ES2235177T3 - Hibridacion comparativa con conjuntos ordenados de acidos nucleicos. - Google Patents
Hibridacion comparativa con conjuntos ordenados de acidos nucleicos.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA METODOS PARA DETERMINAR UN NUMERO RELATIVO DE COPIAS DE ACIDOS NUCLEICOS DIANA Y PARA MAPEAR DE FORMA PRECISA ANORMALIDADES CROMOSOMICAS ASOCIADAS CON ENFERMEDADES. LOS METODOS DE LA INVENCION UTILIZAN ACIDOS NUCLEICOS DIANA INMOVILIZADOS SOBRE UNA SUPERFICIE SOLIDA A LA QUE SE HIBRIDA UNA MUESTRA QUE INCLUYE DOS CONJUNTOS DE ACIDOS NUCLEICOS MARCADOS DIFERENCIALMENTE. LA HIBRIDACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS MARCADOS A LA SUPERFICIE SOLIDA SE DETECTA DESPUES UTILIZANDO TECNICAS ESTANDAR.
Description
Hibridación comparativa con conjuntos ordenados
de ácidos nucleicos.
La presente invención se refiere a métodos para
detectar y cartografiar anormalidades genéticas asociadas a diversas
enfermedades. En particular, se refiere al uso de métodos de
hibridación de ácido nucleico para comparar los números de copias de
secuencias de ácido nucleico particulares en una colección de
secuencias respecto al número de copias de estas secuencias en otras
colecciones de secuencias.
Muchos estudios genómicos y genéticos están
dirigidos a la identificación de diferencias en la dotación o
expresión génica entre poblaciones celulares para el estudio y la
detección de enfermedades. Por ejemplo, muchas malignidades implican
la ganancia o pérdida de secuencias de ADN que dan como resultado la
activación de oncogenes o la inactivación de genes supresores de
tumores. La identificación de los eventos genéticos que conducen a
la transformación neoplásica y la posterior progresión pueden
facilitar los esfuerzos para definir la base biológica de la
enfermedad, mejorar el pronóstico de la respuesta terapéutica y
permitir una detección de tumor más temprana.
Además, los problemas genéticos perinatales
resultan frecuentemente de la pérdida o ganancia de segmentos
cromosómicos tales como la trisomía 21 o los síndromes de
microdeleción. Por tanto, los métodos de detección prenatal de
dichas anormalidades pueden ser provechosos en el diagnóstico
temprano de enfermedades.
La citogenética es el método tradicional para
detectar regiones cromosómicas amplificadas o eliminadas. La
resolución de las técnicas citogenéticas está limitada, sin embargo,
a regiones mayores de aproximadamente 10 Mb (aproximadamente la
anchura de una banda en cromosomas teñidos con Giemsa). En
cariotipos complejos con translocaciones múltiples y otros cambios
genéticos, el análisis citogenético tradicional es de poca utilidad
debido a que la información del cariotipo no puede interpretarse
completamente. Además, el análisis de bandas citogenético
convencional consume tiempo, es de trabajo intenso y frecuentemente
difícil o imposible debido a las dificultades para obtener
cromosomas en metafase adecuados. Además, las señales citogenéticas
de amplificación génica, regiones teñidas homogéneamente (HSR) o
cromosomas dobles diminutos no proporcionan ninguna información que
contribuya a la identificación de las secuencias que se
amplifican.
Métodos más recientes permiten evaluar la
cantidad de secuencia de un ácido nucleico dado en una muestra
utilizando técnicas moleculares. Estos métodos (por ejemplo
transferencia Southern) emplean sondas de ADN o ARN clonado que
hibridan con ADN aislado. La transferencia Southern y técnicas
relacionadas son eficaces incluso si el genoma se transpone en gran
medida de modo que se elimina información de cariotipo útil. Sin
embargo, estos métodos requieren el uso de una sonda específica de
la secuencia a analizar. Por tanto, es necesario emplear muchas
sondas individuales, una cada vez, para examinar el genoma entero de
cada espécimen si no está disponible información anterior sobre
regiones sospechosas particulares del genoma.
La hibridación genómica comparativa (HGC) es un
enfoque más reciente para detectar la presencia e identificar la
localización de secuencias amplificadas o eliminadas. Véanse
Kallioniemi et al., Science 258:
818-821 (1992), Kallioniemi et al., Genes,
Chromosomes and Cancer 10: 231-243 (1994) y el
documento WO 93/18186). La HGC revela aumentos y reducciones
independientemente de la transposición genómica. En una
implementación de la HGC, se aísla ADN genómico de células de
referencia normales, así como de células de ensayo (por ejemplo
células tumorales). Se marcan diferentemente los dos ácidos
nucleicos y después se hibridan in situ con cromosomas en
metafase de una célula de referencia. Se eliminan las secuencias
repetitivas o bien se reduce de algún modo su capacidad de
hibridación tanto en los ADN de referencia como de ensayo. Las
regiones cromosómicas en las células de ensayo que están a un número
de copias aumentado o reducido pueden identificarse rápidamente
detectando regiones en que la relación de señal de los dos ADN está
alterada. Por ejemplo, aquellas regiones en que se ha reducido el
número de copias en las células de ensayo mostrarán una señal
relativamente menor del ADN de ensayo que la referencia en
comparación con otras regiones del genoma. Las regiones en que ha
aumentado el número de copias en las células de ensayo mostrarán una
señal relativamente mayor del ADN de ensayo.
Por tanto, la HGC descubre y cartografía la
localización de las secuencias con un número de copias variante sin
conocimiento anterior de la secuencia. No son necesarias sondas de
secuencias específicas y sólo es necesaria una única hibridación.
Cuando la reducción o el aumento del número de copias está limitado
a la pérdida o ganancia de una copia de una secuencia, la resolución
de la HGC es habitualmente de 5-10 Mb.
El documento US 4.981.783 proporciona un método
para el análisis de la expresión génica en biopsia humana. Se
hibrida un conjunto de secuencias de ADN clonado con una sonda
radiactiva preparada utilizando ARN aislado de tejido de biopsia. El
grado de hibridación es proporcional al nivel de expresión de la
secuencia clonada en el tejido de biopsia.
Son particularmente deseables nuevas técnicas que
proporcionen una sensibilidad aumentada, una localización más
precisa de las anormalidades cromosómicas y que puedan detectar
diferencias en los niveles de expresión génica para el diagnóstico
de enfermedades. La presente invención proporciona estos y otros
beneficios.
La presente invención proporciona un método para
comparar el número de copias de secuencias de ácido nucleico en dos
o más colecciones de moléculas de ácido nucleico, comprendiendo el
método:
- (a)
- proporcionar una pluralidad de elementos diana unidos a una superficie sólida, comprendiendo cada elemento diana un ácido nucleico diana, en la que los ácidos nucleicos diana carecen de la superestructura de un cromosoma en metafase condensado;
- (b)
- poner en contacto los elementos diana con:
- (i)
- una primera colección de ácidos nucleicos marcados que comprende una secuencia sustancialmente complementaria de una secuencia nucleotídica diana, y
- (ii)
- al menos una segunda colección de ácidos nucleicos marcados que comprende una secuencia complementaria de la secuencia nucleotídica diana;
- siendo los marcadores utilizados en el marcaje de la primera y segunda colecciones de ácidos nucleicos distinguibles entre sí; y
- (c)
- detectar la cantidad de unión del primer y segundo ácidos nucleicos marcados complementarios de los ácidos nucleicos diana.
Se proporciona también un kit para cuantificar
las secuencias de ácido nucleico en una muestra de ácido nucleico,
comprendiendo el kit:
- (a)
- un soporte sólido que tiene un conjunto de ácidos nucleicos diana preseleccionados unidos al mismo, en el que los ácidos nucleicos diana carecen de la superestructura de un cromosoma en metafase condensado y en el que el conjunto tiene al menos dos miembros;
- (b)
- un envase que contiene ácidos nucleicos de referencia, comprendiendo dichos ácidos nucleicos de referencia secuencias que son complementarias y no complementarias de al menos un miembro del conjunto; y
- (c)
- dos marcadores fluorescentes diferentes.
Cada elemento diana comprende moléculas de ácido
nucleico diana unidas a un soporte sólido. Pueden estar presentes
una o más copias de cada secuencia en un elemento diana. La
complejidad de secuencia de los ácidos nucleicos diana en el
elemento diana es mucho menor que la complejidad de secuencia de la
primera y segunda colecciones de ácidos nucleicos marcados.
Los ácidos nucleicos tanto de los elementos diana
como de las sondas pueden ser, por ejemplo, ARN, ADN o ADNc. Los
ácidos nucleicos pueden derivar de cualquier organismo.
Habitualmente, el ácido nucleico en los elementos diana y las sondas
es de la misma especie.
Los elementos diana puede estar sobre soportes
separados, tales como una pluralidad de perlas, o un conjunto de
elementos diana puede estar sobre una superficie sólida única, tal
como un portaobjetos de microscopio de vidrio. Las secuencias de
ácido nucleico de los ácidos nucleicos diana en un elemento diana
son aquellas de las que se desea información del número de copias
comparativo. Por ejemplo, la secuencia de un elemento puede
originarse a partir de una localización cromosómica conocida por
estar asociada a una enfermedad, puede seleccionase por ser
representativa de una región cromosómica cuya asociación con la
enfermedad ha de ensayarse, o puede corresponder a genes cuya
transcripción ha de ensayarse.
Después de poner en contacto las sondas con los
elementos diana, se determinan la cantidad de unión de cada uno y la
relación de unión para cada elemento diana. Típicamente, cuanto
mayor es la relación de unión a un elemento diana, mayor es la
relación de número de copias de secuencias en las dos sondas que se
unen a ese elemento. Por tanto, la comparación de las relaciones
entre elementos diana permite la comparación de las relaciones de
número de copias de secuencias diferentes en las sondas.
Los métodos se llevan a cabo típicamente
utilizando técnicas adecuadas para hibridación con fluorescencia
in situ. Por tanto, el primer y segundo marcadores son
habitualmente marcadores fluorescentes.
Para inhibir la hibridación de secuencias
repetitivas en las sondas con los ácidos nucleicos diana, pueden
mezclarse ácidos nucleicos bloqueantes no marcados (por ejemplo ADN
C_{0}t-1) con las sondas. Por tanto, la invención
se centra en el análisis de las secuencias no repetitivas en un
genoma.
En una realización típica, se prepara una
colección de ácidos nucleicos de sonda a partir de una célula de
ensayo, población celular o tejido en estudio; y se prepara la
segunda colección de ácidos nucleicos de sonda a partir de una
célula, población celular o tejido de referencia. Las células de
referencia pueden ser células normales no enfermas, o puede ser de
una muestra de tejido enfermo que sirve como patrón para otros
aspectos de la enfermedad. Por ejemplo, si la sonda de referencia es
ADN genómico aislado de células normales, entonces es conocido el
número de copias de cada secuencia en esa sonda respecto a las demás
(por ejemplo, dos copias de cada secuencia autosómica, y una o dos
copias de cada secuencia de cromosoma sexual dependiendo del
género). La comparación de ésta con una sonda de ensayo permite la
detección de variaciones de lo normal. Como alternativa, la sonda de
referencia puede prepararse a partir de ADN genómico de un tumor
primario que puede contener variaciones sustanciales en el número de
copias entre sus diferentes secuencias, y la sonda de ensayo puede
prepararse a partir de ADN genómico de células metastásicas de ese
tumor, de modo que la comparación muestra las diferencias entre el
tumor primario y su metástasis. Además, ambas sondas pueden
prepararse a partir de células normales. Por ejemplo, la comparación
de poblaciones de ARNm entre células normales de diferentes tejidos
permite la detección de la expresión génica diferencial, que es un
rasgo crítico de la diferenciación de tejidos. Por tanto, en
general, los términos ensayo y referencia se utilizan por
conveniencia para distinguir las dos sondas, pero no implican otras
características de los ácidos nucleicos que contienen.
La invención proporciona también kits que
comprenden materiales útiles para llevar a cabo los métodos de la
invención. Los kits de la invención comprenden un soporte sólido que
tiene un conjunto de ácidos nucleicos unidos al mismo y un envase
que contiene ácidos nucleicos que representan un genoma de
referencia normal, o ADNc de un tipo celular de referencia, y
similares. El kit comprende adicionalmente dos fluorocromos
diferentes, reactivos para marcar los genomas de ensayo, genomas de
referencia alternativos y similares.
Un "conjunto de ácidos nucleicos" es una
pluralidad de elementos diana, comprendiendo cada uno una o más
moléculas de ácido nucleico diana inmovilizadas sobre una superficie
sólida con las que se hibridan los ácidos nucleicos de sonda.
"Ácidos nucleicos diana" de un elemento
diana tienen típicamente su origen en una región definida del genoma
(por ejemplo un clon o varios clones contiguos de una biblioteca
genómica), o corresponden a una unidad genética funcional, que puede
estar completa o no (por ejemplo un ADNc total o parcial). Los
ácidos nucleicos diana pueden comprender también productos de PCR
inter-Alu o de cebador oligonucleotídico degenerado derivados
de dichos clones. Si se está analizando la expresión génica, un
elemento diana puede comprender un ADNc total o parcial.
Los ácidos nucleicos diana de un elemento diana
pueden contener, por ejemplo, genes específicos o ser de una región
cromosómica sospechosa de estar presente a un número de copias
aumentado o reducido en células de interés, por ejemplo células
tumorales. El elemento diana puede contener también un ARNm, o ADNc
derivado de dicho ARNm, sospechoso de estar transcrito a niveles
anormales.
Como alternativa, un elemento diana puede
comprender ácidos nucleicos de significado o localización
desconocidos. Un conjunto de dichos elementos podría representar
localizaciones que muestrean, continuamente o en puntos discretos,
cualquier porción deseada de un genoma incluyendo, pero sin
limitación, un genoma entero, un cromosoma individual o una porción
de un cromosoma. El número de elementos diana y la complejidad de
los ácidos nucleicos en cada uno determinaría la densidad de
muestreo. Por ejemplo, un conjunto de 300 elementos diana,
conteniendo cada diana ADN de un clon genómico diferente, podría
muestrear el genoma humano completo a intervalos de 10 megabases. Un
conjunto de 30.000 elementos, conteniendo cada uno 100 kb de ADN
genómico, podría proporcionar una cobertura completa del genoma
humano.
De forma similar, un conjunto de elementos diana
que comprende ácidos nucleicos de clones de ADNc anónimo permitiría
la identificación de aquellos que podrían expresarse
diferencialmente en algunas células de interés, centrando así la
atención en el estudio de estos genes.
Pueden utilizarse elementos diana de diversas
dimensiones en los conjuntos de la invención. Generalmente, se
prefieren elementos diana más pequeños. Típicamente, un elemento
diana será menor de aproximadamente 1 cm de diámetro. Generalmente,
los tamaños de elemento son de 1 \mum a aproximadamente 3 mm,
preferiblemente entre aproximadamente 5 \mum y aproximadamente 1
mm.
Los elementos diana de los conjuntos pueden
disponerse sobre la superficie sólida a diferentes densidades. Las
densidades de elemento diana dependerán de una serie de factores,
tales como la naturaleza del marcador, el soporte sólido y
similares.
Un experto reconocerá que cada elemento diana
puede comprender una mezcla de ácidos nucleicos diana de diferentes
longitudes y secuencias. Por tanto, por ejemplo, un elemento diana
puede contener más de una copia de un trozo clonado de ADN, y cada
copia puede romperse en fragmentos de diferentes longitudes. La
longitud y complejidad de las secuencias diana de la invención no
son críticas para la invención. Un experto puede ajustar estos
factores para proporcionar una hibridación y producción de señal
óptimas para un procedimiento de hibridación dado, y proporcionar la
resolución necesaria entre diferentes genes o localizaciones
genómicas. Típicamente, las secuencias diana tendrán una complejidad
entre aproximadamente 1 kb y aproximadamente 1 Mb.
Las dianas de la invención son ácidos nucleicos
que carecen sustancialmente de la superestructura asociada a
cromosomas en metafase condensados de los que derivan. La naturaleza
general del empaquetamiento de ADN en los cromosomas eucarióticos es
bien conocida por los expertos en la técnica. Brevemente, la
superestructura de un cromosoma eucariótico comprende muchos órdenes
de complejidad. El ADN se arrolla alrededor de un núcleo de histona
para formar nucleosomas repetitivos regulares, que a su vez se
empaquetan uno sobre otro para generar fibras de cromatina más
estrechamente condensadas de 30 nm. Las fibras de cromatina se
empaquetan después en una variedad de dominios en bucle para
producir órdenes superiores de plegamiento y condensación en el
cromosoma en metafase. Las dianas de ácido nucleico de la invención
carecen de todos o algunos de estos rasgos de los cromosomas en
metafase condensados de origen natural. Para una descripción general
de la estructura global de los cromosomas eucarióticos véase Alberts
et al., "Molecular Biology of the Cell", 2ª ed., pág.
496-506, Garland Publishing Inc. Nueva York,
1989).
Las expresiones "ácido nucleico" o
"molécula de ácido nucleico" designan un polímero de
desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma mono- o
bicatenaria, y a menos que se limite de otro modo, abarcaría
análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de
manera similar a los nucleótidos de origen natural.
Como se utiliza en la presente memoria, una
"sonda" se define como una colección de moléculas de ácido
nucleico (ARN o ADN) capaces de unirse a un ácido nucleico diana de
secuencia complementaria mediante uno o más tipos de enlaces
químicos, habitualmente mediante la formación de puente de
hidrógeno. Las sondas se marcan preferiblemente directa o
indirectamente como se describe a continuación. Son típicamente de
alta complejidad, preparándose por ejemplo a partir de ADN genómico
o ARNm aislado de una célula o población celular.
El término "complejidad" se utiliza aquí
según el significado estándar de este término establecido por
Britten et al. Methods of Enzimol. 29: 363 (1974).
Véase también Cantor y Schimmel, "Biophysical Chemistry: Part
III" en las pág. 1228-1230 para una explicación
adicional de la complejidad de ácido nucleico.
"Se une(n) sustancialmente" designa
una hibridación complementaria entre un ácido nucleico de sonda y un
ácido nucleico diana y abarca desapareamientos menores que pueden
acomodarse reduciendo el rigor del medio de hibridación para
conseguir la detección deseada de la secuencia polinucleotídica
diana.
Las expresiones "hibridación específica" o
"hibrida específicamente con" designan hibridación en la que un
ácido nucleico de sonda se une sustancialmente a un ácido nucleico
diana y no se une sustancialmente a otros ácidos nucleicos del
conjunto en condiciones de rigor definido. Un experto reconocerá que
relajar el rigor de las condiciones de hibridación permitirá que se
toleren desapareamientos de secuencia. El grado de desapareamiento
tolerado puede controlarse mediante un ajuste adecuado de las
condiciones de hibridación.
Un experto reconocerá también que la secuencia
precisa de los ácidos nucleicos particulares descritos en la
presente memoria puede modificarse en un cierto grado para producir
sondas o dianas que sean "sustancialmente idénticas" a otras, y
retengan la capacidad de unirse sustancialmente a un ácido nucleico
complementario. Dichas modificaciones están específicamente
cubiertas por la referencia a secuencias individuales en la presente
memoria. La expresión "identidad sustancial" de secuencias
polinucleotídicas significa que un polinucleótido comprende una
secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia, y más
preferiblemente al menos 95%, en comparación con una secuencia de
referencia utilizando los métodos descritos a continuación que
utilizan parámetros estándar.
Se dice que dos secuencias de ácido nucleico son
"idénticas" si la secuencia de nucleótidos en las dos
secuencias es la misma cuando se alinean para correspondencia máxima
como se describe a continuación. La expresión "complementario
de" se utiliza en la presente memoria para indicar que la
secuencia complementaria es complementaria de toda o parte de una
secuencia polinucleotídica de referencia.
Las comparaciones de secuencia entre dos (o más)
polinucleótidos se realizan típicamente comparando secuencias de las
dos secuencias a lo largo de una "ventana de comparación" para
identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia.
Una "ventana de comparación", como se utiliza en la presente
memoria, designa un segmento de al menos aproximadamente 20
posiciones contiguas, habitualmente de aproximadamente 50 a
aproximadamente al menos 200, más habitualmente de aproximadamente
100 a aproximadamente 150, en el que puede compararse una secuencia
con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones
contiguas después de alinear óptimamente las dos secuencias.
El alineamiento óptimo de secuencias para
comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología
local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981),
mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y
Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 (1970), mediante el método de
búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.
(U.S.A.) 85: 2444 (1988) y mediante implementaciones
informáticas de estos algoritmos.
El "porcentaje de identidad de secuencia" se
determina comparando en dos secuencias alineadas óptimamente a lo
largo de una ventana de comparación, pudiendo comprender la parte de
secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación adiciones o
deleciones (por ejemplo huecos) en comparación con la secuencia de
referencia (que no comprende adiciones ni deleciones), el
alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula
determinando el número de posiciones en las que aparece la base de
ácido nucleico idéntica en ambas secuencias para proporcionar el
número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de
posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la
ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para
proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia.
Otra indicación de que las secuencias
nucleotídicas son sustancialmente idénticas es si dos moléculas
hibridan con la misma secuencia en condiciones rigurosas. Las
condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en
circunstancias diferentes. Generalmente, las condiciones rigurosas
se seleccionan para ser de aproximadamente 5ºC menos que el punto de
fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica
y pH definidos. La Tm es la temperatura (a fuerza iónica y pH
definidos) a la que un 50% de la secuencia diana hibrida con una
sonda perfectamente coincidente.
La Figura 1 muestra microfotografías de
experimentos que muestran la capacidad de los métodos de la
invención de detectar una amplificación del oncogén cMYC. Se
hibridaron ADN de Colo-320, que contiene una
amplificación del oncogén cMYC, y ADN humano normal marcado con un
conjunto consistente en dos elementos diana. Un elemento diana
contenía secuencias del oncogén cMYC clonado, y el otro contenía
secuencias clonadas de una región del genoma humano (21D7) conocida
por no estar amplificada en la estirpe celular
Colo-320. Cada elemento diana comprende fragmentos
monocatenarios correspondientes a un clon. Se inmovilizaron los
fragmentos sobre partículas de vidrio recubiertas de avidina.
La presente invención proporciona métodos para
comparar el número de copias de ácido nucleico anormal. Los métodos
de la invención utilizan ácidos nucleicos diana inmovilizados sobre
un soporte sólido, con los que hibridan ácidos nucleicos de sonda
marcados diferencialmente. La hibridación de los ácidos nucleicos
marcados con la diana se detecta después utilizando técnicas
estándar.
Los métodos de la invención comparan los números
de copias de secuencias capaces de unirse a los elementos diana. Las
variaciones en el número de copias detectables mediante los métodos
de la invención pueden surgir de diferentes modos. Por ejemplo, el
número de copias puede alterarse como resultado de la amplificación
o deleción de una región cromosómica. Como alternativa, el número de
copias puede reducirse mediante transposiciones genéticas que
alteran las secuencias en los ácidos nucleicos de sonda o diana
suficientemente como para reducir su unión.
Los ácidos nucleicos diana de la invención pueden
derivar virtualmente de cualquier fuente. Típicamente, las dianas
serán moléculas de ácido nucleico derivadas de localizaciones
representativas a lo largo de un cromosoma de interés, una región
cromosómica de interés, una biblioteca de ADNc y similares. Estos
ácidos nucleicos diana pueden ser fragmentos relativamente largos
(típicamente de miles de bases) de ácido nucleico obtenidos, por
ejemplo, de productos de PCR inter-Alu de clones genómicos,
digestiones de restricción de clon genómico, clones de ADNc y
similares. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos diana son
una biblioteca previamente cartografiada de clones que se extiende
por una región particular de interés.
La elección de los ácidos nucleicos diana para
utilizar puede estar influenciada por el conocimiento previo de la
asociación de un cromosoma o región cromosómica particular con
ciertas afecciones patológicas. La solicitud internacional WO
93/18186, supra, proporciona una lista de anormalidades
cromosómicas y enfermedades asociadas que se describen en la
bibliografía científica. Como alternativa, puede realizarse un
examen del genoma completo para identificar una nueva región sujeta
a frecuentes cambios en el número de copias utilizando los métodos
de la presente invención. En estas realizaciones, los elementos
diana contienen habitualmente ácidos nucleicos representativos de
localizaciones distribuidas a lo largo del genoma completo. En
algunas realizaciones (por ejemplo, utilizando un gran número de
elementos diana de alta complejidad), todas las secuencias en el
genoma pueden estar presentes en el conjunto.
En algunas realizaciones, se utilizan clones
previamente cartografiados de una región cromosómica particular de
interés como dianas. Dichos clones se están haciendo disponibles
como resultado del rápido progreso de la iniciativa mundial en
genómica.
Los clones cartografiados pueden prepararse a
partir de bibliotecas construidas a partir de cromosomas
individuales, cromosomas múltiples o a partir de un segmento de un
cromosoma. Se utilizan técnicas estándar para clonar fragmentos de
tamaño adecuado en vectores tales como cósmidos, cromosomas
artificiales de levadura (YAC), cromosomas artificiales bacterianos
(BAC) y fago P1.
Aunque es posible generar bibliotecas de clones
como se describe anteriormente, están también disponibles
comercialmente bibliotecas que se extienden por cromosomas
completos. Por ejemplo, están disponibles bibliotecas específicas de
cromosoma de genomas humano y otros en Clonetec (South San
Francisco, CA) o en la American Type Culture Collection (véase
"ATCC/NIH Repository of Catalogue of Human and Mouse DNA Probes
and Libraries", 7ª ed., 1993).
Si es necesario, los clones descritos
anteriormente pueden cartografiarse genética o físicamente. Por
ejemplo, pueden utilizarse FISH y análisis de imagen digital para
localizar cósmidos a lo largo del cromosoma deseado. Este método se
describe, por ejemplo, en Lichter et al., Science,
247: 64-69 (1990). Los clones cartografiados
físicamente pueden utilizarse entonces para cartografiar más
detalladamente una región de interés identificada utilizando HGC u
otros métodos.
Son conocidos en la técnica muchos métodos para
inmovilizar ácidos nucleicos sobre una variedad de superficies
sólidas. Por ejemplo, la superficie sólida puede ser una membrana,
vidrio, plástico o una perla. El componente deseado puede estar
unido covalentemente o no covalentemente mediante unión no
específica. La inmovilización de ácidos nucleicos sobre superficies
sólidas se discute con más detalle a continuación.
Pueden emplearse una gran variedad de polímeros
orgánicos e inorgánicos, así como otros materiales tanto naturales
como sintéticos, como material para la superficie sólida. Las
superficies sólidas ilustrativas incluyen nitrocelulosa, nailon,
vidrio, membranas diazotizadas (papel o nailon), siliconas,
poliformaldehído, celulosa y celulosa acetato. Además, pueden
utilizarse plásticos tales como polietileno, polipropileno,
poliestireno y similares. Otros materiales que pueden emplearse
incluyen papel, cerámica, metales, metaloides, materiales
semiconductores, cerametales o similares. Además, pueden utilizarse
sustancias que forman geles. Dichos materiales incluyen proteínas
(por ejemplo gelatinas), lipopolisacáridos, silicatos, agarosa y
poliacrilamidas. Cuando la superficie del sólido es porosa, pueden
emplearse diversos tamaños de poro dependiendo de la naturaleza del
sistema.
Al preparar la superficie, pueden emplearse una
pluralidad de materiales diferentes, particularmente en forma de
laminados, para obtener diversas propiedades. Por ejemplo, pueden
emplearse proteínas (por ejemplo albúmina de suero bovino) o mezclas
de macromoléculas (por ejemplo solución de Denhardt) para evitar la
unión no específica, simplificar la conjugación covalente, potenciar
la detección de señal o similar.
Si se desea la unión covalente entre un compuesto
y la superficie, la superficie será habitualmente polifuncional o
capaz de ser polifuncionalizada. Los grupos funcionales que pueden
estar presentes sobre la superficie y utilizarse para ligamiento
pueden incluir ácidos carboxílicos, aldehídos, grupos amino, grupos
ciano, grupos etilénicos, grupos hidroxilo, grupos mercapto y
similares. Es conocido el modo de ligamiento de una amplia variedad
de compuestos a diversas superficies y está ampliamente ilustrado en
la bibliografía. Por ejemplo, son conocidos métodos para inmovilizar
ácidos nucleicos mediante la introducción de diversos grupos
funcionales en moléculas (véase, por ejemplo, Bischoff et
al., Anal. Biochem. 164: 336-344 (1987);
Kremsky et al., Nuc. Acids Res. 15:
2891-2910 (1987)). Los nucleótidos modificados
pueden disponerse en la diana utilizando cebadores de PCR que
contienen el nucleótido modificado, o mediante marcaje enzimático de
extremo con nucleótidos modificados.
El uso de soportes de membrana (por ejemplo
nitrocelulosa, nailon, polipropileno) para los conjuntos de ácido
nucleico de la invención es ventajoso debido a la bien desarrollada
tecnología que emplea métodos manuales y robóticos de disposición de
dianas a densidades de elemento relativamente altas (por ejemplo
hasta 30-40/cm^{2}). Además, dichas membranas
están generalmente disponibles y los protocolos y equipo para
hibridación a membranas son bien conocidos. Sin embargo, muchos
materiales de membrana tienen una considerable emisión de
fluorescencia cuando se utilizan marcadores fluorescentes para
detectar la hibridación.
Para optimizar un formato de ensayo dado, un
experto puede determinar la sensibilidad de la detección de
fluorescencia para diferentes combinaciones de tipo de membrana,
fluorocromo, bandas de excitación y emisión, tamaño de punto y
similares. Además, se han descrito membranas de baja fluorescencia
de fondo (véase por ejemplo Chu et al.,
Electrophoresis 13: 105-114 (1992)).
La sensibilidad para la detección de puntos de
diversos diámetros sobre las membranas candidatas puede determinarse
fácilmente, por ejemplo, colocando una serie de dilución de
fragmentos de ADN marcados fluorescentemente en el extremo. Estos
puntos se visualizan después utilizando microscopía de fluorescencia
convencional. Pueden determinarse así la sensibilidad, linealidad e
intervalo dinámico obtenibles por las diversas combinaciones de
fluorocromo y membranas. Las diluciones en serie de pares de
fluorocromo en proporciones relativas conocidas puede analizarse
también para determinar la exactitud con la que las medidas de
relación de fluorescencia reflejan las relaciones de fluorocromo
reales a lo largo del intervalo dinámico permitido por los
detectores y la fluorescencia de membrana.
Los conjuntos sobre sustratos con fluorescencia
mucho menor que las membranas, tales como vidrio, cuarzo o perlas
pequeñas, pueden conseguir una sensibilidad mucho mejor. Por
ejemplo, pueden utilizarse elementos de diversos tamaños, en el
intervalo de \sim1 mm de diámetro hasta \sim1 \mum, con estos
materiales. Se utilizan convenientemente miembros de conjunto
pequeños que contienen pequeñas cantidades de ADN diana concentrado
para hibridaciones comparativas de alta complejidad, puesto que la
cantidad total de sonda disponible para unión a cada elemento estará
limitada. Por tanto, es ventajoso tener miembros de conjunto
pequeños que contengan una pequeña cantidad de ADN diana concentrado
de modo que la señal que se obtiene sea altamente localizada y
brillante. Dichos miembros de conjunto pequeños se utilizan
típicamente en conjuntos con densidades mayores de
10^{4}/cm^{2}. Se han descrito enfoques relativamente simples
capaces de visualización fluorescente cuantitativa de áreas de 1
cm^{2}, que permiten la adquisición de datos a partir de un gran
número de miembros en una sola imagen (véase, por ejemplo, Wittrup
et al., Cytometry 16: 206-213
(1994)).
La unión covalente de los ácidos nucleicos diana
a vidrio o sílice fundida sintética puede lograrse según una serie
de técnicas conocidas. Dichos sustratos proporcionan un sustrato de
muy baja fluorescencia, y un entorno de hibridación altamente
eficaz.
Existen muchos posibles enfoques para acoplar
ácidos nucleicos con vidrio que emplean reactivos comercialmente
disponibles. Por ejemplo, están comercialmente disponibles
materiales para la preparación de vidrio silanizado con una serie de
grupos funcionales, o pueden prepararse utilizando técnicas
estándar. Como alternativa, pueden silanizarse cubreobjetos de
cuarzo, que tienen una autofluorescencia al menos 10 veces menor que
el vidrio.
Las dianas pueden inmovilizarse también sobre
perlas recubiertas comercialmente disponibles u otras superficies.
Por ejemplo, pueden unirse ácidos nucleicos marcados en el extremo
con biotina a perlas recubiertas con avidina comercialmente
disponibles. La estreptavidina o anticuerpo
anti-digoxigenina pueden unirse también a
portaobjetos de vidrio silanizado mediante acoplamiento mediado por
proteína utilizando, por ejemplo, proteína A siguiendo protocolos
estándar (véase, por ejemplo, Smith et al., Science,
258: 1122-1126 (1992)). Pueden prepararse ácidos
nucleicos marcados en el extremo con biotina o digoxigenina según
técnicas estándar.
La hibridación con ácidos nucleicos unidos a
perlas se logra suspendiéndolas en la mezcla de hibridación y
depositándolos después sobre el sustrato de vidrio para análisis
después de lavado. Como alternativa, pueden utilizarse partículas
paramagnéticas, tales como partículas de óxido férrico, con o sin
recubrimiento de avidina.
La técnica anterior describe también técnicas
capaces de producir conjuntos de alta densidad para diversas
aplicaciones, incluyendo secuenciación mediante hibridación y
detección de secuencias particulares (véase, por ejemplo, Fodor
et al., Science 767-773 (1991) y la
patente de EE.UU. nº 5.143.854).
Como con los ácidos nucleicos diana, puede
utilizarse una amplia variedad de ácidos nucleicos como ácidos
nucleicos de sonda en los métodos de la presente invención. Las
sondas pueden comprender, por ejemplo, ADN genómico que representa
el genoma completo de un organismo, tejido o tipo celular
particular, o pueden comprender una parte del genoma, tal como un
cromosoma individual.
Para comparar los niveles de expresión de un gen
o genes particulares, los ácidos nucleicos de sonda pueden derivar
de ARNm o ADNc preparado a partir de un organismo, tejido o célula
de interés. Por ejemplo, puede hibridarse ADNc o ARNm de ensayo,
junto con ARNm o ADNc de células de referencia normales, con un
conjunto de clones de una biblioteca de ADNc normalizado. Además,
pueden hibridarse sondas preparadas a partir de ADN genómico de dos
poblaciones celulares con un conjunto de ADNc para detectar aquellos
ADNc que provienen de regiones de número de copias de ADN variante
en el genoma.
Los métodos de la invención son adecuados para
comparar el número de copias de secuencias particulares en cualquier
combinación de dos o más poblaciones de ácidos nucleicos. Un experto
reconocerá que las poblaciones particulares de ácidos nucleicos de
muestra que se están comparando no son críticas para la invención.
Por ejemplo, puede compararse ADN genómico o ADNc de dos especies
relacionadas. Como alternativa, pueden compararse los niveles de
expresión de genes particulares en dos o más tipos de tejido o
célula. Como se observó anteriormente, los métodos son
particularmente útiles en el diagnóstico de enfermedades.
Pueden utilizarse procedimientos estándar para
aislar ácidos nucleicos (ADN o ARNm) a partir de tejidos apropiados
(véase, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning- A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, N.Y. (1985)). Pueden utilizarse también métodos
convencionales para la preparación de ADNc a partir de ARNm.
Las células o tejido particular de los que se
aíslan los ácidos nucleicos dependerá de la aplicación particular.
Típicamente, para la detección de anormalidades asociadas al cáncer,
se aísla ADN genómico de células tumorales. Para la detección
prenatal de enfermedades, se utilizará tejido fetal.
Si la muestra de tejido es pequeña, de modo que
está disponible una pequeña cantidad de ácidos nucleicos, pueden
utilizarse técnicas de amplificación tales como la reacción en
cadena con polimerasa (PCR) utilizando cebadores degenerados. Para
una descripción general de la PCR, véase "PCR Protocols", Innis
et al., eds., Academic Press, 1990. Además, puede utilizarse
la PCR para amplificar selectivamente secuencias entre secuencias
repetitivas de alto número de copias. Estos métodos utilizan
cebadores complementarios de secuencias intercaladas altamente
repetitivas (por ejemplo Alu) para amplificar selectivamente
secuencias que están entre dos miembros de la familia Alu
(véase, por ejemplo, Nelson et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86: 6686 (1989)).
Como se observó anteriormente, la HGC a nivel
citogenético facilita la búsqueda de genes patológicos identificando
regiones de diferencias en el número de copias entre un genoma
normal y tumoral, por ejemplo. Por ejemplo, los estudios de HGC se
han aplicado al análisis de la variación del número de copias en
cáncer de mama (véase, por ejemplo, Kallioniemi et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2156-2160
(1994)).
En la HGC, la resolución con la que puede
cartografiarse un cambio del número de copias es del orden de varias
megabases. Con la presente invención, la resolución es una función
de la longitud de los segmentos de ADN genómico en los elementos
diana y de la diferencia en la posición cartográfica entre clones
vecinos. Puede conseguirse con la presente invención una resolución
mejor en más de un factor de 10 que con la HGC estándar. Esta
localización mejorada facilitará los esfuerzos por identificar los
genes críticos implicados en una enfermedad, y permitirá una
detección más sensible de las anormalidades que implican una región
pequeña del genoma, tal como en los síndromes de microdeleción.
Como se observó anteriormente, los ácidos
nucleicos que hibridan con los ácidos nucleicos diana están
preferiblemente marcados para permitir la detección de los complejos
de hibridación. Las sondas de ácido nucleico utilizadas en la
hibridación descritas a continuación pueden marcarse detectablemente
antes de la reacción de hibridación. Como alternativa, puede
seleccionarse un marcador detectable que se una al producto de
hibridación. Como se observó anteriormente, el conjunto de ácidos
nucleicos diana hibrida con dos o más ácidos nucleicos de sonda,
simultáneamente o en serie. Por tanto, las sondas se marcan cada una
con un marcador separado y distinguible.
El marcador o grupo detectable particular unido a
los ácidos nucleicos de sonda no es un aspecto crítico de la
invención, a condición de que no interfiera significativamente con
la hibridación de la sonda con la secuencia diana. El grupo
detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad
física o química detectable. Dichos marcadores detectables se han
desarrollado bien en el campo de las hibridaciones de ácido
nucleico, y en general la mayoría de los marcadores útiles en dichos
métodos puede aplicarse a la presente invención. Por tanto, un
marcador es cualquier composición detectable por medios
espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos,
eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles en la presente
invención incluyen tintes fluorescentes (por ejemplo isotiocianato
de fluoresceína, rojo texas, rodamina y similares), radiomarcadores
(por ejemplo ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{32}P),
enzimas (por ejemplo peroxidasa de rábano picante, fosfatasa
alcalina y otras utilizadas habitualmente en un ELISA).
Los ácidos nucleicos pueden marcarse
indirectamente utilizando ligandos para los que están disponibles
anti-ligandos detectables. Por ejemplo, pueden
detectarse ácidos nucleicos biotinilados utilizando avidina o
estreptavidina marcada según técnicas bien conocidas en la técnica.
Además, pueden detectarse moléculas antigénicas o hapténicas
utilizando antisueros o anticuerpos monoclonales marcados. Por
ejemplo, pueden detectarse sondas marcadas con
N-acetoxi-N-2-acetilaminofluoreno o
marcadas con digoxigenina utilizando anticuerpos específicamente
imunorreactivos con estos compuestos (por ejemplo anticuerpo
anti-digoxigenina de oveja marcado con FITC,
(Boehringer
Mannheim)). Además, pueden utilizarse anticuerpos marcados ante dímeros de timidina-timidina (Nakane et al., ACTA Histochem. Cytochem., 20: 229 (1987)).
Mannheim)). Además, pueden utilizarse anticuerpos marcados ante dímeros de timidina-timidina (Nakane et al., ACTA Histochem. Cytochem., 20: 229 (1987)).
Generalmente, se prefieren marcadores que sean
detectables en un número de copias tan bajo como sea posible,
maximizando así la sensibilidad del ensayo, pero que sean
detectables por encima de la señal de fondo. Se elige
preferiblemente un marcador que proporcione una señal localizada,
proporcionando así la resolución espacial de la señal de cada
elemento diana.
Los marcadores pueden acoplarse al ADN en una
variedad de medios conocidos por los expertos en la técnica. En una
realización preferida, la sonda se marcará utilizando traslado de
cortes o extensión de cebador aleatoria (Rigby et al., J.
Mol. Biol., 113: 237 (1977) o Sambrook, et al.,
"Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1985)).
Se compara el número de copias de secuencias de
ácido nucleico particulares en dos sondas hibridando las sondas con
uno o más conjuntos de ácidos nucleicos diana. Se determina la
intensidad de la señal de hibridación y la relación de las
intensidades producidas por las sondas en cada uno de los elementos
diana. Típicamente, cuanto mayor es la relación de intensidades de
señal en un elemento diana, mayor es la relación del número de
copias de secuencias en las dos sondas que se unen a ese elemento.
Por tanto, la comparación de las relaciones de intensidad de señal
entre elementos diana permite la comparación de las relaciones de
número de copias de diferentes secuencias en las sondas.
Se utilizan técnicas de hibridación estándar para
sondear un conjunto de ácidos nucleicos diana. Los métodos adecuados
se describen en referencias que describen las técnicas de HGC
(Kallioniemi et al., Science 258:
818-821 (1992) y el documento WO 93/18186). Están
disponibles diversas guías de técnicas generales, por ejemplo
Tijssen, "Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parts I and
II" (Elsevier, Ámsterdam 1993). Para descripciones de las
técnicas adecuadas para hibridaciones in situ, véanse Gall
et al., Meth. Enzymol., 21: 470-480
(1981) y Angerer et al., en Genetic Engineering:
Principles and Methods, Setlow y Hollaender, eds., vol. 7, pág.
43-65 (Plenum Press, Nueva York, 1985).
Generalmente, las hibridaciones de ácido nucleico
comprende las siguientes etapas principales: (1) inmovilización de
ácidos nucleicos diana; (2) tratamiento de prehibridación para
aumentar la accesibilidad del ADN diana y reducir la unión no
específica; (3) hibridación de la mezcla de ácidos nucleicos con el
ácido nucleico sobre la superficie sólida; (4) lavados
post-hibridación para retirar los fragmentos de
ácido nucleico no unidos en la hibridación y (5) detección de los
fragmentos de ácido nucleico hibridados. El reactivo utilizado en
cada una de estas etapas y sus condiciones de uso varían dependiendo
de la aplicación particular.
En algunas aplicaciones, es necesario bloquear la
capacidad de hibridación de las secuencias repetitivas. Son
conocidos una serie de métodos para retirar y/o desactivar la
capacidad de hibridación de secuencias repetitivas (véase, por
ejemplo, el documento WO 93/18186).
Por ejemplo, pueden utilizarse procedimientos en
volumen. En muchos genomas, incluyendo el genoma humano, una parte
mayoritaria del ADN repetitivo compartido está contenido en unas
pocas familias de secuencias altamente repetidas tales como
Alu. Estos métodos explotan el hecho de que la velocidad de
hibridación de las secuencias complementarias aumenta a medida que
aumenta su concentración. Por tanto, las secuencias repetitivas, que
están generalmente presentes a alta concentración, se volverán
bicatenarias más rápidamente que otras después de la
desnaturalización e incubación en condiciones de hibridación. Los
ácidos nucleicos bicatenarios se retiran después y se utiliza el
resto en hibridaciones. Los métodos de separación de secuencias
monocatenarias de bicatenarias incluyen utilizar hidroxiapatito o
ácidos nucleicos complementarios inmovilizados unidos a un soporte
sólido. Como alternativa, puede utilizarse la mezcla parcialmente
hibridada, y las secuencias bicatenarias serán incapaces de hibridar
con la diana.
Como alternativa, pueden añadirse a la mezcla de
hibridación secuencias no marcadas que sean complementarias de las
secuencias cuya capacidad de hibridación va a inhibirse. Este método
puede utilizarse para inhibir la hibridación de secuencias
repetitivas así como de otras secuencias. Por ejemplo, puede
utilizarse ADN "C_{0}t-1" para inhibir
selectivamente la hibridación de secuencias repetitivas en una
muestra. Para preparar ADN C_{0}t-1, se extrae
ADN, se cizalla, se desnaturaliza y se renaturaliza a un C_{0}t
\sim1 (para la descripción de la cinética de reasociación y los
valores C_{0}t, véase Tjssen supra en pág.
48-54). Debido a que las secuencias altamente
repetitivas se reasocian más rápidamente, los híbridos resultantes
están altamente enriquecidos con estas secuencias. La cadena simple
restante (concretamente secuencias de una copia) se digiere con
nucleasa S1, se purifica el ADN bicatenario
C_{0}t-1 y se utiliza para bloquear la hibridación
de las secuencias repetitivas en una muestra. Aunque el ADN de
C_{0}t-1 puede prepararse como se describe
anteriormente, está también comercialmente disponible (BRL).
Pueden utilizarse métodos estándar para la
detección y el análisis de señales generadas mediante sondas
marcadas. Los métodos particulares dependerán de los marcadores
utilizados en las sondas. Generalmente, se prefieren marcadores
fluorescentes. Por tanto, los métodos adecuados para hibridación de
fluorescencia in situ (FISH) son adecuados en la presente
invención. Los conjuntos de ácidos nucleicos se visualizan en un
microscopio de fluorescencia con un divisor de haz policromático
para evitar desplazamientos de imagen dependientes del color. Las
diferentes imágenes coloreadas se adquieren con una cámara CCD y las
imágenes digitalizadas se almacenan en un ordenador. Se utiliza
después un programa informático para analizar las señales producidas
por el conjunto.
Los métodos preferidos de visualización de
señales se describen en Kallioniemi et al., supra y en
el documento WO 93/18186. Para facilitar la presentación de
resultados y para mejorar la sensibilidad de detección de pequeñas
diferencias de la intensidad de fluorescencia, se utiliza
preferiblemente un sistema de análisis de imágenes digitales. Es un
sistema preferido QUIPS (un acrónimo de sistema de procesamiento de
imágenes cuantitativo en inglés), que es un sistema de análisis de
imágenes automatizado basado en un microscopio de fluorescencia
estándar equipado con una platina automatizada, control de foco y
rueda de filtros (Ludl Electronics Products, Ltd., Hawthorne, NY).
La rueda de filtros se monta en el tramo de excitación de
fluorescencia del microscopio para selección de la longitud de onda
de excitación. Filtros especiales (Chroma Technology, Brattleboro,
VT) en el bloque dicroico permiten la excitación de múltiples tintes
sin desplazamiento del registro de imagen. El microscopio tiene dos
puertos de cámara, uno de los cuales tiene una cámara CCD
intensificada (Quantex Corp., Sunnyvale, CA) para presentación de
imágenes de vídeo sensible a alta velocidad, que se utiliza para
encontrar áreas interesantes en un portaobjetos así como para
enfocar. El otro puerto de cámara tiene una cámara CCD enfriada
(modelo 200 de Photometrics Ltd., Tucson, AZ) que se utiliza para la
adquisición de imágenes real a alta resolución y sensibilidad.
La cámara CCD enfriada está en interfaz con una
estación de trabajo SUN 4/330 (SUN Microsystems, Inc., Mountain
View, CA) mediante un bus VME. La adquisición completa de imágenes
multicolores se controla utilizando un paquete de software de
procesamiento de imágenes SCIL-Image (Delft Centre
for Image Processing, Delft, Holanda).
Este ejemplo demuestra la detección de la
amplificación de una secuencia específica en una estirpe de célula
tumoral, Colo-320, que contiene una amplificación
del oncogén cMYC.
Se marcó una alícuota de ADN de
Colo-320 mediante traslado de corte con nucleótidos
FITC-dUTP y una segunda con rojo
Texas-dUTP. Se utilizó ADN humano normal como genoma
de referencia. Se marcaron dos alícuotas de forma similar al genoma
de ensayo.
El conjunto de hibridación consistía en dos
elementos diana. Uno contenía secuencias del oncogén cMYC y el otro
secuencias de una región del genoma humano (21D7) conocida por no
estar amplificada en la estirpe celular Colo-320. Se
aisló ADN de clones P1 (longitud de inserto \sim80 kb) para estos
dos loci (obtenido a partir de LBL/UCSF Resource for Molecular
Cytogenetics) y se cortó hasta terminación con la enzima de
restricción HindIII, dando como resultado fragmentos en el intervalo
de longitud de varios cientos de pb a más de 10 kb. Se rellenó una
base del saliente resultante utilizando
biotina-dATP, y se desnaturalizó el ADN. Por tanto,
se marcó en el extremo cada fragmento monocatenario con una sola
biotina. Se hicieron reaccionar los fragmentos monocatenarios
correspondientes a cada clon con diferentes alícuotas de
"partículas de 5 \mum" de vidrio de poro controlado
recubierto con avidina (CPG Inc.) (muy heterogéneas en tamaño y
forma). Por tanto, una población de partículas contenía secuencias
diana de cMYC, y la otra contenía secuencias 21D7. El marcaje por
cebado aleatorio del ADN monocatenario en las partículas utilizando
FITC-dUTP mostró que estaba confinado a la
superficie. Estos grandes fragmentos evidentemente no penetraron
sustancialmente en los poros de las partículas.
Se realizaron dos hibridaciones comparativas para
controlar los artefactos potenciales debidos al comportamiento
diferencial de las sondas marcadas, y similares.
1) Se disolvieron 300 ng de ADN genómico de
Colo-320 marcado con FITC y 300 ng de ADN genómico
normal marcado con rojo Texas y 10 \mug de ADN
C_{0}t-1 no marcado en 20 \mul de mezcla de
hibridación, para conseguir concentraciones finales de 50% de
formamida, 2xSSC, y 10% de sulfato de dextrano. Se calentó esto a
70ºC para desnaturalizar el ADN, y se añadieron 10 \mul a un
pequeño número de partículas que contienen secuencias de cMYC. Los
10 \mul restantes se añadieron de forma similar a un pequeño
número de partículas que contienen 21D7.
2) Esta hibridación fue similar a la primera,
excepto porque se invirtieron los marcadores fluorocromos. Por
tanto, se marcó Colo-320 con rojo Texas y el ADN
genómico normal con FITC. La hibridación procedió durante
36-48 horas a 37ºC y las partículas se lavaron, se
suspendieron en agente de antidesvanecimiento de fluorescencia y se
montaron en un portaobjetos de microscopio.
Se observaron las partículas con un microscopio
de fluorescencia convencional. La señal de hibridación fue
prominente en la superficie de las partículas (apareciendo como
gránulos discretos de fluorescencia). Se adquirieron imágenes con la
cámara CCD cuantitativa de los fluorocromos individuales en
partículas representativas con un sistema de microscopía digital con
el microscopio enfocado cerca de los planos ecuatoriales de las
partículas. Se muestran imágenes de partículas seleccionadas por ser
de 10-15 \mum de "diámetro" en la Figura 1.
Debido a su tamaño, la mayoría de cada partícula estaba fuera de
foco. El panel superior muestra los resultados cuando se marcó el
ADN de Colo-320 con FITC y el ADN normal con rojo
Texas, mientras que el panel inferior muestra los resultados cuando
se invirtió el marcaje. En cada panel, la fila superior muestra las
imágenes de rojo Texas y la fila inferior las imágenes de FITC. Las
dos columnas a la izquierda muestran partículas que contienen
secuencias diana de 21D7, mientras que las dos a la derecha son
partículas con secuencias de cMYC. La exposición para todas las
imágenes fue de 1 s y se presentan sin potenciación de contraste ni
sustracción del fondo.
El panel superior muestra que el ADN genómico
normal marcado con rojo Texas proporcionaba aproximadamente iguales
intensidades en las dos partículas 21D7 diferentes y las dos
partículas cMYC. Sin embargo, la intensidad de la hibridación del
ADN de Colo-320 marcado con FITC con las partículas
cMYC fue sustancialmente mayor que con las partículas 21D7. Esto
indica la presencia de más copias de secuencias de cMYC que de 21D7
en la estirpe celular, puesto que la relación de señal Colo a normal
en las partículas cMYC es sustancialmente mayor que en las
partículas 21D7. La señal de FITC en las partículas cMYC formaba un
anillo en el borde de la partícula, indicando una tinción
superficial predominante.
El panel inferior con marcaje inverso muestra que
la señal debida al ADN genómico normal marcado con FITC era
aproximadamente igual en todas las partículas, mientras que el ADN
de Colo-320 marcado con rojo Texas proporcionaba una
señal más brillante en las partículas cMYC. Por tanto, la
amplificación detectada era independiente del esquema de marcaje
utilizado.
La determinación cuantitativa de las relaciones
de fluorescencia fue difícil para estas partículas debido a su
grosor y autofluorescencia. Sin embargo, estimaciones brutas
indicaron que la relación de señal Colo a referencia en las
partículas cMYC es más de tres veces (y quizás 20 veces) mayor que
la relación en las partículas 21D7.
Claims (22)
1. Un método para comparar el número de copias de
secuencias de ácido nucleico en dos o más colecciones de moléculas
de ácido nucleico, comprendiendo el método:
- (a)
- proporcionar una pluralidad de elementos diana unidos a una superficie sólida, comprendiendo cada elemento diana un ácido nucleico diana, en la que los ácidos nucleicos diana carecen de la superestructura de un cromosoma en metafase condensado;
- (b)
- poner en contacto los elementos diana con:
- (i)
- una primera colección de ácidos nucleicos marcados que comprende una secuencia sustancialmente complementaria de una secuencia nucleotídica diana, y
- (ii)
- al menos una segunda colección de ácidos nucleicos marcados que comprende una secuencia complementaria de la secuencia nucleotídica diana;
- siendo los marcadores utilizados en el marcaje de la primera y segunda colecciones de ácidos nucleicos distinguibles entre sí; y
- (c)
- detectar la cantidad de unión del primer y segundo ácidos nucleicos marcados complementarios de los ácidos nucleicos diana.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
los ácidos nucleicos diana son ADN.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
los ácidos nucleicos diana son ADNc.
4. El método de la reivindicación 1, en el que el
primer y segundo ácidos nucleicos marcados comprenden ADN
humano.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
los ácidos nucleicos diana son de aproximadamente 1.000 a
aproximadamente 1.000.000 de nucleótidos de complejidad.
6. El método de la reivindicación 1, en el que la
complejidad de la secuencia complementaria de la secuencia de ácido
nucleico diana es menor de un 1% de la complejidad total de la
colección.
7. El método de la reivindicación 1, en el que el
soporte sólido es una pluralidad de perlas.
8. El método de la reivindicación 1, en el que el
soporte sólido es vidrio.
9. El método de la reivindicación 1, en el que el
primer y segundo marcadores son marcadores fluorescentes.
10. El método de la reivindicación 1, en el que
la primera y segunda colecciones de ácidos nucleicos se tratan para
inhibir la unión de secuencias repetitivas.
11. El método de la reivindicación 10, en el que
la primera y segunda colecciones de ácidos nucleicos se mezclan con
ácidos nucleicos no marcados bloqueantes que comprenden secuencias
repetitivas.
12. El método de la reivindicación 11, en el que
los ácidos nucleicos no marcados bloqueantes son ADN
C_{0}t-1.
13. El método de la reivindicación 1, en el que
los primeros ácidos nucleicos marcados comprenden ARNm o ADNc de una
célula de ensayo y los segundos ácidos nucleicos marcados comprenden
ARNm o ADNc de una célula de referencia.
14. El método de la reivindicación 1, en el que
los primeros ácidos nucleicos marcados son de un genoma de ensayo y
los segundos ácidos nucleicos marcados son de un genoma de
referencia normal.
15. El método de la reivindicación 14, en el que
el genoma de ensayo comprende ácidos nucleicos de tejido fetal.
16. El método de la reivindicación 14, en el que
el genoma de ensayo comprende ácidos nucleicos de un tumor.
17. Un kit para cuantificar las secuencias de
ácido nucleico en una muestra de ácido nucleico, comprendiendo el
kit:
(a) un soporte sólido que tiene un conjunto de
ácidos nucleicos diana preseleccionados unidos al mismo, en el que
los ácidos nucleicos diana carecen de la superestructura de un
cromosoma en metafase condensado y en el que el conjunto tiene al
menos dos miembros;
(b) un envase que contiene ácidos nucleicos de
referencia, comprendiendo dichos ácidos nucleicos de referencia
secuencias que son complementarias y no complementarias de al menos
un miembro del conjunto; y
(c) dos marcadores fluorescentes diferentes.
18. El kit de la reivindicación 17, en el que la
relación molar de ácidos nucleicos complementarios y no
complementarios es menor de 1:100.
19. El kit de la reivindicación 17, en el que los
ácidos nucleicos diana son de entre aproximadamente 1.000 y
aproximadamente 1.000.000 de nucleótidos de complejidad.
20. El kit de la reivindicación 17, en el que el
soporte sólido es vidrio.
21. El kit de la reivindicación 17, en el que los
ácidos nucleicos de referencia son ácidos nucleicos genómicos de
mamífero.
22. El kit de la reivindicación 21, en el que el
ácido nucleico genómico de mamífero es de origen humano.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US353018 | 1994-12-09 | ||
| US08/353,018 US5830645A (en) | 1994-12-09 | 1994-12-09 | Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays |
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