JPH09140292A

JPH09140292A - トランスジェニック動物の作成方法

Info

Publication number: JPH09140292A
Application number: JP7326533A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Toyoda; 裕豊田; Izumi Saito; 泉斎藤
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1995-11-20
Filing date: 1995-11-20
Publication date: 1997-06-03
Anticipated expiration: 2015-11-20
Also published as: WO1997018703A1; AU7588196A; JP3799426B2

Abstract

(57)【要約】【解決手段】外来遺伝子を導入した非増殖型組換えアデ
ノウイルスを卵膜を除去した動物受精卵に感染させた
後、この胚を借り親動物の子宮に移植することを特徴と
するトランスジェニック動物の作成方法。【効果】本発明の方法によって簡便かつ効率的にトラン
スジェニック動物を作成することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は非増殖型組換えアデ
ノウイルスを用いて外来遺伝子をゲノム内に導入して得
られるトランスジェニック動物、および該トランスジェ
ニック動物の作成方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】トランスジェニック動物の作成は、従来
より困難であり、目的とするトランスジェニック動物の
作成が可能な施設は極めて限られているのが現状であ
る。従って、トランスジェニック動物の簡便かつ効率的
な作成方法の開発が強く望まれている。一方、本発明者
らは、非増殖（Ｅ１Ａ欠損）型の組換えアデノウイルス
が宿主ゲノム中にほとんど組み込まれないこと（Rosenf
eld et al., Science 252, 431-434 (1991)) から、遺
伝子制御の研究や体細胞遺伝子治療の開発のための遺伝
子発現に利用されてきた（Akli et al., Nat. Genet.
3, 224-228 (1993)) ことに着目して種々研究を重ね、
ＬａｃＺ遺伝子を含む非増殖型アデノウイルスが、前核
期の無卵膜マウス卵子に感染することが可能であり、悪
影響なしに卵割期の着床前胚において発現することを明
らかにした（Tsukui et al., J. Mamm. Ova.Res., 10
(1), (1993,4) 150-151) 。しかし、この方法によって
も発現は一過性であり、安定なトランスジェニック動物
を作成することには成功していなかった（Tsukui et a
l., Mol. Reprod. Dev. 42 , 291-297 (1995)) 。

【０００3 】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の第１
の目的は、外来遺伝子をゲノムに導入されたトランスジ
ェニック動物の簡便かつ効率的な作成方法を提供するこ
とにある。さらに本発明の第２の目的は、本発明の方法
によって作成されたトランスジェニック動物を提供する
ことにある。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明者は、前記課題を
解決するために鋭意検討した結果、非増殖型組換えアデ
ノウイルスが動物の卵子のゲノム中に組み込まれ、そし
て組み込まれた該アデノウイルスＤＮＡが動物の生殖細
胞系に移行すること、すなわち非増殖型組換えアデノウ
イルスを用いることによりトランスジェニック動物を作
成し得ることを発見した。本発明はかかる発見に基づき
さらに研究を重ねて完成するに至ったものである。

【０００４】即ち、本発明の要旨は、（１）外来遺伝
子を導入した非増殖型組換えアデノウイルスを卵膜を除
去した動物受精卵に感染させた後、この胚を借り親動物
の子宮に移植することを特徴とするトランスジェニック
動物の作成方法、（２）外来遺伝子が、生理活性タン
パク、抗体、マーカー遺伝子としての発色タンパクまた
はマーカー遺伝子としての薬剤耐性タンパクをコードす
る塩基配列を有するヌクレオチドである前記（１）記載
のトランスジェニック動物の作成方法、（３）非増殖
型組換えアデノウイルスを卵膜を除去した動物受精卵に
感染させる場合の投与量が５×１０⁷〜１０⁸ｐｆｕ／
ｍｌであることを特徴とする前記（１）または（２）記
載のトランスジェニック動物の作成方法、（４）非増
殖型組換えアデノウイルスが、ＣＡＧプロモーター支配
下に発現するものである前記（１）〜（３）いずれかに
記載のトランスジェニック動物の作成方法、（５）非
増殖型組換えアデノウイルスが、核移行シグナルを含む
ものである前記（１）〜（４）いずれかに記載のトラン
スジェニック動物の作成方法、（６）外来遺伝子を導
入した非増殖型組換えアデノウイルスの１コピーだけが
動物受精卵のゲノムに組み込まれることを特徴とする前
記（１）〜（５）いずれかに記載のトランスジェニック
動物の作成方法、並びに（７）外来遺伝子を導入した
非増殖型組換えアデノウイルスを卵膜を除去した動物受
精卵に感染させた後、この胚を借り親動物の子宮に移植
することによって作成されたトランスジェニック動物、
に関する。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下に本発明について詳細に説明
する。本発明に用いられる非増殖型アデノウイルスは、
鐘ケ江裕美、原田志津子および斎藤泉「実験医学
別冊」バイオマニュアルシリーズ４「遺伝子導入と発現
・解析法」４３〜５８頁「アデノウイルスを用いた遺伝
子導入」１９９４年に記載の方法によって調製すること
ができ、また外来遺伝子を導入した非増殖型アデノウイ
ルスを調製することができる。

【０００６】本発明に用いられる非増殖型アデノウイル
スは、幾つかの特徴を有する。すなわち、アデノウイル
スは、第１に宿主の範囲がきわめて広く、第２に組み換
え遺伝子を非分裂細胞中に導入させることが可能であ
る。

【０００７】非増殖型組換えアデノウイルスは、かかる
性質を有することから、前核期における動物受精卵に対
するベクターとして期待される。しかしながら、本発明
者らの研究では、非増殖型アデノウイルスベクターの１
種であるＳＲαプロモーターの制御下にある大腸菌Ｌａ
ｃＺ遺伝子を含むAdex4SRLacZLを使用して前核期におけ
る動物受精卵に対する遺伝子導入を試みたが、感染卵子
から発育した１３．５日胎仔において発現を検出するこ
とができなかった（Tsukui, T., et al. Mol.Reprod. D
ev. 42, 291-297 (1995))。

【０００８】本発明においては、動物細胞に感染した後
外来遺伝子の発現を可能とするため、アデノウイルスベ
クターにプロモーターを導入する必要があるが、かかる
プロモーターとしては従来アデノウイルスを用いる遺伝
子導入に使用されてきたものはいずれも使用可能であ
り、特にＣＡＧプロモーター（Araki et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 160-164 (1995)) が好適に
用いられる。

【０００９】本発明において、外来遺伝子の発現産物が
細胞質に蓄積されることによる毒性が懸念される場合
は、外来遺伝子とともに核移行シグナル配列を組み込ん
でもよい。核移行シグナル配列はアデノウイルスベクタ
ーにより感染細胞の核内で発現され核外に分泌された外
来遺伝子産物が再び核内に移行することを促進する（Da
niel Kalderon et al., Cell 39 , 499-509 (1984)) 。

【００１０】本発明者らは、ウイルス組み込みの結果を
明確にするために、以下には１例として、新たなベクタ
ーであるＡｘＣＡＮＬａｃＺを用いる。このＡｘＣＡＮ
ＬａｃＺは、外来遺伝子（ＬａｃＺ）により発現するβ
−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性の同定のため
に、トランスジェニックマウスで普遍的発現に用いられ
るＣＡＧプロモーターの支配下にある核標的化されたＬ
ａｃＺ遺伝子を含む。このベクターの調製は以下のよう
にして行うことができる〔Kanegae,Y. et al., Nucleic
Acids Research, 1995, vol. 23, 3816-3821 〕。例え
ば、Kanegae らの方法により、アデノウイルスの複製に
必要なＥ１Ａ蛋白質を産生させず、外来遺伝子を発現す
るように設計し、また細胞および組織での発現を確認で
きるように、ＣＡＧプロモーターの支配下に大腸菌由来
のＬａｃＺ遺伝子を挿入することにより調製できる。

【００１１】本発明に用いられる外来遺伝子としては、
特に限定されるものではなく、その有用性の観点から、
生理活性タンパク、抗体、マーカー遺伝子としての発色
タンパク、マーカー遺伝子としての薬剤耐性タンパク等
をコードする塩基配列を有するヌクレオチドが挙げられ
る。生理活性タンパクとしては、サイトカイン類（例え
ば、インターロイキン−１〜１５、インターフェロン−
α，βもしくはγ、腫瘍壊死因子−αもしくはβ、顆粒
球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、成長ホルモ
ン、インシュリン、インシュリン様成長ホルモン等）、
神経栄養因子類、α−１アンチトリプシン、血液凝固第
８因子、血液凝固第９因子、α−ガラクトシダーゼ等が
挙げられる。マーカー遺伝子としての発色タンパクとし
ては、β−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰ（Green fluoresc
ent protein)等が挙げられる。マーカー遺伝子としての
薬剤耐性タンパクとしては、アミノグリコシドフォスフ
ォトランスフェラーゼ等が挙げられる。

【００１２】本発明のトランスジェニック動物を作成す
る方法は、以下のようにして行うことができる。本発明
において、トランスジェニック動物とは、生殖系に導入
された外来遺伝子を含有するヒト以外の哺乳動物をい
う。このような動物としてはマウス、ラット、ウサギ、
モルモット、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ等が挙げられ
る。

【００１３】以下にマウスを例として、トランスジェニ
ック動物の典型的な作成方法を説明する。まず、雌マウ
スにＰＭＳＧ（ウマ絨毛性性腺刺激ホルモン）、ｈＣＧ
（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）を腹腔内に注射して過
排卵を誘起する。精子提供用の雄には同系統の雄マウス
を用いる。培養およびウイルスとの反応は、すべて５％
ＣＯ₂、９５％空気、３７℃の条件で行う。ｈＣＧの投
与後１６時間に、卵丘細胞に包まれた未受精卵をＴＹＨ
( マウス体外受精用培地 (Toyoda et al., Jpn. J. Ani
m. Reprod. 16 , 147-151 (1971)))中に採取し、予めＴ
ＹＨで２時間前培養を行った精子を最終濃度が１５０精
子／μＬとなるように加えて体外受精を行う。受精して
から３〜６時間後に受精卵をＷＭ・ＥＤＴＡ（受精卵発
生用培地（Hoshi et al., Jpn. J. Zootech. Sci. 56,
931-937 (1985)))に移し、ヒアルロニダーゼおよび酸性
タイロード液（ｐＨ２．５）で卵丘細胞および卵膜を除
去する。次に、ＡｘＣＡＮＬａｃＺ等の、外来遺伝子の
導入された非増殖型アデノウイルスを１０⁶〜１０⁸ｐ
ｆｕ／ｍｌ、好ましくは５×１０⁷〜１０⁸ｐｆｕ／ｍ
ｌの投与量で、該ウイルスとの反応時間を２〜８時間と
してウイルス感染を行う。

【００１４】ウイルス感染後の胚を借り親マウスの子宮
に移植する。

【００１５】得られた産仔のゲノムに外来遺伝子の導入
された非増殖型アデノウイルスが伝達されたか否かを確
認する。

【００１６】次に、以上のようにして得られたトランス
ジェニックマウスと野生型のマウスとを交配して得られ
る子孫のＦ１において、該トランスジーンが安定に伝達
され、組換え非増殖型アデノウイルス由来の外来遺伝子
が発現していることを確認する。

【００１７】以上のようにして得られるトランスジェニ
ックマウスについては、以下のような性質が観察され
る。後述の実施例において示すように、３匹のマウスす
べてにおいて、１コピーの組み込み、すなわち完全なア
デノウイルスＤＮＡが観察される（図１）。これに反し
て、卵子の前核中にＤＮＡをマイクロインジェクション
した場合には、トランスジェニック動物への組み込み
は、縦列の頭一尾方式で配列された多数のトランスジー
ンのクラスターとなって生ずる。これらの現象は、アデ
ノウイルスの末端蛋白質が、裸のＤＮＡ分子の場合と異
なり、マウス卵子中でのウイルスゲノムの縦列形成を阻
止しているのかも知れない。

【００１８】メンデルの法則に従った安定な生殖細胞系
遺伝が認められるが、この事実は、アデノウイルスゲノ
ムの組み込みが１−細胞期におけるＤＮＡ合成の期間前
または期間中に起こったことを示す。前核中へのＤＮＡ
のマイクロジェクションの場合には、１−細胞期の受精
卵への遺伝子の組み込みが約７０％の頻度で起こること
が報告されている（Bishop et al., Mol. Biol. Med.,
6 , 283-298 (1989))。レトロウイルスベクターの他の
場合は、分裂中の胚（好ましくは４−または８−細胞
期）に感染するときは（Rubenstein et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 83, 366-368 (1986))、前ウイル
ス組み込み（proviral integration) が１個以上の細胞
中で独立に起こり得る。従って、生殖細胞系遺伝率は、
モザイク形成により（Jaenisch et al., Cell 24, 519-
529 (1981)) 、一般的に低い。

【００１９】Ｆ１子孫へのアデノウイルストランスジー
ンの遺伝の場合は、転位は一切示されない（図３）。こ
れに反して、ウイルス複製と宿主細胞に対する細胞毒性
の誘導を支配するＥ１Ａ遺伝子を含む野生型のアデノウ
イルスの場合の組み込み事象は、培養された細胞系中で
多くの転位が起こるようにみえる（Dorsch, M. K. eta
l., J. Virol. 34, 305-314 (1980)、Visser, L. et a
l., J. Virol. 39, 684-693 (1981))。一つの可能性
は、細胞毒性をもつＥ１Ａ遺伝子の欠損により、組み込
まれたアデノウイルスＤＮＡが、マウスの１−細胞から
生殖細胞系へゲノム中で安定な状態で維持されるという
ものである。

【００２０】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらによって制限されるものでは
ない。なお、実施例中のコスミド、ＤＮＡ、各種酵素、
大腸菌、培養細胞などを取り扱う諸操作およびサザン分
析は、特に断らない限り、「Molecular Cloning A Labo
ratory Manual. T. Maniatisら編、第 2版 (1989) ，Co
ld Spring Harbor Laboratory 」に記載の方法に準じて
行った。

【００２１】実施例１（組換えアデノウイルスゲノムの
卵子前核における転写および翻訳の確認）まず、卵膜の存在または非存在の状態で、前核期にある
１−細胞卵子に感染するＡｘＣＡＮＬａｃＺの能力を試
験した。マウスの１−細胞卵を卵膜を有するまま又は卵
膜を除去したのち、１×１０⁸ｐｆｕ／ｍｌのＡｘＣＡ
ＮＬａｃＺ（核移行シグナルを有するアデノウイルス）
で感染させた。感染させた卵子を培養し、感染２４時間
後の２−細胞期で染色した。β−ガラクトシダーゼ活性
は、組織化学的（Ｘ−Ｇａｌ）染色（Beddingtonet a
l., Development 106, 37-46 (1989)) により検出し
た。その結果、、β−ｇａｌ活性は、感染卵から発育し
た２−細胞胚（ウイルス感染２４時間後）の核中に、明
確に局在していることが分かった。この結果は、組換え
アデノウイルスゲノムが卵子の前核中に移行し、そして
感染後２４時間以内に転写／翻訳されることを示した。
他方、卵膜の存在下では、β−ｇａｌ活性は検出されな
かった。従って、卵膜の除去は、感染のための前提条件
である。

【００２２】実施例２（組換えアデノウイルスゲノムの
卵子ゲノムへの組み込みの確認）アデノウイルスゲノムがマウス卵子ゲノム中に組み込ま
れたか否かを明らかにするために、blastocyst（培養４
日後）における感染胚を借り親の子宮に移植した。２７
匹の生まれたマウスの尾静脈血から単離したゲノムＤＮ
Ａを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄIII で消化し
た。サザンブロット分析を行うと、図１に示すように、
３匹のものはアデノウイルスＤＮＡを含んでいた。２〜
４レーンはそれぞれ、ウイルスの内部断片と同定され
た。そして、宿主ゲノムへのアデノウイルスゲノムの組
み込みにより生じたウイルス−細胞ＤＮＡの連結断片と
推定されたものに星印を付した。３匹のマウス（ＡＣＬ
9.1 、9.3 および9.23）はすべて、１個のアデノウイル
スゲノムを保持し、以上の分析により、アデノウイルス
ゲノムはマウスゲノム中にランダムに組み込まれたこと
が分かった。

【００２３】＜実験方法＞マウスのゲノムＤＮＡ（１０
μｇ）をＥｃｏＲＶまたはＨｉｎｄIII で消化し、１．
０％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜ハイボン
ド−Ｎ（アマシャム社製）上にブロットし、そしてラン
ダムにジゴキシゲニン標識されたプローブにハイブリダ
イズさせ、サザン分析を行った。

【００２４】実施例３（トランスジェニック動物中での
外来遺伝子ＬａｃＺの発現）さらに、本発明者らは、この３匹のトランスジェニック
動物中での外来遺伝子ＬａｃＺの発現を試験した。耳の
パンチングにより採取した組織片を常法によりＸ−ｇａ
ｌ染色法（Beddington et al., Development 106, 37-4
6 (1989)) で染色した。３匹のトランスジェニック動物
のうち２匹（ＡＣＬ9.3 と9.23）において実際にβ−ｇ
ａｌ活性が検出された。しかし他の１匹（ＡＣＬ9.1)で
は検出されなかった。

【００２５】実施例４（子孫Ｆ１への組換えアデノウイ
ルスの伝達）アデノウイルスＤＮＡが子孫Ｆ１に伝達したか否かを確
かめるために、３匹のトランスジェニックマウスをＩＣ
Ｒ系マウスと自然交配させた。トランスジェニックマウ
スの１匹（図１、ＡＣＬ9.23）に由来した妊娠１３．５
日目の１０匹のＦ１の胎盤から単離したゲノムＤＮＡを
ＨｉｎｄIII で消化した。サザン分析により、アデノウ
イルストランスジーン（transgene)はＦ１子孫１０匹の
中の６匹に伝達したことが分かった（図３）。これらの
断片パターン（図３、レーン１、３、４、７、８および
１０）は、親のトランスジェニックマウスの断片パター
ン（図３、レーンＡＣＬ９．２３）と一致した。他の２
匹のトランスジェニックマウス（ＡＣＬ9.1 およびＡＣ
Ｌ9.3)のウイルストランスジーンも子孫Ｆ１に伝達した
（それぞれ、２１匹中の１１匹および１３匹中の７
匹）。したがって、アデノウイルストランスジーンは、
Ｆ１子孫に安定に遺伝することが確認されたといえる。
アデノウイルストランスジーンの生殖細胞系への伝達は
メンデルの法則に従っており、転位は全く認められなか
った（図３）。

【００２６】実施例５（アデノウイルストランスジーン
の発現の確認）Ｆ１子孫でのアデノウイルストランスジーンの発現をさ
らに検討するために、同じサンプル（図３）由来の１０
匹のＦ１胎仔についてβ−ｇａｌ活性の染色を行った。
全面的かつ強烈な暗青色の染色が１０匹のＦ１胎仔中の
６匹で観察された。このことは、遺伝したアデノウイル
ストランスジーンが実際にＬａｃＺ遺伝子を発現したこ
とを示すものである。対照的にアデノウイルストランス
ジーンを受け取らなかった他の４匹の胎仔は、全く染色
されなかった。他のトランスジェニックマウスの系列に
ついては、ＡＣＬ9.3 由来の１３匹のＦ１胎仔のうちの
７匹がβ−ｇａｌ活性を示した。以上を総合すると、こ
れらのデータは、Ｆ１子孫におけるＬａｃＺ発現がアデ
ノウイルストランスジーンの安定な状態での伝達から生
じたことを明示するものである。

【００２７】＜実験方法＞胎仔全体を、Allen らの方法
（Allen, N. D. et al., Nature 333 ,852-855 (1988))
の改良法によりβ−ｇａｌ活性を調べるためＸ−ｇａｌ
を用いて染色した。すなわち、胎仔を０．５％ホルムア
ルデヒド、２．５％グルタールアルデヒド、および０．
０５％ＮＰ４０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中に
４℃で３０分間浸漬して固定した。そしてさらに１５分
間、２回目の固定を行った。固定された胎仔をリン酸緩
衝液で３回洗浄し、染色溶液（５ｍＭフェリシアン化カ
リウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、０．１％ＮＰ
４０および０．５ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含むリン酸
緩衝液）中に３７℃で４時間インキュベートした。

【００２８】実施例６（組み込まれたアデノウイルスト
ランスジーンは１コピーである）３匹のマウスすべてにおいて、１コピーの組み込み、す
なわち完全なアデノウイルスＤＮＡが観察された（図
１）。これに反して、卵子の前核中にＤＮＡをマイクロ
インジェクションした場合には、トランスジェニック動
物への組み込みは、縦列の頭一尾方式で配列された多数
のトランスジーンのクラスターとなって生ずる。これら
の現象は、アデノウイルスの末端蛋白質が、裸のＤＮＡ
分子の場合と異なり、マウス卵子中でのウイルスゲノム
の縦列形成を阻止しているのかも知れない。

【００２９】実施例７（組み込み効率に対するウイルス
投与の影響）受精卵の卵丘細胞および卵膜を除去した後、表１に記載
の投与量でＡｘＣＡＮＬａｃＺを感染させ、インビトロ
でｂｌａｓｔｏｃｙｓｔまで培養した後、借り親の子宮
に戻した。実際、１×１０⁷、５×１０⁷および１×１
０⁸（ｐｆｕ／ｍｌ）で感染した胚を移植し、それぞれ
５５、３２、および３６匹の動物個体が得られた。これ
らの個体について、ＬａｃＺ遺伝子をプローブとするサ
ザンブロット解析により得られた結果を表１に示す。表
１から明らかなように、ウイルスの投与量が１×１０⁷
ｐｆｕ／ｍｌの場合（２／５５）に比べて、５×１０⁷
ｐｆｕ／ｍｌの場合（４／３２）および１×１０⁸ｐｆ
ｕ／ｍｌの場合（４／３６）は、組み込み効率が飛躍的
に向上することが分かる。これは、通常のウイルス感染
の場合と異なりウイルス投与量の増加による動物細胞の
死滅を考慮する必要がないため、ウイルス投与量の高い
方が効率が向上するという結果が得られたものと思われ
る。

【００３０】

【表１】

【００３１】

【発明の効果】本発明の方法によって簡便かつ効率的に
トランスジェニック動物を作成することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、非増殖型アデノウイルスＤＮＡの組み
込みのサザン分析による同定を示す電気泳動の写真であ
る。２７匹の動物の尾から単離されたゲノムＤＮＡをＥ
ｃｏＲＶおよびＨｉｎｄIII で消化し、ＡｘＣＡＮＬａ
ｃＺ配列と９８％の相同性を有するｐＡｘＣＡＮＬａｃ
ＺのコスミドＤＮＡをプローブとして用いた。ａはＥｃ
ｏＲＶ消化、ｂはＨｉｎｄIII 消化のデータである。白
丸は、アデノウイルスの末端断片である。星印は組み込
み事象後のウイルス−細胞ＤＮＡの連結断片を示す。

【図２】図２は、３匹のトランスジェニックマウスゲノ
ムに組み込まれたアデノウイルスＤＮＡを示す。太線は
組換えアデノウイルスＡｘＣＡＮＬａｃＺの制限酵素地
図を示す。

【図３】図３は、Ｆ１子孫への生殖細胞系の遺伝および
Ｆ１上でのアデノウイルストランスジーンの発現を示す
電気泳動の写真である。ＬａｃＺ発現性のトランスジェ
ニックマウス（ＡＣＬ9.23）をＩＣＲ雌と交配させ、発
生した１０匹のＦ１胎仔を妊娠後１３．５日に試験に供
した。その１０個の胎盤から単離されたゲノムＤＮＡを
図１に示すものと同様の手順によりサザン分析に付し
た。レーン１、３、４、７、８および１０はアデノウイ
ルストランスジーンの伝達があったことを示し、レーン
２、５、６および９は、かかる伝達がなかったことを示
す。星印は組み込み事象後のウイルス−細胞ＤＮＡの連
結断片を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】外来遺伝子を導入した非増殖型組換えア
デノウイルスを卵膜を除去した動物受精卵に感染させた
後、この胚を借り親動物の子宮に移植することを特徴と
するトランスジェニック動物の作成方法。
【請求項２】外来遺伝子が、生理活性タンパク、抗
体、マーカー遺伝子としての発色タンパクまたはマーカ
ー遺伝子としての薬剤耐性タンパクをコードする塩基配
列を有するヌクレオチドである請求項１記載のトランス
ジェニック動物の作成方法。
【請求項３】非増殖型組換えアデノウイルスを卵膜を
除去した動物受精卵に感染させる場合の投与量が５×１
０⁷〜１０⁸ｐｆｕ／ｍｌであることを特徴とする請求
項１または請求項２記載のトランスジェニック動物の作
成方法。
【請求項４】非増殖型組換えアデノウイルスが、ＣＡ
Ｇプロモーター支配下に発現するものである請求項１〜
請求項３いずれか１項に記載のトランスジェニック動物
の作成方法。
【請求項５】非増殖型組換えアデノウイルスが、核移
行シグナルを含むものである請求項１〜請求項４いずれ
か１項に記載のトランスジェニック動物の作成方法。
【請求項６】外来遺伝子を導入した非増殖型組換えア
デノウイルスの１コピーだけが動物受精卵のゲノムに組
み込まれることを特徴とする請求項１〜請求項５いずれ
か１項に記載のトランスジェニック動物の作成方法。
【請求項７】外来遺伝子を導入した非増殖型組換えア
デノウイルスを卵膜を除去した動物受精卵に感染させた
後、この胚を借り親動物の子宮に移植することによって
作成されたトランスジェニック動物。