TWI650417B - 利用慢病毒轉染去透明帶早期胚胎的基因轉殖方法 - Google Patents

Abstract

一種利用慢病毒轉染去透明帶早期胚胎的基因轉殖方法，係以細胞製備之慢病毒用來基因轉染動物胚胎，選取一對公母動物，並取出卵丘卵子複合物與精子進行體外授精，以培養4至8細胞期階段之胚胎，並在體外進行去除胚胎透明帶，接著以帶有轉殖基因的慢病毒對胚胎進行感染，之後基因轉殖的胚胎持續培養成為囊胚，以提升慢病毒轉染去透明帶早期胚胎的基因轉殖的成功率。

Description

利用慢病毒轉染去透明帶早期胚胎的基因轉殖方法

本發明係有關一種基因轉殖技術，尤指一種利用慢病毒轉染去透明帶早期胚胎的基因轉殖方法。

目前可將外源基因轉殖至動物基因組，常被用以產生基因轉殖動物的方法，大致可分為原核基因顯微注射法(Pronuclear microinjection)、反轉錄病毒感染法(Retroviral vector infection method)、精子載體法、及胚幹細胞媒介法等四種，其中：

1.所述原核基因顯微注射法，其主要問題在於(1)需具備產製取得大量授精卵母細胞之有效技術；(2)顯微操作設備之價格昂貴；(3)操作者需長時間之訓練，具備嫻熟靈巧之顯微操作經驗；(4)外源基因注入胚的原核是以逢機方式嵌入基因組DNA，無法掌握其嵌插情形；(5)此外顯微操作緩慢耗時，需一顆顆旋轉調整至適當角度，顯露其原核以供基因正確注入。

2.所述反轉錄病毒感染法，其主要問題在於，應用反轉錄病毒作為載體進行基因轉殖，其成功率受病毒顆粒之感染力及外源基因之表現能力所影響。而病毒顆粒之感染力與病毒外披膜之嗜性有關。因此，藉由反轉錄病毒產生基因轉殖動物之實驗，雖已被進行多年，惟迄今為止始終停留於測試病毒感染早期胚胎之能力及轉殖基因表現情形。

3.所述精子載體法，其主要問題在於，精子是可作為外源DNA之載體，經由授精作用將外源基因帶入授精卵內，進而達成基因轉殖目的，但已知某些陰離子聚合物，肝素、糊精硫酸鹽、及等電點較低之蛋白質，均能有效結合精子表面，故對DNA與精子結合，有競爭性抑制作用，故基因轉殖效率有限。

4.所述胚幹細胞法，其主要問題在於，此基因轉殖模式，理論上亦能適用於家畜動物以產生基因轉殖，惟家畜之胚幹細胞未能被有效地建立。影響家畜胚幹細胞建立之因素複雜，包括：胚的日齡、動物種別、培養液成份組成、及飼養細胞種類等等，每一項條件因素均扮演著重要角色，且彼此間可能有交互作用之效果，以至於轉殖效率不高。

習知另有一種微滴群卵法，經測試後，去透明带的小鼠胚胎會互相沾黏，故此方式仍不理想。

習知另一種方式，係將體內受精的受精卵從母腹取出後，便直接去掉透明带，再體外培養到桑葚期胚胎，再慢病毒感染，惟此技術經測試後，有幾種缺點：

第一，考慮此技術將來要用到大型經濟動物，體內受精取受精卵是不可能的。

第二，此習用技術將尚未分裂的受精卵直接去掉透明带，而由於越早去掉透明带，將來發育成囊胚的成功機率越低。

第三，去掉透明带後，其在桑葚期才慢病毒感染，雖然胚胎會較完整，但無法產生基因轉殖成功的小鼠。

本發明之主要目的，在於解決上述的問題而提供一種利用慢病毒轉染去透明帶早期胚胎的基因轉殖方法，以提升基因轉殖的成功率。

為達前述之目的，本發明係包括以下步驟：

a.將慢病毒基因轉入動物細胞，以製造出慢病毒顆粒，將動物細胞釋放的慢病毒顆粒，加以收集並予以純化，此純化的慢病毒顆粒將接下來感染胚胎；

b.選取公母成對之實驗動物，其中母動物取其卵丘卵子複合物，且公動物取其精子；

c.前述卵丘卵子複合物與精子進行體外授精，並培養生長為4至8細胞期階段之胚胎；

d.將該4至8細胞期階段之胚胎，在體外去除胚胎透明帶；

e.以製備之慢病毒顆粒，對已去除胚胎透明帶之胚胎於培養液中進行感染；

f.將感染慢病毒之胚胎培養成囊胚。

其中之b步驟，在取完公動物之精子後，置於培養液內，並前後左右搖晃和旋轉數秒，接著在攝氏37度和二氧化碳含量5%之環境條件下，置於培養箱內2至3分鐘，再取出重複搖晃旋轉數秒，使其均勻擴散及前述培養液接觸完全，再放回該培養箱內45~60分鐘，使精子活能化。

其中之c步驟，所述卵丘卵子複合物與精子，是在攝氏37度和二氧化碳含量5%之環境條件下，置於培養箱內放置5至6小時，以進行前述體外授精。

其中之d步驟，是以泰洛氏液去除胚胎透明帶。

其中之d步驟，以50至100ul泰洛氏液滴液及40ul以上之胚胎培養液5滴液，加入至3.5公分培養皿並覆蓋上礦物油，並放入至培養箱30分鐘預培養。

其中之e步驟，在去除透明帶之4至8細胞期階段胚胎，選自1、2、5、10和20ul其中之一體積量之慢病毒添加於20ul之培養液中。

本發明之上述及其他目的與優點，不難從下述所選用實施例之詳細說明與附圖中，獲得深入了解。

當然，本發明在某些另件上，或另件之安排上容許有所不同，但所選用之實施例，則於本說明書中，予以詳細說明，並於附圖中展示其構造。

本發明提供一種利用慢病毒轉染去透明帶早期胚胎的基因轉殖方法，包括：a.將慢病毒基因轉入動物細胞，以製造出慢病毒顆粒，將動物細胞釋放的慢病毒顆粒，加以收集並予以純化，此純化的慢病毒顆粒將接下來感染胚胎；b.選取公母成對之實驗動物，其中母動物取其卵丘卵子複合物，且公動物取其精子；c.前述卵丘卵子複合物與精子進行體外授精，並培養生長為4至8細胞期階段之胚胎；d.將該4至8細胞期階段之胚胎，在體外去除胚胎透明帶；e.以製備之慢病毒顆粒，對已去除胚胎透明帶之胚胎於培養液中進行感染；以及f.將感染慢病毒之胚胎培養成囊胚。

所選用之較佳實施例，說明如下：

慢病毒顆粒製備及純化(Lentivirus production and purification)：

第一天使用6cm細胞培養皿繼代HEK-293T細胞，細胞密度占約30~40%，以3ml DMEM+10% FBS, 無抗生素，在攝氏37度和二氧化碳含量5%培養至第二天。待第二天細胞密度在70~90%之間轉染，分別將三質體pCMV-ΔR8.91：pMD.G：欲轉染質體，依照1.8μg：0.4μg：2.0μg比例，依序分別加入至200μl DMEM並混合均勻。再加入10μl X-tremeGENE HP DNA轉染試劑，輕彈離心管底部混合均勻，並在室溫下靜置20~30分鐘。

一次吸取起所有轉染混合物，並溫和均勻滴加至HEK-293T細胞培養液上，放回攝氏37度和二氧化碳含量5%細胞培養箱培養18小時。第三天替換3ml BSA medium, 成為DMEM + 10% FBS + 1.2% BSA (3ml BSA stock/50ml DMEM + 10%FBS；BSA stock 2g/10ml)。再培養24小時後，收集細胞培養後含病毒顆粒上清液至15ml離心管，並置於4度冰箱保存，此步驟重複收集4天。待第七天進行病毒的純化濃縮，收集之上清液置於冰上以超音波震盪1分鐘，使細胞破裂完全釋放病毒顆粒。接著以1,200rpm離心3分鐘，之後將上清液移至新的15ml離心管，使之去除破碎細胞等。加入chondroitin sulfate C(CSC 8μg/ml, Sigma ) 與魚精蛋白(protamine) ( 8μg/ml, Sigma )，並置於4度冰箱搖晃過夜，隔天以10,000g離心20分鐘，去除上清液，以100μl培養液回溶純化病毒顆粒，並移至1.5ml離心管保存於-80度。

以動物細胞測試純化的慢病毒的感染效率(Test the transduction efficiency of lentivirus to the cells)：

將欲感染之細胞提前準備，以1.5ml新鮮細胞培養液培養於3.5cm之培養皿中，且至感染當天細胞密度約為50-60%，接著加入慢病毒顆粒，而陽離子聚合物聚凝胺(polybrene)及魚精蛋白能提高病毒感染效率，其視實驗需求選擇添加。最適感染時間為48-72小時，之後以1xPBS清洗細胞並更換新培養液，觀察記錄細胞生長狀況及其螢光表現等。

超數排卵(Superovulation)：

選取健康狀況良好的尚未性成熟4至8週齡ICR母鼠，在下午約5-7點光週期下，保定小鼠並腹腔注射孕馬血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotropin) 5 IU/200μl；48-52小時後再腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin) 5 IU/200μl，14-17小時後犧牲小鼠取卵丘及卵子複合物(Cumulus-Oocyte Complexes, COCs)。

取精子細胞(Spermatozoa Collection)：

選取健康狀況良好3-6個月齡性成熟ICR公鼠(ICR鼠係由美國癌症研究所Institute of Cancer Research命名，取三個首寫字母組成，後來被世界各地引進，成為國際通用的封閉群小鼠)，頸椎脫臼犧牲，立即酒精噴濕腹部剪開下腹腔，夾提起脂肪墊便可找尋到性腺組織，找尋並夾起副睪尾末端，剝劃開繫膜剪掉與睪丸副脂肪墊連結、輸精管和副睪體，而後將副睪尾放置在拭鏡紙上，並使用眼科剪刀和鑷子移除殘留多餘血脂，放置在事先準備好35mm精子培養皿石蠟油內，將副睪尾貼近朝向100ul HTF(Human Tubal Fluid，人類輸卵管液)培養滴液，並使用針頭刺劃開並輕輕擠壓出精子團，再用針頭拉近培養滴液內，一個副睪尾約取5~10精子團。

精子活能化(Sperm capacitation)：

取完精子團至100ul HTF培養滴液內後，前後左右搖晃和旋轉約30秒，放置於攝氏37度和二氧化碳含量5%培養箱內2~3分鐘，再取出重複搖晃旋轉30秒，使其均勻擴散及HTF培養液接觸完全，再放回培養箱內45~60分鐘使之活能化。較佳實施例中，活能化時間為45分鐘後，取滴液邊緣4ul高游動力之精子，加至授精滴液之中使其擴散(精子最終濃度1~5x10 ⁶/ml)

取卵丘卵子複合物(Cumulus-Oocyte Complex Collection )：

將超數排卵的4至8週ICR母鼠，一次一隻頸椎脫臼犧牲操作取卵。用酒精噴濕腹部，避免皮毛飛揚沾黏，迅速從腹腔中間橫剪開皮層和肌肉層並上下掀開，把大小腸往斜上方挪移開，在腎臟下方能找著卵巢、輸卵管和子宮，夾住靠近輸卵管的子宮末端，提起繃緊並把係膜向下劃除，在貼著鑷子後方剪掉子宮，繃緊後謹慎在輸卵管和卵巢交界剪除卵巢，將輸卵管放置在試鏡紙上，另一邊操作亦同。使用解剖顯微鏡在試鏡紙上，把殘存多餘的卵巢、子宮和脂肪剪除剩留輸卵管，小心避免傷及弄破膨大部，並將血脂和組織液吸除，迅速操作完後放置在35mm卵子培養皿石蠟油內。將處理完的輸卵管其膨大部靠近朝向滴液，一手用鑷子固定輸卵管，另一手使用27G針頭斜口朝上，從膨大部中央輕柔快速劃開，其卵丘卵子複合物(COCs)會釋放出來，在使用針頭輕輕拉帶進100μlHTF滴液內。於較佳實施例中，是選取4週齡ICR母鼠，於動物舍光週期下午5點，腹腔注射孕馬血清促性腺激素 5IU/200μl作用48小時；之後接著注射人絨毛膜促性腺激素 5IU/200μl作用14小時，於隔天早上7點犧牲小鼠取卵。或者，稍微提高孕馬血清促性腺激素量至250ul (6.25IU)及延長作用時間，促使卵泡發育成熟完全。

體外授精(In Vitro Fertilization)：

取出活能化後的精子培養皿，避免搖晃。在顯微鏡下，使用吸管(P2 pipette)沿著滴液邊緣，緩慢移動吸取活力旺盛之精子3~4μl，加至含有卵丘卵子複合物之培養皿滴液內中央，避免直接對著卵丘卵子複合物注入，防止瞬間附著過多精子可能造成多精入卵，致使細胞質破裂破碎。加完後輕微搖晃，放入攝氏37度和二氧化碳含量5%培養箱內5 ~6小時授精。授精結束後，使用口吸管(mouth pipette)將授精卵依序移至5個40μl HTF滴液洗胚，將多餘不必要的卵丘、精子、和已破碎及萎縮之卵子移除，並可預先統計紀錄完整卵子數量，觀察有無第二極體和雌雄原核出現，藉以判斷卵子授精是否成功，並可預估此次授精率高低，先統計區分開。洗胚紀錄完後，將胚胎過夜培養，隔天早上，再將2細胞期階段胚胎挑出，再經3~5次40μl 培養液(KSOM)洗胚後培養、觀察並紀錄。

以泰洛氏液去除胚胎透明帶(Remove zona of embryos by Tyrode’s solu.tion)：

首先以50-100ul泰洛氏液(Tyrode’s solution)1滴液及40ul胚胎培養液5滴液以上，加入至3.5cm培養皿並覆蓋上礦物油(Liquid paraffin)，並放入至培養箱30分鐘預培養。準備數支巴氏德玻璃管 (Pasteur pipette)，以噴燈燒軟前端玻璃管並離開火焰快速往兩端拉開，用切割石輕劃一下再以兩手指輕折斷，並在顯微鏡下確認其末端切口是否平整避免傷及胚胎，再以弱火輕烤玻璃管末端使其內凹圓鈍，製備數支備用並靜置使其冷卻。之後裝上口吸管吸取欲處理之各階段胚胎，緩緩輕吐於泰洛氏液中，並保持視線搖晃培養皿10秒左右，見其胚胎外透明帶開始消失變薄，立即以口吸管吸取起移至胚胎培養液內，溫和清洗數次並檢查其溶除不完全之胚胎，再以口吸管溫和反覆吸吐於泰洛氏液慢慢溶除並再次清洗。而清洗完畢之卵其放置於培養滴液中，其胚胎間彼此需保持一適當距離放置培養，避免其相互黏合。

慢病毒感染胚胎(Lentivirus infection to the embryos)：

以泰洛氏液處理胚胎以去除其外之透明帶後，使其內部之卵直接暴露在培養液之中，並以慢病毒1x10 ⁶IU/ml (帶有外源基因)直接感染4至8細胞期階段的胚胎，且調整慢病毒及培養液滴液之比例，再放入攝氏37度和二氧化碳含量5%培養箱培養過夜，之後再換新的培養液(KSOM-AA)，體外培養直到發育成囊胚 (blastocyst)。於較佳實施例中，在去除透明帶之4至8細胞期階段胚胎，分別添加入1、2、5、10、20ul不同體積量之慢病毒於20ul培養液(KOSM)中。其中，是在20ul培養液滴液添加5ul慢病毒為最佳。

母小鼠假懷孕(Pseudopregnancy)：

選取健康良好8~16週齡，25~30g體重，陰部濕潤紅腫之ICR母鼠。在下午3~5點放入1代孕母鼠與1結紮公鼠同籠。隔天上午觀察母鼠陰部是否有陰道栓(plug)並記錄日期狀況，在陰道栓出現那天起算0.5天。在囊胚子宮移植，3.5-dpc囊胚可以被移植到2.5-dpc(or 3.5-dpc)假懷孕小鼠的子宮角。對於子宮移植2.5-dpc假懷孕母小鼠比3.5-dpc更佳理想，因操作胚胎有更充足的時間去趕上其發育。

胚胎移植(Embryos transfer)：

假懷孕代孕的母小鼠秤重及麻醉。放置小鼠在9cm培養皿上蓋，以便其可以在顯微鏡平台上容易地移動操作。使用電動理髮器移除小鼠背部局部皮毛，在脊椎凸起處下方及腹部中上方剃除長寬約2cm皮毛。再使用酒精及優碘擦拭，消毒殺菌及清除剃掉的皮毛，之後再使用酒精擦除優碘。在最後一根肋骨下方及脊椎上方，使用精細解剖剪刀，在皮層剪開一小於1cm的縱向切口。使用鑷子將皮層往左(或往右)撥滑開，直至切口超過卵巢(橘紅色)或者脂肪墊(乳白色)，其兩者皆能透過體壁肌肉層找著。然後使用該鑷子夾起肌肉層，並用另一手剪開一個略大於卵巢的小切口，注意避開大血管，可使用剪刀拉伸切口停止出血。此時先用無菌紗布將切口覆蓋並靜置小鼠，然後迅速裝載胚胎至移液器(transfer pipette)。先吸取一小段培養液(M2)，再重複吸取小量培養液(M2)和小氣泡，直至毛細作用減弱，使能良好的控制。再吸一小段培養液(M2)和小氣泡，然後在最小體積培養液(M2)下吸取囊胚(約5-7mm)，再吸取一小氣泡。裝載待移植胚胎完後，回到麻醉的手術小鼠，將移液器安全靜置一旁或手持，務必確保移液玻璃管尖端不要碰到任何東西。使用平端的鑷子夾拉起卵巢的脂肪墊，輕拉出連附在旁的卵巢、輸卵管、和前一部份子宮。使用血管夾(serrefine clamp)夾住脂肪墊，並將它放置在脊椎另一側的無菌紗布上，藉由重力及摩擦力使卵巢、輸卵管和子宮仍保持在外。藉由移動培養皿上蓋，置子宮在左、卵巢在右呈水平方向，便於慣用手操作，並使子宮置於解剖顯微鏡視野正中央，並調整適當視野遠近和對準子宮焦距。使用平端鑷子輕柔的固定子宮前段，並使用26-30g針頭斜面朝上，避開子宮壁上微血管，在子宮輸卵管交界處穿刺一個小洞。操作時子宮和針頭不要過多移動避免造成割劃傷，並注視著穿刺的角度和深度並保持與子宮角平行。確保針頭有進入子宮腔內和並沒有卡在子宮壁。輕輕拉出針頭，假如滑出容易代表針頭有穿透子宮腔。保持注視著穿刺出的洞，移出針頭並插入預先準備含著囊胚的移液器約5mm，緩緩吹出所有囊胚至子宮腔內，直到氣泡、一小段培養液(M2)及氣泡也埋沒入子宮腔。吹動時注視著氣泡在移液器移動，當該氣泡到達子宮穿刺的洞口內移除移液器。注意避免吹入太多的培養液(M2)和氣泡進入子宮內，其可能干擾著床。假如沒有流動不要用力吹，在顯微鏡下檢查是否有堵塞，並排出胚胎重新裝載或換新移液器。拿下血管夾，用平端鑷子夾起脂肪墊，並將子宮、輸卵管和卵巢確實推回體腔內，避免硬塞戳傷卵巢等，可使用無菌棉棒吸取多餘液體並將子宮下挪，將體壁切口露出用鑷子夾住，拉提開一個空間並用另一鑷子將其推回。小鼠另一側同上重複步驟操作。體壁肌肉層是否縫合可選擇。使用無菌棉棒及70%酒精將皮層切口再一次消毒殺菌整理乾淨，再用鑷子將皮層切口捏壓起並用皮釘釘合兩針。在最後，將手術小鼠趴臥放置在乾淨飼育盒內並在燈泡下保持溫暖，或者將飼育盒放置在加熱板或加熱墊上直到小鼠從麻醉恢復甦醒。

在實驗初期首建立良好且穩定的體外授精技術，在多方修正問題及試驗各條件下，本實驗室提升ICR小鼠體外授精之穩定良好授精率至80.10%，囊胚率為77.78%(如表1所示)。且如第1圖所示，胚胎發育具飽滿對稱之型態及完整外觀。 表 1

而泰洛氏液是利用化學原理以酸性溶液融除胚胎外之透明帶，其操作需專注拿捏適當，處理時間短無法完全融除透明帶，致使慢病毒被隔絕無法感染成功，而處理時間過長其酸性溶液亦會造成胚胎傷害，損失胚胎或發育停滯造成囊胚率下降，其兩者皆是間接影響基因轉殖成功率之因素。而觀察結果得知，在早期胚胎去除其透明帶，其少了包覆凝聚之壓力，2細胞及部份4細胞期階段之卵裂球易形成平面結構，偏向外圍擴張發育，而不易往上堆疊形成球體，且可能造成卵裂球相互脫離崩解，致使阻礙胚胎發育降低囊胚率(如表2及第2圖所示)。 表 2

但在早期低細胞數階段之胚胎，其各卵裂球互相抵觸面積少，而對外暴露面積高，使得慢病毒能更完全感染至各個細胞內，增加感染效率及表現情形，進而降低形成鑲嵌體比例之形成。而在中晚期階段胚胎之8細胞、16細胞及桑椹胚，其胚胎之卵裂球已大致凝聚而形成球體，盡管去除其外透明帶，其大多能順利發育至囊胚。但其卵裂球已分裂成多數且彼此相對依靠，而此可能會造成慢病毒感染不全至每個細胞，致使感染效率降低表現下降。而從試驗結果得知，在早中晚期移除透明帶以慢病毒感染，其互有利弊各有優缺。而4~8細胞期階段胚胎，其感染效率及囊胚率皆有良好表現，因此我們後續皆選擇此操作(如第3圖所示)。

移除透明帶之胚胎以培養液(KSOM)緩慢輕柔將泰洛氏液清洗乾淨，避免傷及卵裂球和使其分離，注意將其一一均勻分開放置於滴液中培養，其裸露的卵距離太過靠近會彼此相黏而聚合一起，致使部分發育不良，部份形成相連或融合之囊胚，造成胚胎移殖困與與死胎等後續問題(如第2圖之D部分所示)。而在去除透明帶之4至8細胞期階段胚胎，分別添加入1、2、5、10、20ul不同體積量之慢病毒於20ul KOSM培養液中。從結果發現，所有胚胎皆有成功地被感染且表現RFP螢光基因，以及添加入高比例之慢病毒於無透明帶之胚胎，並未對囊胚發育造成影響，唯怕慢病毒感染過甚，插入過多之外源基因至基因組內，可能干擾本身基因之表現靜默等。而添加1ul和2ul低比例之慢病毒，其RFP螢光表現相對較弱，且內細胞團之螢光表現相較不明顯。而在20ul培養液滴液添加5ul慢病毒，其螢光表現及胚胎型態是最為適合之條件(如第4圖所示)。

以慢病毒感染去除透明帶4至8細胞期階段胚胎，其成功地表達eGFP並順利發育至囊胚，在將其囊陪移殖至代理孕母子宮內，其經正常妊娠順利產下具有eGFP表達之仔鼠(F0, Founder)，而待其性成熟與野生型ICR小鼠交配，其產下之F1仔鼠也具有eGFP表達，證明其具有生殖系傳遞(Germline transmission)之能力。

我們以酸性溶液之泰洛氏液利用化學方式溶除胚胎外透明帶(Zona pellucida)，其在不孕症之輔助生殖技術上，也能用以幫助透明帶過厚硬之囊胚孵化，增加胚胎著床及受孕機率。因此，此基因轉殖方法也是能有助於提升胚胎移殖之仔鼠獲得。

在試驗中發現，在中晚期之胚胎感染並發育至囊胚期，其大部分皆在囊胚外圍之滋養層(Trophoblast)明顯表現外源螢光基因，而在囊胚之內細胞團(Inner cell mass)則是相對較微弱表現，因此，我們試以慢病毒感染去除透明帶之桑椹期(Morula)胚胎，去研究探討對於之後形成囊胚之滋養層及內細胞團表現及之後發育關係。而其無置可否地發育至囊胚且表達eGFP，將其移殖於代理孕母子宮內，在正常妊娠12天與之犧牲剖腹取出子宮、胎盤、及胎兒，並將在暗房以特殊藍光波長照射下，結果如我們預期，其由滋養層發育成的胎盤呈現高eGFP螢光表達，而由內細胞團發育而成之胎兒表現肉眼無法觀測，只能在倒立螢光顯微鏡發現也具有些微eGFP表達，而子宮則全無表達。此結果表示，越晚期胚胎卵裂球分裂數越多，其彼此抵觸聚合形成球體，慢病毒能接觸到之相對於總面積越小，細胞團以大致形成內外之分，致使慢病毒大多感染至細胞團外圍無法深入到內部，外多內少情形之下內細胞團感染不全，致使容易形成嵌合體。其卵裂球外圍形成囊胚滋養層進而再形成的胎盤，致使慢病毒感染eGFP外源螢光基因表現都集中在胎盤上。

慢病毒感染之胚胎移殖入代理孕母子宮內，並不會造成母體間接感染。而以添加慢病毒至培養滴液方式，能一次性感染全部所有無透明帶之胚胎，其大量減少胚胎在外操作時間的影響，且能100%的表達感染之外源基因，而原核顯微注射技術，其需一顆顆操作胚胎，將外源之DNA將其打入原核之中，耗費時間且胚胎成功表達率亦不高。而於之相比，此提供一個簡易操作且高效率表達之方法，以及其低門檻條件，不需昂貴顯微注射設備，只需具備慢病毒顆粒製備、胚胎培養操作及相關動物生殖技術等等，加上有正確材料及方法之反覆練習，各相關動物實驗室其皆能達成產製基因轉殖小鼠。

如第5圖所示，圖片直向 (A, D, G)、(B, E, H)、(C, F, I) 分別為基因轉殖小鼠與野生型小鼠交配及其子代。係在無照明之動物舍內以螢光拍攝，且以暗箱及藍波長照射和黃色玻璃紙作為濾鏡以單眼相機拍攝之。由此可知，本發明之基因轉殖小鼠經和野生型小鼠交配後，其子代也具本發明之基因轉殖小鼠遺傳之基因，且代代相傳。

以上所述實施例之揭示係用以說明本發明，並非用以限制本發明，故舉凡數值之變更或等效元件之置換仍應隸屬本發明之範疇。

由以上詳細說明，可使熟知本項技藝者明瞭本發明的確可達成前述目的，實已符合專利法之規定，爰提出專利申請。

無

第1圖係本發明之實施例之體外授精胚胎發育之各階段型態。分別為(A)未授精卵母細胞。(B)授精後之卵母細胞(合子)。(C)二細胞期階段胚胎。(D)四細胞期階段胚胎。(E)八細胞期階段胚胎。(F)桑椹期胚胎。(G)囊胚期胚胎。(H)孵化中囊胚期胚胎。 第2圖係本發明之實施例以泰洛氏液處理去除透明帶之各階段胚胎型態。(A)體外授精之正常2細胞胚胎。(B)去除透明帶之2細胞胚胎。(C)去除透明帶之4-8細胞胚胎。(D)去除透明帶之桑椹胚(Morula)。 第3圖係本發明之實施例之各階段胚胎去除透明帶以慢病毒感染之型態及螢光表現。(A)4細胞期階段胚胎去除透明帶以慢病毒感染。(B)8細胞期階段胚胎去除透明帶以慢病毒感染。(C)桑椹期胚胎去除透明帶以慢病毒感染。(D)無去除透明帶之4細胞期階段胚胎以慢病毒感染至囊胚期。 第4圖係本發明之實施例之4至8細胞期階段胚胎去除透明帶以不同添加量比例慢病毒之感染效果。 第5圖所係本發明之基因轉殖小鼠與野生型小鼠交配及其子代。

Claims (6)

1. 一種利用慢病毒轉染去透明帶早期胚胎的基因轉殖方法，包括以下步驟：a.將慢病毒基因轉入動物細胞，以製造出慢病毒顆粒，將動物細胞釋放的慢病毒顆粒，加以收集並予以純化，此純化的慢病毒顆粒將接下來感染胚胎；b.選取公母成對之ICR小鼠，其中母小鼠取其卵丘卵子複合物，且公小鼠取其精子；c.前述卵丘卵子複合物與精子進行體外授精，並培養生長為4至8細胞期階段之胚胎；d.將該4至8細胞期階段之胚胎，在體外去除胚胎透明帶；e.以製備之慢病毒顆粒，對已去除胚胎透明帶之胚胎於培養液中進行感染；f.將感染慢病毒之胚胎培養成囊胚。
2. 依請求項1所述之利用慢病毒轉染去透明帶早期胚胎的基因轉殖方法，其中之b步驟，在取完公小鼠之精子後，置於培養液內，並前後左右搖晃和旋轉數秒，接著在攝氏37度和二氧化碳含量5%之環境條件下，置於培養箱內2至3分鐘，再取出重複搖晃旋轉數秒，使其均勻擴散及前述培養液接觸完全，再放回該培養箱內45~60分鐘，使精子活能化。
3. 依請求項2所述之利用慢病毒轉染去透明帶早期胚胎的基因轉殖方法，其中之c步驟，所述卵丘卵子複合物與精子，是 在攝氏37度和二氧化碳含量5%之環境條件下，置於培養箱內放置5至6小時，以進行前述體外授精。
4. 依請求項1所述之利用慢病毒轉染去透明帶早期胚胎的基因轉殖方法，其中之d步驟，是以泰洛氏液去除胚胎透明帶。
5. 依請求項4所述之利用慢病毒轉染去透明帶早期胚胎的基因轉殖方法，其中之d步驟，以50至100ul泰洛氏液滴液及40ul以上之胚胎培養液5滴液，加入至3.5公分培養皿並覆蓋上礦物油，並放入至培養箱30分鐘預培養。
6. 依請求項5所述之利用慢病毒轉染去透明帶早期胚胎的基因轉殖方法，其中之e步驟，在去除透明帶之4至8細胞期階段胚胎，選自1、2、5、10和20ul其中之一體積量之慢病毒添加於20ul之培養液中。