TW200521235A - Cultivated recombinant cell, nuclear transferred embryo capable of developing into mammal, mammal foetus, method for cultivating mammal foetus, and recombinant cell - Google Patents
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- TW200521235A TW200521235A TW92137284A TW92137284A TW200521235A TW 200521235 A TW200521235 A TW 200521235A TW 92137284 A TW92137284 A TW 92137284A TW 92137284 A TW92137284 A TW 92137284A TW 200521235 A TW200521235 A TW 200521235A
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200521235 玖、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 礼動物的核轉置胚之 、培育哺乳動物的方 本發明相關於一種具有發展成哺 培育方法、培育哺乳動物胎兒的方法 法以及培育哺乳動物重組細胞的方法 【先前技術】 WUmut 等人,1997; Schnieke 等人,1997;以⑽“等人 1999; Wells #人,1999)。此等不正常現象係可能因複製 胚於發育過程中無法將置入之供核細胞充分再程序所造成 利用體細胞核轉置技冑進行各種複製動物之產製雖已 被成功建立,惟其產製效率迄今仍低,且常發生複製胚於 早期死亡、高流產率、新生複製仔畜出生前後高死亡率、 或器官發育不全以及巨嬰症等現象(Campbell等人Μ% (Kang 等人,2001 ; Xue 等人,2002) 〇 哺乳動物基因之再程序化現象一般咸認與基因銘印作 用(gene imprinting)有密切關係。體基因組中之基因表現模 式為組織專一性表現(tissue_Specific expression)和特定發 月期別專一性表現(devei〇pmental stage-specific expression)者通常屬於銘印基因(Barl〇w,1995)。 哺乳動物為能將基因銘印現象忠實傳遞至後代,染色 體中原已甲基化之銘印基因將在配子生成過程 (gametogenesis)中發育至始基生殖細胞(primordial germ cells ’ PGC)階段時,其甲基化現象將大部分被去除 200521235 (erasure)(Monk 等人,1987; Labosky 等人,1994),待配子 發育至成熟階段時,雌雄配子中所應被銘印之基因將再行 確立(reestablishment)其正確之甲基化模式;因此,成熟之 卵母細胞與精子,其染色體均已相對被高度甲基化,惟印 母細胞中被甲基化之基因僅屬雌源性之銘印基因,而精子 者則僅有雄源性銘印基因被甲基化;意即所有成熟卵母細 胞之雌源性銘印基因均被甲基化;所有成熟精子之雄源性 銘印基因均被甲基化(FaUs等人,1999 ; Davis等人,2〇〇〇) 田精印受精後’其基因組DNA又將經歷一次全面性的 去甲基化作用(genome_wide demethylarti〇n),並持續至囊 胚期(Monk 等人,1987 ; Howlett 和 Reik,1991 ; Kafd 等人 ,1992);其後將再次重新建立其甲基化作用(心⑽μ methylation) ’並隨胚胎發育之進展逐漸完成其基因銘印模 式(H〇well等人,1998; Hsieh2〇〇〇),而維持迄成年。、 ,卜自從WiImut等人(1997)成功產製世界第—頭體細胞複 製平後,即興起體細胞複製科技之熱潮,惟迄今複製動物 之產製效率仍低’而造成此等低效率之原因,現正逐漸被 證明與供核細胞無法如正常胚者具有健全之基因再程序化 作用有關;且此種不正常之現象更遍及早期之複製胚 (Kang等人,2001)和出生之複製仔畜中(Xue等人,2〇〇2)。 =因之再程序化作用實與基因之甲基化作用息息相關。 泣’如何能在產製核轉置胚過程即調整其如正常胚 甲基化程度’進而促使其具有較健全之基因再又 乍用,將是提高現今低複製動物產製效率之重要策 200521235 【發明内容】 本發明在產製核轉置牛胚過程中,先進行細胞融合及 激活處理生產含4倍體之核轉置胚後,再進行去核操作, 以修正其染色體套數為正常< 2倍體’並發現受核卵母細 胞核之短暫存在有助於供核細胞之去甲基化作用。 哺乳動物在發育過程中,將引發兩次體基因組之全面 性去甲基化作用,其第一次乃發生於配子生成過程中之始 基生殖細胞階段,其目的乃為使基因銘印現象忠實傳遞至 後代;第二次則發生在雌雄配子受精後,以促使受精卵恢 復其發育全能性(Monk等人,1987 ; Labosky等人,1994)。 引發受精卵體基因組全面性去甲基化現象之原因,在早期 被認為係導因於胚分裂後無維持甲基化作用之因子存在, 遂伴隨胚細胞之分裂,其染色體進行複製次數之增加而逐 漸降低其甲基化程度(H〇wlett和Reik,1991);惟最近之研 究則顯不,DNA去甲基酶(demethylase)亦是造成此現象之 另一關鍵因子,並發現其主要功能乃在啟動去曱基化作用 之發生(Cervoni等人,1999)。新近之研究,更發現受精卵 内雖雄原核基因去甲基化作用之發生時機並不一致,其中 雄原核之體組基因於受精數小時後即快速被去甲基化,而 此時之雌原核則仍維持其高度甲基化之現象,並隨細胞分 裂之進展而逐漸下降;此結果說明,雄原核之去甲基化作 用係經由存在於卵母細胞内之去甲基化因子的主動作用所 200521235 引發’而雌原核者,則隨細胞分裂之DNA複製作用而以 被動方式逐漸完成其去甲基化作用(Haaf,2001)。 在本發明之一較佳具體事實中,本發明提供一種具有 發展成哺乳動物的核轉置胚之培育方法,包括: (a) 提供哺乳動物之卵母細胞; (b) 提供哺乳動物之供核細胞; (0將供核細胞或其細胞核置入卵母細胞中,· 轉 (d)將供核細胞與卵母細胞進行融合而產生四倍體核 Ο)將核轉置胚進行激活處理; ⑴去除印母細胞核;和 (g)培養去除卵母細胞核之核轉置胚 5亥哺乳動物為家 較佳地,本發明所述之培育方法中 畜 平又Ί王: 較佳地,本發明所述之纟立育 两干。 細胞係經由體外培養後選取具第一極體者。 卯 較佳地,本發明所述之立立吉 〇月方法中,該(b)步驟之也 細胞為體細胞。 之仏 較佳地,本發明所述之谇吉 源基因。 。月方法中’該體細胞含有 方法中,該(b)步驟之供核 較佳地,本發明所述之培育 細胞進一步進行叙餓培養。 較佳地,本發明所述之典古 月方法中,該⑻步驟之供核 200521235 細胞不進行飢餓培養。 於(c)步顿之供核 於(C)步驟之供核 4 (d)步驟之印母 該(d)步驟係利用 較佳地,本發明所述之培育方法中 細胞係置入卵母細胞之卵黃膜間味 較佳地,本發明所述之培育方法中 細胞係直接注入卵母細胞之細胞質内。 較佳地,本發明所述之培育方法中 細胞係未經去核者。 較佳地,本發明所述之培育方法中 電融合方式。 車乂佳地’本發明所述之培育方法中,該⑷步驟激活處 理係將融合的細胞培養於含有鈣離子載體(caicium ionophore)和6-DMAP之激活液中。 另一方面,在本發明之另一較佳具體事實中,本發明 提供一種培育哺乳動物胎兒的方法,包括·· (a) k供哺乳動物之印母細胞; (b) 提供哺乳動物之供核細胞; (c) 將供核細胞或其細胞核置入卵母細胞中; (d) 將供核細胞與卵母細胞進行融合而產生四倍體核轉 置胚; (e) 將核轉置胚進行激活處理; (f) 去除卵母細胞核; (g) 培養去除卵母細胞核之核轉置胚;和 (h) 將核轉置胚移置入母的受胚哺乳動物生殖道中而形 成胎兒。 200521235 較佳地,本發明所述之 该哺乳動物為家畜。 該家畜為牛。 該〇)步驟之卵母細胞 0 該(b)步驟之供核細胞 万决中, 較佳地,本發明所述 、万法中, 較佳地,本發明所述之 j法中, 係經由體外培養後選取且楚 ’ 系—極體者 較佳地,本發明所述之 < <万决中, 為體細胞。 較佳地,本發明所述之方、 因 去中,該體細胞含有外源基 較佳地,本發明所述之方去 進一步進行飢餓培養。 中’该(b)步驟之供核細胞 較佳地,本發明所述之 方法中,%,u、 不進行飢餓培養。 邊(b)步驟之供核細胞 較佳地,本發明所述之方去 係置入卵母細胞之卵黃膜間隙中於(c)步驟之供核細胞 較佳地,本發明所述之方去 係直接注入卵母細胞之細胞質内中,於(C)步驟之供核細胞 較佳地,本發明所述之方、去 係未經去核者。 中,5亥(d)步驟之卵母細胞 較佳地,本發明所述之方去 合方式。 ’中’該(d)步驟係利用電融 較佳地,本發明所述之方、去 將融合的細胞培養於含有鈣離中,该(e)步驟激活處理係 中。 栽體和LDMAP之激活液 另一方面 在本發明之另— 31佳具體事實中,本發明 200521235 提供一種培育哺乳動物的方法,包括: (a) 提供哺乳動物之卵母細胞; (b) 提供哺乳動物之供核細胞; (0將供核細胞或其細胞核置入卵母細胞中; (d)將供核細胞與卵母細胞進行融合而產生四倍體核轉 置胚; (e) 將核轉置胚進行激活處理; (f) 去除卵母細胞核; (g)培養去除卵母細胞核之核轉置胚;和
(h)將核轉置胚移置入母的 成胎兒,並經過所有胎兒成長 物0 受胚哺乳動物生殖道中而形 及分化期間而生育出哺乳動 較佳地,本發明所述之 較佳地,本發明所述1,該哺乳動物為家畜 較佳地,本發明所述之方:中:該家畜為牛。 係經由體外培養後選取罝 中,5亥(a)步驟之卵母細 ,、弟一極體者。
較佳地,本發明所述之方 為體細胞。 /中’該(b)步驟之供核細 較佳地,本發明所述之方、 因。 去中,該體細胞含有外源基 較佳地,本發明所述 4之方法中 二 進一步進行飢餓培養。 ’该(b)步驟之供核細胞 較佳地,本發明所诚 不進行飢餓培養。 ’该(b)步驟之供核細胞 11 200521235 於(C)步驟之供核細胞 於(C)步驟之供核細胞 該(d)步驟之卵母細胞 該(d)步驟係利用電融 較佳地,本發明所述之方法中 係置入卵母細胞之卵黃膜間隙。 較佳地’本發明所述之方法中 係直接注入卵母細胞之細胞質内。 較佳地,本發明所述之方法中 係未經去核者。 較佳地,本發明所述之方法中 合方式。
較佳地,本發明所述之大 + _ , x w 一 <方法中,該(e)步驟激活處理係 έ有辦離子載體和6_DMAP之激活液 將融合的細胞培養於 中0 Φ ’在本發明之另一較佳具體事實中,本發明 提供-種培育不含人之哺乳動物重組細胞之方法,包括: (a) 提供哺乳動物之卵母細胞; (b) 提供哺乳動物之供核細胞; (0將供核細胞或其細胞核置入印母細胞中; (d) 將供核細胞與卵母細胞進行融合; (e) 將融合細胞進行激活處理;和 (f) 去除卵母細胞核。 較佳地,本發明所述之方法中,該哺乳動物為家畜。 較佳地,本發明所述之方法中,該家畜為牛。 較佳地,本發明所述之方法中,該⑷步驟之_母細胞 係經由體外培養後選取具第—極體者。 較佳地,本發明所述之方法中,該(b)步驟之供核細胞 12 200521235 為體細胞。 該體細胞含有外源基 該(b)步驟之供核細胞 該(b)步驟之供核細胞 於(c)步驟之供核細胞 於(c)步驟之供核細胞 该(d)步驟之印母細胞
該(d)步驟係利用電融 較佳地,本發明所述之 、万法中 因。 較佳地,本發明所述之 進一步進行飢餓培養。 較佳地,本發明所述之方法中 不進行飢餓培養。 較佳地,本發明所述之方法中 係置入卵母細胞之卵黃膜間隙。 較佳地,本發明所述之方法中 係直接注入卵母細胞之細胞質内。 較佳地,本發明所述之方法中 係未經去核者。 較佳地,本發明所述之方法中 合方式。 不呶明所述之方法中, 融 將 中
、 该(e)步驟激活處理 合的細胞培養於含有鈣離子載 戟體和6-DMAP之激活 另-方面,在本發明之另一較佳具體事實中 :供-種喷乳動物重組細胞’其係如上所述之方法培二 目前世界上常用之複製胚產製方法,皆利用先進行 核操作’再依序進行體細胞核注入、細胞融合及激活〜 之先去核再激活(enucleation before activati〇n,eba)的 ς 么 13 200521235 核轉置流程;而本發Μ ^月則將傳統之核轉置流程修正為先進 行體細胞核注入操作, ’、 再依序進行細胞融合、激活處理及 去核操作之先激活再去核(enucleati〇n — —η, Μ核轉置流程。並且由實施例之結果顯示,利用 ΕΑΑ方式所產製核轉置胚於體外發育至各胚期之百分比均 ”巾利用ΕΒΑ方式所產製者相近,此結果說明利用 ΕΑΑ方式產製核轉置胚至少不傷及其於體外之發育能力。 卜和用ΕΒΑ核轉置操作流程所產製之2〇個核轉置 囊胚’於移置人11頭受胚牛後,有2頭懷孕,統計時之 懷孕天數已分別為8.5及7·5月齡;而利用εαα核轉置操 作流程所產製之2個核轉置囊胚,於移置X 1頭受胚牛後
,統計時亦已證實懷孕,且懷孕天數目前A 7月齡。當進 :步:較兩種核轉置囊胚,其微衛星…祕㈣隱特 疋片奴之甲基化程度時則顯示,利用EAA流程所產製核轉 置囊胚之甲基化百分比明顯低於利用Εβ A流程所生產之核
轉置囊者(44.42% w 64.660/^(0.()(^。綜合以上所述結 果說明,卵母細胞核短暫存在於核轉置胚内,即足以誘發 去甲基化因子之作用,並進而促使供核細胞體基因組之去 =基化作用,而達成降低甲基化之效果,故利用EAA所產 製之核轉置囊胚,具有明顯降低核轉置胚甲基化程度之能 力。 另外馨於4倍體核轉置胚無法產製複製動物之事實, 為能突破此一瓶頸,於本發明將先利用未去核之卵母細胞 為受核源進行細胞融合以產製含4倍體之核轉置胚,使供 14 200521235 核細胞能短暫與印母細胞核並存於胚内,並在完成激活處 理後再進行去核操作,以修正其染色體套數為正常之2倍 不上所述’利用EAA方式所生產核轉置胚之體外發育 能力與利用EBA方式所生產者相近,惟利用eaa方式所 生產之核轉置囊胚具較低之基因甲基化程度,且胚移置後 已獲致懷孕之事實,故為一產製複製動物時之一個更佳的 方法’另外本發明所使用之供核細胞可為導入有外源基因 的細胞,其所導人之外源基因可以是經過轉錄以及轉譯丨· 凝血因子或其他具有功能性之蛋白質的基因,藉由導入外 源基因而增進所複製出動物的附加價值,亦可將導入的外 源基因適當調控其專一性表現於分泌的乳汁中,增加複 動物的乳汁利用性。 本發明所新創之核轉置方法除可應用於複製動物之產 製外,亦可為我國動物基因轉殖研發建立更為完善之技術 平台,且有助於經由基因轉殖動物所生產之基因產物商品 更具國際市場競爭力。 _ 本發明中所使用之名詞『核轉置胚』意指將供核細胞 轉置入印母細胞後所得物。 本發明中所使用之名詞『飢餓培養』意指將細胞培養 於僅含有極低含量胎牛血清之培養液中培養。 【實施方式】 本發明中所引述之文獻均以參考資料的方式併入本案 15 200521235 本發明其他的特徵及優 事實及申請專利範圍。 實例 點將可明顯見於下列較佳具體 下列實施例用於示範說明本二 打士 立、 ^ ^月。廷些實施例不以倍 0方式思欲限制本發明之範圍 明的㈣何實施本發
31知例1 ··卵篆·^^母細胞之敌得 1 · 1 ·材料 本實施例所使用之即巢,係採自署宰場所屠宰之淘汰 荷蘭乳牛及台灣黃牛;其㈣時之生ilf景不明。 1·2·步驟 牛隻於屠宰後,即儘速取出其卵巢,並以約%艺左 右含(Mmg/ml 青黴素 / 鏈黴素(Gibc〇, 1514〇_122)之 〇 9 % 生理鹽水攜回實驗室。取回之卵巢先以上述生理鹽水洗淨 後,再喷灑70 %之酒精,並重複三次以達充分之淨菌。 其後再置於直徑10 cm之乾淨培養皿中,並以接有18號 針頭之1 ml注射筒,經由負壓逐一吸取卵巢表面直徑約2 〜8 mm各濾泡之内容物,包括卵丘_卵母細胞複合體 (〇ocyte-Cumulus compiex,coc)及其滤泡液。抽取獲得之 遽泡内容物,經置於低倍(20〜30 X)之立體解剖顯微鏡下, 以適當口徑之玻璃吸管(pasteur pipette),將懸浮於濾泡液 内之COCs全數吸出,並選取卵丘細胞包被完整且印母細 胞品質較佳者,經回溫(37。〇之成熟培養液清洗3〜5次後 16 200521235 ,備供體外成熟培養之用。 實施例2:卵母細胞之體外成熟培卷 2.1.體外成熟培養液之配製 供牛卵母細胞體外成熟培養之培養液,係以9 · 5 m 1之 基礎培養液 Medium-199(Gibco,12340-030),添加 〇.5 mi 之胎牛血清(fetal bovine serum,FBS ; Giboco, 10270-106) 及 1 μΐ 含 5 mg/ml 健他黴素(gentamycin)之溶液(Sigma 1397)配製而成,並經濾菌分裝後冷藏備用。 2·2·體外成熟培養 依據李等人(1997)之牛卵體外成熟培養步驟,於進行 培養前,事先於35 mm之培養m中製作4滴均含W之 坨養液滴,並覆蓋礦物油(mineral 〇il ;叫咖,, 再,於38.5。(:含2% C〇2、98%空氣及飽和濕度條件之培 養相中’進行至少4 h之平衡。其後,再將實施例1所收 集具良好品質之荷蘭牛與台灣黃牛之CQCS,以1()〜2〇個 =等之數量平均移入上述備妥之體外成熟培養 於相同培養環境下,進行18_19h體外成孰 胞經體外成孰播,、π坨養。卵母細 “、、&取具第一極體者,除供作核轉置之受 核源使用外,廿担 又 、’棱仏作為體外胚生產所需之卵源使用。 200521235 (1) BO基礎液 BO液之配製,係依據Brackett和Oliphant (1975)所 述,將 6.55 g NaCn、0·3 g KCn、0·115 g NaH2P04H20、 0.106 g MgCl2· 6H20 和 0.331 g CaCl2· 2H20 溶解於已滅 菌之去離子水中,並定量至100 m卜以配製成BO基礎液 ,該液經濾菌及分裝後冷凍(-20°C)備用。 (2) BO操作液 0.3104 g NaHC03 和 0.0138 g 丙酮酸鈉(Na-Pyruvate) ,先溶解於70 ml之BO基礎液後,再以已滅菌之去離子 水定量至100 ml,並調控酸鹼值於pH=7.6〜7.8,而配製成 BO操作液。該液經濾菌及分裝後冷藏(4°C )備用。 (3) 精液洗滌液 將 0.3604 g 之茶鹼(theophylline)(Sigma,T-1 633)溶於 2〇0 ml之BO液,配製成含10 mM茶鹼之精液洗滌液。 經濾菌後冷藏(4°C )備用。 (4) 精子獲能液 將0·05 g之肝素(Sigma,H-3149)溶於1〇 ml已滅菌 之去離子水中,配製成含5 mg/ml肝素之基礎液。經濾菌 及分裝後冷涞(-20°C)備用。取前述之1〇〇 μΐ基礎液及〇.5 g 牛血清白蛋白(bovine serum albumin, Fraction V ; BSA)(Sigma,A-6793)溶於 50 ml BO 液,配製成含 ι〇 18 200521235 叫/ml肝素及10 mg/ml BSA之精子獲能液。其後,經濾菌 及分裝後冷凍(-20°C)備用。 3.2·精子獲能作用之步驟 精子之獲月b作用,乃根據parrish等人(1986)所述 之方法誘發之。將荷蘭種公牛之冷凍精液,自液態氮内移 出後’直接置於37 C溫水30秒解凍。其後,取1 ml 之精液(兩管冷凍精液)與10ml之精液洗滌液充分混合, 以800 G離心5 min,經移除上清液後,再重覆上述步驟 乙次。精液經2次清洗後,將所留存之丨ml精液加入i ml之精子獲能液(精液濃度約為i χ 1〇7/ml)。在充分混合 後,即吸取0.5 ml之精液,置於一直徑35 mm之培養皿 内,並上覆輕級礦物油,以製成精子懸浮小滴,其後再置 入恆溫培養箱中平衡丨5 min,進行獲能作用,以供體外受 精之用。 3·3·體外受精之步驟 鲁 由貫施例2所收集之牛卵母細胞經24 h之體外成熟培 養後,先利用適當口徑之玻璃吸管,以機械式連續吸吐方 式约略移除其外圍包被之卵丘細胞,再將之置入已獲能作 用之精液小滴内,並移入恆溫培養箱卡進行體外受精。卵 母細胞經8 h之體外受精後,利用微玻管吸取至成熟培養 液中’以機械式連續吸吐移除包被外圍之精子,並經成熟 培養液清洗3次後,再將該卵母細胞置回原已培育形成單 19 200521235 層卵丘細胞之成熟培養液中 進行共培養(李等人,1997) 實施例4 ··供核細胞之製備 4.1.牛耳朵、細胞之初代培養與冷滚保存 成年荷蘭母牛耳朵細胞株之建 姑,, 思立方法,係參照Kubota 4人(1998)之方法進行,即先於 ^ n , 狄休杲之成年荷蘭母牛的 耳朵邊緣部位進行剃毛及洗淨工作 #作,mG%之酒精予以 消毋’其後’利用滅菌之耳刻剪白
寸J ^自5亥部位剪取數片約0.5 X 1 cm2之耳朵組織,並置入含〇 1八各〇*lmg/ml青黴素/鏈黴素之 〇·9% 生理鹽水攜回實驗宮。:# I >伽W I殮至。攜回之耳朵組織,先利用 上述之生理鹽水洗滌3次後,再罟Λ 7Λ0/ > , • 人说丹罝入70%之酒精中靜置5 min進行更徹底之消毒,其後 ,、说以相冋之生理鹽水洗滌3 次後’置於1·5 ml之離心管中,利用滅菌之剪刀將該組織 細剪成約3 mm3之小塊,再移至6 cm之培養皿中,以含 1〇 % fcs DMEM (Gibco, 1 1965_〇92)之細胞培養液於 37。〇 含5% C〇2及飽和濕度條件之培養箱中進行1〇〜i4天之初 代培養(primary culture)。其後,移除上層培養液並旋即加 入3 ml含〇·25%騰蛋白酶(trypsin)溶液使細胞團塊懸浮, 並立即加入6 ml之培養液以終止胰蛋白酶之作用,回收之 懸洋液經250 G之離心力於室溫下離心5 min,及去除上 清液後,先加入1 ml之細胞培養液打散懸浮,再將全數懸 浮液移入1 〇 cm之培養皿中,並加入9 mi之培養液充分 混勻後,於37 °C含5 % C〇2、95 %空氣及飽和溼度條件 20 200521235 下進行培養。細胞於培養期間,每週均更換2〜3次新鮮培 養液,俟該細胞長滿後(約有2 χ丨〇7個細胞),重複上述之 細胞懸浮、離心方法和培養流程,進行第二次之細胞繼代 ,以擴增耳朵細胞族群。該細胞經2次繼代後,循前述方 法將每一培養皿中之細胞離心收集,並加入4 ^含1〇 % DMSO (chmethylsulfoxide ; sigma,D_5879)及 9〇 % 胎牛血 清之冷凍保護液予以充分混勻,使細胞濃度調整為約5 X 101 2 3 cells /ml。其後,將之分裝至冷凍小管中(1加/管),並 依序置於_20。(:冰箱4 h、_80°C冰箱16〜18 h,令其溫 度緩慢降溫後,旋即置入液態氮㈠96。〇内長期保存。若 此等細胞擬於解凍培養後即直接供為核轉置之供核細胞使 用時,則於細胞冷凍前將其細胞濃度調整為約5 xi〇s cells /ml後,再分裝成小管(〇1 ml/管)進行冷凍保存。 21 1 · 2.供核細胞之叙餓培養 2 供核細胞之血清飢餓處理係修正自WUmut等人 (1997)之步驟。將前述凍存於液態氮之小管細胞取出,並 迅速以37 t水浴回溫解凍後,旋即加入3 ml含1〇 % FCS DMEM之培養液充分混勻;其後,先置入35 mm培養 孤中培養4 h,再更換新鮮培養液,俟該細胞長滿後,懸 浮其細胞並予以平均移入4孔之細胞培養皿中培養。待該 細胞增生至約8成滿時,將原細胞培養液,更換成含〇 $ 3 % FCS DMEM之培養液,進行細胞之血清飢餓處理5〜8 天。核轉置前將細胞懸浮含0.5 % FCS DMEM之培養液中 200521235 ,-部分靜置作為供核細胞使用;另一部分則計數以、約 - 1000個細胞為單位,分別置入0·5 ml之離心管中。其後, 經離心及去除上清液後,分別加入2μ1之mpBS溶液直接 置入液態氮中急速冷凍,並立即置於_80〇c冰箱中凍存備供 DNA甲基化分析之用。 實施例5:核轉置胚^產製 5 · 1 ·牛卵母細胞之去核操作 (1) Hoechst 33342螢光染劑之配製 _
Hoechst 33342螢光染色液之配製,係主要參考 M〇hamed等人(1999)之所述而略予修飾,即將1〇叫 Hoechst 33342 (Sigma,b_2261 )螢光染劑溶於 1〇 mi 之滅 菌水中,配製成含lmg/ml H〇echst 33342濃度之螢光儲備 液(stock solution),經分裝後保存於·2(^中備用;在使用 前則吸取2μ1之該螢光儲備溶液與198μ1含5%?以之厘·
199培養液充分混合稀釋成濃度為1〇叫/⑹之H〇echst 33342操作液。 W (2)去核操作及去核成功之判定 Α·先進行去核操作再實施激活處理之傳統核轉置流 程 進行去核彳呆作再貫施激活處理(enucleation before activation,EBA)之轉置流程,係參照Kub〇ta等人(1998 )所述。其詳細步驟乃將業經體外成熟培養之C〇Cs,先 22 200521235 移除其外所包覆之印丘細胞,再將具PBI之印母細胞置於 顯楗刼作腔中,以銳利之去核針將鄰近pBI端之透明帶劃 破’透明帶切口大小約同於PBI之直徑。其後,再將該針 置於卵母細胞上端並由上往下擠壓使其pBl及與之相鄰之 礼細胞質擠出透明帶外而完成。完成去核操作之印母細 胞連同被擠出之卵細胞質及PBI先個別置入已編號之5% Μ 1 99培養小滴中;再將被擠出之卵細胞質及pm移 入另一與其來源去核卵相同編號含1〇 μ§/πι1 H〇echst
^培養液滴中進行螢㈣色2G min。並以波長⑷之 备、外光才欢/則去才亥成功帛,若被擠出 < 印細月包質内呈現藍色 螢光,則表示其相對應去核印之染色體已被去除;而經確 認已去核H細胞始供核轉置之受核細胞使用。 B·完成激活處理再進行去核操作之新創核轉置流程 完成激活處理再進行去核操作之核轉置流程 nuceation after activati〇n,EAA),其詳細步驟則是將未
經去核之㈣細胞先置人供核細胞,並隨即進行細胞融合 ’以先產製含4倍體之核轉置胚。其後,此種纟4套染色 體之核轉置胚在經歷激活處理後,始進行去核操作,使其 木色體套數恢復至正常< 2倍體。去核成功與否之判定則 同傳、洗核轉置流程者。若被擠出之細胞質内僅呈現1個藍 色螢光點,則表示其相對應核轉置胚中源自即母細胞之染 色體已被去除。 5.2.體細胞置入卵黃臈間隙之顯微操作 將已去核或未去核之受核卵母細胞及供核之體細胞 23 200521235 分別置於不同之、、t盖 〆射小滴後’先移動顯微鏡視野至置放供 核細胞之〉主射月允皆免 内,並以置核吸管吸取適當數量(每次約 10個)之ί、核、細胞,再移動顯微鏡視野至置放受核印母細 于J滴内進行體細胞之置入操作。其步驟乃首先以 胚m定受核㈣細胞,再操縱已吸取供核細胞之置 核吸& ’沿著先前去核操作穿剌透明帶所留下之裂縫進入 即頁膜間隙,並於詈姑蛋 ύ ^ I %罝敌早一供核細胞後,移出置核吸管而 兀成核轉置操作。惟在未去核卵母細胞組,其供核細胞則 置放在與ΡΒΙ端(3點鍾方向)呈9〇度之位置(6或12點鍾 方向),以避免去核操作時,連同將供核細胞去除。 實施例6:核韓f胚之電融合摇作 6·1·電融合液之製備 A· CaCl2儲備液之配製 將0.01 lg之CaCl2溶於10 ml之滅菌去離子水中而成 濃度10 mM之CaCl2之儲備液,經濾菌分裝後冷藏(4t:)備 用。 B· Mg Cl2儲備液之配製 將0.023g之MgC12. 6H20溶於10 ml之滅菌去離子水 中而成濃度10 mM MgS04之儲備液,經濾菌分裝後冷藏 (4 C )備用。 C.電融合液之配製 取 2.915g 之甘露醇(mannitol ; Sigma,M-9546)加入 4〇 ml之滅菌去離子水中先充分溶解’再加入500 μΐ CaCl2 24 200521235 、500 μΐ MgS04之儲備液及0·5 mg BSA,經充分溶解後 ’並以滅菌之去離子水定量至5〇 ml,而成濃度0.32 Μ甘 露醇+ 100 μΜ CaC12+l〇〇 μΜ MgS04 + 0.01 mg/ml BSA 之電 融合液’其後經濾菌分裝後冷藏(4。〇),使用前回溫至室溫 (25〜30°C),備供核轉置胚之電融合及電激活之用。此外, 另混合不同比率之胚培養液與電融合液製備成4滴分別含 25%、50%、75%及1〇〇%電融合液之8〇μ1小滴於μ mm培 養皿中,並於覆蓋輕級礦物油後,置入胚培養箱中平衡至 少4 h,備供電融合及電激活前平衡核轉置胚之用。 6·2·電融合操作 電融合供核與受核細胞之操作步驟和所採用之電融合 參數組合,係修正自Kubota等人(1998 )之方法,即在電 融合處理前,將核轉置胚先移入含25%電融合液之小滴中 ,再逐步移入含50。/。、75°/❹及1〇〇%電融合液之小滴中,每 小滴之浸置時間& 2 min,卩漸進調整核轉置胚之渗透壓 。電融合操作係將1·5 ml之電融合液置於1〇〇 mm胚培養 皿内形成電激融合槽,並以兩支已滅菌之不鏽鋼微針調整 核轉置胚之方向,使供核細胞與受核卵母細胞接觸之界面 與電融合微針末端之平整切面平行(令電場方向垂直通過供 、受核兩細胞之接觸界面)。其後,啟動電融合操作器( ECM 2001 ; BTX Inc·,San 一〇,職),應用
電場強度、15_c電激持續時間及i次方形直流電 參數組合進行電融合。完成電融合步驟之核轉置胚,旋即 移入含50%電融合液之小滴中使其恢復渗透壓,2⑽後 25 200521235 再移入胚培養液中並置於恆溫培養箱中培養,30 min後將 該胚置於倒立顯微鏡上記錄胚之融合率,融合之核轉置胚 旋即置回恆溫培養箱中培養備供後續激活處理之用。 實施例7:核轉置胚之^ 7.1.激活液之配製 7·1·1·妈離子載體(calcium i〇nophore)A23 187 激活液 之配製 將1 mg之鈣離子載體(Sigma,c-7522)溶於1.91 mi 之DMSO中而配製成含1 mM之儲備液,其後,經分裝後 冷凍(-20°C)備用。於激活處理前將冷凍之A23187儲備液 於常溫解凍後,取5μ1之儲備液加入995μ1之胚培養液中 充分混勻而配製成含5μΜ之操作液,備供激活處理時使 用。 7·1·2· 6-二甲基胺嘌呤(6-dimethylaminopurine 6- DMAP)激活液之配製 將 100 mg 之 6-DMAP(Sigma,D-2629)先加入 3 〇64 ml 之TCM-199培養液中,再置入56°C之水浴槽中,使6_ DMAP微顆粒完全溶解,而配製成含200 之儲備液, 其後,經分裝後冷凍(-2〇。〇備用。於激活處理前將冷;東之 6-DMAP儲備液於常溫解凍後,取1〇 μΐ之儲備液加入 990μ1之胚培養液中充分混勻而配製成含2 mM之6_ DMAP操作液,其後,以每滴50μ1之體積置4滴 /同万;3 5 mm 培養皿中,並於覆蓋輕級礦物油後,置入胚培養箱中平衡 26 200521235 至乂 4 h備供核轉置胚激活處理之使用。 7 ·2 ·激活處理步驟 核轉置胚之激活處理,係修正自Liu等人( 1998 )之 步驟’將上述經EBA和EAA核轉置流程所產製之已融合 核轉置胚先置回胚培養箱培養4 h後,再分別移入含5 μΜ Α23 1 87激活溶液中5 min,然後再移入含2 6-DMAP 之激活液中培養4 h而完成激活處理步驟。
寬·^受精胚及核棘晉脒之體外培養 8 · 1 ·體外培養液滴之製備 含單層卵丘細胞之牛胚體外培養液滴之製備方法係依 據李等人(1997)所述,即將前i經18〜19 h體外成熟培養 之COCs,在執行移除印丘細胞過程所遺留於原體外成熟 培養液滴内之彡卩丘細胞,經持續培養使細胞增生並佈滿培 養液滴形成單層之卵丘細胞而製備完成。 。 8·2·胚之體外培養
—體外受精胚及實施例7完成激活處理之核轉置庇" 經3次胚培養液之清洗後,再分別置入已備 7 丘細胞之培養液滴中,並移人恆溫培養箱中進料=^ 於開始培養後每隔24 h記錄核轉置胚之發育严。。 天更換50%之新鮮胚培養液迄開始培養之^月形,且母兩 受精胚及核轉置胚於體外發育至囊肢期後 寺體外 置囊胚予以進行胚移置(於下說明);另一邛八一部分之核轉 為單位,先經mPBS沖洗3次後,再分P刀則以4〜5個 別置入〇.5ml之離 27 200521235 吕中直接置入液悲氮中急速冷凍,並立即置於· 8 〇。〇冰 箱中,存備供DNA甲基化分析之用。分析前則將冷床之 體卜又。精囊胚及核轉置囊胚自_8〇c>c冰箱中取出,並隨即置 〇 37 C水中解凍,其後再依序置入液態氮及37它水中進 行7東解來步驟,使胚透明帶破裂,以利體基因組厕八 之回收。 核轉置胚之胚銘罟 將兩種核轉置流程所產製之核轉置囊胚,應用非外科 手術法移置入與移置胚生理週期同期化(穩定發情後之第7 日)之受料牛生料巾。其過料在進行㈣置前,先利 用直腸觸珍檢查受胚母半早 母牛子呂%境及黃體發育情形,以擇 付適备之受胚牛進行胚移置。適當受胚牛之條件,係指經 …工—子呂時,可感覺子宮中度收縮、無異常内容 物(如子宮積膿或藉a楚、 谷 狀$積水4)、具彈性,且彡卩巢表面具明顯 犬起之頁體組織者,判宏或一 乂 ”、 ' 為一、,及;若該黃體組織適中突被 者’將判定為二級;卷網4人主 田觸以時發現子宮無彈性且收縮里常 者,或卵巢表面僅且滁 "书 腔者,則判定為級::起之黃體組織者,或具黃體囊 與二級之母牛’供為受胚牛使用。備妥受胚牛後=: 所欲移置之核轉置胚移入含2。 =將 :::置於直徑“…麥管内,再置:::::: 之二角將::入益自受胚牛子宮頸進入具發育黃體同側 庄入器進入達子宮角末端之f曲部位時, 28 200521235 完成胚移置步驟 將胚注入’並於胚注入器移出生殖道後 核韓置胚之體外和體内發言能六 10.1.步驟 經體外成熟培養18〜19 h之牛印母細胞,去除包覆A 外之印丘細胞後’逢機分為2組。其中一組之印母細胞利 用EBA之核轉置操作流程生產對照組之核轉置胚;另一植 之卵母細胞,則利用EAA之核轉置操作流程生產處理组之 核轉置胚。此兩種利用不同去核時機所產製之核轉置胚於 產製後,均置入先前已備妥含單層卵丘細胞之胚培養液滴 中’於38.5 C、2% C〇2及飽和濕度條件之培養箱中進行 8天之體外共培養。於開始培養後每24 h紀錄兩組合轉置 胚之發育情形’用以評估兩組核轉置胚之體外發育能力。 待各兩組核轉置胚於體外培養發育至囊胚期日寺,利 科移胚法’分別注入生理週期同期化之受胚母牛 並於胚移i 53天後以直腸觸診判定受胚牛之懷孕情形,’ 用以評估各處理組核轉置胚之體内發育能力。 ^ 10·2·結果 能 本試驗所探討核轉置操作流程對核轉置胚體 力影響之結果示於表丨。 卷用 影響 表·核轉置操作流程對核轉置牛胚體外發育能力 之 29 200521235 核轉 置方法* 核轉 置胚培養 數目 .........核轉置胚發展情況及數目 2-cell 16-cell CM B EBA 82 76(92.7) 48(58.5) 41(50.0) 38(46.3) EAA 85 75(88.2) 49(57.6) 41(48.2) 38(44.7) * EBA(Enucleation before activation):先去核再激活; EAA(Enucleation after activation):先激活再去核。 ★ CM(C〇mpactedm〇lua)··桑椹期;B(Blast〇cyst):囊胚 期0 結果顯示,利用EBA和EAA所產製核轉置胚於體外 發育至各胚期之百分比均極為接近(2_細胞期·· 92.7 ^ 88·2 % ; 16'細胞期:58·5 57·6 % ;桑椹期:5〇 〇 鼠 2 ,囊胚期· 46.3 v*s· 44.7 %) ’於處理組別間不具顯 著性差異(P > 0·05)。利用EBA核轉置操作流程所產製之 20個核轉置囊胚,於移置入丨丨頭受胚牛後,有2頭懷孕 ,統計時之懷孕天數已分別8.5及7·5月齡;而利用EAA 核轉置操作流程所產製之2個核轉置囊胚,於移置入1頭 叉胚牛後,亦已證實懷孕,其懷孕天數目前為7月齡(如表 2所示)。這顯示兩種核轉置流程所產制之核轉置胚均具有 發育成個體之能力。 表2 ·利用不同核轉置流程所產製核轉置牛胚之懷孕 率 4 30 200521235 核轉 置方法 核轉 置胚的移 置數目 接受 移置的母 牛數 懷孕 數 EBA 20 11 2 EAA 2 1 1 基化程度之測定 DNA甲基化私度之分析方法係修正自等人籲 (1998)和Kang等人(2001)所述,其詳細步驟如下: 11.1·酸性亞硫酸鹽(Bisulfite)之化學處理 (1) 將貫施例8經急速冷象_解柬二次處理之體外生產 囊胚、供核細胞及經EBA和EAA核轉置流程所產製之核 轉置囊胚’分別加入2μ1含ιμβ/μ1之E c〇H tRNA、2μ1 δ 0·02 Μ 之 SDS、0·3μ1 含 I9pg/mi 之 proteinase κ、以 及14·7μ1之去離子水,使最終體積為2〇μ1後,置於37它 水浴槽中作用1 h。 籲 (2) 於98°C條件下作用15 min。 (3) 加入2·5μ1之Bam Η I和2·5μ1之專用10X緩衝 液,於37°C條件下作用10 h。 (4) 加入2μ1含3M之NaOH,於37°C條件下作用15 min 〇 (5) 加入 12μ1 含 10mM 之對苯二酚(hydroquinone)、 208μ1 含 2.3 Μ 之重亞硫酸鈉(sodium metabisulfite)(pH = 5) 31 200521235 、以及2μ1含lpg/μΐ之E.coli tRNA,於50°C條件下作用 10 h ° (6) 利用市售純化DNA之套組(Wizad DNA Clean up system, Promega,A-7280),去除DNA樣品中之鹽類,其 詳細步驟如操作手冊所述,並獲得40μ1之DNA溶液。 (7) 加入 4·4μ1 含 3 Μ 之 NaOH,於 37°C 作用 15 min 〇 (8) 加入 2μ1 含 1 pg/μΐ 之 E.coli tRNA、28μ1 含 5 Μ 之醋酸銨(ammonium acetate)(pH=7)、以及 180μ1 之 ι〇〇〇/。 酒精,充分混勻,以沉澱DNA。 (9) 利用10000 G離心10 min後,去除上清液。 (10) DNA經自然乾燥後溶於20μ1之去離子水中,並凍存 於-2CTC條件下備用。 11 ·2·利用聚合酶連鎖反應(PCR)方法擴增經亞硫酸鹽化學 處理之DNΑ片段 本實施例進行DNA去甲基化程度分析之基因片段座落於牛 似k///k /基因。所使用之上下游端引子對為BSI(+)和BSI(—) 。:BSI(+)之序歹U 為 5,-AATACCTCTAATTTCAAACT-3’ ; BSI( -)之序列為 5,-TTTgTgAATgTAgTTAATA-3,(Kang 等人,2001) 。其中BSI(+)引子於合成時即先予以標定FAM螢光物質。其 步驟簡述如下,取4μ1上述經亞硫酸鹽化學處理之各處理組 DNA溶液,分別加入各0·75μ1含10 pmol/μΐ之BSI(+)和BSI( —)引子、Ιμΐ 含 5υ/μ1 之 EXTaq、4μ1 含 50 μΜ 之 dNTP 和 2μ1 32 200521235 EXTaq專用之10倍濃縮PCR緩衝液,以及11·5μ1之已滅菌去 離子水,使最終體積為20μ1。各PCR反應液經充分混勻後,置 入 PCR 反應槽中,以(I ) 94°C,60 sec ; (Π ) 94°C,60 sec、46 °C,60 sec、72°C,20 sec,共 40 循環;(IE ) 72°C,5 min ; (IV )停置於4°C等條件完成PCR反應。完成PCR反應之樣品遂進 行去甲基化程度之分析。 11.3. DNA去甲基化程度之分析 DNA甲基化程度之測定原理,係利用亞硫酸鹽之化學處理 可將DNA序列上未被甲基化作用之胞喊淀(cytosine)轉換成尿 。密σ定(uracil);而已被甲基化者,則保有其原有之胞哺咬驗基。 因此,將已被亞硫酸鹽化學處理之DNA片段,先經PCR技術 擴增後,再利用可截切特定DNA曱基化切位之限制酶進行截切 ;若該DNA片段中之胞嘧啶已被甲基化,則該胞嘧啶鹼基將不 因亞硫酸鹽之化學處理而被置換,因此可被上述之限制酶截切 ;當DNA片段中之胞嘧啶未被甲基化時,該胞嘧啶鹼基將被置 換成尿嘧啶,而改變其原有之序列,因此無法被上述之限制酶 截切而保有其完整長度之DNA片段(Warnecke等人,1998)。於 本實施例亦將應用此原理與方法,評估核轉置胚與供核細胞及 正常受精胚間,其等如仏///仏/基因曱基化程度之差異性。上述 經PCR所擴增之牛似紿///紿/基因片段全長約211 bp,片段中 共有12個甲基作用位置(CpGl〜CpG12),此曱基化之位置及其 經亞硫酸鹽處理後之序列改變情形如下所示。 200521235
GGTACCTCTGATTTCAGACTC AATACCTCT AATTTCAAACTC
CG
AT
CG CAGGGTCCCTGCAGAC 43
CA AT Cfii CAAAA TCCCTACA AAC
CpG1 CpG2 86 TGGGGACAGGAGAGTCAGGCCT TAAA AAC A AAAAAA TC AAACC7
CG TCTTGGGTTGAGGCATGGA CA TCTTAA ATTAA AA CATAAA
CpG3 ACTC CG CTTGCCTCT CG AGATGTCCC CG< ACTC CA CTTA CCTCT CA AAATATCCC CA> C ^pG 4 C :pG 5 C :pG6
129 CpG7
TGT TATI
A A C CG CA\ AGCTGTATTTGGAACCTGGGGTTTTTTC AACTA TATTTAAAACC TAAA ATTTTTT C\
CpG8
GAGAAGCTGCCCCTT AA AAAACT ACCCCT1 5U11 C
CG
AA
CAAA
CG GTGC CAATAC 172
CG CA
CG CA
CpG9 CpG10 TGTTGACTGCATTCACAGG T ATTAA CTAC ATTC AC A AA pG12 211 (Kang 等人,2001) 211 bp長度之扣仏///紿/DNA片段的序列(上股)及其經亞硫 酸鹽處理後之序列(下股),而甲基化位置為框列處序列,另可 被限制酶截切之位置分別為CpG-4和CpG-7。在未經亞硫 酸鹽處理時,其CpG4和CpG7可被jc/I限制酶完全截切成35 、86、90 bp。惟因本實施例僅在BSI(+)引子上標定FAM螢光 物質,因此分析此片段之甲基化程度時,僅可偵測獲致約9〇 bp 、125 p和211 bp等片段。其步驟乃將上述已完成亞硫酸鹽處 理及PCR反應之各試驗樣品,均予以取出4μ1後,分別加入 2μ1 m限制酶(ΝΕΒ,R0551S)和2μ1 ΑζΊ專用之10倍濃縮緩 衝液,以及12μ1之已滅菌去離子水,使最終體積為20μ1。各分 34 200521235 析樣品經充分混勻,並於37°C條件下作用12 h後,取Ιμΐ該等 經jc/I限制酶作用之各試驗樣品PCR產物,分別加入0·5μ1含 TAMRA螢光物質標示之350 bp分子大小的標準品(Applied Biosystems, 401736) 、〇·5μ1專用緩衝液及3μ1之去離子曱醯胺 液予以混合均勻,於90°C下變性2 min後,立即置於冰上備用 。其後,先將該變性之各混合溶液分別取出1.5 μΐ並載入核酸 自動定序儀(Applied Biosystems-377)中電泳2 h後,再以 GeneScan 和 Genotyper 軟體(Applied Biosystems,Foster City, USA)分析該電泳膠片上所呈現各長度片段所含之DNA量。之 後,將各試驗處理組中被如Η限制酶截切成各片段長度(包括約 90及125 bp者)之DNA總合量除以該受測樣品之DNA總量( 包括所有被切及未切之DNA),以獲致該處理組/基因 被甲基化之百分比,而完成曱基化程度之分析。 11.4.評估利用ΕΒΑ及ΕΑΑ核轉置流程所產製核轉 置胚之DNA甲基化程度的結果 將源自體外生產囊胚、供核細胞以及利用 ΕΒΑ和 ΕΑΑ核轉置操作流程所生產核轉置囊胚之DNA,經亞硫酸 鹽處理後,其等化/"k I DNA片段甲基化程度之分析結 果示於表3。 表3.利用EBA和EAA核轉置流程所產製核轉置胚 中化///化I基因之曱基化程度 200521235 處理方 法 檢測 次數 化I基因之甲基化程度 (%) 平均值(標準# ) 體外生 產囊胚(IVP) 6 31.87 (± 4.83)c 供核細 胞 6 69.78 (土 5.62)a ΕΒΑ產 製之核轉置 胚 6 64.66 (士 1.66)a ΕΑΑ產 製之核轉置 胚 6 44.42 (± 2.96)b 不同上標英文字的值具有顯著差異(p<0 001)。 結果顯示,供核細胞及利用EB A核轉置操作流程所生 產核轉置囊胚之DNA I DNA片段甲基化百分比相 近(69.78% & 64.66%),惟此兩值均明顯高於體外生產囊胚 (31.87%)及利用EAA流程生產之核轉置囊胚者(44·42%)(ρ < 0.001),且利用ΕΑΑ流程生產之核轉置囊胚者又明顯較 體外生產囊胚者高(ρ< 〇〇〇1)。這結果說明,纟常體外受 精胚於1月至囊胚期時,其甲基化程度將被明顯降低, 而原本I由具有高度甲基化之供核細胞所產製之核轉置囊 36 200521235 胚則仍維持其原有具較高 ¥*η , Ψ基化之現象,而利用EAA所產 I之核轉置曩胚,則具有 午瓜核轉置胚甲基化之能力。 統計分;^ 以上實施例1 〇所使用 之用之統计分析如下所述,利用 EB A和EAA所產製核轉置 i胚於體外發育至各胚期之發育 差異性,係應用卡方分析法分析之;而兩組核轉置胚之甲 基化程度比較’則利用-般線性模式(Generai Linear Models)進行變方分析,並 ^ 少以Duncan平均值比較 法评估處理間之差異顯著性。 根據本發明可作之不同修正及變化對於熟習該項技術 者而&均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明 已敘述特定的較佳具體事實,必須瞭解的是本發明不應被 不當地限制於該等特定具體事實上。事實上,在實施本發 明之已述模式方面,對於熟習該項技術者而言顯而易知2 不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之内。 【圖式簡單說明】 (一) 圖式部分 無 (二) 元件代表符號 無 37 200521235 參考資料 李善男、劉振發、許義明。1997。經體外成熟和體外受精之牛卵母細胞與卵丘 細胞共培養之發育率。中畜會誌24(4):429〜438。
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Claims (1)
- 200521235 拾、申請專利範圍: 1 · 一種具有發展成不含人之哺乳動物的核轉置胚之 培育方法,包括: U)提供哺乳動物之卵母細胞; (b) 提供哺乳動物之供核細胞; (c) 將供核細胞或其細胞核置入卵母細胞中; (d) 將供核細胞與卵母細胞進行融合而產生四倍體核轉 置胚;(e)將核轉置胚進行激活處理; (0去除卵母細胞核;和 (g)培養去除卵母細胞核之核轉置胚。 2 ·如申請專利範圍第丄項所述之培育方法,盆 哺乳動物為家畜。 3 ·如申請專利範圍第2 豕畜為牛。 項所述之培育方法,其中該 •如申請專利範圍第3項所述之培育方法 1¾ ^ rr.,」⑷步驟H細胞係經由料培養後㈣具第i極體者 5’如申請專利範圍第3項所述之培育方法 步驟之供核細胞為體細胞。 一 6 .如申請專利範圍第5項所述 體細胞含有外源基因。 月方法,其中7 (b)步驟8 .如申請專利範圍第3項所述之培育 之供核細胞進-步進行飢餓培養。。 .如申請專利範圍第3項所述之培育 方法,其中該 方法,其中該 41 200521235 (b)步驟之供核細胞不進行仇餓培養。 9 ·如申請專利範圍第3項所述之培育方法,其中於 )v驟之供核細胞係置入纟P母細胞之印黃膜間隙。 1 Q ·如申請專利範圍第3項所述之培育方法,其中 ;()V驟之供核細胞係直接注入卵母細胞之細胞質内。 1 1 ·如申請專利範圍第3項所述之培育方法,其中 該(d)步驟之卵母細胞係未經去核者。 12 如申請專利範圍第3項所述之培育方法,其中 該(d)步驟係利用電融合。 13 如申晴專利範圍第3項所述之培育方法,其中 / (幻步驟激活處理係將融合的細胞培養於含有鈣離子載體 (calclumion〇ph〇re)和 6_dmaP 之激活液中。 1 4 · 一種培育不含人之哺乳動物胎兒的方法,包括 (a) 提供哺乳動物之卵母細胞; (b) 提供哺乳動物之供核細胞; (C)將供核細胞或其細胞核置入卵母細胞中; ⑷將供核細胞與印母細胞進行融合而產生四倍體核轉 置胚; (e)將核轉置胚進行激活處理; (0去除卵母細胞核; (g) 培養去除彡卩母細胞核 (h) 將核轉置胚移置入母 成胎兒。 之核轉置胚;和 的胚哺乳動物生殖道中而形 42 200521235 1 5 ·如申請專利範圍第1 4項所述之方法,其中該 哺乳動物為家畜。 / 1 6 ·如申請專利範圍第1 5項所述之方法,其中該 家畜為牛。 ~ 1 7 ·如申請專利範圍第1 6項所述之方法,其中該 (a) 步驟之卵母細胞係經由體外培養後選取具第一極體者。 1 8 ·如申請專利範圍第1 6項所述之方法,其中該 (b) 步驟之供核細胞為體細胞。 ^ 1 9 ·如申請專利範圍第1 8項所述之方法,其中該 體細胞含有外源基因。 Λ 2 0 ·如申請專利範圍第丄6項所述之方法,其中該 (b)步驟之供核細胞進一步進行飢餓培養。 2 1 ·如申請專利範圍第i 6項所述之方法,其中該 (b) 步驟之供核細胞不進行飢餓培養。 2 2 ·如申請專利範圍第i 6項所述之方法,其中於 (c) 步驟之供核細胞係置入卵母細胞之卵黃膜間隙。 2 3 ·如申請專利範圍第i 6項所述之方法,其中於 (〇步驟之供核細胞係直接注入卵母細胞之細胞質内。/、、 2 4 ·如申請專利範圍第丄6項所述之方法,其中該 (d) 步驟之卵母細胞係未經去核者。 〆 2 5 ·如申請專利範圍第丄6項所述之方法,其中該 (d)步驟係利用電融合。 以 ^ 2 6 ·如申請專利範圍第丄6項所述之方法,其中該 忒(e)步驟激活處理係將融合的細胞培養於含有鈣離子載體 43 200521235 和6-DMAP之激活液中。 2?-種培育不含人之哺乳動物的方法,包括 (a) 提供哺乳動物之卵母細胞; (b) k供哺乳動物之供核細胞; ⑷將供核細胞或其細胞核置入卵母細胞中 四倍體核轉(d)將供核細胞與卵母細胞進行融合而產 置胚; (e)將核轉置胚進行激活處理; ⑺去除印母細胞核; (g)培養去除卵母細胞核之核轉置胚;和 ㈨將核轉置胚移置入母的受胚哺乳動物生殖道中而 成胎兒’並經過所有胎兒成長及分化期間而生育出哺乳 2 8 ·如申請專利範圍第2 7項所述之方法,1 哺乳動物為家畜。 〜 —2 9 ·如申請專利範圍第2 8項所述之方法,其中該 豕畜為牛。 3 〇 ·如申請專利範圍第2 9項所述之方法,其中該 (a) 步驟之卵母細胞係經由體外培養後選取具第一極體者。 3 1 ·如申請專利範圍第2 9項所述之方法,其中該 (b) 步驟之供核細胞為體細胞。 3 2 ·如申請專利範圍第2 9項所述之方法,其中該 體細胞含有外源基因。 3 3 ·如申請專利範圍第2 9項所述之方法,其中該 44 200521235 (b)步驟之供核細胞進一步進行仇餓培養。 3 4 ·如申請專利範圍第2 9項所述之方法,其中該 (b) 步驟之供核細胞不進行叙餓培養。 3 5 ·如申請專利範圍第2 9項所述之方法,其中於 (c) 步驟之供核細胞係置入彡卩母細胞之彡卩黃膜間隙。 3 6 ·如申請專利範圍第2 9項所述之方法,其中於 (C)步驟之供核細胞係直接注入卵母細胞之細胞質内。 3 7 ·如申請專利範圍第2 9項所述之方法,其中該 (d) 步驟之卵母細胞係未經去核者。 3 8 ·如申請專利範圍第2 9項所述之方法,其中該 (d) 步驟係利用電融合。 3 9 ·如申請專利範圍第2 9項所述之方法,其中該 (e) 步驟激活處理係將融合的細胞培養於含有鈣離子載體和 6·〇μαρ之激活液中。 4 0 · —種培育不含人之哺乳動物重組細胞之方法, 包括: (a) 提供哺乳動物之卵母細胞; (b) 提供哺乳動物之供核細胞; (c) 將供核細胞或其細胞核置入卵母細胞中; (d) 將供核細胞與印母細胞進行融合; (e) 將融合細胞進行激活處理;和 (0去除卵母細胞核。 4 1 .如申請專利範圍第4 〇項所述之方法,复 哺乳動物為家畜。 200521235 4 2 .如申請專利範圍第4 1項所述之方法,直 家畜為牛。 〃 Τ β 4 3 ·如申請專利範圍第4 2項所述之方法,其中該 U)步驟之卵母細胞係經由體外培養後選取具第一極體者二 4 4 ·如申請專利範圍第4 2項所述之方法,其中該 (b)步驟之供核細胞為體細胞。 4 5 .如申請專利範圍第4 4項所述之方法,其中該 體細胞含有外源基因。 八 ^ 4 6 ·如申請專利範圍第4 2項所述之方法,其中該 (b)步驟之供核細胞進一步進行飢餓培養。 μ 4 7 ·如申請專利範圍第4 2項所述之方法,其中該 (b) 步驟之供核細胞不進行叙餓培養。 4 8 ·如申請專利範圍第4 2項所述之方法,其中於 (c) 步驟之供核細胞係置入卵母細胞之卵黃膜間隙。 4 9 ·如申請專利範圍第4 2項所述之方法,其中於 (c) 步驟之供核細胞係直接注入卵母細胞之細胞質内。 5 〇 ·如申請專利範圍第4 2項所述之方法,其中該 (d) 步驟之卵母細胞係未經去核者。 5 1 ·如申請專利範圍第4 2項所述之方法,其中該 (d)步驟係利用電融合。 5 2 ·如申請專利範圍第4 2項所述之方法,其中該 忒(e)步驟激活處理係將融合的細胞培養於含有#5離子載體 和6-DMAP之激活液中。 5 3 · —種人以外哺乳動物重組細胞,其係經由如申 46 200521235 請專利範圍第4 0至5 2項任一項所述之方法培育而得。拾壹、圖式: 無47 200521235 柒、指定代表圖: (一) 本案指定代表圖為:第( )圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明: 無 捌、本案若有化學式時,請揭示最能顯示發明特徵的化學式
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