TWI332030B - - Google Patents

Description

1332030 玫、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明相關於一種具有發展成哺乳動物的核轉置胚之 培育方法、培育哺乳動物胎兒的方法、培育哺乳動物的方 法以及培育哺乳動物重組細胞的方法β 【先前技術】 利用體細胞核轉置技術進行各種複製動物之產製雖已 被成功建立，惟其產製效率迄今仍低，且常發生複製胚胎 早期死亡、高流產率、新生複製仔畜出生前後高死亡率、 或器官發育不全以及巨嬰症等現象（Campbell等人，1996; wiimut 等人，1997; Schnieke 等人，1997;等人， 1999 ; Wells等人，丨999)。此等不正常現象係可能因複製 胚於發月過程中無法將置入之供核細胞充分再程序所造成 (Kang 等人，2001 ; Xue 等人，2〇〇2)。 哺乳動物基因之再程序化現象一般咸認與基因銘印作 用（gene imprinting)有密切關係。體基因組中之基因表現模 式為，’且織專性表現（tissue-specific expression)和特定發 月期別專一性表現（devel〇pmental stage_specific expression)者通常屬於銘印基因（Bad〇w，ι995) 〇 哺孔動物為能將基因銘印現象忠實傳遞至後代，染色 體中原已甲基化之銘印基因將在配子生成過程 (gametogenesis)中發育至始基生殖細胞（prim〇r(jial germ cells ’ PGC)階段時，其甲基化現象將大部分被去除 1332030 (erasure)(Monk 等人，1987;Labosky 等人，1994)，待配子 發育至成熟階段時’雌雄配子中所應被銘印之基因將再行 確立（reestablishment)其正確之甲基化模式；因此，成熟之 印母細胞與精子，其染色體均已相對被高度甲基化，惟卵 母細胞中被甲基化之基因僅屬雌源性之銘印基因，而精子 者則僅有雄源性銘印基因被甲基化；意即所有成熟印母細 胞之雌源性銘印基因均被曱基化；所有成熟精子之雄源性 銘印基因均被甲基化（Falls等人，1999 ; Davis等人，2〇〇〇) 。當精卵受精後，其基因組DNA又將經歷一次全面性的 去甲基化作用（genome-wide demethylartion)，並持續至囊 胚期（Monk 等人，1987 ; Howlett 和 Reik，1991 ; Kafri 等人 ，1992);其後將再次重新建立其曱基化作用（“如μ methylation)，並隨胚胎發育之進展逐漸完成其基因銘印模 式（Howell等人，1998 ; Hsieh，2000)，而維持迄成年。 自從Wihmu等人（1997)成功產製世界第一頭體細胞複 製羊後’即興起體細胞複製科技之熱潮，惟迄今複製動物 之產製效率仍低，而造成此等低效率之原因，現正逐漸被 證明與供核細胞無法如正常胚者具有健全之 作用有關；且此種不正常之現象更遍及早期之複= (Kang等人，2〇〇1)和出生之複製仔畜中（Xue等人，2〇〇2)。 然基因之再程序化作用實與基因之甲基化作用息息相關。 因此，如何能在產製核轉置胚過程即調整其如正常胚者般 具有較低之曱基化程度’進而促使其具有較健全之基因再 程序化作用，將是提高現今低複製動物產製效率之重要策 1332030 略。 【發明内容】 本發明在產製核轉置牛胚過程十，先進行細胞融合及 激活處理生產I 4倍體之核轉置胚後’再進行去核操作， 以修正其染色體套數為正常< 2倍體’並發現受核卵母細 胞核之短暫存在有助於供核細胞之去曱基化作用。 哺乳動物在發育過程中，將引發兩次體基因組之全面 性去曱基化作用，其第一次乃發生於配子生成過程中之始 基生殖細胞階段，其目的乃為使基因銘印現象忠實傳遞至 後代；第二次則發生在雌雄配子受精後，以促使受精印恢 復其發育全能性（Monk等人，1987 ; Labosky等人，1994)。 引發受精卵體基因組全面性去甲基化現象之原因，在早期 被認為係導因於胚分裂後無維持曱基化作用之因子存在， 遂伴隨胚細胞之分裂，其染色體進行複製次數之增加而逐 漸降低其甲基化程度（Howlett和Reik，1991);惟最近之研 九則顯示，DNA去甲基酶（demethylase)亦是造成此現象之 另一關鍵因子，並發現其主要功能乃在啟動去曱基化作用 之發生（Cervoni等人，1999)。新近之研究，更發現受精卵 内雕雄原核基因去甲基化作用之發生時機並不一致，其中 雄原核之體組基因於受精數小時後即快速被去曱基化，而 此時之雌原核則仍維持其高度曱基化之現象，並隨細胞分 裂之進展而逐漸下降；此結果說明，雄原核之去甲基化作 用係經由存在於卵母細胞内之去甲基化因子的主動作用所 1332030 引發’而雌原核者，則隨細胞分裂之DNA複製作用而以 被動方式逐漸完成其去曱基化作用（Haaf，2001)。 在本發明之一較佳具體事實中，本發明提供一種具有 發展成哺乳動物的核轉置胚之培育方法，包括： (a) 提供哺乳動物之卵母細胞； (b) 提供哺乳動物之供核細胞； (c) 將供核細胞或其細胞核置入卵母細胞中；

(句將供核細胞與卵母細胞進行融合而產生四倍體核 置胚； X (e) 將核轉置胚進行激活處理； (f) 去除卵母細胞核，·和 (g) 培養去除卵母細胞核之核轉置胚。 較佳地，本發明所述之谇官 玄培月方法中’該哺乳動物為家 方法中，該家畜為牛。 方法中，該（a)步驟之卵母 —極體者》 方法中，該（b)步驟之供核

較佳地，本發明所述之培肓 較佳地，本發明所述之培育 細胞係經由體外培養後選取具第 較佳地，本發明所述之培育 細胞為體細胞。 較佳地， 本發明所述之培育 源基因。 方法中 該體細胞含有外 該（b)步驟之供核 該（b)步騾之供核 較佳地，本發明所述之培育方法中 細胞進一步進行飢餓培養。 較佳地，本發明所述之择女 。玲方法中 8 1332030 細胞不進行飢餓培養。 較佳地，本發明所述之培育方法中， 細胞係置入卵母細胞之卵黃膜間隙。 ；（c)步驟之供核 較佳地，本發明所述之培育方法令，、 細胞係直接注入即母細胞之細胞質内。，於（c)步驟之供核 較佳地，本發明所述之培育方法 細胞係未經去核者。 彳’該（句步驟之卵母 較佳地，本發明所述之培育方法 電融合方式。 r，該（d)步驟係利用 該（e)步騾激活處 子載體（calcium 較佳地，本發明所述之培育方法中， 理係將融合的細胞培養於含有鈣離 ionophore)和6_DMAP之激活液中。 中，本發明 另-方面，在本發明之另一較佳具體事實 如供一種培育哺乳動物胎兒的方法，包括： U)提供哺乳動物之卵母細胞； (b)提供哺乳動物之供核細胞； ⑷將供核細胞或其細胞核置人卵母細胞中； ⑷將供核細胞與㈣細胞進行融合而產生四倍體核轉 置胚； (e) 將核轉置胚進行激活處理； (f) 去除卵母細胞核； U)培養去除卵母細胞核之核轉置胚；和 (h)將核轉置胚移置入母的受胚哺乳動物生殖道中而形 成胎兒。 1332030 較佳地，本發明所述之方 較佳地，本發明所述 ^ ’該哺乳動物為家畜》 較佳地，本發明所述之:：中:㈣畜為牛。 係經由體外培養後選取且 、 °亥（a)步驟之卵母細胞 ' % 弟—極體者。 較佳地，本發明所述之方法 ^ 為體細胞》 ' ’该（b)步驟之供核細胞 較佳地，本發明所述 /中，該體細胞含有外源基 因。 該（b)步驟之供核細胞 該（b)步驟之供核細胞 於（c)步驟之供核細胞 於（C)步驟之供核細胞 §玄（d)步驟之卵母細胞 該U)步驟係利用電融 該（e)步驟激活處理係 較佳地，本發明所述之方法中 進一步進行叙餓培養。 較佳地，本發明所述之方法中 不進行飢餓培養。 較佳地，本發明所述之方法中 係置入印母細胞之卵黃膜間ρ宇 較佳地，本發明所述之方法中 係直接注入卵母細胞之細胞質内。 較佳地，本發明所述之方法中 係未經去核者。 較佳地，本發明所述之方法中 合方式。 較佳地’本發明所述之方法 將融合的細胞培養於含有鈣離 ：(e)步驟激活處理令 中。 载體和6-dmAP之激活洋 另一方面’在本發明之另— 較佳具體事實中，本發印 1332030 知:供一種培育哺乳動物的方法，包括·· U)提供哺乳動物之卵母細胞； (b)提供哺乳動物之供核細胞； (C)將供核細胞或其細胞核置入卵母細胞中； (d)將供核細胞與卵母細胞進行融合而產生四倍體核 置胚； X # (e)將核轉置胚進行激活處理； ⑴去除彡卩母細胞核；

(g) 培養去除卵母細胞核之核轉置胚；和 (h) 將核轉置胚移置入母的受胚哺乳動物生殖道中而 :胎兒’並經過所有胳兒成長及分化期間而生育出喷乳 該哺乳動物為家畜。 該家畜為牛。 該（a)步驟之卵母細胞 〇 该（b)步驟之供核細胞

該體細胞含有外源基 較佳地，本發明所述之方法中， 較佳地，本發明所述之方法中， 較佳地，本發明所述之方法中， 係經由體外培養後選取具第_極體者 較佳地，本發明所述之方法中， 為體細胞。 較佳地，本發明所述之方法中 因0 較佳地，本發明所述之方法士 進一步進行飢餓培養。 忒（b)步驟之供核細胞 較佳地，本發明所述之方法中> 不進行飢餓培養。 忒（b)步驟之供核細胞 11 1332030 ，於（c)步驟之供核細胞 於（c)步驟之供核細胞 该（d)步驟之即母細胞 該（d)步驟係利用電融 該（e)步驟激活處理係 較佳地，本發明所述之方法中 係置入卵母細胞之卵黃膜間隙。 較佳地，本發明所述之方法中 係直接注入卵母細胞之細胞質内。 較佳地，本發明所述之方法中 係未經去核者。 較佳地，本發明所述之方法中 合方式。 較佳地，本發明所述之方 ^ w少鄉教活處理係 將融合的細胞培養於含有鈣齙 有巧離子载體和6-DMAp之激活液 〒。 本發明 包括： 另一方面，在本發明> H ^ , /3艾另一較佳具體事實中 ^供一種培育不含人之哺·？丨叙4k去·/ 用孔勤物重組細胞之方法 (a) 提供哺乳動物之卵母細胞； (b) 提供哺乳動物之供核細胞； (c) 將供核細胞或其細胎妨罢、〆 肥核置入卵母細胞中； (d) 將供核細胞與卵母λ脍 υ、、«胞進行融合； (e) 將融合細胞進行激活處理；和 (0去除卵母細胞核。 較佳地，本發明所述之大 , 之方法中，該哺乳動物為家畜。 杈佳地，本發明所述之方 々古宁，該家畜為牛。 較佳地，本發明所述之古 /中’該（a)步驟之卵母细胞 係！由體外培養後選取具第—極體者。 、' 較佳地，本發明所述之古 方法中，該（b)步驟之供核細胞 12 1332030 為體細胞。 較佳地，本發明所述之方沐 去中，該體細胞含有外源基 較佳地，本發明所述之方法中 進一步進行叙餓培養。 較佳地，本發明所述之方法中 不進行飢餓培養。 1 亥（b)步驟之供核細胞 該（b)步驟之供核細胞 較佳地，本發明所述之方法中 係置入卵母細胞之卵黃膜間隙。 較佳地’本發明所述之方法中 係直接注入卵母細胞之細胞質内。 較佳地，本發明所述之方法中 係未經去核者。 於（c)步驟之供核細胞 於（c)步驟之供核細胞 該（d)步驟之卵母細胞

較佳地，本發明所述之方法中 合方式。 該（d)步驟係利用電融 較佳地，本發明所述之方法 將融合的細胞培養於含有辦離子 中。 中’该（e)步驟激活處理係 載體和6-DMAP之激活液

另一方面，在本發明之另 提供一種哺乳動物重組細胞， 得。 較佳具體事實中，本發明 其係如上所述之方法培育而 。目前世界上常用之複製胚產製方法，皆利用先進行4 /操作再依序進行體細胞核注入 '細胞融合及激活處理 之先去核再激活（enucleation bef〇re activati〇n，ΕΒΑ)的傳統 13 1332030 核轉置流程；而本發明則將傳統之核轉置流程修正為先進 . 行體細胞核注入操作，再依序進行細胞融合、激活處理及 . 去核操作之先激活再去核（enucleati〇I1 after activation EAA)的核轉置流程。並且由實施例之結果顯示，利用 EAA方式所產製核轉置胚於體外發育至各胚期之百分比均 與正常到用EBA方式所產製者相近，此結果說明利用 EAA方式產製核轉置胚至少不傷及其於體外之發育能力。 另外利用EBA核轉置操作流程所產製之2〇個核轉置 囊胚，於移置入11頭受胚牛後，有2頭懷孕，統計時之 _ 懷孕天數已分別為8.5及7.5月齡；而利用EAA核轉置操 作流程所產製之2個核轉置囊胚，於移置入丨頭受胚牛後 ，統計時亦已證實懷孕，且懷孕天數目前為7月齡。當進 一步比較兩種核轉置囊胚，其微衛星〗e〗）dna特 疋片段之曱基化程度時則顯示，利用EAA流程所產製核轉 置囊胚之甲基化百分比明顯低於利用EB A流程所生產之核 轉置囊者（44.42% vs. 64.66%)(p< 〇.〇〇〇。综合以上所述結 果說明，㈣細胞核短暫存在於核轉置胚内m誘# · 去曱基化因子之作用，並進而促使供核細胞體基因組之去 甲基化作用，而達成降低甲基化之效果，故利用eaa所產 裝之核轉置囊胚’具有明顯降低核轉置胚曱基化程度之能 力。 另外鑒於4倍體核轉置胚無法產製複製動物之事實， 為能突破此一瓶頸，於本發明將先利用未去核之卵母細胞 為受核源進行細胞融合以產製含4倍體之核轉置胚，使供 14 1JJ2030 核細胞能短暫與卵母細胞核並存於胚内’並在完成激活處~ 理後再進行去核操作，以修正其染色體套數為正常之2倍 體。 综上所述，利用EAA方式所生產核轉置胚之體外發育 能力與利用EBA方式所生產者相近，惟利用EAA方式所 生產之核轉置囊胚具較低之基因曱基化程度，且胚移置後 已獲致懷孕之事實，故為一產製複製動物時之一個更佳的 方法，另外本發明所使用之供核細胞可為導入有外源基因 的細胞，其所導入之外源基因可以是經過轉錄以及轉譯出 攀 凝血因子或其他具有功能性之蛋白質的基因，藉由導入外 源基因而增進所複製出動物的附加價值，亦可將導入的外 源基因適當調控其專一性表現於分泌的乳汁中，增加複製 動物的乳汁利用性。 本發明所新創之核轉置方法除可應用於複製動物之產 製外’亦可為我國動物基因轉殖研發建立更為完善之技術 平台’且有助於經由基因轉殖動物所生產之基因產物商品 更具國際市場競爭力。 _ 本發明中所使用之名詞『核轉置胚』意指將供核細胞 轉置入印母細胞後所得物。 本發明中所使用之名詞『飢餓培養』意指將細胞培養 於僅含有極低含量胎牛血清之培養液中培養。 【實施方式】 本發明中所引述之文獻均以參考資料的方式併入本案 15 及優點將可明 顯見於下列較佳具體 本發明其他的特徵 事實及申請專利範圍。 實例 下列實施例用於 何方式意欲限制本發 明的材料及方法。 不範說明本發明。這些實施例不以任 明之範圍，但用於指示如何實施本發 取得與處理

1· 1 ·材料 —本實施例所使用之印巢，係採自屠宰場所屠宰之淘汰 4蘭乳牛及台灣黃牛；其|宰時之生理背景不明。 1.2.步驟 牛隻於屠宰後，即儘速取出其卵巢，並以約30。(：左 右含 O.lmg/ml 青黴素 / 鏈黴素（Gibc〇, 1514〇122)之 〇 9 %

生理鹽水攜回實驗室。取回之卵巢先以上述生理鹽水洗淨 後，再喷灑70 %之酒精，並重複三次以達充分之淨菌。 其後再置於直徑10 cm之乾淨培養皿中，並以接有18號 針頭之1 ml注射筒，經由負壓逐一吸取卵巢表面直徑約2 〜8 mm各遽泡之内容物，包括卵丘-卵母細胞複合體 (oocyte-cumulus complex, COC)及其濾泡液。抽取獲得之 濾泡内容物，經置於低倍（20〜30 X)之立體解剖顯微鏡下， 以適當口徑之玻璃吸管（pasteur pipette) ’將懸浮於據泡液 内之COCs全數吸出，並選取卵丘細胞包被完整且印母細 胞品質較佳者，經回溫（37°C )之成熟培養液清洗3〜5次後 16 1332030 ，備供體外成熟培養之用。 _實施例2:卵母細胞之體外成熟接I 2.ι.體外成熟培養液之配製 供牛卵母細胞體外成熟培養之培養液，係以9. $ m 1之 基礎培養液 Medium-199(Gibco，12340-030)，添加 〇·5 mi 之月〇 牛血 /月（fetal bovine serum，FBS·; Giboco, 10270-106) 及1 μ丨含5 mg/ml健他黴素（gentamycin)之溶液（Sigma, G_ 1397)配製而成，並經濾菌分裝後冷藏備用。 2.2.體外成熟培養 依據李等人（1 997)之牛卵體外成熟培養步驟，於進行 培養前，事先於35 mm之培養皿中製作4滴均含1〇〇 μ1之 。養液滴，並覆蓋礦物油（mineral 〇n ; Sigma，， 再置於38.51含2% C〇2、98%空氣及飽和渴度條件之於 養箱中’進行至少4h之平衡。其後，再將實施例"斤^ 集具良好品f之荷蘭牛與台灣黃牛之COCs，以1G〜2〇個 不等之數量平均移人上述備妥之體外成熟培養液滴中，並 於相同培養環境下’進# 18]9 h體外錢培養。印母細 胞經體外成熟後’選取具第一極體者，除供作核轉置之受 t源使用外’並提供作為體外胚生產所需之卵源使用。 之產製 3.1·精子獲能液之配製 17 !332〇3〇 (1) BO基礎液 BO液之配製，係依據Brackett和Oliphant (1975)所 述，將 6.55 g NaCH、0.3 g KC1、0.115 g NaH2P04H20、 0.106 g MgCl2. 6H20 和 0.331 g CaCl2· 2H20 溶解於已滅 菌之去離子水中，並定量至100 ml，以配製成BO基礎液 ’該液經濾菌及分裝後冷凍（-20。〇備用。 (2) BO操作液 0.3104 g NaHC03 和 0.0138 g 丙酮酸鈉（Na-Pyruvate) ’先溶解於70 ml之BO基礎液後，再以已滅菌之去離子 水定量至100 ml，並調控酸驗值於pH=7.6〜7.8，而配製成 BO操作液。該液經濾菌及分裝後冷藏（4°c )備用。 (3) 精液洗滌液 將 0.3604 g 之茶驗（theophylline)(Sigma，T-1633)溶於 200 ml之BO液，配製成含1〇 mM茶鹼之精液洗滌液。 經濾菌後冷藏（4。(：）備用。 (4) 精子獲能液 將0·05 g之肝素（Sigma，H-3149)溶於1〇 ml已滅菌 之去離子水中’配製成含5 mg/ml肝素之基礎液。經濾菌 及分裝後冷凍（-20。〇備用。取前述之100 μΐ基礎液及0.5 g 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，Fraction V ; BSA)(Sigma，A-6793)溶於 50 ml BO 液，配製成含 ι〇 1332030 gg/ml肝素及10 mg/ml BSA之精子獲能液。其後，經濾菌 及分裝後冷凍（-2(TC)備用。 3.2·精子獲能作用之步驟 精子之獲作用，乃根據parrjsh等人（1986)戶斤述 之方法誘發之。將荷蘭種公牛之冷凍精液，自液態氮内移 出後，直接置於37它溫水30秒解凍。其後，取1 ml 之精液（兩管冷凍精液）與1〇 ml之精液洗滌液充分混合， 以800 G離心5 min，經移除上清液後，再重覆上述步驟 乙人精液經2次清洗後，將所留存之1 ml精液加入1 ml之精子獲能液（精液濃度約為lxl〇7/ml)。在充分混合 '卩吸取0.5 ml之精液，置於一直徑35 mm之培養皿 内，並上覆輕級礦物油，以製成精子懸浮小滴，其後再置 入J·亙恤培養相中平衡15 min，進行獲能作用，以供體外受 精之用。

3.3.體外受精之步驟 由實施例2所收集之牛卵母細胞經24 h之體外成 養後，先利㈣當σ徑之玻璃吸管，以機械式連續吸 式’力略移除其外圍包被之卵丘細月包，再將之置入已獲 精液滴内，並移入恆溫培養箱中進行體外受精 母細胞經8 h之體外受精後，利用微玻管吸取至成熟 液中’以機械式連續吸吐移除包被外圍之精子，並經 ~養液凊& 3次後’再將該印母細胞置回原已培育形> 19 1332030 層卵丘細胞之成熟培養液中 ，進行共培養（李等人 1997)

實施例4:供核細胞之制借 4.1.牛耳朵細胞之初代培養與冷凍保存 成年荷蘭母牛耳朵細胞株之建立方法，係參照 荨人U998)之方法進行，即先於擬採集之成年荷蘭母牛的 耳朵邊緣部位進行刹毛及洗淨工作，再以7〇%之酒精予以 消毒，其後，利用滅菌之耳刻剪自該部位剪取數片約〇·5χ 1 cm2之耳朵組織，並置入含〇 lmg/mi青徽素/鍵黴素之 0.9%生理鹽水攜回實驗室。攜回之耳朵組織，先利用 上述之生理鹽水洗滌3次後，再置入7〇%之酒精中靜置5 min進行更徹底之消毒，其後，以相同之生理鹽水洗滌3 次後，置於1.5 ml之離心管中，利用滅菌之剪刀將該組織 細剪成約3 mm3之小塊，再移至6 cm之培養皿中，以含

1〇 % FCS DMEM (Gibco, 1 1965-092)之細胞培養液於 pi 含5% C〇2及飽和濕度條件之培養箱中進行1〇〜14天之初 代培養（primary culture)。其後’移除上層培養液並旋即加 入3 ml含〇.25〇/0胰蛋白酶（trypsin)溶液使細胞團塊懸浮， 並立即加入6 ml之培養液以終止胰蛋白酶之作用，回收之 懸浮液經250 G之離心力於室溫下離心5 min，及去除上 清液後，先加入1 ml之細胞培養液打散懸浮，再將全數懸 浮液移入10 cm之培養皿中，並加入9 ml之培養液充分 混勻後’於3 7 °C含5 % C02、95 %空氣及飽和溼度條件 20 1332030 下進行培養。細胞於培養期間，每週均更換2〜3次新鮮培 養液’俟該細胞長滿後（約有2 X 107個細胞），重複上述之 細胞懸浮、離心方法和培養流程，進行第二次之細胞繼代 ，以擴增耳朵細胞族群。該細胞經2次繼代後，循前述方 法將每一培養皿中之細胞離心收集，並加入4 mi含1 〇 % DMSO (dimethylsulfoxide ; Sigma，D-5879)及 90 % 胎牛血 清之冷康保護液予以充分混勻，使細胞漢度調整為約5 X 1〇6 cells /ml。其後’將之分裝至冷凍小管中（lmi/管），並 依序置於-20 °C冰箱4 h、-8(TC冰箱16〜18 h，令其溫 度緩慢降溫後’旋即置入液態氮961 )内長期保存。若 此等細胞擬於解凍培養後即直接供為核轉置之供核細胞使 用時，則於細胞冷凍前將其細胞濃度調整為約5 X i〇5 cells /ml後’再分裝成小管（01 ^1/管）進行冷减保存。 4.2.供核細胞之叙餓培養 供核細胞之血清飢餓處理係修正自 Wilmut等人 (1997)之步驟。將前述凍存於液態氮之小管細胞取出，並 迅速以3 7 C水;谷回溫解;東後，旋即加入3 ml含1 〇 % FCS DMEM之培養液充分混勻；其後，先置入35 mm培養 皿中培養4 h，再更換新鮮培養液，俟該細胞長滿後，懸 浮其細胞並予以平均移入4孔之細胞培養皿中培養。待該 細胞增生至約8成滿時，將原細胞培養液，更換成含〇 5 % FCS DMEM之培養液，進行細胞之血清飢餓處理5〜8 天。核轉置前將細胞懸浮含〇·5 % FCS DMEM之培養液中 21 1332030 ，一部分靜置作為供核細胞使用；另一部分則計數以約 10 0 0個細胞為单位’分別置入〇. 5 m 1之離心管中。其後， 經離心及去除上清液後，分別加入2μΐ之mPBS溶液直接 置入液態氮中急速冷束’並立即置於_ 8 0 °C冰箱中束存備供 DNA曱基化分析之用。 實施例5:核韓置胚之產製 5.1.牛卵母細胞之去核操作 (1) Hoechst 33342螢光染劑之配製 Hoechst 33342螢光染色液之配製，係主要參考 Mohamed等人（1999)之所述而略予修飾，即將1〇 mg Hoechst 3 3 342 ( Sigma，B-2261 )螢光染劑溶於 1〇 ml 之滅 菌水中’配製成含lmg/ml Hoechst 33342濃度之螢光儲備 液（stock solution)，經分裝後保存於_2〇°c中備用；在使用 前則吸取2μ1之該螢光儲備溶液與ι98μ1含5% FCS之M-199培養液充分混合稀釋成濃度為1〇 gg/ml之H〇echst 3 3 342操作液。 (2)去核操作及去核成功之判定 A*先進行去核操作再實施激活處理之傳統核轉置流 程 先進行去核操作再實施激活處理（enucleati〇n before activation，EBA)之轉置流程，係參照Kubota等人（1998 )所述。其詳細步驟乃將業經體外成熟培養之COCs，先 22 1332030 移除其外所包覆之卵丘細胞，再將具PBI之卵母細胞置於 顯微操作腔中，以銳利之去核針將鄰近PBI端之透明帶劃 破，透明帶切口大小約同於PBI之直徑。其後，再將該針 置於卵母細胞上端並由上往下擠壓使其pBI及與之相鄰之 部份細胞質擠出透明帶外而完成。完成去核操作之印母細 胞連同被擠出之卵細胞質及PBI先個別置入已編號之5% FCS M-199培養小滴中；再將被擠出之卵細胞質及ρΒι移 入另一與其來源去核卵相同編號含1〇 Hg/ml H〇echst 33342 之培養液滴中進行螢光染色2〇 mine並以波長343 nm之 紫外光檢測去核成功率，若被擠出之卵細胞質内呈現藍色 螢光，則表示其相對應去核卵之染色體已被去除；而經確 認已去核之卵母細胞始供核轉置之受核細胞使用。 B.完成激活處理再進行去核操作之新創核轉置流程 完成激活處理再進行去核操作之核轉置流程 (enucleation after activati〇n，EAA)，其詳細步驟則是將未 經去核之印母細胞先置入供核細胞，並隨即進行細胞融合 以先產製含4倍體之核轉置胚。其後，此種含4套染色 體之核轉置胚在經歷激活處理後，始進行去核操作，使其 染色體套數恢復至正常《2倍體。去核成功與否之判定則 同傳統核轉置流程者。若被擠出之細胞質内僅呈現丨個藍 色螢光點，則表示其相對應核轉置胚中源自卵母細胞之染 色體已被去除。 5.2.體細胞置入卵黃膜間隙之顯微操作 將已去核或未去核之受核卵母細胞及供核之體細胞， 23 1332030 刀別置於不同之注射小滴後，先移動顯微鏡 核細胞之注射腔室内，並以置核吸管吸取適當數量(= 1 〇個）之供核細胞，再^ ^ ^ ^ ^ 錢視野至置放受核卵母細 胞之注射小滴内進行體細胞之置入操作。其步驟乃首先以 胚固疋官固定受核印母細胞，再操縱已吸取供核細胞之置 核吸管，沿著先前去核操作穿剌透明帶 印黃膜間隙’並於置放單-供核細胞後，，出置核=而 兀成核轉置操作。惟在未去核印母細胞組，其供核細胞則 置放在與ΡΒΙ端（3點鍾方向）呈9〇度之位置（6或Μ點鍾 方向），以避免去核操作時，連同將供核細胞去除。 复座例6:核韓置胚之雷融合操作 6.1.電融合液之製備 A· CaCl2儲備液之配製 曲將0‘01 U之CaCl2溶於1〇 mi之滅菌去離子水中而成 /辰度10 mM之CaCl2之儲備液，經濾菌分裝後冷藏（4。〇）備 用。 B· Mg Cl2儲備液之配製 將0.023g之MgC12. 6H20溶於10 ml之滅菌去離子水 中而成濃度10 mM MgS04之儲備液，經濾菌分裝後冷藏 (4。。）備用。 c·電融合液之配製 取 2.915g 之甘露醇（mannit〇l; Sigma，M-9546)加入 40 之滅菌去離子水中先充分溶解，再加入5〇〇 μΐ CaC12 24 1332030 、500 μΐ MgS04之儲備液及0.5 mg BSA，經充分溶解後 ’並以滅菌之去離子水定量至50 m卜而成濃度0.32 Μ甘 露醇+ 100 μΜ CaC12+100 μΜ MgS04 + 0.01 mg/ml BSA 之電

融合液，其後經濾菌分裝後冷藏（4。〇），使用前回溫至室溫 (25〜30 °C )’備供核轉置胚之電融合及電激活之用。此外， 另混合不同比率之胚培養液與電融合液製備成4滴分別含 25%、50〇/。、75%及1〇〇%電融合液之8〇μι小滴於35 mm培 養皿中，並於覆蓋輕級礦物油後，置入胚培養箱十平衡至 少4h’備供電融合及電激活前平衡核轉置胚之用。 6.2.電融合操作 電融合供核與受核細胞之操作步驟和所採用之電融合 參數組合，係修正自Kubota等人（1998 )之方法，即在電 融合處理前，將核轉置胚先移入含25%電融合液之小滴中

’再逐步移入含50%、75〇/〇及1〇〇%電融合液之小滴中，每 小滴之浸置時間為2 min，以漸進調整核轉置胚之渗透塵 。電融合操作係將h5 ml之電融合液置於100 mm胚培養 皿内形成電激融合槽，並以兩支已滅菌之不鏽鋼微針調整 之方向，使供核細胞與受核卵母細胞接觸之界面 與電融合微針末端之平整切面平行（令電場方向垂直通過供 、受核兩細胞之接觸界面）。其後，啟動電

-Μ2〇〇1；ΒΤχ Inc., SanDieg〇j USA),^i s ky；J ::強度、電激持續時間及】次方形 行電融合。完成電融合步驟之核轉置胚： 3 /〇電融合液之小滴令使其恢復滲透壓，2 min後 25 1332030 再移入胚培養液中並置於恒溫培養箱中培養，3〇爪“後將 該胚置於倒立顯微鏡上記錄胚之融合率，融合之核轉置胚 旋即置回恆溫培養箱中培養備供後續激活處理之用。 f施例7」座轉置胚之激活虚理舟驄 7.1.激活液之配製 7丄1.鈣離子載體（calcium i〇n〇ph〇re)A23187激活液 之配製 ， 將1 mg之鈣離子載體（Sigma，C-7522)溶於1.91 ml 之DMSO中而配製成含丨mM之儲備液，其後，經分裝後 冷/東（_2〇C)備用。於激活處理前將冷凍之A23187儲備液 於常溫解凍後，取5 μΐ之儲備液加入995μ1之胚培養液中 充分混勻而配製成含5μΜ之操作液，備供激活處理時使 用。 7.1，2· 6- 一甲基胺嗓吟（6_dimethylaminopurine 6-DMAP)·激活液之配製 將 100 mg 之 6-DMAP(Sigma, D-2629)先加入 3.064 ml 之TCM-199培養液中，再置入56。〇之水浴槽中，使6_ DMAP微顆粒完全溶解，而配製成含2〇〇 mM之儲備液， 其後’經分裝後冷凍（_2〇〇c )備用。於激活處理前將冷床之 6-DMAP儲備液於常溫解凍後，取之儲備液加入 990μ1之胚培養液中充分混勻而配製成含2 mM之& DMAP操作液’其後，以每滴5〇μ1之體積置4滴於μ mm 培養皿中’並於覆蓋輕級礦物油後，置入胚培養箱中平衡 26 1^^2030 至v 4 h，備供核轉置胚激活處理之使用。 · 7·2·激活處理步驟 , 轉置胚之激活處理，係修正自Liu等人（1998 )之 步驟’將上述經EBA矛口 EAA核轉置流程所產製之已融合 h轉置胚先置回胚培養箱培養“後，再分別移入含

A23187激活溶液+ 5 min，然後再移人含2 mM 6-DMAP 之激活液中培養4h而完成激活處理步驟。 卜受精胚及核棘曼胚之體外培養 · 8.1. 體外培養液滴之製備 含單層卵丘細胞之牛胚體外培養液滴之製備方法係依 據李等人（1997)所述，即將前述經18〜19 h體外成熟培養 之COCs ’在執行移除卵丘細胞過程所遺留於原體外成熟 養液滴内之卵丘細胞’經持續培養使細胞增生並佈滿培 養液滴形成單層之卵丘細胞而製備完成。 8.2. 胚之體外培養 體外受精胚及實施例7完成激活處理之核轉置胚，先 % 經3次胚培養液之清洗後，再分別置入已備妥形成單層卵 丘細胞之培養液滴中，並移入恆溫培養箱中進行共培養。 於開始培養後每隔24 h記錄核轉置胚之發育情形，且每兩 天更換50。/。之新鮮胚培養液迄開始培養之第8天。待體外 受精胚及核轉置胚於體外發育至囊胚期後，一部分之核轉 置囊胚予以進行胚移置（於下說明）；另一部分則以4〜5個 為單位’先經mPBS沖洗3次後，再分別置入〇.5ml之離 27 1332030 直接置入液態氮中急速冷凍，並立 = :ΓΝ"基化分析之"析前則將冷康之 。、囊胚及核轉置囊胚自_8〇t冰箱中取出，並隨即置 =、37 C水中解康，其後再依序置人液態氮及抓水中進 打冷H東步驟，使胚透明帶破裂，以利體基因组DNA 之回收。 轉置胚之胚t 手衍核轉置流程所產製之核轉置囊胚，應用非外科 日i之^胚//移置胚生理週期同期化（穩定發情後之第7 用直腸H 道中。其過程係在進行胚移置前，先利 得適：：：受胚母牛子宮環境及黃體發育情形，以擇 =3:牛進行胚移置。適當受胚牛之條件，係指經 ==宮時，可感覺子宮中度收縮、無異常内容 物（如子呂積膿或積水等）、 突起之黃體組織者H , 且"表面具明顯 去收 Λ者 疋為一級；若該黃體組織適中突起 者，將判定為二級；當觸診時發現子 者，或卵巢砉$ # …、彈性且收縮異常 Ρ巢表面僅具猶微突起之黃體組織 腫者，㈣定為三級。其tg體囊 A 1主土组逼狀況被判定A — ·έΒ 與二級之母牛，供為受胜牛使用。備 為，.及 所欲移置之核韓人 又胚牛後，紅即將 ，龙梦署於古 mu-1"胚移置液中 ^ '徑為0.25 CI11之麥管内，再置入庇、Φ 。其後，將瓶注入号自“4置入胚注入器t 之子宮角4 又胚牛子1頸進入具發育黃體同側 之子呂角’#庇注人器進人達 28 1 月禾知之彎曲部位時， 1332030 將胚注入，並於胚‘注 入器移出生殖道後，完成胚移置步驟 兔施例！〇:匕1_^^ EAA核轉詈流程所產製 後轉置胚之體外__^發育能力 10.1.步驟 經體外成熟培養18〜19 h之牛卵母細胞，去除包覆其 外之卵丘細胞後，逢機分為2組。其中一組之卵母細胞利 用EB A之核轉置操作流程生產對照組之核轉置胚；另一組 之卵母細胞，則利用EAA之核轉置操作流程生產處理組之 核轉置胚。此兩種利用；^去核時機所產冑之核轉置胚於 產製後’均置入先前已備妥含單層卵丘細胞之胚培養液滴 中，於38.5°C、2% C〇2及飽和濕度條件之培養箱中進行 8天之體外共培養1開始培養後每24 h紀錄兩組合轉置 胚之發育情形，用以評估兩組核轉置胚之體外發育能力。 待各兩組核轉置胚於體外培養發育至囊胚期時，利用非外 科移胚法，分別注入生理週期同期化之受胚母牛子宮内， 並於胚移置53天後以直腸觸診判定受胚牛之懷孕情形， 用以評估各處理組核轉置胚之體内發育能力。 10.2.結果 本试驗所探討核轉置操作流程對核轉置胚體外發育能 力影響之結果示於表1。 b 表丨.核轉置操作流程對核轉置牛胚體外發育能力之 影響 ％ 29 1332030 核轉 置方法* 核轉 置胚培養 數目 核j 專置胚發展情況及數目（％)★ 2-cell 16-cell CM B EBA 82 76(92.7) 48(58.5) 41(50.0) 38(46.3) EAA 85 75(88.2) 49(57.6) 41(48.2) 38(44.7) * EBA(Enucleation before activation):先去核再激活； EAA(Enucleation after activation):先激活再去核。 CM(Compacted molua):桑椹期；B(Blastocyst):囊胚 期。 結果顯示’利用EBA和EAA所產製核轉置胚於體外 發月至各胚期之百分比均極為接近（2_細胞期：92.7 vs. 88.2 °/❶；16-細胞期：58.5 vs. 57.6 % ;桑椹期：5〇 〇 48.2 °/〇 ’囊胚期：46.3 44.7 %)，於處理組別間不具顯 著性差異（p> 0,05)。利用EBA核轉置操作流程所產製之 20個核轉置囊胚’於移置入11頭受胚牛後，有2頭懷孕

，統計時之懷孕天數已分別8.5及7.5月齡；而利用EAA 核轉置操作流程所產製之2個核轉置囊胚，於移置入丨頭 弩胚牛後，亦已證實懷孕，其懷孕天數目前為7月齡（如表 所示）。這顯示兩種核轉置流程所產制之核轉置胚均具有 聲育成個體之能力。 表2.利用不同核轉置流程所產製核轉置牛胚之懷孕 率 30 丄州2030 核轉 置方法 核轉 置胚的移 置數目 接受 移置的母 牛數 懷孕 數 EBA 20 11 2 EAA 2 1 1 f施例11:核韓詈_胚DNA甲基化程廑之消丨定 DNA曱基化程度之分析方法係修正自warnecke等人 (1998)和Kang等人（2001)所述，其詳細步驟如下： 11.1.酸性亞硫酸鹽（Bisulfite)之化學處理 (1) 將實施例8經急速冷凍·解凍二次處理之體外生產 囊胚、供核細胞及經£ΒΛ和EAA核轉置流程所產製之核 轉置囊胚，分別加入2μ1含1μβ/μ1之E.c〇ii tRNA、2μ1 έ 0.02 Μ 之 SDS、0.3μ1 含 19pg/ml 之 proteinase Κ、.以 及14·7μ1之去離子水，使最終體積為2〇μ1後，置於37^ 水浴槽中作用1 h。 (2) 於98°C條件下作用15 min。 (3) 加入2.5μ1之Bam Η I和2_5μ1之專用10X緩衝 液’於37。(：條件下作用10 h。 (4) 加入2μ1含3M之NaOH，於37。(：條件下作用15 min。 (5) 加入 12μ1 含 10mM 之對苯二盼（hydroquinone)、 208μ1 含 2.3 Μ 之重亞硫酸納（sodium metabisulfite)(pH = 5) 31 1332030 、以及2μ1含ιμβ/μι之E.coli tRNA，於50°C條件下作用 10 h ° (6) 利用市售純化DNA之套組（Wizad DNA clean up system，Promega，A-7280)’去除DNA樣品中之鹽類，其 詳細步驟如操作手冊所述，並獲得4〇μ1之DNA溶液。 (7) 加入 4·4μ1 含 3 Μ 之 NaOH，於 37。(：作用 15 min 〇 (8) 加入 2μ1 含 1 μβ/μΐ 之 E.coli tRNA、28μ1 含 5 Μ 之醋酸錄（ammonium acetate)(pH=7)、以及 180μ1 之 100% 酒精，充分混勻，以沉澱DNA。 (9) 利用10000 G離心10 min後，去除上清液。 (10) DNA經自然乾燥後溶於20μ1之去離子水中，並凍存 於-20°C條件下備用。 11.2.利用聚合酶連鎖反應（PCR)方法擴增經亞硫酸鹽化學 處理之DNA片段 本實施例進行DNA去甲基化程度分析之基因片段座落於牛 /基因。所使用之上下游端引子對為BSI(+)和BSI(—） 。BSI(+)之序列為 5，-AATACCTCTAATTTCAAACT-3, ； BSI( 一）之序列為 5’-TTTgTgAATgTAgTTAATA-3,（Kang 等人，2001) 。其中BSI(+)引子於合成時即先予以標定FAM螢光物質。其 步驟簡述如下，取4μ1上述經亞硫酸鹽化學處理之各處理組 DNA溶液，分別加入各〇.75μ1含10 pmol/μΐ之BSI(+)和BSI( ―)引子、Ιμΐ 含 5υ/μ1 之 EXTaq、4μ1 含 50 μΜ 之 dNTP 和 2μ1 32 1332030 EXTaq專用之10倍濃縮PCR缓衝液，以及11·5μ1之已滅菌去 離子水，使最終體積為20μ1。各PCR反應液經充分混勻後，置 入 PCR 反應槽中，以（I ) 94°C，60 sec ; (Π ) 94°C，60 sec、46 °C，60 sec、72°C，20 sec，共 40 循環；（皿）72°C，5 min ; (IV )停置於4°C等條件完成PCR反應。完成PCR反應之樣品遂進 行去曱基化程度之分析。 11.3. DNA去甲基化程度之分析 DNA曱基化程度之測定原理，係利用亞硫酸鹽之化學處理 可將DNA序列上未被甲基化作用之胞嘴咬（cytosine)轉換成尿 °密。定（uracil);而已被甲基化者，則保有其原有之胞嘴咬驗基。 因此，將已被亞硫酸鹽化學處理之DNA片段，先經PCR技術 擴增後，再利用可截切特定DNA甲基化切位之限制酶進行截切 ;若該DNA片段中之胞嘧啶已被甲基化，則該胞嘧啶鹼基將不 因亞硫酸鹽之化學處理而被置換，因此可被上述之限制酶截切 ;當DNA片段中之胞嘧啶未被甲基化時，該胞嘧啶鹼基將被置 換成尿嘧啶，而改變其原有之序列，因此無法被上述之限制酶 截切而保有其完整長度之DNA片段（Warnecke等人，1998)。於 本實施例亦將應用此原理與方法，評估核轉置胚與供核細胞及 正常受精胚間，其等如化川以/基因甲基化程度之差異性。上述 經PCR所擴增之牛如化//…/基因片段全長約211 bp，片段中 共有12個甲基作用位置（CpGl〜CpG12)，此甲基化之位置及其 經亞硫酸鹽處理後之序列改變情形如下所示。 43 1332030 CG AT CA A1 CG CAGGGTCCCTGCAGAC CN CAAAA TCCCTACA AAC CpG1 CpG2

GGTACCTCTGATTTCAGACTC AATACCTCT AATTTCAAACTC

TGGGGACAGGAGAGTCAGGCCT TAAA AACA AAAAAA TC AAACCT

CG TCTTGGGTTGAGGCATGGA CA TCTTAA ATTAA AA CATAAA 86

CpG3 ACTC CG CTTGCCTCT CG AGATGTCCC CG( ACTC CA CTTA CCTCT CA AAATATCCC CAJ C ：pG 4 C ^pG 5 C :pG6

129 CpG7

TGT TAT

A A C

CG CA AGCTGTATTTGGAACCTGGGGTTTTTTC AACTA TATTTAAAACC TAAA ATTTTTT Ci

CpG8

CG CA

GAGAAGCTGCCCCTT AA AAAACT ACCCCH

CGCA

CG

AA

CA AA

CG GTGC C/ATAC 172

CpG9 CpG10 TGTTGACTGCATTCACAGG T ATTAA CTACATTCACA AA 211

Cp^12 (Kang 等人，2001) 211 bp長度之/ DNA片段的序列（上股）及·其經亞硫 酸鹽處理後之序列(；下股），而甲基化位置為框列處序列，另可 被限制酶截切之位置分別為CpG-4和CpG-7。在未經亞硫 酸鹽處理時，其CpG4和CpG7可被限制酶完全截切成3 5 、86、90 bp。惟因本實施例僅在BSI( + )引子上標定FAM螢光 物質，因此分析此片段之甲基化程度時，僅可偵測獲致約90 bp 、125 p和211 bp等片段。其步驟乃將上述已完成亞硫酸鹽處 理及PCR反應之各試驗樣品，均予以取出4μ1後’分別加入 2μ1 m限制酶(NEB，R0551S)和2μ1 ΑζΊ專用之10倍濃縮缓 衝液，以及12μ1之已滅菌去離子水，使最終體積為20μ1。各分 34 1332030 析樣品經充分混勻’並於37°C條件下作用12 h後，取Ιμΐ該等 經dcz’I限制酶作用之各試驗樣品pcR產物，分別加入〇.5μΐ含 TAMRA螢·光物質標示之350 bp分子大小的標準品（Applied Biosystems, 401736) 、0·5μ1專用緩衝液及3μ1之去離子曱醯胺 液予以混合均勻，於90°C下變性2 min後，立即置於冰上備用 。其後，先將該變性之各混合溶液分別取出1.5 μΐ並載入核酸 自動定序儀（Applied Biosystems-377)中電泳2 h後，再以 GeneScan 和 Genotyper 軟體（Applied Biosystems，Foster City, USA)分析該電泳膠片上所呈現各長度片段所含之DNA量。之 後，將各試驗處理組中被jcH限制酶截切成各片段長.度（包括約 90及125 bp者）之DNA總合量除以該受測樣品之DNA總量（ 包括所有被切及未切之DNA) ’以獲致該處理組/基因 被甲基化之百分比，而完成甲基化程度之分析。 11.4.評估利用ΕΒΑ及ΕΑΑ核轉置流程所產製核轉 置胚之DNA甲基化程度的結果 將源自體外生產囊胚、供核細胞以及利用 ΕΒΑ和 ΕΑΑ核轉置操作流程所生產核轉置囊胚之DNA，經亞硫酸 鹽處理後，其等以e I DNA片段甲基化程度之分析結 果示於表3。 表3.利用EBA和EAA核轉置流程所產製核轉置胚 中I基因之甲基化程度 1332030 處理方 法 檢測 次數 ~---- 以β//心I基因之甲基化程度 _(%) _____ 平均值（標準蓽） 體外生 產囊胚（IVP) 6 ----- 3 1.87 (± 4.83)c 供核細 胞 6 ------ 69.78 (士 5.62)a EBA產 製之核轉置 胚 6 — 64.66 (± 1.66)a EAA產 製之核轉置 胚 6 44.42 (土 2.96)b 不同上標英文字的值具有顯著差異（p<0 〇〇1)。 結果顯示，供核細胞及利用EBA核轉置操作流程所生 產核轉置囊胚之DNA加e//"e】DNA片段曱基化百分比相 近（69.78% & 64.66%) ’惟此兩值均明顯高於體外生產囊胚 (31.87%)及利用£^流程生產之核轉置囊胚者（4442%)化 <0.001) ’且利用EAA流程生產之核轉置囊胚者又明顯較 體外生產囊胚者高(p<〇.〇〇1)。這結果說明，纟常體外受 精胚，於發育至囊胚期時，#甲基化程度將被明顯降低， 原本’二由具有鬲度甲基化之供核細胞所產製之核轉置囊 36 1332030 胚則仍維持其原有具較高甲基化之現象，而利用EAA所產 製之核轉置囊胚，則具有降低核轉置胚甲基化之能力。 實施例12:統計分姘 以上實施例1〇所使用之統計分析如下所述，利用 EBA和EAA所產製核轉置胚於體外發育至各胚期之發育 差異性，係應用卡方分析法分析之；而兩組核轉置胚之甲 基化程度比較，則利用一般線性模式（General Unear Models)進行變方分析，並進一步以Duncan平均值比較 法評估處理間之差異顯著性。

j據本發明可作之不同修正及變化對於熟習該項技 者而吕均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發 已敘述特疋的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不鹿; ==制於該等特定具體事實上。事實上，在實施二 ;已述模式方面’對於熟習該項技術者而言顯而易^ 不同修正亦被涵蓋於下列中請專利範圍之内。 【圖式簡單說明】 (一） 圖式部分 «»%、 (二） 元件代表符號 37 1332030 參考資料 李善男、劉振發、許義明。1997。經體外成熟和體外受精之牛卵母細胞與卵丘 細胞共培養之發育率。中畜會誌24(4):429〜438。

Barlow, D. P. 1995. Genomic imprinting in mammals. Science 270:1610-1613.

Brackett, B. G. and G. Oliphant. 1975. Capacitation of rabbit spermatozoa in vitro. Biol. Reprod. 12:260-274.

Campbell, K. H., J. Me Whir, W. A. Ritchie and I. Wilmut. 1996. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 380:64-66.

Cervoni, N., Sanjoy Bhattacharya and Moshe Szyf. 1999. DNA demethylase is a processive enzyme. J. Biol. Chem. 274:8363-8366.

Davis, T. L., G. J. Yang, J. R. McCarrey and M. S. Bartolomei. 2000. The H19 methylation imprint is erased and re-established differentially on the parental alleles during male germ cell development. Hum. Mol. Genet. 9:2885-2894.

Falls, J. G., D. J. Pulford, A. A. Wylie and R. L. Jirtle. 1999. Genomic imprinting: implications for human disease. Am. J. Pathol. 154:635-647.

Haaf, T. 2001. The battle of the sexes after fertilization: behaviour of paternal and maternal chromosomes in the early mammalian embryo. Chromosome Res. 9:263-271.

Howell, C. Y., A. L. Steptoe, M. W. Miler and J. R. Chaillet. 1998. Cis-acting signal for inheritance of imprinted DNA methylation patterns in the preimplantation mouse embryo. Mol. Cell. Biol. 18: 4149-4156.

Howlett, S. K. and W. Reik. 1991. Methylation levels of maternal and paternal genomes during preimplantation development. Development 113:119-127.

Hsieh, C. L. 2000. Dynamics of DNA methylation pattern. Cour. Opin. Genet. Dev. 10:224-228.

Kafri，T.，M. Ariel, M. Brandeis，R. Shemer, L. Urven，J. McCarrey, H. Cedar and A. Razin. 1992. Developmental pattern of gene-specific DNA methylation in the mouse embryo and germ line. Genes Dev. 6:705-714.

Kang, Y. K., D. B. Koo, J. S. Park, Y. H. Choi, A. S. Chung, K. K. Lee and Y. M. 38 1332030

Han. 2001. Aberrant methylation of donor genome in cloned bovine embryos. Nat. Genet. 28: 173-177.

Kubota, C., X. Yang, A. Dinnyes, J. Todoroki, H. Yamakuchi, K. Mizoshita, S. Inohae and N. Tabara. 1998. In vitro and in vivo survival of frozen-thawed bovine oocytes after IVF, nuclear transfer, and parthenogenetic activation. Mol. Reprod. Dev. 51:281-286.

Labosky, P. A., D. P. Barlow and B. L. M. Hogan. 1994. Mouse embryonic germ (EG) cell lines: transmission through the germline and defferences in the compared with embryonic stem (ES) cells. Development 120:3197-3204.

Liu, L. C. Ju and X. Yang. 1998. Parthenogenetic development and protein patterns of newly matured bovine oocytes after chemical activation. Mol. Reprod. Dev. 49:298-307.

Mohamed Nour, M. S. and Y. Takahashi. 1999. Preparation of young preactivated oocytes with high enucleation efficiency for bovine nuclear transfer. Theriogenology 51:661-666.

Monk, Μ., M. Boubelik and S. Lehnert. 1987. Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extraembryonic and germ cell lineages during mouse embryo development. Development 99:371-382.

Parrish, J. J., J. L. Susko-Parrish, M. L. Leibfried-Rutledge, E. S. Critser, W. H. Eyestone and N. L. First. 1986. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen. Theriogenology 25: 591-600.

Renard, J. P., S. Chastnat, P. Chesne, C. Richard, J. Marchal, N. Cordonnier, P. Chavatte and X. Vignon. 1999. Lymphoid hypoplasis and somatic cloning. Lancet 353:1489-1491.

Schnieke, A. E., A. J. Kind, W. A. Ritchie, K. Mycock, A. R. Scott, M. Ritchie, I. Wilmut, A. Colman and K. H. S. Campbell. 1997. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science 278: 2130-2133.

Wamecke, P. M., J. R. Mann, M. Frommer and S. J. Clark. 1998. Bisulfite 39 1332030 • sequencing in preimplantation embryos: DNA methylation profile of the upstream region of the mouse imprinted HI9 gene. Genomics 51:182-190.

Wells, K. N., P. M. Misica and H. R. Tervit. 1999. Production of cloned calves following nuclear transfer with cultured adult mural granulose cells. Biol. Reprod. 60: 996-1005.

Wilmut, I., A. E. S., J. McWhir, A. J. Kind and K. H. S. Campbell. 1997. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cell. Nature 385: 810-813.

Xue, F., X. C. Tian, C. Kubota, F. Du, M. Taneja, A. Dinnyes, Y. Dai, H. Levine, L.V. Pereira and X. Yang. 2002. Aberrant X-chromosome inactivation in deceased cattle derived from somatic cloning. Nat. Genet. 31: 216-220.

Claims (1)

1. !332〇3〇 森明%修(更}正本 種具有發展成牛的核轉置胚之培育方法，包括 (a) 提供牛之印母細胞； (b) 提供牛之供核細胞； (c) 將供核細胞或其細胞核置入卵母細胞中； (d) 將供核細胞與卵母細胞進 疋订邮〇向屋生四倍體核轉 置胚； (e) 將核轉置胚進行激活處理； (0去除卵母細胞核；和 (g)培養去除卵母細胞核之核轉置胚。 2 .如申請專利範圍第1項所述之培育方法，其中該 U)步驟之卵母細胞係經由體外培養後選取具第一極體者。 3 .如申請專利範圍第i項所述之培育方法，其中該 (b)步驟之供核細胞為體細胞。 4 .如申請專利範圍第3項所述之培育方法，其中該 體細胞含有外源基因。 〃 5.如申請專利範圍第j項所述之培育方法，其十該 (b)步驟之供核細胞進—步進行飢餓培養。 6·如申請專利範圍第1項所述之培育方法，其中該 (b)步驟之供核細胞不進行飢餓培養。 7 .如申請專利範圍第1項所述之培育方法，其中於 ()v h之供核細胞係置入卵母細胞之卵黃膜間隙。 8 .如申請專利範圍第1項所述之培育方法，其中於 41 1332030 (C)步驟之供核細胞係直接注入印母細胞之細胞質内。 9 .如申請專利範圍第i項所述之培育 (d)步驟之卵母細胞係未經去核者。 ^ 1〇·如申請專利範圍第1項所述之培育方法，立 該（d)步驟係利用電融合。 “中 11.如申請專利範圍第1項所述之培育方法’其 該⑷步驟激活處理係、將融合的細胞培養於含有每離子載: (calcium ionoph〇re；^〇 6_DMAp 之激活液中。 丄2. —種培育牛胎兒之方法，包括： U)提供牛之卵母細胞； (b)提供牛之供核細胞； (C)將供核細胞或其細胞核置入卵母細胞中； (d)將供核細胞與卵母細胞進行融合而產生四倍體 署U轉 (e)將核轉置胚進行激活處理； (0去除印母細胞核；

   (g) 培養去除卵母細胞核之核轉置胚；和 (h) 將核轉置胚移置入母牛生殖道中而形成胎兒。 如申請專利範圍第1 2項所述之方法，其中 (a)步驟 即母細胞係經由體外培養後選取具第一極體者。 1 4 ·如申請專利範圍第1 2項所述之方法，其中兮 ()V驟之供核細胞為體細胞。 Λ 如申請專利範圍第1 4項所述之方法，复中1 細胞含有外源基因 ’、 42 1332030 1 6 .如申請專利範圍第丄2項所述之方法，其： (b)步驟之供核細胞進一步進行飢餓培養。 /、中該 1 7 .如申請專利範圍第丄2項所述之方法，其 (b) 步驟之供核細胞不進行叙餓培養。 '、Λ 18 .如申請專利範圍第12項所述之方法，其中 (c) 步驟之供核細胞係置入卵母細胞之卵黃膜間隙。 ； 1 9 .如申請專利範圍第1 2項所述之方法，其中於 (c) V驟之供核細胞係直接注入卵母細胞之細胞質内。； 2 0 .如申請專利範圍第i 2項所述之方法，发 / 1 X ^ v、甲吞亥 (d) 乂驟之卵母細胞係未經去核者。 2 1 .如申請專利範圍第1 2項所述之方法，其中兮 (d)步驟係利用電融合。 22. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該 忒（e)步驟激活處理係將融合的細胞培養於含有鈣離子載體 和6-DMAP之激活液中。 23. —種培育牛之方法，包括： U)提供牛之卵母細胞； (b) 提供牛之供核細胞； (c) 將供核細胞或其細胞核置入卵母細胞中； (d) 將供核細胞與卵母細胞進行融合而產生四倍體核轉 置胚； (e) 將核轉置胚進行激活處理； (f) 去除卵母細胞核； (g) 培養去除卵母細胞核之核轉置胚；和 43 1332030 (h)將核轉置胚移置入母牛生殖道中而形成胎兒，並經 過所有胎兒成長及分化期間而生育出牛。 24 .如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該 (a) 步驟之卵母細胞係經由體外培養後選取具第一極體者 2 5 .如申請專利範圍第2 3項所述之方法，其中該 (b) 步驟之供核細胞為體細胞。 26 .如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該 體細胞含有外源基因。 2 7 .如申請專利範圍第2 3項所述之方法，其中該 (b)步驟之供核細胞進一步進行叙餓培養。 2 8 .如申請專利範圍第2 3項所述之方法，其中該 (b)步驟之供核細胞不進行飢餓培養。 Z 9 .如申請專利範圍第2 3項所述之方法，其中於 (c) 步驟之供核細胞係置入卵母細胞之卵黃獏間隙。 3 0 ·如申請專利範圍第2 3項所述之方法，其中於 (C)步驟之供核細胞係直接注入卵母細胞之細胞質内。； 3 1 .如申請專利範圍第2 3項所述之方法，其 (d) 步驟之卵母細胞係未經去核者。 、 其中該 d z ·如申請專利範圍第2 3項所述之方法 (d)步驟係利用電融合。 述之方法，其中該 含有鈣離子載體和

   ύ •如申請專利範圍第2 3項所 ⑷步驟n處理係將融合的細胞培養於 6-DMAP之激活液中。 —種培育牛重組細胞之方法，包括· 44- 1332030 (a) 提供牛之卵母細胞； (b) 提供牛之供核細胞； (c) 將供核細胞或其細胞核置入即母細胞中； (d) 將供核細胞與卵母細胞進行融合； (e) 將融合細胞進行激活處理；和 · (f) 去除卵母細胞核。 35·如申請專利範圍第34項所述之方法，其中該 (a) 步驟之卵母細胞係經由體外培養後選取具第—極體者。 36 .如申請專利範圍第34項所述之方法，其中該馨 (b) 步驟之供核細胞為體細胞。 3 7 .如申請專利範圍第3 6項所述之方法，其中該 體細胞含有外源基因。 3 8 .如申請專利範圍第3 4項所述之方法，其中該 (b)步驟之供核細胞進一步進行飢餓培養。 3 9 ·如申請專利範圍第3 4項所述之方法，其中該 (b) 步驟之供核細胞不進行飢餓培養。 40. 如申請專利範圍第34項所述之方法，其中於 _ (c) 步驟之供核細胞係置入卵母細胞之卵黃膜間隙。 41. 如申請專利範圍第34項所述之方法，其t於 (c) 步驟之供核細胞係直接注入卵母細胞之細胞質内。 4 2 .如申請專利範圍第3 4項所述之方法，其中該 (d) 步驟之卵母細胞係未經去核者。 4 3 .如申請專利範圍第3 4項所述之方法，其中該 (d)步驟係利用電融合。 45 1332030 44 ·如申請專利範圍第34項所述之方法，其中該 該（e)步驟激活處理係將融合的細胞培養於含有鈣離子載體 和6-DMAP之激活液中。 · 4 5 · —種牛的重組細胞，其係經由如申請專利範圍 ψ 第3 4至4 4項任一項所述之方法培育而得。 拾壹、圖式： 無

   46