KR101985924B1 - 세포질 이식을 이용한 복제배아의 재프로그래밍 효율 향상 방법 - Google Patents
세포질 이식을 이용한 복제배아의 재프로그래밍 효율 향상 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 포유동물의 체세포 복제 효율을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 세포질 이식 기술을 이용하여 복제배아의 재프로그래밍 효율을 향상시킴으로써 양질의 배아를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법을 사용 시 복제하고자 하는 체세포의 genome editing에 의하여 원하는 유전자를 삽입 또는 제거하여 형질전환복제동물을 생산하는데 매우 효율적으로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 포유동물의 체세포 복제 효율을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 세포질 이식 기술을 이용하여 복제배아의 재프로그래밍 효율을 향상시킴으로써 양질의 배아를 제공하는 방법에 관한 것이다.
1997년 복제된 양 돌리와 같이, 미성숙된 난자를 대상으로 유선상피세포 또는 태아 섬유아세포 등 분화가 이루어진 세포의 핵을 치환하는 체세포 복제기술이 개발되어, 우수한 형질을 갖는 가축, 인공장기 생산용, 질환모델 동물 및 희귀 또는 멸종상태의 동물 등을 대상으로 무한히 복제할 수 있게 되었다[Wilmut et al., Nature, 385, 810 (1997)]. 이러한 예로는, 태아 섬유아세포, 난구세포, 협막세포의 핵을 치환하여 소를 복제하는 방법이 보고되어 있고[Cibelli et al., Science , 280 , 1256 (1998); Kato et al., ibid, 282, 2095 (1988); Wells et al., Biol. Reprod., 60, 996 (1999)], 생쥐의 경우 난구세포를 이용하여 복제하는 방법이 보고된 바 있다[Wakayama et al., Nature , 394, 369 (1998)].
그러나, 이들 방법들은 여전히 체세포 핵치환 복제수정란의 체외발달율이 저조하여 실제 복제에 성공할 확률이 매우 낮은 실정이었으며, 돼지의 경우에는 핵치환된 복제수정란의 배반포기까지의 체외 발달율이 5% 미만으로 매우 저조할 뿐만 아니라, 세포수가 적으며, 이들 복제수정란의 계속적인 발달이 이루어지지 못하는 등, 아직까지도 복제에 성공하지 못하는 실정이다[Du et al., Theriogenology , 282 , 2095 (1999); Tao et al., Cloning, 1, 55 (1999)].
핵이 제거된 난모세포(enucleated oocyte)에 고도로 분화된 체세포 핵을 주입함으로써 재생된 배아를 생산할 수 있다. 이러한 체세포 핵이식(somatic cell nuclear transfer; SCNT)을 통하여 20종 이상의 포유동물을 성공적으로 복제하기는 하였으나 이 기술은 완전하지 못하다[Wilmut I, Beaujean N, De Sousa P, Dinnyes A, King T, Paterson L, et al. Somatic cell nuclear transfer. Nature. 2002; 419(6907):583-7.; Young LE. Scientific hazards of human reproductive cloning s. Human Fertility. 2003; 6(2):59-63; Solter D. Mammalian cloning: advances and limitations. Nature Reviews Genetics. 2000; 1(3):199-207 등 참조]. SCNT의 낮은 효율은 주입된 체세포의 불완전한 재프로그래밍(reprogramming)과 후성적(epigenetic) 결함 때문인 것으로 보이며, 따라서 성공적인 복제는 분화된 체세포의 전분화능(totipotent)을 가진 배아-유사 상태로의 재프로그래밍에 의존적이다[Dean W, Santos F, Stojkovic M, Zakhartchenko V, Walter J, Wolf E, et al. Conservation of methylation reprogramming in mammalian development: aberrant reprogramming in cloned embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(24):13734-8; Tian XC. Reprogramming of epigenetic inheritance by somatic cell nuclear transfer. Reproductive biomedicine online. 2004; 8(5):501-8; Latham KE. Early and delayed aspects of nuclear reprogramming during cloning. Biology of the Cell. 2005; 97(2):119-32]. 공여되는 체세포(somatic donor cells)의 재프로그래밍은 대체로 완전하며, 이러한 세포들을 이용한 SCNT는 건강한 복제 동물을 생산할 수 있으나, 많은 증거들은 체세포 유전체의 임의의 유전자좌에서의 불완전하거나 비정상적인 재프로그래밍이 배아 발달에 치명적일 수 있는 유전자의 비정상적 발현에 기여하며 이로 인해 복제동물의 이상을 야기한다는 사실을 뒷받침한다[Dean W, Santos F, Stojkovic M, Zakhartchenko V, Walter J, Wolf E, et al. Conservation of methylation reprogramming in mammalian development: aberrant reprogramming in cloned embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(24):13734-8; Tian XC. Reprogramming of epigenetic inheritance by somatic cell nuclear transfer. Reproductive biomedicine online. 2004; 8(5):501-8; Latham KE. Early and delayed aspects of nuclear reprogramming during cloning. Biology of the Cell. 2005; 97(2):119-32]. 체세포 유전체에서 메틸화 수준을 감소시키거나, 히스톤 탈아세틸효소(deacetylase) 활성을 억제함으로써 염색체 접근성을 증가시킴으로써 체세포 핵의 재프로그래밍을 증가시키려는 노력이 이루어져 왔다[Enright B, Kubota C, Yang X, Tian X. Epigenetic characteristics and development of embryos cloned from donor cells treated by trichostatin A or 5-aza-2-deoxycytidine. Biol Reprod. 2003; 69(3):896-901]. 복제된 배아의 발달 능력은 이러한 유전자들의 조절이상의 수준과 역의 상관관계가 있다. 공여 세포들의 후성적 상태에 더하여, 수여자인 난모세포의 질 역시 재프로그래밍 효율에 영향을 미칠 수 있다.
복제의 효율을 증가시키기 위해서는, 양질의 배아가 제공되어야 한다. 일부 연구결과에 따르면 배아 응집은 배반포 발달율과 복제된 배아의 질을 모두 향상시키는 훌륭한 수단이 될 수 있다[Tang P-c, West JD. The effects of embryo stage and cell number on the composition of mouse aggregation chimaeras. Zygote. 2000; 8(03):235-43; Misica-Turner PM, Oback FC, Eichenlaub M, Wells DN, Oback B. Aggregating embryonic but not somatic nuclear transfer embryos increases cloning efficiency in cattle. Biol Reprod. 2007; 76(2):268-78]. 응집된 소 복제 배아는, 발달율이 향상되지는 않더라도, 단일의, 응집되지 않은 복제 배아에 비해 총 세포수를 더 많이 가진다[Boiani M, Eckardt S, Leu N, Schler HR, McLaughlin K. Pluripotency deficit in clones overcome by cloneclone aggregation: epigenetic complementation? The EMBO Journal. 2003; 22(19):5304-12. doi: 10.1093/emboj/cdg507. PubMed PMID: PMC204490].
본 발명자들은 포유동물의 체세포 복제 효율을 증대시키기 위한 방법을 연구하던 중 체세포복제를 위해 핵과 극체와 함께 제거된 세포질을 다른 난자의 체세포에서 빼서 주입 시 체세포의 재프로그래밍 효율이 매우 높아져 복제 효율을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 탈핵된 난모세포(oocyte)에 복제하고자 하는 체세포와 함께 세포질을 주입하여 복제배아의 재프로그래밍 효율을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 복제배아의 재프로그래밍 효율을 향상시키는 방법을 이용하여 포유동물의 체세포 복제 효율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포질이 소실된 탈핵된 난모세포에 복제하고자 하는 체세포 및 세포질을 주입하는 단계를 포함하는, 복제배아의 재프로그래밍 효율을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling), 정량적 역전사 PCR(quantitative reverse transcription PCR) 및 면역세포화학(immunocytochemistry) 기술 등을 이용하여, 탈핵된 난모세포로의 세포질 이식이 복제된 착상 전 소 배아의 배아 발달능력과 질에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위해 본 발명자들은 새로운 기술인 세포질 주입 클로닝 기술(cytoplasm injection cloning technology, CICT)을 개발하였다. 이 기술은 탈핵 과정에서 세포질이 소실된 난모세포에 다른 난모세포의 세포질을 이식하는 기술로, 이를 통해 탈핵된 난모세포의 소실된 세포질을 재생시킬 수 있다.
따라서 상기 본 발명의 복제배아의 재프로그래밍 효율을 향상시키는 방법은 세포질이 소실된 탈핵된 난모세포에 복제하고자 하는 체세포 및 다른 난모세포의 세포질을 주입하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 주입되는 다른 난모세포의 세포질의 양은 탈핵된 난모세포에서 소실된 세포질의 양과 거의 동일하다. 즉, 수여자 난모세포에 존재하던 본래의 세포질 양만큼 주입될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 탈핵된 난모세포에서 소실된 세포질의 양은 전체 세포질의 약 10 ~ 50 부피%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 복제배아의 재프로그래밍 효율을 향상시키는 방법은, 세포질의 약 20 ~ 40 부피%가 소실된 탈핵된 난모세포에 복제하고자 하는 체세포 및 다른 난모세포의 세포질 20 ~ 40 부피%를 주입하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 복제배아의 재프로그래밍 효율을 향상시키는 방법에 사용되는 세포질이 소실된 탈핵된 난모세포는 난모세포의 제일 극체 및 그 주위 세포질을 흡입하여 탈핵시키는 방법으로 준비될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 복제하고자 하는 체세포 및 세포질을 주입하는 단계는, 조작 피펫(manipulation pipette)을 이용하여 상기 탈핵된 난모세포의 난황 주위공간에 단일 원형 공여자 체세포(a single round donor somatic cell) 및 공여자 난모세포의 세포질을 함께 주입하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 복제배아의 재프로그래밍 효율을 향상시키는 방법은 상기 체세포 및 세포질이 주입된 난모세포를 SV 매개 방법을 통해 융합시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 복제배아의 재프로그래밍 효율을 향상시키는 방법은 (a) 복제하고자 하는 체세포를 가진 개체로부터 복제하고자 하는 체세포를 추출하는 단계; (b) 체외성숙시킨 난모세포로부터 세포질의 20~40 부피%와 핵이 제거된 탈핵된 난모세포를 준비하는 단계; (c) 공여자 난모세포로부터 20~40 부피%의 세포질을 추출하는 단계; (d) 상기 복제하고자 하는 체세포를 가진 개체로부터 추출된 체세포와 공여자 난모세포로부터 추출한 세포질을 상기 (b) 단계의 탈핵된 난모세포에 주입하는 단계; 및 (e) 상기 체세포 및 세포질이 주입된 난모세포를 융합시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 복제배아는 인간을 제외한 포유동물의 복제배아일 수 있다. 상기 인간을 제외한 포유동물에는 돼지, 소, 양, 마우스, 개 등이 포함될 수 있고, 바람직하게 소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 분할이 이루어지고 배반포를 형성한 배아의 비율은 대조군인 SCNT (somatic cell nuclear transfer) 그룹[탈핵된 난모세포의 난황주위공간(perivitelline space)에 공여자 체세포(donor somatic cell)만을 주입한 그룹]에서보다 본 발명의 CICT (cytoplasm injection cloning technology) 그룹[탈핵된 난모세포에 체세포와 함께 공여자 난모세포의 세포질을 주입한 그룹]에서 훨씬 더 높았다(각각 61.5 ± 1.3% vs. 39.7 ± 2.1% 및 28.9 ± 0.8% vs. 20.2 ± 1.3%)(P < 0.05). 또한, 8일 배반포(Day 8 blastocyst) 당 총 세포수는 SCNT 그룹에서보다 CICT 그룹에서 훨씬 더 많았다(176.2 ± 6.5 vs. 119.3 ± 7.7, P < 0.05). 또한, CICT는 미토콘드리아 활성을 증가시키는 것으로 나타났고, mRNA 수준은 DNA methyl transferase1 및 DNA methyl transferase 3a의 mRNA 수준은 SCNT 그룹에 비해 CICT 그룹에서 훨씬 더 낮았다(P<0.05). DNA methyl transferase 3b의 mRNA 수준은 SCNT 그룹에 비해 CICT 그룹에서 더 낮았으나 유의적인 차이는 없었다(P>0.05). 이러한 결과를 종합하면, CICT는 복제된 소 배아의 체외 발달능력과 질을 향상시킨다는 것을 알 수 있다.
따라서, 다른 양태로서 본 발명은 상기 복제배아의 재프로그래밍 효율을 향상시키는 방법을 이용한 포유동물의 체세포 복제 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 포유동물의 체세포 복제 효율을 증가시키는 방법은 (a) 포유동물로부터 복제하고자 하는 체세포를 추출하는 단계; (b) 체외성숙시킨 난모세포로부터 세포질의 20~40 부피%와 핵이 제거된 탈핵된 난모세포를 준비하는 단계; (c) 공여자 난모세포로부터 20~40 부피%의 세포질을 추출하는 단계; (d) 상기 포유동물로부터 추출된 체세포와 공여자 난모세포로부터 추출한 세포질을 상기 (b) 단계의 탈핵된 난모세포에 주입하는 단계; (e) 상기 체세포 및 세포질이 주입된 난모세포를 융합시키는 단계; 및 (f) 상기 융합된 난모세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (f)단계는 융합된 난모세포를 이오노마이신(ionomycin)에서 1 ~ 10분 동안 배양하고, DMAP (6-dimethyl aminopurine)를 3 ~ 5시간 동안 처리하여 활성화시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 포유동물은 인간을 제외한 포유동물일 수 있고, 상기 인간을 제외한 포유동물에는 돼지, 소, 양, 마우스, 개 등이 포함될 수 있고, 바람직하게 소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 체세포 복제동물을 제공한다.
본 발명에 따른 방법을 사용 시 복제하고자 하는 체세포의 genome editing에 의하여 원하는 유전자를 삽입 또는 제거하여 형질전환복제동물을 생산하는데 매우 효율적으로 활용될 수 있다. 즉, 질환모델동물, 생리활성물질을 생산하는 형질전환 복제 동물의 생산에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 멸종위기종의 체세포복제에 의한 복원을 가능하게 할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 체세포 복제 효율을 증가시키는 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다.
도 2는 IVF, SCNT 및 CICT 그룹에서 8 일 배반포의 TUNEL 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 8 일 배반 포자에서 미토콘드리아 염색의 형광 강도를 확인한 결과이다.
도 4는 RT-qPCR에 의해 결정된 배반포에서 DNMT 유전자의 상대적 mRNA 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 2는 IVF, SCNT 및 CICT 그룹에서 8 일 배반포의 TUNEL 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 8 일 배반 포자에서 미토콘드리아 염색의 형광 강도를 확인한 결과이다.
도 4는 RT-qPCR에 의해 결정된 배반포에서 DNMT 유전자의 상대적 mRNA 발현 정도를 확인한 결과이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
'핵 이식'은 탈핵된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다.
'핵 이식란'은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.
'복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 세포, 배아 세포, 태아 유래 세포 및/또는 성체 유래 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다.
'핵 공여 세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다.
'수핵 난자'는 탈핵 과정을 통해 본래의 핵이 제거되고 핵 공여 세포로부터 핵을 전달받는 난자를 말한다.
'난자'는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다.
'탈핵 난자'는 난자의 핵이 제거된 것을 말한다.
'융합'은 핵 공여 세포와 수핵 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를들어, 지질막은 세포의 플라스마 막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 핵 공여 세포와 수핵 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 핵 공여 세포가 수핵 난자의 주란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다.
'핵 재프로그래밍(nuclear reprogramming)'은 핵 이식 과정 중 수핵 난자와 공여 세포를 융합한 후 공여 세포주의 핵이 재구성 되도록 일정 시간을 항온 배양하는 것으로, 핵 이식란(복제수정란)의 정상적인 발생을 유도하는 과정을 말한다.
'활성화'는 핵 전이 단계 전, 핵 전이 단계 동안 및 핵 전이 단계 후에 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다. 바람직하게는, 본 발명에서는 핵 전이 단계 이전에 미리 자극을 주는 것을 말한다.
포유동물은 인간을 제외한 포유동물을 의미하며, 가장 바람직하게는 돼지, 소, 양, 마우스, 개일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
체세포복제동물을 생산하기 위해서는 난자의 핵을 제거하고 복제하고자 하는 체세포를 주입하고 융합하여 재프로그래밍을 유도하여 1-cell stage로 역분화를 유도하는 과정을 반드시 거치게 된다. 그러나 탈핵과정에서 제거된 약 30 부피%의 세포질이 부족하여 주입한 체세포의 재프로그래밍이 불충분하여 복제동물의 생산효율이 매우 낮다는 단점이 있었다.
본 발명에서는 이를 극복하기 위해서 또 다른 탈핵된 세포질을 약 30 부피%를 재주입하여 체세포의 재프로그래밍의 효율을 높이는 방법을 사용하였으며, 본 발명의 방법으로 제조된 CICT 군에서 기존의 방법을 사용한 SCNT 군보다 배아의 융합률이 월등히 높았으며(표 2 참조), 배반포의 질도 우수함을 확인할 수 있었다(표 3 참조).
또한, 본 발명의 방법으로 제조된 CICT 군에서 기존의 방법을 사용한 SCNT 군보다 미토콘드리아 염색의 형광강도가 월등히 높았다(도 3 참조).
나아가 DNA 메틸 전이 효소 1 (DNMT1), DNA 메틸 전이 효소 3a (DNMT3a), DNA 메틸 전이 효소 3b (DNMT3b)의 mRNA 발현 수준을 정량화하기 위해 RT-qPCR 분석한 결과에서도 상기 유전자의 발현 수준은 하우스 키핑 유전자(housekeeping gene) GAPDH의 수준으로 정상화되었으며, 상기 유전자의 mRNA 발현 정도는 본 발명의 방법으로 제조된 CICT 군에서 SCNT 군보다 유의적으로 낮음을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
따라서, 본 발명의 방법을 사용하여 생산된 복제수정란은 체외수정란과 유사하였으며, 기존의 체세포복제 유래 수정란보다 유의적으로 높게 나타났다.
또한 이들 수정란의 발달율도 높고 세포사멸 할구의 수도 낮을 뿐만 아니라 세포질에 존재하는 미토콘드리아의 활성도도 체외수정란과 유사하였다. 이러한 결과에서 탈핵과정에 손실된 세포질의 재복원(약 30 부피%)은 복제수정란의 복제효율을 높이는데 매우 효과적임을 알 수 있다.
본 발명은 일 구체예로서 20 ~ 40 부피%가 탈핵된 난자에 복제하고자 하는 특징이 있는 체세포 및 다른 난자의 세포질 20 ~ 40 부피%를 주입하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물의 체세포 복제 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다른 구체예로서 (a) 성숙한 난자의 세포질을 20 ~ 40 부피% 제거하여 탈핵시키는 단계; 및 (b) 탈핵된 난자에 복제하고자 하는 특징이 있는 체세포를 이식하고 세포융합유도시켜 체세포 핵치환 복제수정란을 재구성하는 단계; 를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 체세포 복제 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
상기 (b)단계에서 체세포를 이식 시 (a)단계에서 사용된 난자 이외의 다른 난자에서 세포질 20 ~ 40 부피%를 뽑아 함께 주입하는 단계를 더 포함시킬 수 있다.
또한, 상기 (b)단계에서 융합된 난자의 활성화는 이오노마이신(ionomycin)에서 1 ~ 10분 동안 인큐베이션하고, DMAP (6-dimethyl aminopurine)를 3 ~ 5시간 동안 융합된 난자에 처리할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<
실시예
1>
실험 재료 및 방법
1. 윤리규정
모든 방법 및 실험 절차는 경상대학교의 실험 동물 보호 및 사용 가이드 라인 (승인 번호 GAR-110502-X0017)에 따라 수행되었다.
2. 화학물질
달리 명시하지 않는 한 모든 화학 물질 및 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 입수하였다.
3. 기증자 세포(donor cell)의 준비
기증자 체세포는 한우 가축의 피부 조직에서 유래되었다. 간략히 설명하자면, 피부 조직을 Dulbecco 인산염 완충 식염수 (D-PBS, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 3 번 세척하고, 1mm2로 잘게 잘라 0.25 % (v / v) Trypsin-EDTA 용액 (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA)에서 37 ℃의 온도로 1 시간 동안 배양 하였다. 그 후, 세포를 15% (v/v) 소 태아 혈청 (FBS, Gibco), 1% (v/v) L-glutamine, 1% (v/v) 비필수 아미노산 및 1% (v/v) 페니실린 - 스트렙토 마이신으로 보충된 donor cell culture medium [Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM, Gibco)로 3번 세척하였으며, 1,000 rpm에서 2 분간 원심 분리한 다음, 100 mm 플라스틱 접시 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에 분주하였다. 분주된 세포는 5% CO2를 함유한 습기가 있는 공기, 37 ℃의 donor cell culture 배지에서 10-14 일 동안 연속 배양 하였다. passage #3의 세포를 10 % (v / v) FBS 및 10 % (v / v) 디메틸 술폭시드가 보충된 DMEM에서 동결시키고 액체 질소에서 저장 하였다. 세포를 해동하고, passage #4-8까지 배양한 다음 복제에 사용하였다.
4. 난모세포 수집 및 체외 성숙(
IVM
)
한우의 난소는 지방 도살장에서 얻은 후 35 ℃의 멸균 식염수에 보관하여 2 시간 이내에 실험실로 옮겼다. Cumulus-oocyte complexes (COCs)는 진공 펌프에 부착된 18 게이지 바늘을 사용하여 직경 2 ~ 8 mm의 모낭으로부터 흡인되었다.
균등하게 과립화된 세포질 및 압축된 난구세포(cumulus cell)의 3 개 이상의 층을 갖는 COCs를 선별하고 TL-HEPES [114 mM sodium chloride, 3.2 mM potassium chloride, 2 mM sodium bicarbonate, 0.34 mM sodium biphosphate, 10 mM sodium lactate, 0.5 mM magnesium chloride, 2 mM calcium chloride, 10 mM HEPES, 1 L/mL phenol red, and 1% (v/v) P/S]에서 세척한 다음 IVM 배지[TCM-199 (Gibco) supplemented with 10% (v/v) FBS, 1 ㎍/mL estradiol-17β, 10 ㎍/mL follicle-stimulating hormone, 0.6 mM cysteine, and 0.2 mM Na-pyruvate]에 넣고, 600μL의 IVM 배지를 포함하는 4-웰 디시(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 트랜스퍼한 다음, 38.5℃에서 5 % CO2를 함유한 가습 공기 중에서 22-24 시간 동안 배양하였다.
5. 체외수정
정액을 37℃의 수조에서 1 분 동안 해동시켰다. 정자를 세척하고 실온에서 1,800 x rpm으로 5 분간 원심 분리하여 D-PBS로 펠렛화하였다. 펠릿을 20 ㎍ / mL 헤파린을 함유하고 있고, 38.5 ℃에서 15 분 동안 5 % CO2를 함유한 가습 환경에서 배양된 체외수정(in vitro fertilization; IVF) 배지[6 mg / mL 소 혈청 알부민 (BSA), 22 ㎍ / mL 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 100 IU / mL 페니실린 및 0.1 mg / mL 스트렙토마이신]에서 조심스럽게 재부유시켰다.
정자 현탁액을 IVF 배지 (최종 밀도 1-2 × 106 sperm/mL)로 희석시켰다. 성숙한 COCs는 600 μL의 IVF 배지에 정자가 들어있는 4-well dish에 옮겨졌고, 38.5℃에서 5 % CO2를 함유한 가습 환경에서 18-20 시간 동안 배양되었다.
6. 핵 이식
IVM 배지에서 22-24 시간 배양한 후, 적혈구를 TL-HEPES에서 제조한 0.1 % (v/v) 소 고환 히알루로니다아제에 반복적인 피펫팅을 가하여 COCs로부터 제거하였다. 제1 극체(first polar body)를 가진 탈수된 난모세포를 핵 제거 (enucleation)를 위해 선별하였다.
이에 대해 간단히 설명하면, 7.5 ㎍ / mL 사이토카라신 B (cytochalasin B; CB) 및 0.3 % BSA가 보충된 TCM-199 배지의 작은 방울(droplet)에서 제일 극체 및 소량의 주위 세포질을 흡입함으로써 탈핵을 하였다. 총 탈핵된 난모세포의 약 30 부피%가 세포질의 원천으로 사용되었다. 남은 난모세포는 수핵난자로 사용되었다. 핵 공여 체세포를 센다이 바이러스 (SV, Cosmo Bio, Tokyo, Japan) 용액에 1 분 동안 담갔다.
그 후, 조작 피펫을 이용하여 각각의 탈핵된 난모세포의 난황주위공간(perivitelline space)에 단일 원형 공여자 체세포(a single round donor somatic cell; <20 ㎛)를 주입하거나(SCNT 그룹), 또는 공여자 난모세포에서 세포질의 약 30 부피%를 체세포와 함께 주입하여(CICT 그룹) 탈핵된 수여자 난모세포(recipient oocyte)의 세포질을 회복시켰다(도 1 참조).
재구성된 난모세포를 SV 매개 방법(Song Y-H, Pinkernell K, Alt E. Stem cell induced cardiac regeneration: Fusion/mitochondrial exchange and/or transdifferentiation? Cell Cycle. 2011; 10(14):2281-6)을 통해 융합시킨 다음 5 ㎍ / mL CB가 보충된 변형된 SOF-BE1(synthetic oviduct fluid-bovine embryo 1) 배지에서 2 시간 동안 배양 하였다. 성공적으로 재건된 난모세포는 5 μM 이오노마이신(ionomycin)에서 5 분 동안 인큐베이션하고, 2 mM 6-dimethylaminopurine에서 38.5 ℃에서 5 % CO2를 함유한 가습 환경에서 4시간동안 배양하여 활성화시켰다.
7. 체외배양
20 시간 동안 배양된 정자 및 / 또는 재구성된 난모세포의 활성화 후, 추정 된 접합체 / 활성화된 배아를 광범위하게 세척하고 38.5 ℃에서 5 % CO2를 함유한 가습한 환경에서 미네랄 오일로 덮인 SOF-BE1 배지 (20 embryos per droplet) 80μL의 액적(droplet)에서 배양하였다.
배양 배지의 절반을 2 일마다 보충하였다. 재구성된 배아와 체외 수정된 배아의 절단은 융합 후 2 일째 및 IVF(체외수정) 후 3 일째에 확인 하였다(day 0 = day of IVF or fusion). 배양 8 일 후 입체 현미경으로 배반포 발달 정도를 관찰하였다. 8일 배반포를 TL-HEPES에서 3번 세척하고 고정액[4% (v/v) paraformaldehyde prepared in 1 M phosphate-buffered saline (PBS)]으로 옮겨 4 ℃에서 보관하여 세포자멸사 및 총 세포를 분석하였다. 유전자 발현 분석을 위해 8 일 배반 포자를 1.5 mL Eppendorf tube에 옮기고 액체 질소로 급속 동결시킨 다음 -80 ℃에서 보관하였다.
8.
TUNEL
(Terminal
deoxynucleotidyl
transferase
dUTP
nick-end labeling) 분석
8 일 배반포에서 총 세포 및 사멸 세포의 수는 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling)으로 분석하였다. TUNEL은 제조업자의 프로토콜에 따라 In Situ Cell Death Detection Kit (Fluorescein, Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 수행하였다.
이에 대해 간단히 말하면, 고정된 배아를 PVP-PBS[1 M PBS supplemented with 0.3% (w/v) polyvinylpyrrolidine]로 세척한 후, 실온에서 30 분 동안 투과성 용액[0.5% (v/v) Triton X-100 and 0.1% (w/v) sodium citrate]으로 배양 하였다.
투과(permeabilization) 후, 배아를 PVP - PBS로 두 번 씻고, 1시간 동안 어둠 속에서 fluorescein-conjugated deoxyuridine triphosphate 및 terminal deoxynucleotide transferase로 배양하였다.
TUNEL로 염색된 배아는 PVP-PBS로 세척한 다음, 10분 동안 10 ㎍/mL의 Hoechst 33342를 포함하는 PVP-PBS에 배양하였으며, 과도한 Hoechst 33342를 제거하기 위해 PVP - PBS로 두 번 세척한 다음 유리슬라이드에 올렸다.
배반포 당 세포 수는 수은 램프가 장착된 epifluorescence 현미경 (Olympus IX71, Tokyo, Japan)을 사용하여 카운팅하였다. TUNEL 양성 세포는 밝은 적색으로 나타나 세포 사멸의 발생을 나타내었다. 본 발명을 위하여 TUNEL 분석을 3 회 수행 하였으며, 한 개의 그룹 당 15 개의 배반포를 분석 하였다.
9. 미토콘드리아 활동의 평가
미토콘드리아 활성을 상업적 키트 (MitoTracker Green FM; Invitrogen)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 분석하였다.
이에 대해 간단히 설명하면, 고정된 8 일 배반포를 D-PBS로 3 번 세척한 후 125 nm의 MitoTracker® Green FM로 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 그런 다음, 배반포를 D-PBS로 2번 헹구고 Hoechst 33342로 실온의 어두운 곳에서 10 분 동안 표지하였다. 염색 후 배반포를 유리 슬라이드 위에 놓고 공 초점 레이저 스캐닝 Olympus Fluoview FV1000 현미경 하에서 검사 하였다. 여기 파장은 594nm이고, 방출은 608nm에서 판독되었다. Mitochondrial 형광은 ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, https://imagej.nih.gov/ij)를 사용하여 각 이미지에서 배경 밀도를 뺀 다음 표준화 후 정량화시켰다. 그룹 당 20 개의 배반포를 검사하였으며, 실험은 3회 반복하였다.
10.
mRNA
추출 및 cDNA
역전사
제작자의 지침에 따라 Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Life Technologies, Inc., Foster City, CA, USA)를 사용하여 복제된 포배 (IVF, SCNT 및 CICT)의 각 그룹에서 총 RNA를 추출하였다.
NANO DROP 2000c 기기 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 RNA의 농도 및 순도를 측정하였다. RNA 샘플은 사용 전 -80 ℃에서 보관하였다. iScript™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 제조사의 지침에 따라 mRNA를 1 차 상보형 DNA (cDNA)로 역전사시켰다. 마지막으로 cDNA를 RT-qPCR 분석에 사용하기 전까지 -80 ℃에서 보관하였다.
11. RT-
qPCR
분석
유전자 특이적 프라이머는 Primer3Plus 소프트웨어 (http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)를 사용하여 디자인되었으며 표 1에 기재하였다.
RT-qPCR 분석은 0.2 mM의 각 소 특이성 프라이머, 1 x iQ SYBR Green Supermix(iQ SYBR Green Supermix kit, Bio-Rad Laboratories, Inc.) 및 3μL의 희석된 cDNA를 포함하는 반응 부피가 10 μL 인 CFX98 실시간 시스템(Bio 1 x iQ SYBR Green Supermix (iQ SYBR Green Supermix 키트, Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 사용하여 수행하였다.
모든 cDNA 샘플을 GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 특이 적 프라이머를 사용하여 분석하여 본 발명의 내부 통제 유전자의 발현 변화를 검출 하였다. 상대적인 GAPDH 발현이 샘플 간에 유의하게 다르지 않다는 것을 확인한 후, 모든 전사물을 독립적인 분석에서 정량화하였다. PCR은 95 ℃에서 15 초간, 57 ℃에서 20 초간 및 72 ℃에서 30 초간의 44 사이클의 변성 단계 (95 ℃에서 3 분간) 및 72 ℃에서 5 분간의 최종 신장 단계를 포함한다.
증폭은 점진적 변성을 사용하여 용융 곡선 분석을 한 후, 온도를 초당 0.2 ℃의 속도로 65 ℃에서 95 ℃로 증가시키면서 형광을 연속적으로 측정하였다. 정량 분석은 ΔΔC (t) 방법을 사용하여 수행하였다. 프로파일된 모든 유전자에 대해, 표준 편차 / 평균치 × 100의 식을 사용하여 내부의 변동계수를 계산했다.
| Gene | Primer sequence | Accession number | Product size (bp) |
| DNMT1 | F: AGGGAGACGTGGAGATGCTG R: CATGGAGCGCTTGAAGGAG |
AY244709 | 194 |
| DNMT3a | F: AGACATGTGGGTTGAACCCG R: GGCTCCCACAAGAGATGCAG |
AY271298 | 188 |
| DNMT3b | F: CAGGATGGGAAGGAGTTTGGA R: CACCAAACCACTGGACCCAC |
AY244710 | 151 |
| GAPDH | F: CCCAGAATATCATCCCTGCT R: CTGCTTCACCACCTTCTTGA |
NM_001034034 | 185 |
Abbreviations: F, forward; R, reverse.
12. 통계 분석
데이터는 평균의 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 나타내었고 SPSS 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 one-way ANOVA로 분석하였다. Duncan의 다중 범위 테스트를 사용하여 그룹을 비교하였다. P <0.05는 유의한 것으로 간주한다.
<
실시예
2>
본 발명의 방법으로 제조된 소 복제수정란의 배아
발달능
정도 확인
본 발명자들은 세포질 이동이 2 일째에 복제된 착상 전 이식 소 배아의 절단 및 8 일째 배아 발달능에 미치는 영향을 조사하고 이들 비율을 체외 수정된 배아의 비율과 비교하였다.
그 결과, 융합률(fusion rate)은 본 발명의 방법으로 다른 난자의 세포질을 약 30 부피% 정도 주입한 CICT 군에서 기존의 방법을 사용한 SCNT 군보다 유의하게 높음을 알 수 있었다(82.0 ± 0.3% vs. 68.3 ± 1.5%; 표 2 참조). 또한, CICT 군에서 분열을 일으킨 배아의 비율은 SCNT 군보다 유의적으로 높았으나(61.5 ± 1.3% vs. 39.7 ± 2.1%), IVF 군(75.4 ± 1.3%)보다는 낮은 수준임을 확인할 수 있었다(표 2 참조).
배아 포배기로 발달한 배아의 비율은 CICT 군에서 SCNT 군보다 유의하게 높았으나(28.9 ± 0.8% vs. 20.2 ± 1.3%), CICT와 IVF 군간에 유의한 차이는 없었다(표 2 참조).
| Group | No. of cultured zygotes | No. of cloned oocytes | No. (%) of fused embryos* | No. (%) ≥ 8/16 cell embryos** | No. (%) of blastocysts*** |
| IVF | 258 | - | - | 194 (75.4 ± 1.3)a | 80 (31.2 ± 1.2)a |
| SCNT | - | 558 | 381 (68.3 ± 1.5)a | 148 (39.7 ± 2.1)b | 74 (20.2 ± 1.3)b |
| CICT | - | 296 | 243 (82.0 ± 0.3)b | 149 (61.5 ± 1.3)c | 70 (28.9 ± 0.8)a |
*Fusion rates were calculated based on the number of injected oocytes.
**Cleavage rates were calculated based on the number of fused embryos.
***Blastocyst development rates were calculated based on the number of fused
a- cValues with different superscripts in the same column are significantly different (P < 0.05).
<
실시예
3>
본 발명의 방법으로 제조된 소 복제수정란의 소
배반포
질 확인
본 발명의 방법을 사용한 CICT가 배반포의 질을 향상 시켰는지 여부를 조사하기 위해, 8일된 배반포의 총 세포 및 아폽토시스 세포의 수를 세었다.
그 결과, CICT 군에서 배반포 당 총 세포 수는 SCNT 군 (176.2 ± 6.5 vs. 119.3 ± 7.7) 보다 현저히 높았고(P <0.05), IVF 군(184.0 ± 8.7)과 유사함을 확인할 수 있었다(표 3 및 도 2 참조). 대조적으로 배반포 당 CICT 군의 세포 사멸 세포의 수는 SCNT 군보다 낮았다(3.5 ± 1.1 vs. 4.1 ± 0.8). 그러나 이러한 차이는 유의하지 않았다(표 3 참조).
| Group | No. of blastocysts | No. of total cells per blastocyst |
No. of apoptotic cells per blastocyst |
| IVF | 15 | 184.0 ± 8.7a | 4.4 ± 0.5a |
| SCNT | 15 | 119.3 ± 7.7b | 4.1 ± 0.8a |
| CICT | 15 | 176.2 ± 6.5a | 3.5 ± 1.1a |
a- cValues with different superscript in the same columns are significantly different (P < 0.05).
<
실시예
4>
본 발명의 방법으로 제조된 소 복제수정란의 미토콘드리아 활성 분석
본 발명자들은 MitoTracker® Green FM을 이용하여 세포질 이동이 미토콘드리아 형광 강도에 미치는 영향을 조사하였다.
그 결과, 미토콘드리아 염색의 형광 강도는 CICT 군에서 SCNT 군(22.3 ± 6.5 vs. 15.2 ± 3.8 arbitrary units) 보다 유의하게 높음을 알 수 있었다. 그러나 CICT와 IVF 군(22.3 ± 6.5 vs. 20.5 ± 7.7 arbitrary units) 사이에 유의한 차이는 없음을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
<
실시예
5>
본 발명의 방법으로 제조된 소 복제수정란의 RT-
qPCR
분석 결과
RT-qPCR은 DNA 메틸 전이 효소 1 (DNMT1), DNA 메틸 전이 효소 3a (DNMT3a), DNA 메틸 전이 효소 3b (DNMT3b)의 mRNA 발현 수준을 정량화하기 위해 수행하였다.
확인 결과, 상기 유전자의 발현 수준은 하우스 키핑 유전자(housekeeping gene) GAPDH의 수준으로 정상화되었다. 또한, DNMT1과 DNMT3a의 mRNA 정도는 CICT 군에서 SCNT 군보다 유의하게 낮음을 알 수 있었다. 그러나 CICT와 IVF 군간에 유의한 차이는 없었으며, DNMT3b의 mRNA 발현 정도는 CICT 군에서 SCNT 군보다 낮았다(도 4 참조). 그러나 세 군간에 유의한 차이는 없었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (7)
- (a) 복제하고자 하는 체세포를 가진 인간을 제외한 포유동물로부터 복제하고자 하는 체세포를 추출하는 단계;
(b) 체외성숙시킨 난모세포로부터 세포질의 20~40 부피%와 핵이 제거된 탈핵된 난모세포를 준비하는 단계;
(c) 공여자 난모세포로부터 20~40 부피%의 세포질을 추출하는 단계;
(d) 상기 복제하고자 하는 체세포를 가진 개체로부터 추출된 체세포와 공여자 난모세포로부터 추출한 세포질을 상기 (b) 단계의 탈핵된 난모세포에 주입하는 단계; 및
(e) 상기 체세포 및 세포질이 주입된 난모세포를 융합시키는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 재프로그래밍 효율을 향상시키는 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 체세포 및 세포질을 주입하는 단계는 조작 피펫(manipulation pipette)을 이용하여 상기 탈핵된 난모세포의 난황 주위공간에 체세포 및 세포질을 함께 주입하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 체세포 및 세포질이 주입된 난모세포를 센다이 바이러스(Sendai Virus, SV) 매개 방법을 통해 융합시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 삭제
- (a) 인간을 제외한 포유동물로부터 복제하고자 하는 체세포를 추출하는 단계;
(b) 체외성숙시킨 난모세포로부터 세포질의 20~40 부피%와 핵이 제거된 탈핵된 난모세포를 준비하는 단계;
(c) 공여자 난모세포로부터 20~40 부피%의 세포질을 추출하는 단계;
(d) 상기 인간을 제외한 포유동물로부터 추출된 체세포와 공여자 난모세포로부터 추출한 세포질을 상기 (b) 단계의 탈핵된 난모세포에 주입하는 단계;
(e) 상기 체세포 및 세포질이 주입된 난모세포를 융합시키는 단계; 및
(f) 상기 융합된 난모세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 체세포 복제 효율을 증가시키는 방법.
- 삭제
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| HUA, SONG 등, Animal Reproduction Science, 2011, 126권, 페이지 37-44* |
| WEN, DUANCHENG 등, ‘Histone variant H3.3 is an essential maternal factor for oocyte reprogramming’, PNAS, 2014.05.20, 111권, 20호, 페이지 7325-7330 |
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