patente 1] Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1985, Sep; 82(18): 6148-6152

[Documento de no patente 2] Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1985, Oct; 82(20): 6927-6931

[Documento de no patente 3] Mol. Cell. Biol., 2000, Oct; 20(20): 7419-7426

[Documento de no patente 4] J. Virol., 2000, Nov; 74(22): 10778-10784

[Documento de no patente 5] Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2002, 19 de Feb; 99(4): 2140-2145

Divulgación de la invención

[Problemas que van a resolverse mediante la invención]

Para analizar la expresión génica en la placenta y sus efectos durante la embriogénesis, deben introducirse genes foráneos sólo en la placenta pero no en el embrión. Un método convencional para introducir genes en la placenta comprende la inyección directa de un vector viral o similar en la placenta usando una aguja de inyección o similar tras laparotomía durante el embarazo. Sin embargo, las desventajas del método son la gran carga impuesta por la cirugía y que no puede esperarse que el método introduzca genes en toda la zona de la placenta.

Además, como métodos basados en LV para introducir genes en la placenta, se conoce un método transgénico que usa infección de óvulos fertilizados (embriones en fase de dos células) y un método para microinyección en la cavidad del blastocisto. El primer método tiene la ventaja de que la operación es conveniente y la desventaja de que los genes se introducen tanto en la placenta como en el embrión.

Mientras, aunque el segundo método para microinyección en la cavidad del blastocisto permite que los genes se introduzcan específicamente en la placenta, generalmente no se usa porque el método requiere un sistema caro y técnicas de habilidad. Además, el método es problemático porque los embriones resultan muy dañados debido a que se hace penetrar un capilar de vidrio directamente en los blastocistos. Además, es difícil tratar embriones a gran escala mediante este método.

También hay un método conocido para preparar animales rescatados de letalidad embrionaria debido a anomalía placentaria, y se basa en un método de rescate tetraploide. En este método, además de un animal mutante, se preparan embriones en fase de dos células de un animal silvestre y entonces de fusionan entre sí para preparar embriones tetraploides mediante tratamiento eléctrico o similar. Entonces, se preparan embriones quiméricos agregando embriones en fase de ocho células del animal mutante con los embriones en fase de cuatro células tetraploides del animal silvestre, habiéndose retirado de ambos la zona pelúcida. Se crean animales quiméricos trasplantando los embriones quiméricos en animales pseudopreñados.

Sin embargo, los experimentos que usan este método también llevan mucho tiempo, porque el método requiere embriones de un animal silvestre además de los de un animal mutante. Además, los embriones silvestres deben hacerse tetraploides mediante fusión eléctrica o similar. Además, el método se usa para el fin de complementar la función placentaria en animales mutantes y por tanto no es adecuado para analizar la función génica en la placenta.

La presente invención se logró en vista de las circunstancias anteriores. Un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para introducir genes específicamente en placenta completa.

[Medios para resolver los problemas]

Los presentes inventores realizaron diversos exámenes para lograr el objetivo descrito anteriormente. Como resultado, los inventores encontraron que podían introducirse genes específicamente en células trofectodérmicas con alta eficacia infectando blastocistos no humanos, de los que se había retirado la zona pelúcida (matriz extracelular que cubre a los embriones tempranos en preimplantación para protegerlos de la infección viral y similares), con vectores virales.

Más específicamente, los presentes inventores introdujeron satisfactoriamente genes en el trofectodermo no humano, que es la capa exterior del blastocisto, retirando la zona pelúcida con tratamiento ácido, tratamiento enzimático o tratamiento físico y cocultivando los blastocistos no humanos con vectores virales. Así, los inventores completaron la presente invención. Además, los inventores encontraron que este método no tiene el riesgo de infectar células de la masa celular interna no humana, que se desarrolla dando lugar a un feto no humano en el futuro, con el vector viral porque el trofectodermo sirve como barrera.

Específicamente, la presente invención proporciona lo siguiente:

1. Un método para introducir un polinucleótido arbitrario específicamente en una célula trofectodérmica no humana, que comprende las etapas de:

(a)

retirar la zona pelúcida de un blastocisto no humano; y

(b)

introducir un polinucleótido arbitrario en células trofectodérmicas del blastocisto obtenido en la etapa (a).

2. El método para producir un blastocisto no humano que comprende una célula trofectodérmica en la que se ha introducido específicamente un polinucleótido arbitrario, que comprende las etapas de:

(a)

retirar la zona pelúcida de un blastocisto no humano; y

(b)

introducir un polinucleótido arbitrario en células trofectodérmicas del blastocisto obtenido en la etapa (a).

3.

El método según el punto 1 ó 2, en el que el polinucleótido arbitrario es un polinucleótido que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal o un polinucleótido que regula la expresión de la proteína.

4.

El método según el punto 3, en el que el polinucleótido que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal es al menos un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: Dlx3, Fgfr2, Fra1, Fzd5, Gab1, Gcm1, Grb2 hipomorfo, Gja7, Hgf, Hsp84-1, ltgav, Junb, Lifr, ERK1, ERK2, ERK5, MEK1, MEKk3, p38α, p38β, Met, Pdgfra, Pdgfb, Pparg, Rxra, Rxrb, Sos1, Vhlh, Wnt2, Ets2, Mash2, Egfr, Hsf1, Bmp5, Bmp7, Dnmt1, ltga4, Lhx1, Mrj, Tcf, Lef, Cdx2, Eomes, Fgf4, Esrrb, Hand1, Mdfi, Esx1, Arnt, Tcfeb y Gjb2.

5.

El método según una cualquiera de los puntos 1 a 4, en el que el blastocisto se deriva de un animal no humano que tiene una anomalía en una proteína esencial para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de la proteína.

6.

El método según uno cualquiera de los puntos 1 a 5, en el que la zona pelúcida se retira mediante tratamiento ácido, tratamiento enzimático o tratamiento físico.

7.

El método según el punto 6, en el que el tratamiento ácido es un tratamiento con disolución ácida de Tyrode.

8.

El método según el punto 6, en el que el tratamiento enzimático es un tratamiento con pronasa.

9.

El método según uno cualquiera de los puntos 1 a 8, en el que el polinucleótido se introduce infectando un blastocisto con un vector viral que porta un polinucleótido deseado.

10.

El método según uno cualquiera de los puntos 1 a 8, en el que el polinucleótido se introduce usando un reactivo de transfección de ácido nucleico.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama que muestra la estructura del vector LV (LV-CAG-EGFP) usado en la presente invención.

La figura 2 muestra fotografías de fetos y placentas de embriones E13,5 obtenidos mediante infección con un vector viral que expresa EGFP. Los fetos y placentas respectivos: se derivan de un embrión no tratado (parte superior); se obtienen mediante el método de TG (parte media); se obtienen mediante el método de la presente invención (parte inferior). En el método de la presente invención, la expresión del gen introducido se encuentra sólo en la placenta, mientras que en el método de TG, se observa expresión génica tanto en el feto como en la placenta.

La figura 3 muestra fotografías de cortes de placentas de embriones E13,5 obtenidos mediante infección con un vector viral que expresa EGFP. Los cortes finos respectivos de la placenta: se derivan de un embrión no tratado (parte superior); se obtienen mediante el método de TG (parte media); se obtienen mediante el método de la presente invención (parte inferior). En la placenta tratada mediante el método de TG y el método de la presente invención, se observó expresión génica en casi todas las células, excepto en las células maternas, en la capa de células gigantes, capa espongiotrofoblástica y capa laberíntica. a es una fotografía tras tinción con HE; b es una fotografía bajo microscopio fluorescente.

La figura 4 muestra diagramas y fotografías que ilustran el rescate de ratones deficientes en erk2. a es un diagrama que ilustra el locus en ratones deficientes en erk2. La erk endógena no se expresa porque se inserta un gen de resistencia a fármacos entre los exones 2 y 3. b es un diagrama que muestra un vector de lentivirus construido para expresar erk2 bajo el control de un promotor CAG. c es un diagrama que muestra genotipos de la descendencia obtenida mediante el uso del método de la presente invención para transferir genes a blastocistos obtenidos apareando ratones heterocigotos. No nacen ratones hemocigotos mediante apareamiento natural; sin embargo, se obtuvieron 16 ratones homocigotos mediante el método de transferencia génica específico de placenta de la presente invención. d es una fotografía que muestra el genotipado mediante PCR de la descendencia obtenida. Nacieron ratones homocigotos, que tenían sólo el alelo mutante pero no el alelo silvestre. e es una fotografía que muestra un ratón silvestre para erk2 (izquierda), un ratón heterocigoto (centro) y un ratón recién nacido homocigoto (derecha) como resultado del tratamiento de la presente invención. f es una fotografía que muestra el resultado de la inmunotransferencia de tipo Western. Se mostró que el recién nacido expresaba erk2 endógena y que los ratones homocigotos no expresaban erk2.

La figura 5 muestra diagramas y fotografías que ilustran el rescate de ratones deficientes en p38α. a es un diagrama que ilustra el locus en ratones deficientes en p38α. La p38α endógena no se expresa porque se inserta un gen de resistencia a fármacos entre los exones 10 y 11. b es un diagrama que muestra un vector de lentivirus construido para expresar p38α bajo el control de un promotor CAG. c es una fotografía que muestra genotipos de la descendencia obtenida mediante el uso del método de la presente invención para transferir genes a blastocistos obtenidos apareando ratones heterocigotos. No nacen ratones hemocigotos mediante apareamiento natural; sin embargo, se obtuvieron 34 ratones homocigotos mediante el método de transferencia génica específico de placenta de la presente invención. d es una fotografía que muestra el genotipado mediante PCR de la descendencia obtenida. Nacieron ratones homocigotos, que tenían sólo el alelo mutante pero no el alelo silvestre. e es una fotografía que muestra un ratón silvestre para p38α (izquierda) y un ratón recién nacido homocigoto (derecha) como resultado del tratamiento de la presente invención. f es una fotografía que muestra el resultado de la inmunotransferencia de tipo Western. Se mostró que el recién nacido expresaba p38α endógena y que los ratones homocigotos no expresaban erk2.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

La presente invención se basa en el hallazgo de los presentes inventores de que pueden introducirse genes arbitrarios específicamente en células trofectodérmicas no humanas con alta eficacia, infectando vectores virales que portan un polinucleótido arbitrario en blastocistos no humanos, de los que se ha retirado la zona pelúcida (matriz extracelular que cubre embriones tempranos en preimplantación para protegerlos de la infección viral y similares), con vectores virales. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos para introducir polinucleótidos arbitrarios específicamente en células trofectodérmicas no humanas.

En los métodos de la presente invención, en primer lugar se obtienen blastocistos no humanos. Blastocisto se refiere a un embrión que ha terminado la fase de segmentación durante el desarrollo temprano de mamíferos. Los óvulos de mamífero son alecíticos; se dividen holoblásticamente y forman agregados de blastómeros. En la fase de 32 células, los óvulos se dividen dando lugar al trofectodermo que envuelve el exterior del agregado y la masa celular interna dentro del agregado. La masa celular interna se desarrolla dando lugar al cuerpo de un feto en el futuro, mientras que el trofectodermo se diferencia dando lugar a la placenta. En los métodos de la presente invención, se introducen polinucleótidos arbitrarios específicamente en células trofectodérmicas no humanas que constituyen la capa más exterior de un blastocisto.

Pueden prepararse blastocistos no humanos mediante los métodos descritos a continuación. Específicamente, se recogen óvulos y espermas de animales arbitrarios, y entonces se lleva a cabo la fecundación mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Pueden prepararse blastocistos no humanos a partir de los óvulos fecundados resultantes mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, cultivando los óvulos en medio kSOM durante 96 horas. Alternativamente, pueden obtenerse blastocistos no humanos directamente de animales según métodos que se usan convencionalmente por los expertos en la técnica (por ejemplo, métodos descritos en: Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, 3ª edición, pág. 201-203, Cold

Spring Harbor Laboratory Press).

En los métodos de la presente invención, se retira entonces la zona pelúcida de los blastocistos no humanos obtenidos anteriormente. Se cubren los embriones (embriones tempranos en preimplantación) con zona pelúcida, que es matriz extracelular, para protegerlos de la infección de virus o similares. En los métodos de la presente invención, se retira la zona pelúcida.

La zona pelúcida puede retirarse mediante métodos conocidos, por ejemplo, tratamiento ácido, tratamiento enzimático o tratamiento físico. Un ejemplo de un tratamiento ácido de este tipo es un tratamiento que usa disolución ácida de Tyrode (Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, 3ª edición, págs. 485-486, Cold Spring Harbor Laboratory Press). La zona pelúcida puede disolverse parcialmente, por ejemplo, aspirando la disolución ácida de Tyrode (pH de 2,3 a 2,5) con una micropipeta y entonces pulverizando suavemente los embriones no humanos inmovilizados con la disolución. Alternativamente, la zona pelúcida puede disolverse sumergiendo los embriones no humanos en disolución ácida de Tyrode.

El tratamiento enzimático para la retirada de la zona pelúcida incluye tratamiento con pronasa (Calbiochem 537088, Sigma P5147) y similares. Por ejemplo, se colocan embriones no humanos en una disolución de pronasa al 0,5% hasta que se disuelve la zona pelúcida. Una vez disuelta la zona pelúcida, se lavan bien los embriones con un medio y entonces pueden obtenerse blastocistos con la zona pelúcida retirada (Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, 3ª edición, págs. 731, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Además, en la presente invención, zona pelúcida también puede retirarse mediante métodos físicos. Tales métodos físicos de retirada incluyen un método de disección de zona en el que se inmovilizan embriones no humanos y se disecciona parte de la zona pelúcida con una micropipeta (Hum. Reprod., 5:7-13, 1990), métodos para diseccionar, perforar o afinar la zona pelúcida con un láser (Hum. Reprod., 15:1061-1064, 2000) o un piezomicromanipulador (Developmental Biology, 250:348-357, 2002) y similares.

La zona pelúcida puede retirarse mediante los métodos descritos anteriormente. En la presente invención, sin embargo, los métodos para retirar la zona pelúcida no se limitan a los ejemplos descritos anteriormente y los métodos incluyen todos los métodos que puedan retirar la zona pelúcida.

Finalmente, en los métodos de la presente invención se introducen polinucleótidos arbitrarios en blastocistos no humanos con la zona pelúcida retirada. En una realización preferida, los métodos para introducir polinucleótidos arbitrarios en blastocistos no humanos con la zona pelúcida retirada incluyen métodos para introducir un vector que porta un polinucleótido arbitrario en blastocistos, pero no se limitan particularmente a ellos.

Los vectores que portan un polinucleótido arbitrario que va a introducirse en blastocistos no humanos incluyen vectores virales. Tales vectores virales incluyen vectores virales arbitrarios usados convencionalmente por los expertos en la técnica, por ejemplo, vectores de lentivirus (Molecular Therapy 2003, 8; 666-673), vectores retrovirales (Molecular Therapy 2003, 8; 666-673), vectores de adenovirus, liposomas de HVJ, Lipofectamine, y similares. El liposoma de HVJ (virus hemaglutinante de Japón: virus Sendai) es un vector que puede introducir eficazmente genes y oligonucleótidos encapsulados en liposomas en diversos órganos en el cuerpo usando la actividad de la proteína de fusión de HVJ, un virus que produce fusión celular, y HMG-1, una proteína de unión a ADN.

De tales vectores, se prefieren los vectores de lentivirus. El lentivirus pertenece a la familia de los retrovirus, y es un virus de inmunodeficiencia en seres humanos, monos, gatos y ganado bovino. Con respecto a la estructura génica, el virus está constituido por varios genes reguladores además de por genes estructurales fundamentales para el retrovirus (gag, pol y env). Los vectores de lentivirus construidos por alteración del lentivirus pueden integrar genes foráneos en el cromosoma, y por tanto puede esperarse la expresión a largo plazo de los genes introducidos en ellos. Además, a diferencia de otros vectores retrovirales, los vectores lentivirus tienen una señal de translocación nuclear, y por tanto pueden introducir genes en células que no están dividiéndose.

Los vectores de lentivirus usados en la presente invención incluyen vectores de lentivirus que tienen al menos LTR, RRE y GAG. Los vectores de lentivirus usados en los métodos de la presente invención deben tener al menos estos requisitos, pero pueden tener adicionalmente otros genes, por ejemplo, deltaU3, PPT y WPRE. Tales vectores de lentivirus también se usan preferiblemente como vector viral en los métodos de la presente invención.

En una realización particularmente preferida, los vectores de lentivirus usados en la presente invención tienen LTR (deltaU3), GAG, RRE, PPT y WPRE. Un ejemplo representativo de vectores de lentivirus que tienen tales estructuras es un vector construido sustituyendo un ADNc de interés por el resto de GFP del vector viral de GFP dado a conocer en el ejemplo 1 y en el siguiente documento: Molecular Therapy 2003, 8; 666-673. La estructura del vector y el método de construcción se dan a conocer en el documento indicado anteriormente.

Pueden infectarse blastocistos no humanos con un vector de lentivirus que porta un polinucleótido arbitrario, por ejemplo, mezclando blastocistos con la zona pelúcida retirada con una disolución que contiene el vector de lentivirus que porta el polinucleótido arbitrario, y luego dejando reposar la mezcla durante de 4 a 5 horas. Mediante este método, puede introducirse específicamente un vector de lentivirus que tiene un polinucleótido arbitrario en el

trofectodermo.

Alternativamente, también pueden introducirse polinucleótidos arbitrarios en blastocistos no humanos con la zona pelúcida retirada usando un reactivo de transfección de ácido nucleico. En el presente documento, el reactivo de transfección de ácido nucleico se refiere a cualquier reactivo que pueda introducir un polinucleótido arbitrario en blastocistos. Tales reactivos de transfección de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Effectene (Qiagen) y FuGene (Roche).

Puede introducirse un polinucleótido en una forma tal como ADN, ARN, ADNc, ARNm, o ácido nucleico artificial. Tales ADN, ARN, ADNc y ARNm también incluyen derivados de los mismos. Tales ácidos nucleicos artificiales incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, ADN, ARN, ADNc, ARNm, en los que sus estructuras de cadena de azúcar están modificadas, o derivadas de los mismos. Además, los polinucleótidos que van a introducirse pueden ser polinucleótidos desnudos o polinucleótidos introducidos en un vector. Los expertos en la técnica pueden diseñar y usar vectores apropiados dependiendo del fin. Los vectores usados en la presente invención pueden comprender, además de un polinucleótido arbitrario que va a introducirse, regiones de polinucleótido que funcionan en huéspedes de expresión, tales como sitio de inicio de la transcripción y sitio de terminación de la transcripción, para la expresión más eficaz del polinucleótido arbitrario.

En una realización preferida de la presente invención, los polinucleótidos que van a introducirse incluyen, pero no se limitan particularmente a, polinucleótidos que codifican para una proteína esencial para el desarrollo fetal o polinucleótidos que regulan la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal.

Tales polinucleótidos que codifican para una proteína esencial para el desarrollo fetal incluyen cualquier polinucleótido que codifica para una proteína implicada directa o indirectamente en el desarrollo fetal. Tales polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, Dlx3 (SEQ ID NO: 1), Fgfr2 (SEQ ID NO: 2), Fra1 (SEQ ID NO: 3), Fzd5 (SEQ ID NO: 4), Gab1 (SEQ ID NO: 5), Gcml (SEQ ID NO: 6), Grb2 hipomorfo (SEQ ID NO: 7), Gja7 (SEQ ID NO: 8), Hgf (SEQ ID NO: 9), Hsp84-1 (SEQ ID NO: 10), ltgav (SEQ ID NO: 11), Junb (SEQ ID NO: 12), Lifr (SEQ ID NO: 13), ERK1 (SEQ ID NO: 14), ERK2 (SEQ ID NO: 15), ERK5 (SEQ ID NO: 16), MEK1 (polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17), MEKk3 (polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18), p38α (SEQ ID NO: 19), p38β (SEQ ID NO: 20), Met (SEQ ID NO: 21), Pdgfra (SEQ ID NO: 22), Pdgfb (SEQ ID NO: 23), Pparg (SEQ ID NO: 24), Rxra (SEQ ID NO: 25), Rxrb (SEQ ID NO: 26), Sos1 (SEQ ID NO: 27), Vhlh (SEQ ID NO: 28), Wnt2 (SEQ ID NO: 29), Ets2 (SEQ ID NO: 30), Mash2 (SEQ ID NO: 31), Egfr (SEQ ID NO: 32), Hsf1 (SEQ ID NO: 33), Bmp5 (SEQ ID NO: 34), Bmp7 (SEQ ID NO: 35), Dnmt1 (SEQ ID NO: 36), Itga4 (SEQ ID NO: 37), Lhx1 (SEQ ID NO: 38), Mrj (SEQ ID NO: 39), Tcf1 (SEQ ID NO: 40), Lef1 (SEQ ID NO: 41), Cdx2 (SEQ ID NO: 42), Eomes (SEQ ID NO: 43), Fgf4 (SEQ ID NO: 44), Esrrb (SEQ ID NO: 45), Hand1 (SEQ ID NO: 46), Mdfi (SEQ ID NO: 47), Esx1 (SEQ ID NO: 48), Arnt (SEQ ID NO: 49), Tcfeb (SEQ ID NO: 51), y Gjb (SEQ ID NO: 52).

Los expertos en la técnica pueden obtener fácilmente los polinucleótidos descritos anteriormente que codifican para una proteína esencial para el desarrollo fetal. Por ejemplo, tales polinucleótidos pueden aislarse de fuentes naturales, usando diversas muestras biológicas tales como tejido placentario, células madre trofoblásticas y células diferenciadas de las mismas como fuente, basándose en sus propiedades fisicoquímicas y similares. Alternativamente, los polinucleótidos pueden sintetizarse químicamente basándose en información de secuencia conocida. Alternativamente, los polinucleótidos pueden obtenerse usando técnicas de recombinación génica para transformar células huésped con un vector que porta los polinucleótidos que codifican para una proteína esencial para el desarrollo fetal, cultivando luego las células transformadas resultantes que producen la proteína de recombinación génica y recogiendo la proteína de las células o el sobrenadante de cultivo de las mismas.

Los polinucleótidos mencionados anteriormente que codifican para una proteína esencial para el desarrollo fetal incluyen genes homólogos de diversos animales. En el presente documento, “gen homólogo” se refiere a los polinucleótidos enumerados anteriormente de SEQ ID NO: 1 a 16 y 19 a 51, polinucleótidos que codifican para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ó 18, o polinucleótidos que codifican para una proteína que tiene una función biológica equivalente a la de los productos de transcripción/traducción de tales polinucleótidos, en diversos animales.

Los métodos que conocen bien los expertos en la técnica para aislar genes homólogos incluyen técnicas de hibridación (Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975) y técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230,1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol. 239, 487491, 1988). Más específicamente, los expertos en la técnica pueden aislar de manera rutinaria polinucleótidos que codifican para una proteína esencial para el desarrollo fetal de diversas células y tejidos animales (por ejemplo, tejidos placentarios, células madre trofoblásticas y células diferenciadas de las mismas), usando como sonda, polinucleótidos que codifican para una proteína esencial para el desarrollo fetal (por ejemplo, las secuencias de polinucleótido de SEQ ID NO: 1 a 16 y 19 a 51, y las secuencias de polinucleótido que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ó 18) o una parte de las mismas, o usando como cebador, oligonucleótidos que se hibridan específicamente con los polinucleótidos que codifican para una proteína esencial para el desarrollo fetal. Alternativamente, pueden obtenerse secuencias de genes homólogos de bases de datos conocidas.

Los polinucleótidos de la presente invención que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal se derivan preferiblemente de, pero no se limitan particularmente a, seres humanos, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, ganado bovino, caballos, cerdos, cabras, ovejas y monos, más preferiblemente de seres humanos.

Además, en una realización preferida, los polinucleótidos arbitrarios usados en la presente invención incluyen polinucleótidos que regulan la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal. Tales polinucleótidos incluyen, por ejemplo:

(a)

ADN que expresan ARN complementarios al producto de transcripción de un ADN que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal;

(b)

ADN que expresan ARN que tienen una actividad de ribozima de escindir específicamente el producto de transcripción de un ADN que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal;

(c)

ADN que expresan ARN que tienen una actividad de iARN de escindir específicamente el producto de transcripción de un ADN que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal; y

(d)

ADN que se unen específicamente a un factor regulador de la transcripción de un ADN que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal y regula la expresión del mismo.

En el presente documento, “regulación de la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal” incluye potenciación o supresión de la transcripción de un gen que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal, o potenciación o supresión de su traducción para dar una proteína.

En una realización, “polinucleótido que regula la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal” es un ADN que codifica para un ARN antisentido complementario al producto de transcripción de un ADN que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal. El efecto antisentido se demostró por primera vez usando el método de expresión génica transitoria, basado en el hallazgo de que un ARN antisentido ejerce un efecto antisentido cuando se introduce en plantas mediante electroporación (Ecker y Davis, Proc. Natl. Acad. EE:UU:, 83: 5372, 1986). Tras este hallazgo, se notificaron otros casos, cuando se redujeron los niveles de expresión de los genes diana mediante la expresión de ARN en tabaco o petunia (Krol et al., Nature 333: 866, 1988). Hasta la fecha, el efecto antisentido se ha establecido como método para suprimir la expresión génica en eucariotas, incluyendo tanto animales como plantas.

La acción de los ácidos nucleicos antisentido en la supresión de la expresión génica diana incluye: inhibición del inicio de la transcripción mediante formación de moléculas tricatenarias; supresión de la transcripción mediante la formación de híbridos con un sitio que tiene una estructura de bucle abierto local generada por ARN polimerasa; inhibición de la transcripción mediante la formación de híbridos con ARN a medida que avanza su síntesis; supresión de corte y empalme mediante la formación de híbridos en una unión intrón-exón; supresión de corte y empalme mediante la formación de híbridos con el sitio de formación de espliceosoma; supresión de transporte desde el núcleo hasta el citoplasma mediante la formación de híbridos con ARNm; supresión de corte y empalme mediante la formación de híbridos con el sitio de ocupación de extremos o el sitio de adición de poli(A); supresión del inicio de la traducción mediante la formación de híbridos con el sitio de unión del factor de inicio de la traducción; supresión de la traducción mediante la formación de híbridos con el sitio de unión a ribosomas adyacentes al codón de iniciación; prevención de elongación de cadena peptídica mediante la formación de híbridos con la región de traducción del sitio de unión a polisomas del ARNm; y supresión de la expresión génica mediante la formación de híbridos con el sitio de interacción ácido nucleico-proteínas. Estos inhiben el proceso de transcripción, corte y empalme o traducción y suprimen la expresión génica diana (Hirashima y Inoue, Shin Seikagaku Jikkenkoza 2 (New Lecture for Experimental Biochemistry 2), Kakusan IV (Nucleic Acid IV), Replication and Expression of Genes; Ed., Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd., págs. 319-347, 1993).

La expresión de una proteína endógena esencial para el desarrollo fetal también puede suprimirse usando ADN que codifican para ribozimas. La ribozima se refiere a una molécula de ARN con actividad catalítica. Hay diversas ribozimas con diferentes actividades, y particularmente estudios de ribozimas que sirven como enzimas de escisión de ARN han permitido el diseño de ribozimas para la escisión del ARN específica de sitio. Las ribozimas incluyen las que comprenden 400 nucleótidos o más, tales como ARN M1 y de tipo intrón del grupo 1 incluidos en ARNseP, así como ribozimas con un dominio activo de aproximadamente 40 nucleótidos, denominadas ribozimas de tipo cabeza de martillo u horquilla (Makoto Koizumi y Eiko Otsuka, Tanpakushitu, Kakusan, Koso (Protein, Nucleic acid and Enzyme). 35:2191, 1990).

Por ejemplo, el dominio de autoescisión de las ribozimas de tipo cabeza de martillos escinde G13U14C15 en el extremo 3’ de C15. El apareamiento de bases de U14 con A en la posición 9 es importante para esta actividad, y se ha demostrado que se produce escisión aun cuando el nucleótido en la posición 15 es A o U, en lugar de C (Koizumi et al., FEBS Lett. 228:225, 1988). Cuando se diseña el sitio de unión a sustrato de una ribozima para que sea complementario a una secuencia de ARN adyacente al sitio diana, es posible crear una ribozima de escisión de ARN similar a una enzima de restricción que reconoce la secuencia UC, UU o UA en el ARN diana (Koizumi et al., FEBS Lett. 239:285, 1988; Makoto Koizumi y Eiko Otsuka, Tanpakushitu, Kakusan, Koso (Protein, Nucleic acid and Enzyme ), 35:2191, 1990; Koizumi et al., Nucleic Acids Res. 17:7059, 1989).

Las ribozimas de tipo horquilla también son útiles para el fin de la presente invención. Por ejemplo, se encuentran ribozimas de tipo horquilla en la cadena menor del ARN satélite en virus de la mancha anular del tabaco (Buzayan, Nature 323:349, 1986). Se ha demostrado que esta ribozima también puede diseñarse para escindir ARN de una manera específica de diana (Kikuchi y Sasaki, Nucleic Acid Res. 19:6751, 1992; Yo Kikuchi, Kagaku To Seibutsu (Chemistry and Biology) 30:112, 1992).

En una realización alternativa, “polinucleótido que regula la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal” es un ADN que codifica para ARN bicatenario (ARNbc) complementario al producto de transcripción de un ADN endógeno que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal. La introducción de un ARNbc que comprende una secuencia idéntica o similar a la secuencia génica diana en células puede producir el fenómeno denominado interferencia de ARN (iARN), donde se suprimen las expresiones tanto del gen foráneo introducido y el gen endógeno diana. Cuando se introducen de aproximadamente 40 a algunos cientos de pares de bases de ARNbc en las células, una nucleasa similar a la ARNasa III denominada Dicer, que tiene un dominio helicasa, procesa los ARNbc a partir de su extremo 3’ para dar aproximadamente de 21 a 23 pares de bases de ARN de interferencia corto (ARNic) en presencia de ATP. Proteínas específicas se unen al ARNic para formar complejos de nucleasa (complejos de silenciamiento inducidos por ARN (RISC)). Los complejos reconocen y se unen a la misma secuencia que el ARNic, y entonces escinden el producto de la transcripción (ARNm) de un gen diana en la posición correspondiente al centro del ARNic mediante la actividad enzimática similar a ARNasa III. En otra ruta, la cadena antisentido del ARNic se une al ARNm y sirve como cebador para la ARN polimerasa dependiente de ARN (RsRP) para sintetizar ARNbc. También se considera otra ruta donde este ARNbc también sirve como sustrato para Dicer, produciendo nuevo ARNic para amplificar el efecto.

La iARN se encontró originalmente en Caenorhabditis elegans (Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, 1998), y hasta ahora se ha observado no sólo en Caenorhabditis elegans sino también en diversos organismos tales como plantas, Nematoda, Drosophila y Protozoa (Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999); Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15,485-490 (2001); Hammond, S. M., Caudy, A. A. & Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-119 (2001); Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)). Se ha confirmado que se suprime la expresión génica diana cuando se introducen ARNbc exógenos en estos organismos. La iARN también se ha usado como método para crear animales deficientes.

En el momento en que se dio a conocer la iARN, se creía que sólo era eficaz una longitud particular (40 nucleótidos)

o mayor de los ARNbc. Sin embargo, Tuschl et al. en la Universidad Rockefeller en los EE.UU. notificaron que la introducción de aproximadamente 21 pares de bases de ARNbc monocatenario (ARNic) en células produce un efecto de iARN sin inducir respuesta antiviral mediada por PKR, ni siquiera en células de mamífero (Tuschl, Nature, 411, 494-498 (200 1 )). Desde entonces, la iARN ha llamado mucho más la atención como tecnología aplicable para células de mamífero diferenciadas tales como células humanas.

Un ADN para su uso en los métodos de la presente invención comprende un ADN codificante antisentido que codifica para un ARN antisentido para cualquier región dentro del producto de transcripción (ARNm) de un gen diana y un ADN codificante sentido que codifica para un ARN sentido para cualquier región dentro del mismo ARNm, y permite la expresión del ARN antisentido y el ARN sentido a partir del ADN codificante antisentido y el ADN codificante sentido, respectivamente. Además, también puede prepararse un ARNbc a partir del ARN antisentido y sentido. En la presente invención, la secuencia diana no está limitada particularmente, siempre que un ARNbc que comprende una secuencia idéntica o similar a la secuencia diana suprima la expresión de un ADN que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal cuando se introduce en las células.

Cuando un sistema de expresión para el ARNbc para su uso en los métodos de la presente invención se mantiene en un vector o similar, la construcción puede ser de manera que el ARN tanto antisentido como sentido se expresen a partir de un único vector o de manera independiente a partir de vectores diferentes. Por ejemplo, cuando se expresan ARN tanto antisentido como sentido a partir de un único vector, puede prepararse un constructo construyendo por separado un casete de expresión para el ARN antisentido y un casete de expresión para el ARN sentido, donde se une un promotor tal como la serie polIII, que permite la expresión de un ARN corto, en el sentido de 5’ del ADN codificante antisentido y el ADN codificante sentido, respectivamente, e insertando entonces estos casetes en un vector en la misma orientación o en la inversa.

Alternativamente, el sistema de expresión puede construirse de manera que el ADN codificante antisentido y el ADN codificante sentido se dispongan en cadenas separadas y en el sentido opuesto. Este constructo comprende un ADN bicatenario (ADN que codifica para ARNic) en el que la cadena que codifica para el ARN antisentido y la cadena que codifica para el ARN sentido se aparean entre sí y se disponen promotores en ambos extremos de los mismos en el sentido opuesto, de manera que el ARN antisentido o el ARN sentido pueden expresarse a partir de cada cadena. En este caso, se prefiere que se disponga un terminador en el extremo 3’ de cada cadena (cadena codificante de ARN antisentido o cadena codificante de ARN sentido) para evitar la adición de secuencias extra en el sentido de 3’ del ARN sentido y el ARN antisentido. Puede usarse una secuencia de cuatro o más nucleótidos de adenina (A) consecutivos o similar como terminador. Además, los dos promotores son preferiblemente diferentes en este sistema de expresión palindrómico.

Mientras, cuando se expresan el ARN antisentido y ARN sentido a partir de vectores separados, pueden prepararse constructos, por ejemplo, construyendo por separado un casete de expresión para el ARN antisentido y un casete de expresión para el ARN sentido, donde se une un promotor tal como la serie polIII, que permite la expresión de un ARN corto, en el sentido de 5’ del ADN codificante antisentido y el ADN codificante sentido, respectivamente, e insertando entonces estos casetes en vectores separados.

Puede usarse un ARNic como ARNbc para la iARN. “ARNic” se refiere a un ARN bicatenario, que consiste en cadenas cortas dentro de un intervalo no citotóxico y no se limita a ARNic con una longitud completa de 21 a 23 pares de bases tal como notifican Tuschl et al. (citado anteriormente). El ARNic no está limitado particularmente, siempre que su longitud esté dentro de un intervalo no tóxico; por ejemplo, la longitud puede estar en el intervalo de 15 a 49 pares de bases, preferiblemente de 15 a 35 pares de bases, y más preferiblemente de 21 a 30 pares de bases. Alternativamente, la longitud final de la parte de ARN bicatenario formada del ARNic expresado como resultado de la transcripción puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 15 a 49 pares de bases, preferiblemente de 15 a 35 pares de bases, y más preferiblemente de 21 a 30 pares de bases.

Como ADN para su uso en los métodos de la presente invención, pueden usarse constructos que forman un ARN bicatenario con una estructura de horquilla (ARN en “horquilla” (ARNhp) auto-complementario preparado insertando una secuencia apropiada (preferiblemente secuencia de intrones) entre las repeticiones invertidas de una secuencia diana (Smith, N.A., et al. Nature, 407: 319, 2000; Wesley, S. V. et al. Plant J. 27: 581, 2001; Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29:E55, 2001).

No es necesario que los ADN usados para la iARN sean idénticamente perfectos al gen diana; sin embargo, tienen al menos una identidad de secuencia del 70% o superior, preferiblemente del 80% o superior, y más preferiblemente del 90% o superior (por ejemplo, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o superior). La identidad de secuencia puede determinarse mediante los métodos descritos anteriormente.

Los expertos en la técnica pueden preparar los ADN anteriores usando técnicas de ingeniería genética comunes. Los ADN pueden prepararse, por ejemplo, sintetizando secuencias arbitrarias usando métodos de síntesis de oligonucleótido bien conocidos.

Los ADN pueden introducirse en cromosomas celulares y expresarse dentro de las células tal como están; sin embargo, los ADN anteriores preferiblemente se portan por vectores para la transferencia génica eficaz al interior de células, y similares. En el presente documento también se describen vectores que comprenden los ADN para su uso en los métodos de la presente invención.

Además, en otra realización, “polinucleótido que regula la expresión de un polinucleótido que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal” incluye ADN que regulan la expresión uniéndose específicamente a un factor regulador de la transcripción para el ADN que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal. Como ejemplo de tales ADN, se conocen los ADN señuelo. Los ADN señuelo incluyen, por ejemplo, aproximadamente 20 nucleótidos de ADN que comprenden una secuencia complementaria a un factor regulador de la transcripción tal como NF-kB. Los ADN señuelo inhiben la función de un factor regulador de la transcripción uniéndose al factor. Como resultado, también se suprime la expresión de una proteína que se regula por el factor regulador de la transcripción.

Por tanto, los polinucleótidos que se introducen específicamente en el trofectodermo mediante los métodos de la presente invención incluyen no sólo polinucleótidos que codifican para una proteína esencial para el desarrollo fetal sino también polinucleótidos que regulan la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal. Por ejemplo, puede analizarse la función génica en embriogénesis introduciendo en blastocistos un polinucleótido que regula la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal.

Es posible determinar si se ha introducido un polinucleótido arbitrario específicamente en el trofectodermo de un blastocisto no humano mediante los métodos de la presente invención, usando métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, amplificando genes introducidos con PCR, o detectando la expresión de un gen indicador tal como EGFP o lacZ con un método de fluorescencia o luminiscencia, o similar.

Los blastocistos no humanos en los que van a introducirse los polinucleótidos que codifican para una proteína esencial para el desarrollo fetal o polinucleótidos que regulan la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal anteriores no están limitados particularmente. Los blastocistos no humanos en los que van a introducirse tales polinucleótidos incluyen, por ejemplo, blastocistos derivados de animales que tienen una anomalía en una proteína esencial para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de proteínas de la misma. En el presente documento, “proteína esencial para el desarrollo fetal” se refiere a una proteína implicada directa o indirectamente en el desarrollo fetal, tal como se describió anteriormente. Específicamente, las proteínas incluyen las que comprenden las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótido de SEQ ID NO: 1 a 16 y 19 a 51, y proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ó 18. Además, “que tienen una anomalía en una proteína esencial para el desarrollo fetal” se refiere a un estado en el que la proteína esencial para el desarrollo fetal es estructural o funcionalmente anómala. Alternativamente, “que tienen una anomalía en la regulación de la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal” se refiere a que tienen

una anomalía en cualquiera o en ambos de los siguientes procesos: transcripción de un ADN que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal para dar ARN y traducción de dicho ARN para dar proteínas. Además, en la presente invención, “que tienen una anomalía en la regulación de la expresión de una proteína” incluye no sólo el caso de que la producción de la proteína se inhibe completamente debido a la anomalía en cualquiera o ambos de los procesos de transcripción y traducción, sino también el caso en que el nivel o momento de la expresión de la proteína no es normal o en que la proteína se produce con anomalía en parte de la función o estructura normal de la proteína.

Por ejemplo, animales no humanos que no podrían nacer naturalmente debido a letalidad embrionaria pueden nacer introduciendo un polinucleótido que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal en blastocistos de los animales que tienen la anomalía en la proteína que es esencial para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de proteínas de la misma.

Los animales no humanos de los que se derivan los blastocistos incluyen, pero no se limitan particularmente a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, ganado bovino, cerdos, cabras, ovejas, monos, y similares.

Tal como se describió anteriormente, también pueden introducirse “polinucleótidos que regulan la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal” en blastocistos. Anteriormente se describieron realizaciones específicas de tales polinucleótidos. Además, los blastocistos no humanos en los que van a introducirse tales polinucleótidos incluyen blastocistos de animales que tienen una anomalía en una proteína esencial para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de proteínas de la misma, y blastocistos que no tienen anomalía en proteínas esenciales para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de proteínas de la mismas. Cuando un polinucleótido que regula la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal es un polinucleótido que potencia la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal, por ejemplo, animales que no podrían nacer naturalmente debido a letalidad embrionaria, pueden nacer introduciendo el polinucleótido en blastocistos de animales que tienen una anomalía en una proteína esencial para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de proteínas de la misma. Alternativamente, cuando un polinucleótido que regula la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal es un polinucleótido que suprime la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal, por ejemplo, pueden identificarse genes esenciales para el desarrollo fetal, o puede analizarse la función genética en el desarrollo fetal introduciendo el polinucleótido en blastocistos que no tienen anomalía en proteínas esenciales para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de proteínas de las mismas.

Por tanto, los expertos en la técnica pueden usar los métodos de la presente invención para diversos fines y aplicaciones seleccionando polinucleótidos apropiados que van a introducirse y blastocistos no humanos apropiados en los que se introducen los polinucleótidos. En los métodos de la presente invención, los polinucleótidos que van a introducirse no están particularmente limitados. Además, las combinaciones de polinucleótidos que van a introducirse no están limitadas.

La presente invención también se refiere a métodos para introducir blastocistos no humanos donde se introduce un polinucleótido arbitrario específicamente en las células trofectodérmicas.

En los métodos de la presente invención para producir blastocistos no humanos, en primer lugar se retira la zona pelúcida de los blastocistos. Puede usarse cualquier blastocisto no humano. Los blastocistos también pueden obtenerse, por ejemplo, mediante los métodos descritos anteriormente. Además, la zona pelúcida puede retirarse, por ejemplo, mediante los métodos descritos anteriormente, pero los métodos no se limitan a los mismos.

En los métodos de la presente invención para producir blastocistos no humanos, se introducen entonces polinucleótidos arbitrarios en los blastocistos anteriores. Los polinucleótidos pueden introducirse mediante los métodos descritos anteriormente, pero los métodos no se limitan a los mismos.

En los métodos de la presente invención para producir blastocistos no humanos, no hay limitación sobre el tipo de polinucleótido que va a introducirse, y puede introducirse cualquier polinucleótido. En una realización preferida, tales polinucleótidos incluyen polinucleótidos que codifican para una proteína esencial para el desarrollo fetal o polinucleótidos que regulan la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal. Realizaciones específicas de estos polinucleótidos también son tal como se describió anteriormente.

Además, no hay limitación sobre el tipo de blastocisto no humano en el que se introducen los polinucleótidos descritos anteriormente. Por ejemplo, pueden usarse los blastocistos no humanos descritos anteriormente.

En los métodos de la presente invención para producir blastocistos no humanos, no hay limitación sobre el polinucleótido que va a introducirse, el blastocisto no humano en el que se introduce el polinucleótido o combinaciones de los mismos. Los expertos en la técnica pueden producir y usar combinaciones apropiadas dependiendo del fin.

En el presente documento se describen métodos para producir animales no humanos y métodos para rescatar animales no humanos de letalidad embrionaria.

En los métodos descritos para producir animales no humanos, en primer lugar se retira la zona pelúcida de los

blastocistos de un animal no humano. Puede usarse cualquier blastocisto no humano para este fin. Los blastocistos que van a usarse en los métodos descritos para producir animales no humanos son preferiblemente, pero no se limitan a, blastocistos de animales no humanos que tienen una anomalía en una proteína esencial para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de proteínas de la misma. Pueden introducirse polinucleótidos en tales blastocistos para generar animales no humanos rescatados de letalidad embrionaria debido a anomalía placentaria.

Tales blastocistos pueden obtenerse mediante los métodos descritos anteriormente. La zona pelúcida también puede retirarse mediante cualquier método, por ejemplo, los métodos descritos anteriormente.

En los métodos descritos para producir animales no humanos, se introduce entonces un polinucleótido arbitrario en los blastocistos anteriores. El polinucleótido también puede introducirse mediante los métodos descritos anteriormente.

En los métodos descritos para producir animales no humanos, no hay limitación sobre el tipo de polinucleótido que va a introducirse. En una realización preferida, el polinucleótido incluye polinucleótidos que codifican para una proteína esencial para el desarrollo fetal o polinucleótidos que normalizan la regulación de la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal. Realizaciones específicas del polinucleótido que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal son tal como se describió anteriormente. Además, los polinucleótidos que normalizan la regulación de la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal incluyen polinucleótidos que pueden corregir anomalías en cualquiera o ambos de los siguientes procesos: transcripción de un ADN que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal para dar ARN y traducción del ARN para dar proteínas. En el presente documento, normalización significa no sólo corrección perfecta de la anomalía, sino también corrección parcial de la anomalía y reducción en el grado de anomalía.

En los métodos descritos para producir animales no humanos, los blastocistos no humanos anteriores se trasplantan finalmente en un receptor. El receptor es preferiblemente el mismo animal o un animal que pertenece a la misma especie de animal que el animal del que se derivan los blastocistos. Los expertos en la técnica pueden trasplantar de manera rutinaria blastocistos en receptores (Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, 3ª edición, págs. 263-271, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Los animales no humanos que van a producirse incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, ganado bovino, caballos, cerdos, cabras, ovejas, monos, y similares.

Por tanto, pueden producirse animales no humanos que son letales embrionarios usando métodos para introducir polinucleótidos específicamente en células trofectodérmicas. Debe observarse que los animales no humanos producidos mediante los métodos descritos en el presente documento no son animales quiméricos porque no portan en sus cuerpos el polinucleótido introducido en el blastocistos.

En el presente documento se describen adicionalmente métodos para rescatar animales no humanos de letalidad embrionaria. En los métodos descritos para rescatar animales no humanos de letalidad embrionaria, en primer lugar se retira la zona pelúcida de los blastocistos de un animal no humano que tiene una anomalía en una proteína esencial para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de proteínas de la misma. Realizaciones de animales no humanos que tienen una anomalía en una proteína esencial para el desarrollo fetal y animales no humanos que tienen una anomalía en la regulación de la expresión de la proteína esencial para el desarrollo fetal son tal como se describió anteriormente. Tales blastocistos pueden obtenerse, por ejemplo, mediante los métodos descritos anteriormente. La zona pelúcida también puede retirarse mediante cualquier método y los métodos descritos anteriormente.

En los métodos descritos para rescatar animales no humanos de letalidad embrionaria, se introducen entonces polinucleótidos que codifican para una proteína esencial para el desarrollo fetal o polinucleótidos que normalizan la regulación de la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal en los blastocistos anteriores. Los polinucleótidos también pueden introducirse mediante los métodos descritos anteriormente.

En los métodos descritos para rescatar animales no humanos de letalidad embrionaria, se trasplantan los blastocistos anteriores a un receptor para que nazcan animales recién nacidos. El receptor es preferiblemente el mismo animal o un animal que pertenece a la misma especie animal que el animal del que se derivan los blastocistos. Los expertos en la técnica pueden trasplantar blastocistos a receptores y hacer que nazcan animales recién nacidos usando métodos convencionales. Además, los animales no humanos que van a rescatarse incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, ganado bovino, caballos, cerdos, cabras, ovejas, monos, y similares.

Además, en el presente documento se describen métodos de examen de polinucleótidos que rescatan de letalidad embrionaria, que comprenden las siguientes etapas:

(a)

retirar la zona pelúcida de los blastocistos de un animal no humano que tiene una anomalía en una proteína esencial para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de proteínas de la misma;

(b)

introducir polinucleótidos arbitrarios en los blastocistos obtenidos en la etapa (a);

(c)

trasplantar los blastocistos obtenidos en la etapa (b) a un receptor no humano para que nazca un animal recién nacido; y

(d)

seleccionar los polinucleótidos que han rescatado de letalidad embrionaria en comparación con cuando no se ha introducido polinucleótido arbitrario.

En los métodos de examen descritos, en primer lugar se retira la zona pelúcida de los blastocistos de un animal no humano que tiene una anomalía en una proteína esencial para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de proteínas de la misma Realizaciones específicas de animales no humanos que tienen una anomalía en una proteína esencial para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de proteínas de la misma son tal como se describió anteriormente. La retirada de los blastocistos puede lograrse mediante los métodos descritos anteriormente, pero no se limitan a los mismos.

En los métodos de examen descritos, se introducen entonces polinucleótidos arbitrarios en los blastocistos obtenidos tal como se describió anteriormente. Puede introducirse cualquier polinucleótido, y la longitud y el origen de los mismos, y los métodos para obtenerlos no están limitados. Los polinucleótidos usados en los métodos de examen pueden sintetizarse químicamente, o pueden derivarse de fuentes naturales, por ejemplo, bibliotecas génicas tales como bibliotecas de ADN, y productos de transcripción de las bibliotecas génicas. Además, estos polinucleótidos pueden usarse tras marcaje apropiado según sea necesario. Tal marcaje incluye, por ejemplo, marcaje radiactivo, marcaje fluorescente, y similares. Estos polinucleótidos pueden introducirse en blastocistos mediante los métodos descritos anteriormente.

En los métodos de examen descritos, los blastocistos no humanos anteriores introducidos con un polinucleótido arbitrario se trasplantan entonces en un receptor no humano para que nazca un animal recién nacido. Tal como se describió anteriormente, los blastocistos pueden trasplantarse a receptores no humanos y pueden obtenerse animales recién nacidos mediante métodos convencionales usados por los expertos en la técnica.

En los métodos de examen descritos, los polinucleótidos que han rescatado de letalidad embrionaria se seleccionan en comparación con cuando no se introduce polinucleótido arbitrario. Los polinucleótidos seleccionados pueden servir como polinucleótidos que normalizan la regulación de la expresión de una proteína esencial para el desarrollo fetal, y por tanto son útiles en la producción o el rescate de animales no humanos, que morirían de manera natural debido a letalidad embrionaria. Alternativamente, estos polinucleótidos pueden usarse como agentes terapéuticos para enfermedades producidas por una anomalía en proteínas esenciales para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de las mismas.

Ejemplos

A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente con referencia a los ejemplos, pero no se limita a los mismos.

Materiales y métodos

(1)

Método basado en LV de producción de TG (método convencional)

Se administró PMSG (gonadotropina sérica de yegua preñada) a ratones BDF1 hembra y tras aproximadamente 48 horas, se administró HCG para inducir superovulación. Se aparearon los ratones con ratones BDF1 macho. Aproximadamente 48 horas tras el apareamiento, se extrajeron los embriones en fase de dos a cuatro células de los oviductos en medio FHM. Se retiró la zona pelúcida mediante tratamiento con disolución ácida de Tyrode. Entonces, se colocaron los óvulos fecundados uno por uno en un lugar de disolución viral (1 x 108 ng/ml) para su infección. Se cultivaron los óvulos hasta que se convirtieron en blastocistos. Tras lavar con medio kSOM, se trasplantaron los blastocistos en el útero de un ratón pesudopreñado (en el día 2,5 del pseudoembarazo).

(2)

Rescate tetraploide (método convencional)

Tetraploide se refiere a un embrión tetraploide. El embrión contribuye principalmente a la placenta que es un tejido extraembrionario. Cuando se prepara una quimera por agregación con un embrión tetraploide y un embrión de un ratón mutante con anomalía placentaria, el ratón mutante puede desarrollarse en la placenta que tiene funciones normales. Se administró PMSG a ratones BDF1 hembra, y tras aproximadamente 48 horas, se administró HCG para inducir superovulación. Se aparearon los ratones con ratones BDF1 macho. Aproximadamente 48 horas tras el apareamiento, se extrajeron los embriones en fase de dos células de los oviductos en medio FHM. Se produjeron quimeras por agregación desarrollándose embriones en fase de cuatro células a partir de una célula tetraploide obtenida fusionando eléctricamente embriones diploides en fase de dos células entre sí, y colocándolos en estrecho contacto con embriones en fase de ocho células obtenidos mediante tratamiento de superovulación con el mismo esquema y apareando heterocigotos +/-, tras lo que se retiró la zona pelúcida mediante tratamiento con disolución ácida de Tyrode. Se cultivaron los embriones en medio kSOM hasta que se convirtieron en blastocistos. Se trasplantaron los blastocistos en el útero de un ratón pseudopreñado (en el día 2,5 del pseudoembarazo).

(3)

Método de transferencia génica específico de placenta usando LV (método de la presente invención)

Se administró PMSG a ratones hembra +/-, y tras aproximadamente 48 horas, se administró HCG para inducir superovulación. Se aparearon los ratones con ratones macho +/-. Aproximadamente 48 horas tras el apareamiento, se extrajeron los embriones de dos a cuatro células de los oviductos en medio en FHM. Se cultivaron los embriones de dos a cuatro células en medio kSOM durante aproximadamente 48 horas hasta que se convirtieron en blastocistos. Tras retirarse la zona pelúcida mediante tratamiento con disolución ácida de Tyrode, se colocaron los blastocistos uno por uno en un lugar de disolución viral (1 x 10 ng/ml) para su infección. El tiempo de infección fue de cuatro a cinco horas. Se lavaron una vez los blastocistos recogidos de la disolución viral y luego se trasplantaron los blastocistos en el útero de un ratón pseudopreñado (en el día 2,5 del pseudoembarazo).

(4)

Cortes tisulares

Se fijaron placentas con paraformaldehído al 4% a 4ºC durante 12 horas, y entonces se lavaron en PBS a 4ºC durante dos o tres horas. Se reemplazó la PBS con acetona y tras una o dos horas, se reemplazó la acetona con 1,5 ml/tejido de disolución Technovit 8400 (0,06 g/10 ml). Se fijaron los tejidos durante aproximadamente dos horas. Tras precipitarse los tejidos, se añadieron 50 µl de disolución Technovit 8400 (vial pequeño). Se añadieron los tejidos y resina dentro de la estructura, se cubrieron y entonces se incubaron a 4ºC durante 12 horas para su incorporación. Estos cortes se produjeron y se conservaron.

(5)

Inmunotransferencia de tipo Western

Se homogeneizaron colas de los recién nacidos en tampón de lisis usando un homogeneizador. Se dejaron los lisados en hielo con agitación ocasional durante 1 hora, y entonces se centrifugaron a 13.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se usaron los sobrenadantes resultantes como extractos. Se determinaron las concentraciones y se ajustaron para que fueran constantes. Entonces se cargaron los extractos y se sometieron a electroforesis. Tras la electroforesis, se transfirieron las muestras a una membrana de PCDF (Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA). Tras bloquear con tampón TBS-T que contenía un 5% de leche desnatada, se hizo reaccionar la membrana con un anticuerpo primario (ERK2, BD pan ERK n.º 610123; p38α, Santa Cruz p38 (C-20) n.º sc-535) a 4ºC durante la noche. Se lavó la membrana tres veces con tampón TBS-T, y entonces se incubó con un anticuerpo anti-conejo o anti-ratón marcado con HRP a temperatura ambiente durante una hora. Tras lavar cuatro veces con tampón TBS-T, se usó ECL™ (RPN2209) con desarrollo de color y se desarrolló una imagen.

(6)

PCR

Se extrajeron los ADN genómicos de una parte de los tejidos de fetos, placentas y recién nacidos para examinar sus genotipos mediante el método de PCR. Los cebadores y las condiciones de PCR usados se muestran a continuación

Tipado de EGFP

Cebador-1378: gagctagccaccatggtgagcaagggcgag (SEQ ID NO: 52)

Cebador-1382: tcaccttgatgccgttcttct (SEQ ID NO: 53)

Condición de PCR: 94ºC durante dos minutos, 30 ciclos de (94ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 30 segundos), y 72ºC durante dos minutos, seguido por 4ºC

Tipado de ERK2

Cebador-1331: taactgggtcgagcacagtgatgc (SEQ ID NO: 54)

Cebador-1332: tcagaattgatctggtcttcaagaccttg (SEQ ID NO: 55)

Cebador-1333: atgtatgctatacgaagttattagggc (SEQ ID NO: 56)

Condición de PCR: 95ºC durante dos minutos, 40 ciclos de (95ºC durante 20 segundos y 64ºC durante 40 segundos), y 72ºC durante un minuto, seguido por 4ºC

Tipado de p38

Cebador-1380: ccctcgtggatggttgccagcagc (SEQ ID NO: 57)

Cebador-1343: cttactttgcactgaacacacacatcc (SEQ ID NO: 58)

Condiciones de PCR: 94ºC durante dos minutos; 40 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante un minuto); y 72ºC durante dos minutos, seguido por 4ºC

Se trataron los productos de PCR resultantes con la enzima de restricción EcoRV. El genotipado se basó en las diferencias en tamaño entre los tipos silvestre y mutante.

[Ejemplo 1] Infección y evaluación de LV-CAG-EGFP

Se intentó la introducción de un lentivirus (LV) que portaba el gen de GFP (LV-CAG-EGFP, que se construyó mediante el método descrito en Molecular Therapy 2003, 8;666-673; se construyó el plásmido de vector de lentivirus SIN introducido con un ADNc que codifica para EGFP bajo el control de un promotor CAG y se combinó con un plásmido de empaquetamiento, plásmido de expresión Rev y plásmido de expresión VSVG; se introdujo la mezcla en células 293T mediante el método de fosfato de calcio; se recogieron las partículas virales liberadas al sobrenadante de cultivo y se concentraron mediante ultracentrifugación; para los plásmidos, véase la figura 1) usando el método de TG y el método de la presente invención. El gen usado en este experimento fue el gen de GFP y las zonas introducidas con el gen emiten fluorescencia verde. Se examinaron los sujetos en los que se había introducido el gen mediante cada método para determinar el sitio de infección y se evaluaron para determinar la eficacia de infección mediante observación microscópica, cortes tisulares, PCR, etc.

Con el método de TG, tanto el feto E13,5 como la placenta emitieron fluorescencia verde, y el gen se introdujo en ambos (figura 2). Mientras, con el método de la presente invención, el gen se introdujo sólo en la placenta y no en el feto (figura 2). Una comparación de los cortes en la placenta no tratada y la placenta en la que se había introducido el gel mediante el método de la presente invención demostró que el gen se introdujo en toda la zona de la placenta que tenía la introducción génica mediante el método de la presente invención (figura 3). Además, se examinó la introducción del gen mediante PCR. Con el método de TG, el gen se introdujo sólo en la placenta en algunos casos; sin embargo, en aproximadamente el 60% de todos los casos (38 de 66 sujetos), el gen se introdujo tanto en la placenta como en el feto (tabla 1). En contraposición, cuando se introdujo el mismo vector viral mediante el método de la presente invención, el gen se introdujo sólo en la placenta en los 69 sujetos, y no en ningún feto (tabla 1). Además, se analizaron 91 recién nacidos y el resultado mostró que todos habían nacido normalmente y que no se había introducido el gen (tabla 1). Los hallazgos descritos anteriormente demuestran que puede lograrse transferencia génica específica de placenta mediante el método de la presente invención.

Tabla 1

Método

dpc P + E P E (-) Número total

Método de

13,5 38 24 0 4 66

TG

19,5 ND ND 28 25 53

Método

13,5 0 69 0 0 69

novedoso

19,5 ND ND 0 91 91

Examinado mediante PCR. Sin embargo, no se analizó la placenta de E19,5

ND

: sin datos

P

: El gen se introdujo sólo en la placenta

E

: El gen se introdujo sólo en el embrión

(-)

: No se introdujo gen

[Ejemplo 2] Rescate de ratones deficientes para ERK2 y p38α

A continuación, los presentes inventores especularon con que introducir un gen de interés mediante los métodos de la presente invención en ratones mutantes que eran originalmente letales embrionarios debido a anomalía placentaria podría permitir su desarrollo y análisis posnatal. Se usaron ratones deficientes en ERK2 y ratones deficientes en p38α para estos experimentos.

(1) Ratones deficientes en ERK2 (figura 4)

Se ha notificado que los ratones deficientes en ERK2 son letales embrionarios aproximadamente en E10,5 debido a anomalía placentaria (Hatano N. et al., Genes Cells. Nov. de 2003; 8(11): 847-56). Según Hatano N. et al., las capas laberínticas son finas en la placenta deficiente; la pared cardiaca del feto se hace más fina y su desarrollo se retarda; y por tanto los embriones tras E 11,5 son indetectables. El afinamiento de las capas laberínticas y la anomalía de la pared cardiaca mejoraron mediante el rescate tetraploide. Por tanto, Hatano N. et al., argumentaron que el afinamiento de la pared cardiaca era una anomalía secundaria como resultado del suministro insuficiente de oxígeno y nutrientes de la placenta.

Se construyó un vector de lentivirus que expresaba ADNc de ERK2 bajo el control de un promotor CAG (figura 3b). Una vez retirada la zona pelúcida de los blastocistos obtenidos apareando ERK2 +/-con ERK2+/-, se infectaron los blastocistos con el vector viral y se trasplantaron en el útero de un ratón pseudopreñado. El genotipado de la descendencia resultante mediante PCR mostró 16 ratones homocigotos (figuras 4c y 4d). Los recién nacidos homocigotos parecieron ser ligeramente pequeños pero sanos, y también se observó que bebían leche (figura 4e). Además, la inmunotransferencia de tipo Western demostró que la proteína ERK2 estaba ausente en los ratones (figura 4f).

(2) Ratones deficientes en p38α (figura 5)

Se ha notificado que los ratones deficientes en p38α son letales embrionarios aproximadamente en E10,5 debido a anomalía placentaria (Adams RH et al., Mol Cell. jul. de 2000; 6(1): 109-16; Mudgett JS et al., Proc Natl Acad Sci

USA. 12 de sep. de 2000; 97(19): 10454-9). En los ratones deficientes en p38α, las capas laberínticas placentarias y la pared cardiaca fetal son finas e imperfectas, y se observa angiogénesis cerebral aberrante. Cuando se forma placenta normal mediante rescate tetraploide en los ratones, tanto su pared cardiaca como la angiogénesis cerebral fueron normales. Adams RH et al. notificaron que se suponía que las anomalías no placentarias se debían al suministro insuficiente de oxígeno y nutrientes de la placenta y por tanto la causa directa de letalidad embrionaria es la anomalía placentaria.

En los ratones deficientes en p38α, también se introdujo el gen específicamente en sus placentas usando un vector de lentivirus (figura 5b) y se determinaron sus genotipos mediante PCR. Como resultado, nacieron 34 ratones homocigotos (figuras 5c y 5d). Los recién nacidos de deleción homocigotos parecieron ser ligeramente pequeños pero sanos, y también se observó que bebían leche (figura 5e). Además, la inmunotransferencia de tipo Western demostró que la proteína p38α estaba ausente en los ratones (figura 5f).

Tal como se describió anteriormente, se estableció un sistema para transferencia génica específica de placenta y se demostró que pueden nacer ratones deficientes que son letales embrionarios debido a anomalía placentaria usando este sistema. Además, el uso de ratones deficientes también permite análisis funcionales posnatales.

Se han notificado cuarenta o más tipos de ratones mutantes genéticamente que muestran anomalía placentaria desde 2001 (Rossant J, Cross JC., Nat Rev Genet. Jul de 2001; 2(7):538-48. Review). Cuando los ratones son letales embrionarios debido a anomalía placentaria, el gen no puede analizarse para determinar su función o similar tras el nacimiento. Los métodos de la presente invención pueden aplicarse para rescatar experimentos de tales ratones mutantes y por tanto para permitir análisis funcionales génicos posnatales.

Aunque el rescate tetraploide compensa simplemente la placenta anómala de un embrión y normaliza su función, el uso de LV permite que se expresen genes mutantes de una manera específica de placenta, y también pueden usarse LV en combinación con iARN. Por ejemplo, se espera que pueda analizarse la función específica de placenta de ERK2 cuando un gen de ERK2 mutante funcione como mutante dominante negativo en la placenta.

Alternativamente, también se espera que mediante el uso de LV, no sólo pueda analizarse cada gen en detalle, sino que también pueda analizarse la relación del gen con otros miembros de la subfamilia de genes y con genes antes y después de la ruta de señalización. Por tanto, se espera que con estudios adicionales, el desarrollo del método de transferencia génica específico de placenta basado en LV pueda conducir a investigación aplicada tal como terapia génica y análisis de la función génica a nivel individual.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona métodos para introducir genes específicamente en toda la placenta no humana. Los métodos de transferencia génica de la presente invención plantean sólo una pequeña carga en madres y fetos no humanos, porque no introducen genes directamente en la placenta. Además, a diferencia del sistema de microinyección, los presentes métodos no requieren ni dispositivos caros ni técnicas de habilidad.

Además, los métodos de la presente invención pueden usarse para introducir diversos genes en la placenta no humana; esto no sólo complementa la función placentaria en animales mutantes, sino que también permite análisis funcionales de estos genes en la placenta. Por tanto, los métodos de la presente invención también son útiles para estudios que analizan las funciones génicas en embriogénesis.

Lista de secuencias

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para introducir un polinucleótido arbitrario específicamente en una células trofectodérmica no humana, que comprende las etapas de:

   (a)

   retirar la zona pelúcida de un blastocisto no humano; y

   (b)

   introducir un polinucleótido arbitrario en células trofectodérmicas del blastocisto obtenido en la etapa (a).

2. 2. Método para producir un blastocisto no humano que comprende una célula trofectodérmica en la que se ha introducido específicamente un polinucleótido arbitrario, que comprende las etapas de:

   (a)

   retirar la zona pelúcida de un blastocisto no humano; y

   (b)

   introducir un polinucleótido arbitrario en células trofectodérmicas del blastocisto obtenido en la etapa (a).

3. 3.

   Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el polinucleótido arbitrario es un polinucleótido que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal o un polinucleótido que regula la expresión de la proteína.

4. 4.

   Método según la reivindicación 3, en el que el polinucleótido que codifica para una proteína esencial para el desarrollo fetal es al menos un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: Dlx3, Fgfr2, Fra1, Fzd5, Gab1, Gcm1, Grb2 hipomorfo, Gja7, Hgf, Hsp84-1, ltgav, Junb, Lifr, ERK1, ERK2, ERK5, MEK1, MEKk3, p38α, p38β, Met, Pdgfra, Pdgfb, Pparg, Rxra, Rxrb, Sos1, Vhlh, Wnt2, Ets2, Mash2, Egfr, Hsf1, Bmp5, Bmp7, Dnmt1, ltga4, Lhx1, Mrj, Tcf, Lef, Cdx2, Eomes, Fgf4, Esrrb, Hand1, Mdfi, Esx1, Arnt, Tcfeb y Gjb2.

5. 5.

   Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el blastocisto se deriva de un animal no humano que tiene una anomalía en una proteína esencial para el desarrollo fetal o en la regulación de la expresión de la proteína.

6. 6.

   Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la zona pelúcida se retira mediante tratamiento ácido, tratamiento enzimático o tratamiento físico.

7. 7.

   Método según la reivindicación 6, en el que el tratamiento ácido es un tratamiento con disolución ácida de Tyrode.

8. 8.

   Método según la reivindicación 6, en el que el tratamiento enzimático es un tratamiento con pronasa.

9. 9.

   Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el polinucleótido se introduce infectando un blastocisto con un vector viral que porta un polinucleótido deseado.

10. 10.

    Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el polinucleótido se introduce usando un reactivo de transfección de ácido nucleico.