JP3799426B2

JP3799426B2 - トランスジェニック動物の作成方法

Info

Publication number: JP3799426B2
Application number: JP32653395A
Authority: JP
Inventors: 裕豊田; 泉斎藤
Original assignee: Todai TLO Ltd
Current assignee: Todai TLO Ltd
Priority date: 1995-11-20
Filing date: 1995-11-20
Publication date: 2006-07-19
Anticipated expiration: 2015-11-20
Also published as: JPH09140292A; WO1997018703A1; AU7588196A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は非増殖型組換えアデノウイルスを用いて外来遺伝子をゲノム内に導入して得られるトランスジェニック動物、および該トランスジェニック動物の作成方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トランスジェニック動物の作成は、従来より困難であり、目的とするトランスジェニック動物の作成が可能な施設は極めて限られているのが現状である。
従って、トランスジェニック動物の簡便かつ効率的な作成方法の開発が強く望まれている。
一方、本発明者らは、非増殖（Ｅ１Ａ欠損）型の組換えアデノウイルスが宿主ゲノム中にほとんど組み込まれないこと（Rosenfeld et al., Science 252, 431-434 (1991)) から、遺伝子制御の研究や体細胞遺伝子治療の開発のための遺伝子発現に利用されてきた（Akli et al., Nat. Genet. 3, 224-228 (1993)) ことに着目して種々研究を重ね、ＬａｃＺ遺伝子を含む非増殖型アデノウイルスが、前核期の無卵膜マウス卵子に感染することが可能であり、悪影響なしに卵割期の着床前胚において発現することを明らかにした（Tsukui et al., J. Mamm. Ova.
Res., 10(1), (1993,4) 150-151) 。
しかし、この方法によっても発現は一過性であり、安定なトランスジェニック動物を作成することには成功していなかった（Tsukui et al., Mol. Reprod. Dev. 42 , 291-297 (1995)) 。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の第１の目的は、外来遺伝子をゲノムに導入されたトランスジェニック動物の簡便かつ効率的な作成方法を提供することにある。さらに本発明の第２の目的は、本発明の方法によって作成されたトランスジェニック動物を提供することにある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、非増殖型組換えアデノウイルスが動物の卵子のゲノム中に組み込まれ、そして組み込まれた該アデノウイルスＤＮＡが動物の生殖細胞系に移行すること、すなわち非増殖型組換えアデノウイルスを用いることによりトランスジェニック動物を作成し得ることを発見した。本発明はかかる発見に基づきさらに研究を重ねて完成するに至ったものである。
【０００４】
即ち、本発明の要旨は、
（１）外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスを卵膜を除去した動物受精卵に感染させた後、この胚を借り親動物の子宮に移植することを特徴とするトランスジェニック動物の作成方法、
（２）外来遺伝子が、生理活性タンパク、抗体、マーカー遺伝子としての発色タンパクまたはマーカー遺伝子としての薬剤耐性タンパクをコードする塩基配列を有するヌクレオチドである前記（１）記載のトランスジェニック動物の作成方法、
（３）非増殖型組換えアデノウイルスを卵膜を除去した動物受精卵に感染させる場合の投与量が５×１０⁷〜１０⁸ｐｆｕ／ｍｌであることを特徴とする前記（１）または（２）記載のトランスジェニック動物の作成方法、
（４）非増殖型組換えアデノウイルスが、ＣＡＧプロモーター支配下に発現するものである前記（１）〜（３）いずれかに記載のトランスジェニック動物の作成方法、
（５）非増殖型組換えアデノウイルスが、核移行シグナルを含むものである前記（１）〜（４）いずれかに記載のトランスジェニック動物の作成方法、
（６）外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスの１コピーだけが動物受精卵のゲノムに組み込まれることを特徴とする前記（１）〜（５）いずれかに記載のトランスジェニック動物の作成方法、並びに
（７）外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスを卵膜を除去した動物受精卵に感染させた後、この胚を借り親動物の子宮に移植することによって作成されたトランスジェニック動物、に関する。
【０００５】
即ち、本発明の要旨は、
（１）外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスを投与量５×１０ ^７〜１０ ^８ｐｆｕ／ｍｌで、卵膜を除去した動物受精卵に感染させた後、この胚を借り親動物の子宮に移植することを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成方法、
（２）外来遺伝子が、生理活性タンパク、抗体、マーカー遺伝子としての発色タンパクまたはマーカー遺伝子としての薬剤耐性タンパクをコードする塩基配列を有するヌクレオチドである前記（１）記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成方法、
（３）非増殖型組換えアデノウイルスが、ＣＡＧプロモーター支配下に発現するものである前記（１）または（２）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成方法、
（４）非増殖型組換えアデノウイルスが、核移行シグナルを含むものである前記（１）〜（３）いずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成方法、
（５）外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスの１コピーだけが動物受精卵のゲノムに組み込まれることを特徴とする前記（１）〜（４）いずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成方法、並びに
（６）外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスを投与量５×１０ ^７〜１０ ^８ｐｆｕ／ｍｌで、卵膜を除去した動物受精卵に感染させた後、この胚を借り親動物の子宮に移植することによって作成されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物、に関する。
【０００６】
本発明に用いられる非増殖型アデノウイルスは、幾つかの特徴を有する。すなわち、アデノウイルスは、第１に宿主の範囲がきわめて広く、第２に組み換え遺伝子を非分裂細胞中に導入させることが可能である。
【０００７】
非増殖型組換えアデノウイルスは、かかる性質を有することから、前核期における動物受精卵に対するベクターとして期待される。しかしながら、本発明者らの研究では、非増殖型アデノウイルスベクターの１種であるＳＲαプロモーターの制御下にある大腸菌ＬａｃＺ遺伝子を含むAdex4SRLacZLを使用して前核期における動物受精卵に対する遺伝子導入を試みたが、感染卵子から発育した１３．５日胎仔において発現を検出することができなかった（Tsukui, T., et al. Mol. Reprod. Dev. 42, 291-297 (1995))。
【０００８】
本発明においては、動物細胞に感染した後外来遺伝子の発現を可能とするため、アデノウイルスベクターにプロモーターを導入する必要があるが、かかるプロモーターとしては従来アデノウイルスを用いる遺伝子導入に使用されてきたものはいずれも使用可能であり、特にＣＡＧプロモーター（Araki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 160-164 (1995)) が好適に用いられる。
【０００９】
本発明において、外来遺伝子の発現産物が細胞質に蓄積されることによる毒性が懸念される場合は、外来遺伝子とともに核移行シグナル配列を組み込んでもよい。核移行シグナル配列はアデノウイルスベクターにより感染細胞の核内で発現され核外に分泌された外来遺伝子産物が再び核内に移行することを促進する（Daniel Kalderon et al., Cell 39 , 499-509 (1984)) 。
【００１０】
本発明者らは、ウイルス組み込みの結果を明確にするために、以下には１例として、新たなベクターであるＡｘＣＡＮＬａｃＺを用いる。このＡｘＣＡＮＬａｃＺは、外来遺伝子（ＬａｃＺ）により発現するβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性の同定のために、トランスジェニックマウスで普遍的発現に用いられるＣＡＧプロモーターの支配下にある核標的化されたＬａｃＺ遺伝子を含む。このベクターの調製は以下のようにして行うことができる〔Kanegae,Y. et al., Nucleic Acids Research, 1995, vol. 23, 3816-3821 〕。例えば、Kanegae らの方法により、アデノウイルスの複製に必要なＥ１Ａ蛋白質を産生させず、外来遺伝子を発現するように設計し、また細胞および組織での発現を確認できるように、ＣＡＧプロモーターの支配下に大腸菌由来のＬａｃＺ遺伝子を挿入することにより調製できる。
【００１１】
本発明に用いられる外来遺伝子としては、特に限定されるものではなく、その有用性の観点から、生理活性タンパク、抗体、マーカー遺伝子としての発色タンパク、マーカー遺伝子としての薬剤耐性タンパク等をコードする塩基配列を有するヌクレオチドが挙げられる。生理活性タンパクとしては、サイトカイン類（例えば、インターロイキン−１〜１５、インターフェロン−α，βもしくはγ、腫瘍壊死因子−αもしくはβ、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、成長ホルモン、インシュリン、インシュリン様成長ホルモン等）、神経栄養因子類、α−１アンチトリプシン、血液凝固第８因子、血液凝固第９因子、α−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。マーカー遺伝子としての発色タンパクとしては、β−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰ（Green fluorescent protein)等が挙げられる。マーカー遺伝子としての薬剤耐性タンパクとしては、アミノグリコシドフォスフォトランスフェラーゼ等が挙げられる。
【００１２】
本発明のトランスジェニック動物を作成する方法は、以下のようにして行うことができる。本発明において、トランスジェニック動物とは、生殖系に導入された外来遺伝子を含有するヒト以外の哺乳動物をいう。このような動物としてはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ等が挙げられる。
【００１３】
以下にマウスを例として、トランスジェニック動物の典型的な作成方法を説明する。
まず、雌マウスにＰＭＳＧ（ウマ絨毛性性腺刺激ホルモン）、ｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）を腹腔内に注射して過排卵を誘起する。精子提供用の雄には同系統の雄マウスを用いる。培養およびウイルスとの反応は、すべて５％ＣＯ₂、９５％空気、３７℃の条件で行う。
ｈＣＧの投与後１６時間に、卵丘細胞に包まれた未受精卵をＴＹＨ( マウス体外受精用培地 (Toyoda et al., Jpn. J. Anim. Reprod. 16 , 147-151 (1971)))中に採取し、予めＴＹＨで２時間前培養を行った精子を最終濃度が１５０精子／μＬとなるように加えて体外受精を行う。受精してから３〜６時間後に受精卵をＷＭ・ＥＤＴＡ（受精卵発生用培地（Hoshi et al., Jpn. J. Zootech. Sci. 56, 931-937 (1985)))に移し、ヒアルロニダーゼおよび酸性タイロード液（ｐＨ２．５）で卵丘細胞および卵膜を除去する。
次に、ＡｘＣＡＮＬａｃＺ等の、外来遺伝子の導入された非増殖型アデノウイルスを１０⁶〜１０⁸ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは５×１０⁷〜１０⁸ｐｆｕ／ｍｌの投与量で、該ウイルスとの反応時間を２〜８時間としてウイルス感染を行う。
【００１４】
ウイルス感染後の胚を借り親マウスの子宮に移植する。
【００１５】
得られた産仔のゲノムに外来遺伝子の導入された非増殖型アデノウイルスが伝達されたか否かを確認する。
【００１６】
次に、以上のようにして得られたトランスジェニックマウスと野生型のマウスとを交配して得られる子孫のＦ１において、該トランスジーンが安定に伝達され、組換え非増殖型アデノウイルス由来の外来遺伝子が発現していることを確認する。
【００１７】
以上のようにして得られるトランスジェニックマウスについては、以下のような性質が観察される。
後述の実施例において示すように、３匹のマウスすべてにおいて、１コピーの組み込み、すなわち完全なアデノウイルスＤＮＡが観察される（図１）。これに反して、卵子の前核中にＤＮＡをマイクロインジェクションした場合には、トランスジェニック動物への組み込みは、縦列の頭一尾方式で配列された多数のトランスジーンのクラスターとなって生ずる。これらの現象は、アデノウイルスの末端蛋白質が、裸のＤＮＡ分子の場合と異なり、マウス卵子中でのウイルスゲノムの縦列形成を阻止しているのかも知れない。
【００１８】
メンデルの法則に従った安定な生殖細胞系遺伝が認められるが、この事実は、アデノウイルスゲノムの組み込みが１−細胞期におけるＤＮＡ合成の期間前または期間中に起こったことを示す。前核中へのＤＮＡのマイクロジェクションの場合には、１−細胞期の受精卵への遺伝子の組み込みが約７０％の頻度で起こることが報告されている（Bishop et al., Mol. Biol. Med., 6 , 283-298 (1989)) 。レトロウイルスベクターの他の場合は、分裂中の胚（好ましくは４−または８−細胞期）に感染するときは（Rubenstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 366-368 (1986))、前ウイルス組み込み（proviral integration) が１個以上の細胞中で独立に起こり得る。従って、生殖細胞系遺伝率は、モザイク形成により（Jaenisch et al., Cell 24, 519-529 (1981)) 、一般的に低い。
【００１９】
Ｆ１子孫へのアデノウイルストランスジーンの遺伝の場合は、転位は一切示されない（図３）。これに反して、ウイルス複製と宿主細胞に対する細胞毒性の誘導を支配するＥ１Ａ遺伝子を含む野生型のアデノウイルスの場合の組み込み事象は、培養された細胞系中で多くの転位が起こるようにみえる（Dorsch, M. K. et al., J. Virol. 34, 305-314 (1980)、Visser, L. et al., J. Virol. 39, 684-693 (1981))。一つの可能性は、細胞毒性をもつＥ１Ａ遺伝子の欠損により、組み込まれたアデノウイルスＤＮＡが、マウスの１−細胞から生殖細胞系へゲノム中で安定な状態で維持されるというものである。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
なお、実施例中のコスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞などを取り扱う諸操作およびサザン分析は、特に断らない限り、「Molecular Cloning A Laboratory Manual. T. Maniatisら編、第 2版 (1989) ，Cold Spring Harbor Laboratory 」に記載の方法に準じて行った。
【００２１】
実施例１（組換えアデノウイルスゲノムの卵子前核における転写および翻訳の確認）
まず、卵膜の存在または非存在の状態で、前核期にある１−細胞卵子に感染するＡｘＣＡＮＬａｃＺの能力を試験した。
マウスの１−細胞卵を卵膜を有するまま又は卵膜を除去したのち、１×１０⁸ｐｆｕ／ｍｌのＡｘＣＡＮＬａｃＺ（核移行シグナルを有するアデノウイルス）で感染させた。感染させた卵子を培養し、感染２４時間後の２−細胞期で染色した。β−ガラクトシダーゼ活性は、組織化学的（Ｘ−Ｇａｌ）染色（Beddington et al., Development 106, 37-46 (1989)) により検出した。その結果、、β−ｇａｌ活性は、感染卵から発育した２−細胞胚（ウイルス感染２４時間後）の核中に、明確に局在していることが分かった。この結果は、組換えアデノウイルスゲノムが卵子の前核中に移行し、そして感染後２４時間以内に転写／翻訳されることを示した。他方、卵膜の存在下では、β−ｇａｌ活性は検出されなかった。従って、卵膜の除去は、感染のための前提条件である。
【００２２】
実施例２（組換えアデノウイルスゲノムの卵子ゲノムへの組み込みの確認）
アデノウイルスゲノムがマウス卵子ゲノム中に組み込まれたか否かを明らかにするために、blastocyst（培養４日後）における感染胚を借り親の子宮に移植した。２７匹の生まれたマウスの尾静脈血から単離したゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄIII で消化した。サザンブロット分析を行うと、図１に示すように、３匹のものはアデノウイルスＤＮＡを含んでいた。２〜４レーンはそれぞれ、ウイルスの内部断片と同定された。そして、宿主ゲノムへのアデノウイルスゲノムの組み込みにより生じたウイルス−細胞ＤＮＡの連結断片と推定されたものに星印を付した。
３匹のマウス（ＡＣＬ9.1 、9.3 および9.23）はすべて、１個のアデノウイルスゲノムを保持し、以上の分析により、アデノウイルスゲノムはマウスゲノム中にランダムに組み込まれたことが分かった。
【００２３】
＜実験方法＞
マウスのゲノムＤＮＡ（１０μｇ）をＥｃｏＲＶまたはＨｉｎｄIII で消化し、１．０％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜ハイボンド−Ｎ（アマシャム社製）上にブロットし、そしてランダムにジゴキシゲニン標識されたプローブにハイブリダイズさせ、サザン分析を行った。
【００２４】
実施例３（トランスジェニック動物中での外来遺伝子ＬａｃＺの発現）
さらに、本発明者らは、この３匹のトランスジェニック動物中での外来遺伝子ＬａｃＺの発現を試験した。耳のパンチングにより採取した組織片を常法によりＸ−ｇａｌ染色法（Beddington et al., Development 106, 37-46 (1989)) で染色した。３匹のトランスジェニック動物のうち２匹（ＡＣＬ9.3 と9.23）において実際にβ−ｇａｌ活性が検出された。しかし他の１匹（ＡＣＬ9.1)では検出されなかった。
【００２５】
実施例４（子孫Ｆ１への組換えアデノウイルスの伝達）
アデノウイルスＤＮＡが子孫Ｆ１に伝達したか否かを確かめるために、３匹のトランスジェニックマウスをＩＣＲ系マウスと自然交配させた。トランスジェニックマウスの１匹（図１、ＡＣＬ9.23）に由来した妊娠１３．５日目の１０匹のＦ１の胎盤から単離したゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIII で消化した。サザン分析により、アデノウイルストランスジーン（transgene)はＦ１子孫１０匹の中の６匹に伝達したことが分かった（図３）。これらの断片パターン（図３、レーン１、３、４、７、８および１０）は、親のトランスジェニックマウスの断片パターン（図３、レーンＡＣＬ９．２３）と一致した。他の２匹のトランスジェニックマウス（ＡＣＬ9.1 およびＡＣＬ9.3)のウイルストランスジーンも子孫Ｆ１に伝達した（それぞれ、２１匹中の１１匹および１３匹中の７匹）。したがって、アデノウイルストランスジーンは、Ｆ１子孫に安定に遺伝することが確認されたといえる。アデノウイルストランスジーンの生殖細胞系への伝達はメンデルの法則に従っており、転位は全く認められなかった（図３）。
【００２６】
実施例５（アデノウイルストランスジーンの発現の確認）
Ｆ１子孫でのアデノウイルストランスジーンの発現をさらに検討するために、同じサンプル（図３）由来の１０匹のＦ１胎仔についてβ−ｇａｌ活性の染色を行った。全面的かつ強烈な暗青色の染色が１０匹のＦ１胎仔中の６匹で観察された。このことは、遺伝したアデノウイルストランスジーンが実際にＬａｃＺ遺伝子を発現したことを示すものである。対照的にアデノウイルストランスジーンを受け取らなかった他の４匹の胎仔は、全く染色されなかった。他のトランスジェニックマウスの系列については、ＡＣＬ9.3 由来の１３匹のＦ１胎仔のうちの７匹がβ−ｇａｌ活性を示した。以上を総合すると、これらのデータは、Ｆ１子孫におけるＬａｃＺ発現がアデノウイルストランスジーンの安定な状態での伝達から生じたことを明示するものである。
【００２７】
＜実験方法＞
胎仔全体を、Allen らの方法（Allen, N. D. et al., Nature 333 ,852-855 (1988))の改良法によりβ−ｇａｌ活性を調べるためＸ−ｇａｌを用いて染色した。すなわち、胎仔を０．５％ホルムアルデヒド、２．５％グルタールアルデヒド、および０．０５％ＮＰ４０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中に４℃で３０分間浸漬して固定した。そしてさらに１５分間、２回目の固定を行った。固定された胎仔をリン酸緩衝液で３回洗浄し、染色溶液（５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、０．１％ＮＰ４０および０．５ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含むリン酸緩衝液）中に３７℃で４時間インキュベートした。
【００２８】
実施例６（組み込まれたアデノウイルストランスジーンは１コピーである）
３匹のマウスすべてにおいて、１コピーの組み込み、すなわち完全なアデノウイルスＤＮＡが観察された（図１）。これに反して、卵子の前核中にＤＮＡをマイクロインジェクションした場合には、トランスジェニック動物への組み込みは、縦列の頭一尾方式で配列された多数のトランスジーンのクラスターとなって生ずる。これらの現象は、アデノウイルスの末端蛋白質が、裸のＤＮＡ分子の場合と異なり、マウス卵子中でのウイルスゲノムの縦列形成を阻止しているのかも知れない。
【００２９】
実施例７（組み込み効率に対するウイルス投与の影響）
受精卵の卵丘細胞および卵膜を除去した後、表１に記載の投与量でＡｘＣＡＮＬａｃＺを感染させ、インビトロでｂｌａｓｔｏｃｙｓｔまで培養した後、借り親の子宮に戻した。実際、１×１０⁷、５×１０⁷および１×１０⁸（ｐｆｕ／ｍｌ）で感染した胚を移植し、それぞれ５５、３２、および３６匹の動物個体が得られた。これらの個体について、ＬａｃＺ遺伝子をプローブとするサザンブロット解析により得られた結果を表１に示す。表１から明らかなように、ウイルスの投与量が１×１０⁷ｐｆｕ／ｍｌの場合（２／５５）に比べて、５×１０⁷ｐｆｕ／ｍｌの場合（４／３２）および１×１０⁸ｐｆｕ／ｍｌの場合（４／３６）は、組み込み効率が飛躍的に向上することが分かる。これは、通常のウイルス感染の場合と異なりウイルス投与量の増加による動物細胞の死滅を考慮する必要がないため、ウイルス投与量の高い方が効率が向上するという結果が得られたものと思われる。
【００３０】
【表１】

【００３１】
【発明の効果】
本発明の方法によって簡便かつ効率的にトランスジェニック動物を作成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、非増殖型アデノウイルスＤＮＡの組み込みのサザン分析による同定を示す電気泳動の写真である。２７匹の動物の尾から単離されたゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄIII で消化し、ＡｘＣＡＮＬａｃＺ配列と９８％の相同性を有するｐＡｘＣＡＮＬａｃＺのコスミドＤＮＡをプローブとして用いた。ａはＥｃｏＲＶ消化、ｂはＨｉｎｄIII 消化のデータである。白丸は、アデノウイルスの末端断片である。星印は組み込み事象後のウイルス−細胞ＤＮＡの連結断片を示す。
【図２】図２は、３匹のトランスジェニックマウスゲノムに組み込まれたアデノウイルスＤＮＡを示す。太線は組換えアデノウイルスＡｘＣＡＮＬａｃＺの制限酵素地図を示す。
【図３】図３は、Ｆ１子孫への生殖細胞系の遺伝およびＦ１上でのアデノウイルストランスジーンの発現を示す電気泳動の写真である。ＬａｃＺ発現性のトランスジェニックマウス（ＡＣＬ9.23）をＩＣＲ雌と交配させ、発生した１０匹のＦ１胎仔を妊娠後１３．５日に試験に供した。その１０個の胎盤から単離されたゲノムＤＮＡを図１に示すものと同様の手順によりサザン分析に付した。レーン１、３、４、７、８および１０はアデノウイルストランスジーンの伝達があったことを示し、レーン２、５、６および９は、かかる伝達がなかったことを示す。星印は組み込み事象後のウイルス−細胞ＤＮＡの連結断片を示す。

Claims

外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスを投与量５×１０ ^７〜１０ ^８ｐｆｕ／ｍｌで、卵膜を除去した動物受精卵に感染させた後、この胚を借り親動物の子宮に移植することを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成方法。
外来遺伝子が、生理活性タンパク、抗体、マーカー遺伝子としての発色タンパクまたはマーカー遺伝子としての薬剤耐性タンパクをコードする塩基配列を有するヌクレオチドである請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成方法。
非増殖型組換えアデノウイルスが、ＣＡＧプロモーター支配下に発現するものである請求項１または２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成方法。
非増殖型組換えアデノウイルスが、核移行シグナルを含むものである請求項１〜３いずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成方法。
外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスの１コピーだけが動物受精卵のゲノムに組み込まれることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成方法。
外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスを投与量５×１０ ^７〜１０ ^８ｐｆｕ／ｍｌで、卵膜を除去した動物受精卵に感染させた後、この胚を借り親動物の子宮に移植することによって作成されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物。