JP5143026B2 - 癌の予後診断及び病理学的病期分類のための試薬及び方法。 - Google Patents

Description

本発明は、個体における結腸直腸癌の進行を評価するための試薬及び方法に関する。より詳しくは、本発明は、療法を個体に合わせてより正確に調整する目的で癌の進行又は病理学的病期分類を判定又は診断するための前記試薬及び方法を提供する。本発明は同様に、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＨＥＲ１、ｐＡＫＴ、ｐＥＲＫ、ｐＭＥＫ及びＫｉ６７を含むＥＧＦＲ経路のバイオマーカーのいずれか１つ又は有益な組合せの、発現及び活性化を定量化するために生体試料を測定および分析するための免疫学的試薬及び方法にも関する。
〔関連出願の相互参照〕

本出願は、本明細書に参照により援用されている２００６年２月１６日付けの米国仮特許出願第６０／７７４，５６３号明細書についての優先権を請求するものである。

癌療法の主要目的は、正常な細胞に不利な影響を及ぼすことなく、悪性細胞を選択的に死滅させるか又はその無制御成長を阻害することにある。従来の化学療法薬は、好ましくは正常な細胞に対してよりも悪性細胞に対しより大きな親和性を有するか、又は少なくともその高い細胞成長速度及び代謝活性に基づいて悪性細胞に選好的に影響を及ぼす、細胞毒性の高い作用物質である。しかしながら、これらの作用物質は、「特効薬」でないことがわかってきており、しばしば癌細胞と同様に正常な細胞に危害を加える。逆説的ではあるが、一部の癌は、正常な細胞が発生させることのない前記化学療法薬に対する耐性を発生させる。悪性細胞を標的とし、正常な細胞を標的としないことができる、標的療法と呼ばれる癌治療療法が癌化学療法の新たな潮流となっている。このような新しいアプローチは、比較的副作用の少ない融通性及び応答性のある治療を必要とする慢性的身体条件であり続けている固形腫瘍癌の治療に特に関連性をもつものであり、その発達を調査する必要がある。

一般に、標的癌療法は、発癌現象に特異的であり、従って非癌細胞を容赦する分子又は細胞内経路と干渉することにより、癌細胞の成長及びまん延を遮断しようとしている。これらの作用物質は、癌性又は前癌状態の細胞の成長停止、末端分化及び細胞死を生成するのに使用されるが、正常な細胞の発達を中断することもできる従来の化学療法又は化学予防薬とは対照的に作用する。しかしながら、一部には正常な細胞及び癌細胞の両方に発現される受容体及びリガンドの多様性、及びその結果としての受容体シグナリングからの帰結が可変的であることに起因して、標的療法用の堅固な診断候補バイオマーカーは開発が困難であった。

腫瘍形成を理解し治療するための重要な標的として、複数のシグナリング経路が浮上してきている。これらには、成長因子シグナル翻訳経路が含まれる。成長因子経路は、細胞内及び環境信号に応答して、細胞の成長及び代謝を調節する。これらのシグナリング経路は、往々にして癌の中で改変されるか又は異常調節され、その結果、無制御成長の表現型及び周囲の組織への浸潤がもたらされる。

細胞成長の主要な決定因子であり、癌の診断及び治療における活発な研究の標的であるのは、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及びその受容体（ＥＧＦＲ）である。ＥＧＦは、シグナル伝達カスケードを開始させるべくタンパク質−受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を活性化し、結果として細胞の成長、増殖及び分化の変化をもたらす成長因子である。ＥＧＦ及びｒａｓ／ｒａｆ、ｍｅｋ及びｅｒｋを含むその下流側の標的（図１に例示）は、異なる癌の発病機序及び進行に関与するものとして知られている。この経路及びそのシグナル分子は治療的介入のための魅力的な標的を提供し、かかるアプローチが開発中である（Ｓｔａｄｌｅｒ、２００５年、Ｃａｎｃｅｒ、第１０４号：２３２３〜３３頁；Ｎｏｒｍａｎｎｏら、２００６年、Ｇｅｎｅ、第３６６号：２〜１６頁）。

ＥＧＦ及びその受容体を標的とする作用物質としては、ベバシツマブ、ＰＴＫ７８７、ＳＵ０１１２４８及びＢＡＹ４３−９００６が含まれる。ＢＡＹ４３−９００６はまた、ｒａｆ、ｍｅｋ及びｅｒｋを含むＥＧＦ経路内の下流側の標的を阻害することも示されている（Ｓｔａｄｌｅｒ、２００５年、Ｃａｎｃｅｒ、前掲書）。この受容体系はまた、肺、胸部、前立腺、結腸、卵巣、頭部及び頸部を含む多くのヒト固形腫瘍の発生及び進行に関与している。ＨＥＲ１／ＥＧＦＲは、４つの受容体｛ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１又はＥｒｂＢ１とも呼ばれる）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）及びＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）｝のファミリーのメンバーである。受容体は、細胞原形質膜内に常在し、外部リガンド結合ドメイン、膜内外ドメイン及び内部チロシンキナーゼドメインから成る。リガンドの結合は、受容体の２量体化及び内部受容体ドメインの自己リン酸化をひき起こす。こうして、細胞分裂及びその他の数多くの細胞成長局面に影響を及ぼす細胞反応カスケードが開始される。ＥＧＦ受容体の活性の増強は、それがリガント濃度の増大、受容体数又は受容体突然変異のいずれによりひき起こされたものであるにせよ、細胞増殖の増大を導き得る。現在では、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ系がさまざまな固形腫瘍の確立及び進行を媒介し得ることを示す有意な証拠が存在する。

研究により癌の制御及び治療におけるＥＧＦ経路の役割が調べられてきたが、腫瘍の進行及び転移中のこの経路の変化についてはほとんどわかっていない。ＥＧＦＲ経路における下流側エフェクターの微妙な改変が、とりわけ腫瘍タイプ、病期及び個々の組成に基づいて治療的介入のための特有かつ可動性の標的を提供し得る。かかる変動は、悪性腫瘍の診断及び治療に対し有意な影響を及ぼし得る。

大規模試験からの結果に基づいて、従来の癌治療の治療計画が開発されてきており、これらの治療計画は、多様な患者及び腫瘍についての予測結果に依存している。個々の患者、腫瘍及び病理学的病期分類（図２に示されている）に合わせて療法を調整する能力は、より少ない副作用でより効果の大きい悪性腫瘍治療を提供し得る。さらに、癌治療の進行を監視しそれに応じて療法を調整できれば、広範な患者群からのデータを用いて以前に開発された治療計画に対する応答における個々の差異に対しより迅速に反応することが可能になると思われる。

当該技術分野においては、癌の病期を迅速に診断しＥＧＦＲ経路を対象とした治療の効果を監視するために癌治療の前及び途中のさまざまな細胞内シグナル分子の変化のスクリーニング及び迅速な検出を可能にする、診断バイオマーカーを開発する必要性が存在している。同様に、ＥＧＦＲ経路を対象とした阻害物質の改良された同定方法の必要性も存在している。

本発明は、癌を患う個体における腫瘍の進行を評価するための試薬及び方法を提供しており、特に、前記方法は腫瘍の病期を立証し、抗癌療法の効能を評価するために使用される。本発明は同様に、患者個別化された抗癌治療及び治療に対する応答を提供するための方法であって、本発明の方法を用いて立証された腫瘍のタイプ及び病期に基づいて個々の患者に対し特定の治療が投与され、該治療が、前記治療に対する患者の個々の応答に基づいて維持又は変更される方法を提供する。

第１の態様において、本発明は、個体における腫瘍の進行、特に結腸直腸癌の進行を評価するための試薬、特に免疫学的試薬および方法を提供する。この態様では、患者由来の組織又は腫瘍細胞含有試料が分析されて、１つ以上の生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンを検出する。特定の実施形態においては、前記生物学的マーカーは、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、ｐＭＥＫ、ｐＨＥＲ１、ｐＥＲＫ又はＫｉ６７を含むＥＧＦ代謝経路のメンバーであるが、これらに限定されない。これらの実施形態においては、腫瘍の進行が評価され、ここで、１つ以上の、特に複数のこれらの生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンは、前記腫瘍の立証された進行病期をもつ組織又は細胞試料由来の１つ以上の、特に複数のこれらの生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンと実質的に類似している。

他の実施形態においては、本発明は、個体における腫瘍の進行、特に結腸直腸癌の進行を評価するための試薬、特に免疫学的試薬および方法を提供する。この態様では、患者由来の組織又は腫瘍細胞含有試料が分析されて、１つ以上の生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンを検出する。特定の実施形態においては、前記生物学的マーカーは、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、ｐＭＥＫ、ｐＨＥＲ１、ｐＥＲＫ又はＫｉ６７を含むＥＧＦ代謝経路のメンバーであるが、これらに限定されない。これらの実施形態においては、腫瘍の進行が評価され、ここで、１つ以上の、特に複数のこれらの生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンは、正常な細胞を含むものの腫瘍細胞を含まない非腫瘍組織又は細胞試料由来の１つ以上の、特に複数のこれらの生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンと異なっている。

本発明の試薬及び方法の好ましい用途は、結腸直腸癌腫の臨床病期を評価することを目的としたものであり、ここで前記発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンを含む生物学的マーカーにはＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＭＥＫ、Ｋｉ６７及びｐＨＥＲ１が含まれる。同様に、本発明のこれらの態様には、ＥＧＦＲをコードするゲノムＤＮＡの遺伝子増幅を測定するさらなる工程が含まれる。一部の実施形態においては、これらの検定は、ゲノムＥＧＦＲコーティングＤＮＡ内の安定な（ｂａｌａｎｃｅｄ）二染色体性を検出する。

これらの態様においては、組織試料は、好ましくは、小腺腫（ｓｍａｌｌ ａｄｅｎｏｍａ）又は腺腫様ポリープである。特にこれらの実施形態においては、本発明は、非腫瘍組織又は細胞試料内の該生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方レベルと比較して、ＥＧＦＲの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方が増大、ＰＴＥＮの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方が増大し、ｐＭＥＫの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方が減少している、発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンを提供する。

その他の実施形態においては、腫瘍は腺癌である。特に、これらの実施形態においては、本発明は、小腺腫組織又は細胞試料内の該生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方レベルと比べて、ＰＴＥＮの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方が減少し、及びｐＭＥＫの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方が増大している、発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンを提供する。これらの実施形態は、その範囲内に、ＦＧＦＲをコードするゲノムＤＮＡの遺伝子増幅を測定するさらなる工程を有することができる。一部の実施形態においては、これらの検定は、ゲノムＥＧＦＲをコードするＤＮＡ内の安定な二染色体性及び安定な三染色体性を検出する。

さらなる実施形態においては、患者からの組織試料は、悪性試料であり、本発明は、小腺腫の組織又は細胞試料内の該生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のレベルに比べて、ＰＴＥＮの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方が減少し、及びｐＭＥＫの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方が増大している、発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンを提供する。これらの実施形態は、その範囲内に、ＥＧＦＲをコードするゲノムＤＮＡの遺伝子増幅を測定するさらなる工程を有することができる。一部の実施形態においては、これらの検定は、ゲノムＥＧＦＲをコードするＤＮＡ内の安定な二染色体性及び安定な多染色体性を検出する。

好ましい実施形態においては、本発明の方法において検出されたパターンを含む生物学的マーカーのこれらの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンは、免疫組織化学又はインサイチュハイブリダイゼーションにより検出される。好ましい実施形態において、前記方法は、有利には標識された特異的結合試薬、好ましくは免疫学的試薬を用いた染色後、組織切片のコンピューター援用画像解析を用いて実施される検定を含む。

本発明の方法の実践においては、特定の複数の化学療法薬の１つ又はその組合せに対する応答性をもつ、腫瘍特に結腸直腸癌腫瘍を有する個体を同定するための方法が提供される。これらの実施形態においては、本発明の方法は、１つ又は複数の生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンを検出するために使用される。一部の実施形態においては、該腫瘍は結腸直腸癌であり、生物学的マーカーにはＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、ｐＭＥＫ、ｐＨＥＲ１、ｐＥＲＫ、又はＫｉ６７が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法の有利な実施形態においては、発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンは、複数の化学療法薬の１つ又はその組合せに対する応答性をもつものとして、腫瘍を同定する。特定の実施形態においては、本発明の方法は、化学療法薬に対する応答性をもつ腫瘍試料を同定するために有用であるが、ＥＧＦＲ抗体又はキナーゼ阻害物質、又はＥＧＦＲ抗体およびキナーゼ阻害物質の両方を含むものに限定されない。

さらなる態様において、本発明は、本発明の方法の実践用キットを提供する。有用な実施形態において、前記キットは、ヒト腫瘍試料内の腫瘍の進行又は化学療法薬の応答性又はその両方に関して情報を提供する生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方を検出するための少なくとも２つの試薬、好ましくは特異的結合剤、より好ましくは免疫学的試薬を含む。一部の実施形態においては、少なくとも２つの試薬は、ＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、ｐＭＥＫ、ｐＨＥＲ１、ｐＥＲＫ又はＫｉ６７を含む、これらに限定されない生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方を検出するために有用である。一部の実施形態において、該少なくとも２つの生物学的マーカーはＰＴＥＮ及びｐＭＥＫである。一部の実施形態においては、前記キットは、好ましくはＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＭＥＫ、ｐＥＲＫ、又はＫｉ６７を含む、これらに限定されない少なくとも３つの生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方を検出するための試薬を含む。一部の実施形態において、少なくとも３つの生物学的マーカーはＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ及びｐＭＥＫである。他の実施形態において、キットは、ＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＭＥＫ、ｐＥＲＫ、又はＫｉ６７の発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンを検出するための試薬を含む。本発明のキットの一部の実施形態は同様に、ＥＧＦＲをコードするゲノムＤＮＡの遺伝子増幅を検出するための試薬をも含んでいる。本発明の前記キットの各実施形態は有利にはさらに、本発明の方法の実践においてキットを使用するための使用説明書を含む。

本発明の特定の好ましい実施形態は、一部の好ましい実施形態についての以下のさらに詳細な説明及び特許請求の範囲から明白になるであろう。

特許又は出願ファイルはカラーで作成された少なくとも１つの図面を含んでいる。カラー図面を伴う本特許又は特許出願公報のコピーは、必要な手数料の支払いを伴って要請に基づいて特許庁により提供されるものである。

本発明は、癌患者を含む個体における結腸直腸癌の進行を評価するための方法を提供する。さらに、本発明は、結腸直腸癌の進行を評価するため予測的なバイオマーカーを提供している。さらに、本発明は、化学療法薬に対する応答性をもつ結腸直腸癌腫瘍を同定するための方法を提供している。その上本発明は、結腸直腸癌の進行を評価するためのキットを提供する。

化学療法薬物治療が外科手術の補助および術後に着手される従来の抗癌方法とは対照的に、新補助（又は一次）化学療法は、一部の癌患者に初期治療として薬物を投与することから成る。かかるアプローチの１つの利点は、３ｃｍ超の原発性腫瘍については、該化学療法の腫瘍収縮効果によって、大部分の患者について（例えば乳癌患者における根治的乳房切除術とは対照的に）保存外科的処置をこのアプローチの後に又は同時に使用することを可能にするという点にある。もう１つの利点は、数多くの癌について、全患者の約３分の２において部分的及び／又は完全な応答が達成されるという点にある。最後に、２〜３サイクルの化学療法治療後に大部分の患者が応答性を有することから、化学療法治療に対し応答性をもたない腫瘍を有する患者を同定するために、使用した化学療法治療計画の生体内での効能を監視することが可能である。非応答性腫瘍の適時の同定により、臨床医は不必要な治療副作用に対する癌患者の曝露を制限し、代替的治療を始めることができる。残念なことに、組織学的検査を含む当該技術分野で存在する方法は、このような適時の、および正確な同定の最適な応用には不充分である。本発明は、有効な転帰（すなわち腫瘍の削減又は除去）の確率が増大している癌患者に対して行うことのできる、より情報に基づく有効な治療計画を開発するための方法を提供する。

疾病の初期診断及びその後の疾病経過（治療の前後及び最中）の監視の両方である癌診断は、従来、患者から取出した細胞又は組織試料の組織学的検査を通して確認される。臨床病理学者には、かかる試料が良性であるか又は悪性であるかを正確に判定し、悪性とみなされた腫瘍試料の攻撃性を分類できる能力が必要である。なぜなら、これらの判定が患者の治療の適切な行程を選択する基礎となることが多いからである。同様にして、病理学者は、特に結果的又は間接的な治療によって、最も特定的には化学療法薬又は生物学的作用物質による治療によって、癌がどの程度成長したか又は寛解に入ったかを検出できなければならない。

組織学的検査は従来、試料の形態学的特徴を光学顕微鏡下で容易に観察できるようにする組織染色手順を伴う。病理学者は、染色された試料を検査した後、一般的には、腫瘍試料が悪性か否かの定性的判定を下す。しかしながら、腫瘍の攻撃性は往々にして、試料の形態により反映されることもあればされないこともあるタンパク質の発現又は抑制及びタンパク質のリン酸化といったような腫瘍内部の細胞の生化学の結果であることから、試料の組織学的検査のみを通して腫瘍の攻撃性を確認することはむずかしい。従って、腫瘍試料内の細胞の生化学を評価できることが重要である。さらに、腫瘍関連遺伝子又はタンパク質、又はより具体的には腫瘍関連シグナル経路の細胞構成要素の遺伝子発現及びタンパク質のリン酸化の両方を観察し、定量化できることが望ましい。

癌療法は、単にその組織学又は疾病の部位に基づくのではなく、むしろ腫瘍の分子プロファイリングを基礎とすることができる。腫瘍試料内の標的療法の生物学的効果を解明し、これらの効果を臨床的応答と相関させることは、腫瘍内の作動的な優勢的成長及び存続経路を同定し、その結果起こりうる応答のパターンを立証し、および反対に耐性を克服するための戦略設計の論理的根拠を提供するのを助ける。例えば、成長因子受容体の診断標的化に成功すれば、腫瘍の成長又は存続が標的受容体又は受容体ファミリーによって駆動されているか、療法が標的としていないその他の受容体により駆動されているか、そして下流側シグナルがもう１つの発癌経路の関与を示唆しているか否かが判定されるはずである。さらに、２つ以上のシグナル経路が関与している場合、これらのシグナル経路のメンバーを診断標的として用いて、２重阻害剤療法が有効となるか又は有効であるかを判定することができる。

化学療法が有効であるためには、投薬療法が腫瘍細胞を破壊しかつ正常な体細胞、特に腫瘍に隣接する又はその近位に存在する正常な細胞には危害を加えてはならない。これは、とりわけ、癌細胞内では圧倒的に発生するが正常な細胞内では発生しない細胞活性に影響を及ぼす投薬療法を用いることで達成可能である。

当該技術分野において既知の自動（コンピューター援用）画像解析システムが、腫瘍試料の視覚的検査を増強させることができる。代表的な実施形態においては、細胞又は組織試料は、特定の生物学的マーカーを特異的に標識する試薬に曝露され、拡大された細胞の画像は、テレビカメラなどのカメラ又は電解結合素子（ＣＣＤ）から画像を受信するコンピューターによって処理される。かかるシステムは、例えば、試料中のＥＧＦＲ、ｐｔｙｒ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、ｐＭＥＫ、ｐＨＥＲ１、ｐＥＲＫ又はＫｉ６７又は任意の付加的な診断用バイオマーカーを検出しその発現及び活性化レベルを測定するために使用可能である。かくして、本発明の方法は、より正確な癌診断、および組織学的に同定された癌細胞内の遺伝子発現のより優れた特徴づけであって、最も特定的には、腫瘍マーカー遺伝子又は（例えば異なる悪性度を有する）特定の癌型及び亜型内で発現させられるものとして知られている遺伝子の発現に関する特徴づけを提供する。この情報により、一定の腫瘍型又は亜型についての臨床的効能をもつ薬物を、このように同定された細胞をもつ患者に対し投与できることから、施行される治療についてのより情報に基づくおよび有効な治療計画が可能になる。

従来の抗癌療法のもう１つの欠点は、個々のヒト患者における特定の癌を治療する上での特異的な化学療法薬の効能が予測不可能であるという点にある。この予測不能性を考慮すると、当該技術分野では療法を開始するまでは、個々の患者における１つ以上の選択された作用物質が抗腫瘍薬として活性であるか否かを判定すること、又は治療の正確な予後診断又は経過を告げることができない。特定の個体にとってどの治療計画が最も効果が高くなるかを評価する技術を現状では一切持っていない臨床医は、特定の臨床癌に対して治療治療計画の選択をせまられる可能性があることから、このことは特に重要である。本発明の方法の利点は、該方法が、個々の患者における提案された治療薬（又は作用物質の組合せ）の予想される効能をより良く評価できる、という点にある。請求されている方法は、それらが化学療法治療計画の効能を評価する上で時間効果性及びコスト効果性の両方を有し、かつ癌患者にとって外傷性傷害が最小であるという点で有利である。

ポリペプチドの発現及びリン酸化のパターンが、本発明の方法を用いて検出および定量化される。より特定的には、腫瘍関連シグナル経路の細胞構成要素であるポリペプチドの発現及びリン酸化のパターンが、本発明の方法を用いて検出および定量化される。例えば、ポリペプチドの発現及びリン酸化のパターンは、抗体を含むがこれに限定されない、ポリペプチドに特異的な生物検出試薬を用いて検出可能である。代替的には、生物検出試薬は核酸プローブであり得る。

本明細書で開示されている発明の方法で使用される核酸プローブは、試料に対するそのハイブリダイゼーションを検出できる１つ以上の核酸フラグメントの集合として定義される。該プローブは、標的又は試料に対するその結合を検出できるような形で標識されていてもいなくてもよい。プローブは、ゲノムの１つ以上の特定の（予め選択された）部分、例えば１つ以上のクローン、１つの単離された全染色体又は染色体フラグメント又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物由来の、核酸供給源から産生される。核酸プローブは同様に、アレイの中といったように固体表面（例えばニトロセルロース、ガラス、石英、ヒューズドシリカスライド）上で固定化された単離された核酸でもあり得る。該プローブは、例えば国際公開第９６／１７９５８号パンフレット中で記述されている通りの核酸アレイのメンバーであってよい。高密度アレイを産生させる能力をもつ技術をこの目的で使用することもできる（例えばＦｏｄｏｒ、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第Ｘ号：７６７〜７７３頁；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、１９９８年、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．第８号：Ｒ１７１〜Ｒ１７４頁；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ、１９９７年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２３号：１０８７〜１０９２頁；Ｋｅｒｎ、１９９７年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２３号：１２０〜１２４頁；米国特許第５，１４３，８５４号明細書を参照のこと）。当業者であれば、特定のプローブの正確な配列を或る程度まで修飾して、「実質的に同一」ではあるもののそれらが由来したプローブと同じ標的又は試料に特異的に結合する（すなわちこれに特異的にハイブリッド形成する）能力を保持するプローブを産生させることができる、ということを認識するだろう。「核酸」という用語は、１本鎖又は２本鎖形態のいずれのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドも意味する。該用語は、例えばオリゴヌクレオチドなどの、基準核酸として所望の目的で類似の又は改善された結合特性をもつ天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含している。該用語は同様に、天然に発生するヌクレオチドと類似の方法で、所望の目的のために改善された速度で代謝される核酸をも内含する。該用語は同様に、合成主鎖を伴う核酸様構造をも包含する。当業者であれば、例えば結腸癌腫細胞のスクリーニングに向けられた米国特許第６，３２６，１４８号明細書を参照することにより、試料内の癌細胞のスクリーニングのために核酸プローブをどのように使用するかを認識するものと思われる。

癌に関連するポリペプチドは、直接検出されるか又は適切な２次抗体（例えばマウス一次抗体を使用する場合にはウサギ抗マウスＩｇＧ）及び／又は３次アビジン（又はストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ））ビオチン錯体（「ＡＢＣ」）を用いて検出される、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、ｐＭＥＫ、ｐ、ｐＥＲＫ、又はＫｉ６７を含む、これらに限定されないバイオマーカーに対抗する適切な一次抗体を用いた画像解析により定量化可能である。

本明細書で例示されているような本発明の方法の実践において有用である試薬の例としては、免疫学的試薬が含まれる。「免疫学的試薬」というのは、特にポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体を含む抗体を意味する。本発明の抗体は、化学的合成又は組換え発現技術を含めた抗体合成のための当該技術分野において既知のあらゆる方法によって、又は好ましくは従来の免疫学的方法によって産生可能である。本明細書で使用する「抗体」という用語には、天然に発生する抗体と非天然発生の抗体の両方が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「抗体」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥといったようなあらゆる免疫学的結合剤を広く意味するように意図されている。一般に、生理学的状況で最も一般的な抗体でありかつ実験室環境内で最も容易に作られることから、ＩｇＧ及び／又はＩｇＭが好まれる。より具体的には、「抗体」という用語は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、及び例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントなどの抗原結合フラグメントが含まれる。さらに、「抗体」という用語には、遺伝子操作された抗体及びそのフラグメントを含めたキメラ抗体及び完全合成抗体が含まれる。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を「精製すること」が可能であり、これは、該ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体にその他の抗体が全く含まれていないことを意味している。

ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を調製するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば本明細書に参照により援用されているＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；及びＨｕｒｒｅｌｌ（編）、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．を参照のこと）。当業者にとって明白であるように、ポリクローナル抗体は、馬、牛、山羊、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス及びラットといったさまざまな温血動物から産生され得る。抗原性エピトープの免疫原性は、（完全及び不完全）フロイントといったアジュバント、水酸化アルミニウムといった無機ゲル、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの表面活性物質及び例えばＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルバムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントの使用を通して増大させることができる。このようなアジュバントは、当該技術分野においても周知である。アジュバント及び免疫検定のさまざまな局面に関する情報は、例えばＴｉｊｓｓｅｎ（１９８７年、ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＡＮＤ ＴＨＥＯＲＹ ＯＦ ＥＮＺＹＭＥ ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹＳ、第３版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の中で開示されている。ポリクローナル抗血清を調製するための方法を網羅するその他の有用な参考文献としては、ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ（１９６９年、Ｈｏｅｂｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ）；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ（１９６２年、ＳＰＥＣＩＦＩＣＩＴＹ ＯＦ ＳＥＲＯＬＯＧＩＣＡＬ ＲＥＡＣＴＩＯＮＳ、Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、及びＷｉｌｌｉａｍｓら、（１９６７年、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）がある。

ポリクローナル抗体の産生において用いられる免疫原組成物の量は、免疫原の性質ならびに免疫化のために用いられる動物に応じて変動する。免疫原の投与にはさまざまな経路（皮下、筋肉、皮内、静脈内及び腹腔内）を用いることができる。ポリクローナル抗体の産生は、免疫化後のさまざまな時点で免疫化動物の血液をサンプリングすることにより監視され得る。第２のブースタ注射も与えることができる。ブースタ投与及び力価測定の工程は、適切な力価が達成されるまで反復される。所望の免疫原性レベルが得られた時点で、免疫化動物を出血させ、血清を単離し貯蔵することができる。

標準的方法を用いて免疫化された動物から産生された血清は直接使用でき、あるいは、固定化したプロテインＡとなどのＩｇＧ特異的吸着剤での吸着クロマトグラフィー又は血漿交換法といったような標準的方法を用いて、血清からＩｇＧ画分を分離することができる。

既知の方法に従った所望のフラグメントの分割及び収集により、対応する抗体からＦ（ａｂ’）_２及びＦａｂフラグメントなどの抗体フラグメントを産生させることができる（例えばＡｎｄｒｅｗら、１９９２年、「Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」ｉｎ ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｕｎｉｔ２．８、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓを参照のこと）。

代替的には、本明細書に参照により援用されている米国特許第４，１９６，２６５号明細書の中で例証されている周知の技術などに従って、本発明の抗原ペプチドに対するモノクローナル抗体を調製できる。本発明の抗原ペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知の技術によって産生される。通常、この工程には、所望の抗体を産生するＢ−リンパ球と不死化細胞系の融合を含む。不死化用細胞系は通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシ及びヒト由来の骨髄腫細胞である。マウス及びラットなどのげっ歯類が好ましい動物であるが、ウサギ又はヒツジ細胞の使用も可能である。マウスが好ましく、最も日常的に使用され、および一般的により高い割合で安定した融合を提供することから、ＢＡＬＢ／Ｃマウスが最も好まれる。

抗原の注射を受けた哺乳動物から抗体産生リンパ球を得る技術は周知である。一般に、ヒト由来の細胞が利用される場合には末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が用いられ、または非ヒト哺乳動物供給源からの脾臓又はリンパ節細胞が使用される。宿主動物には、精製された抗原の反復投薬量が注射され、動物は、不死化細胞系との融合のために採取される前に所望の抗体産生細胞を生成することが可能となる。不死化された細胞系は、便宜上及び利用上の問題から、ラット又はマウスの骨髄腫細胞系であることが最も多い。融合のための技術も同じく当該技術分野において周知であり、一般的にポリエチレングリコールなどの融剤と細胞の混合を含む。

一般に、抗体を産生する潜在性をもつ以下の免疫化体細胞、特にＢ−リンパ球（β−細胞）が、ｍＡｂ生成プロトコルでの使用に選択される。これらの細胞は、生検された脾臓、へんとう腺又はリンパ節又は末梢血試料から得ることができる。脾細胞及び末梢血細胞が好ましく、前者はそれが分裂中の形質芽球期にある抗体産生細胞の豊かな供給源であることを理由として、又後者は末梢血が容易に入手可能であることを理由として好まれる。多くの場合、一団の動物が免疫化されていることになり、最高の抗体力価をもつ動物の脾臓は除去され、脾臓リンパ球は注射器で脾臓を均質化することによって得られる。一般的には、免疫化されたマウス由来の脾臓は約５０００万個から２億個のリンパ球を含む。

ハイブリドーマ産生融合手順において使用するのに適した骨髄腫細胞系は、好ましくは抗体を産生せず、高い融合効率、およびその後所望の融合された細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支援する、一定の選択培地の中で成長能力を無くさせる酵素欠乏を有する。当業者にとっては既知であるように、数多くの骨髄腫のうちのいずれか１つを使用することができる。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９、ＵＳＡ、から入手可能なマウス骨髄腫系を、ハイブリダイゼーションにおいて使用可能である。例えば免疫動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸ０Ｂｕｌを使用することができる。ラットについては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０を使用でき、Ｕ―２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２及びＵＣ７２９−６は全て、ヒトの細胞融合に関連して有用である。１つの好ましいマウス骨髄腫細胞は、細胞系所蔵番号ＧＭ３５７３を要求することによりＮＩＧＭＳ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから容易に入手可能であるＮＳ−１骨髄腫細胞系（Ｐ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１とも呼ばれる）である。使用可能なもう１つのマウス骨髄腫細胞系は８−アザグアニン耐性マウスのマウス骨髄腫ＳＰ２／０非生産細胞系である。

抗体を産生する脾臓又はリンパ節細胞及び骨髄腫細胞のハイブリッドを生成する方法は、通常、細胞膜の融合を促進する作用物質（化学的及び電気的）の存在下で、２：１の比で（ただし、比率はそれぞれ約２０：１〜約１：１まで変動し得る）、骨髄腫細胞と体細胞を混合する工程を含んでいる。Ｓｅｎｄａｉウイルスを用いる融合方法（Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６号：４９５頁；Ｋｏｈｌｅｒら、１９７６年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第６号：５１１頁；Ｋｏｈｌｅｒら、１９７６年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第６号：２９２頁）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（３７％（ｖ／ｖ）のＰＥＧ）を用いるＧｅｆｔｅｒら（１９７７年、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ第３号：２３１〜２３６頁）による融合方法が記述されてきた。電気的に誘発される融合方法の使用も適切である（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６年）。

融合手順は、通常約１×１０^−６〜１×１０^−８の低い頻度で生存可能なハイブリッドを産生させる。しかしながら、生存可能な融合ハイブリッドは、選択培地中での培養により親の未融合細胞（特に通常は無限に分裂し続けることになる未融合骨髄細胞）から分化されることから、それが問題となることはない。選択培地は一般に、組織培養培地内でヌクレオチドの新規合成を遮断する作用物質を含むものである。一般的に好ましい作用物質はアミノプテリン、メトトレキサート、及びアザセリンである。アミノプテリン及びメトトレキサートは、プリン及びピリミジンの両方の新規合成を遮断し、一方アザセリンはプリン合成のみを遮断する。アミノプテリン又はメトトレキサートが使用される場合、培地にはヌクレオチド（ＨＡＴ培地）の供給源としてヒポキサンチン及びチミジンが補足される。アザセリンが使用される場合、培地にはヒポキサンチンが補充される。好ましい選択培地はＨＡＴである。骨髄腫細胞は、例えばヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）などのサルベージ経路の主要酵素が不完全であり、存続できない。β細胞はこの経路を操作できるが、培養中で制限された寿命しかもたず、一般に約２週間で死滅する。従って選択培地内で生存できる唯一の細胞は骨髄腫及びβ細胞から形成されたハイブリッドである。

これらの条件下で融合産物を培養することで、特定のハイブリドーマが選択されるハイブリドーマ集団が提供される。一般的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート内での単一クローン希釈により細胞を培養しその後所望の反応性について（約２〜３週間後に）個々のクローン上清内でテストすることによって実施される。所望の抗体を分泌するハイブリドーマが、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着法）、ＲＩＡ（放射免疫測定）などの標準的免疫検定を用いて選択される。標準的タンパク質精製技術（例えばＴｉｊｓｓｅｎ、１９８５年、前掲書）を用いて培地から抗体が回収される。検定は、放射免疫検定、酵素免疫検定、細胞毒性検定、プラーク検定、ドット免疫結合検定などのように、鋭敏、簡易かつ高速でなくてはならない。

選択されたハイブリドーマは次に段階希釈され、個々の抗体産生細胞系内にクローニングされ、このクローンを次に無限に繁殖させてｍＡｂｓを得ることができる。細胞系は少なくとも２つのやり方でｍＡｂ産生のために運用可能である。ハイブリドーマの試料を、原初の融合のための体細胞及び骨髄腫細胞を提供するために使用された種類の組織適合動物の体内に（往々にして腹腔内に）注射することができる。注射を受けた動物は、融合された細胞ハイブリッドにより産生された特定のモノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発生させる。次に該動物の血清又は腹水などの体液を抜いて、高濃度のｍＡｂｓを提供することができる。ｍＡｂｓが天然に培地内に分泌され高濃度で容易に得ることができる場合、個々の細胞系を試験管内で培養することもできると思われる。いずれの手段で産生されたｍＡｂｓも、望ましい場合にはろ過、遠心分離及びＨＰＬＣ又は親和性クロマトグラフィーなどのさまざまなクロマトグラフィー法を用いてさらに精製可能である。

Ｋｏｈｌｅｒら、（１９８０年、ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９８５年、前掲書）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８４年、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｈｕｒｒｅｌｌ（１９８２年、前掲書）を含む数多くの参考文献が、上述の技術を応用する上での指針を提供するべく入手可能である。モノクローナル抗体は同様に、周知のファージライブラリシステムを用いて産生させることもできる。例えば、Ｈｕｓｅら、（１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２４６号：１２７５頁）；Ｗａｒｄら、（１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ第３４１号：５４４頁）を参照のこと。

Ｆ（ａｂ’）_２及びＦａｂフラグメントなどの抗体フラグメントを、既知の方法（例えばＡｎｄｒｅｗら、１９９２年、「Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ中、Ｕｎｉｔ２．８、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）を参照）に従った所望のフラグメントの分割及び収集によって、対応する抗体から産生させることができる。

ポリクローナル抗体であれモノクローナル抗体であれ、かくして産生された抗体と、例えば周知の方法により固体支持体に結合された固定化形態で使用することができる。

免疫測定法及び免疫特異的結合検定の基礎として、標準的方法により標識された又は未標識の抗体を使用することもできる。使用可能な免疫学的検定としては、いくつかの例を挙げると、ウェスタンブロット法、放射免疫検定法、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降検定、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集検定、補体結合検定、免疫放射定量測定法、螢光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法が含まれるが、これらに限定されない。かかる検定は定法であり、当該技術分野においては周知である（例えばＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年、前掲書参照）。

特に、本発明の抗体は、免疫組織化学（ＩＨＣ）による研究用に調製された新鮮凍結及び／又はホルマリン固定、パラフィン包埋組織ブロックの両方と併用することもできる。

検出は、検出可能な物質に対し抗体をカップリングすることで容易になる。検出可能な物質の例としては、さまざまな酵素、補欠分子団、螢光性材料、発光性材料、生物発光材料、放射性材料、さまざまなポジトロン放出断層撮影法を用いるポジトロン放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。検出可能な物質は、当該技術分野において既知の技術を用いて、抗体（又はそのフラグメント）に直接か又は（例えば当該技術分野において既知のリンカーなどの）中間体を通して間接的にカップリング又は接合化可能である。例えば、本発明に従って診断法として用いるために抗体に接合体され得る金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号明細書を参照のこと。使用される特定の標識は、免疫測定法のタイプによって左右されることになる。使用可能な標識の例としては、例えば^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ又は^９９Ｔｃなどの放射性標識、例えばフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル及びウンベリフェロンなどの螢光性標識；例えばルシフェラーゼ及び２，３−ジヒドロフタラジンジオンなどの化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、及び例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチーム、グルコース−６−ホスファートデヒドロゲナーゼ及びアセチルコリンステラーゼなどの酵素が含まれるが、これらに限定されない。抗体は、既知の方法でかかる標識でタグ付けされ得る。例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミダート、スクシニミド、ビスジアゾ化ベンザジンなどといったカップリング剤を、螢光性、化学発光性又は酵素標識で抗体にタグ付けするのに使用することができる。関与する一般的方法は当該技術分野において周知であり、例えばＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ（１９８７年、Ｃｈａｎ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ）の中で記述されている。

さらに、予測されるポリペプチドの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンを、非腫瘍組織又は細胞試料と比較することが可能である。非腫瘍組織又は細胞試料は、同じ個体由来の非腫瘍組織又は細胞試料から得ることができ、または代替的に、異なる個体由来の非腫瘍組織又は細胞試料から得ることができる。あるポリペプチドについて検出されたパターンは、非腫瘍組織又は細胞試料と比べて検出されたポリペプチドが少ない場合には、哺乳動物の腫瘍、組織又は細胞試料内で減少したものとする。あるポリペプチドについて検出されたパターンは、非腫瘍組織又は細胞試料に比べて検出されたポリペプチドが多い場合、哺乳動物の腫瘍、組織又は細胞試料内で「増大した」ものとする。あるポリペプチドについて検出されたパターンは、非腫瘍組織又は細胞試料に比べて検出されたポリペプチドが同じか又はほぼ同じである場合、哺乳動物の腫瘍、組織又は細胞試料において「正常」であるものとする。

本発明の方法を実施するにあたっては、解剖病理学研究室の組織検査技師などにより染色手順を実施することができる。代替的には、該染色手順は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｙｓｔｅｍｓのＢｅｎｃｈｍａｒｋ（登録商標）自動染色装置シリーズなどの自動化されたシステムを用いて実施可能である。いずれの場合でも、本発明の方法に従って使用するための染色手順は、当該技術分野において周知の標準的な技術及びプロトコルに従って実施される。

「細胞又は組織試料」というのは、塗沫標本、唾液、生検材料、分泌物、脳脊髄液、胆汁、血液、リンパ液、尿及び糞便などの身体試料から単離された細胞、最も好ましくは腫瘍細胞、又は、胸、肺、腸、皮膚、頸部、前立腺及び胃などの器官から取出された組織を含む生体試料を意味するが、これらに限定されない。例えば、組織試料は機能的に関係する細胞又は隣接する細胞の一領域を含み得る。

標的タンパク質の量は、染色された抗原の平均光学密度を測定することによって定量化され得る。付随して、染色された総組織面積の割合又は百分率は、例えば第２の画像内の（抗体閾値レベルなどの）制御レベルより上の染色された面積として容易に計算することができる。バイオマーカーを含む核の視覚化の後、治療後の患者由来の組織内のかかる細胞の百分率又は量は、未治療の組織内のかかる細胞の百分率又は量と比較される。本発明に関しては、ポリペプチドの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンの「判定」というのは、直接的検査を通して、又は例えば契約診断サービスなどから間接的に、かかるポリペプチドについての発現レベル情報を得ることを単に意味するものとして広義に理解される。

代替的には、標的タンパク質の量は、螢光方法を用いて判定可能である。例えば、免疫組織化学、フローサイトメトリ及び平板に基づく検定を含め、増大する利用分野リストの中で量子ドット（Ｑｄｏｔ）がますます有用になってきており、従ってこれを本発明と併用してもよい。Ｑｄｏｔナノ結晶は、感度及び定量のためのきわめて輝度の高いシグナル並びに画像化及び解析のための高い光安定性を含む、特有の光学特性を有する。単一の励起源が必要とされ、接合体の範囲が増大しているために、これらは細胞ベースの広範囲の利用分野において有用なものとなっている。Ｑｄｏｔバイオ接合体は、利用可能な最も輝度の高い従来の染料に匹敵する量子収量をその特徴とする。さらに、これらの量子ドットベースのフルオロフォアは、従来の染料の１０〜１０００倍の光を吸収する。基礎を成すＱｄｏｔ量子ドットからの発光は少なく対称的で、これは他の色との重複が最小限におさえられることを意味し、その結果、はるかに多くの色が同時に使用されるにも関わらず、隣接する検出流路内への滲み出しは最小限におさえられ、クロストークは減衰されることになる。標準的な螢光顕微鏡がＱｄｏｔバイオ接合体の検出のための安価な手段である。Ｑｄｏｔ接合体は事実上光安定性があることから、問題の領域を見つけ試料上に適切に焦点を合わせるために顕微鏡で充分に時間を取ることができる。Ｑｄｏｔ接合体は、輝度の高い光安定性ある発光が必要とされる場合にいつでも有用であり、１つの励起源／フィルタしか利用できない場合及び色間のクロストークを最小限にする必要のある多色利用分野において特に有用である。例えば、量子ドットは、ストレプトアビジンをＩｇＧの接合体として、細胞表面マーカー及び核抗原を標識するため、ならびに細胞微小管及びアクチンを染色するために使用されてきた（Ｗｕら、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．第２１号、４１〜４６頁）。

例えば、ＱＤＯＴ螢光ＩＨＣは、検出基板がストレプトアビジン接合体ＱｄｏｔｓＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）（「Ｖｅｎｔａｎａ」）である場合、二次抗体を用いて実施可能である。画像解析は、最初にスペクトル画像化カメラ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）上で画像キューブを捕捉することで実施することができる。励起はＵＶ（水銀）光源で行うことができる。画像キューブは次に、Ｖｅｎｔａｎａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ上で解析できる。簡単に言うと、画像キューブを前記アプリケーション内で検索し、６０５ｎｍ及び６５５ｎｍで発光すると予想されるＱｄｏｔｓの画像強度に基づいてデータを抽出し報告することができる。

一例を挙げると、マルチスペクトル画像化システムＮｕａｎｃｅ^ＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）で螢光を測定することができる。もう１つの例としては、スペクトル画像化システムＳｐｅｃｔｒ Ｖｉｅｗ^ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）を用いて螢光を測定することができる。マルチスペクトル画像化は、画像の各画素における分光情報が収集され、結果としてのデータが分光画像処理ソフトウェアで解析される技術である。例えば、Ｎｕａｎｃｅシステムは、電子的かつ連続的に選択可能でありかつその後かかるデータを扱かうように設計された解析プログラムと共に利用される一連の画像を異なる波長で撮影することができる。Ｎｕａｎｃｅシステムは、染料のスペクトルがきわめて重複している場合でさえ、又はこれらのスペクトルが同時局在化されているか又は試料内の同じ箇所に発生している場合でも、スペクトル曲線が異なることを条件として、多数の染料からの定量的情報を得ることができる。数多くの生体材料が自己螢光発生するか又は、より高エネルギーの光により励起された時点でより低エネルギーの光を発出する。このシグナルはより低いコントラストの画像及びデータを結果としてもたらし得る。マルチスペクトル画像化能力のない高感度カメラは、螢光シグナルと同調した自己螢光シグナルを増大させるだけである。マルチスペクトル画像化は、組織から自己螢光発生を混合解除又は分離することによって、達成可能な信号対雑音比を増大させることができる。

抗体検出方法に関連して、「検出試薬」というのは、一次又は二次抗体の両方を含めた抗体の検出のために使用可能な試薬を意味する。例えば、検出試薬は、螢光検出試薬、Ｑｄｏｔｓ、色原体検出試薬又は重合体ベースの検出系であり得る。しかしながら、本発明の方法及びキットはこれらの検出試薬に限定されず、又一次又は二次抗体スキームにも限定されない（例えば３次抗体等も本発明の方法により考慮されている）。

本発明は、発現されたタンパク質バイオマーカーを間接的に検出する手段として、核酸プローブを使用することもできる。例えば、ＥＧＦＲバイオマーカーのためのプローブは、プローブ設計技術の当業者にとっては周知である標準的なプローブ設計方法を用いて構築可能である。一例を挙げると、本明細書に参照により援用されている米国特許出願公開第２００５／０１３７３８９Ａ１号明細書「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔａｉｎｉｎｇ」は、染色体全体を標識するように設計された配列の不均質混合物を含む無反復プローブ組成物を設計する方法について記述している。

遺伝子特異的プローブを、以下の公開手順のいずれかに従って設計することができる。この目的を達成するために、目的の部位以外の場所でのハイブリダイゼーションを最小限におさえるために、純粋又は均質なプローブを産生させることが重要である（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、１９８２年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ、第７６号：１〜４６頁）。Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓら、（１９８４年、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、第９１号：２８〜３８頁）は、反復ＤＮＡ配列ファミリーのメンバーに対応する染色体上の多数の遺伝子座を検出するための単一の種類のＤＮＡプローブの構築を開示している。

Ｗａｌｌａｃｅら、（１９８１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第９号：８７９〜９４頁）は、構造遺伝子に対応する単一の遺伝子座を検出するための混合型塩基配列をもつ合成オリゴヌクレオチドプローブの構築を開示している。塩基配列の混合は、構造遺伝子が対応するタンパク質内のアミノ酸の選択された配列をコードしうる全てのヌクレオチド配列を考慮することにより決定された。

Ｏｌｓｅｎら、（１９８０年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１９号：２４１９〜２８頁）は、最初に、ユニーク配列ＤＮＡ画分を単離できるように、全ゲノムヒトＤＮＡのそれ自体に対するハイブリダイゼーション；第２に相同性マウス／ヒト配列が除去されるように、単離されたユニーク配列ヒトＤＮＡ画分のマウスＤＮＡに対するハイブリダイゼーション；および最後に、ユニーク配列Ｘ染色体ＤＮＡの画分が単離されるように、そのヒト染色体のみがＸ染色体であるヒト／マウスハイブリッドの全ゲノムＤＮＡに対する、マウスと相同でないユニーク配列ヒトＤＮＡのハイブリダイゼーション、という連続的ハイブリダイゼーションによる、標識されたユニーク配列ヒトＸ染色体ＤＮＡの単離方法を開示している。

遺伝子検出プロトコルにおいて本発明の方法内で、標識された核酸プローブを使用することが可能である。例えば、ＥＧＦＲ遺伝子などの遺伝子の遺伝子状態を判定するために、螢光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）遺伝子検出方法を使用することができる。例えばＥＧＦＲをコードするゲノムＤＮＡの増幅、欠失又は再配置を測定するために、ＦＩＳＨ遺伝子検出を用いることができる。したがってゲノムＤＮＡの増幅、欠失又は再配置の測定を可能にするＦＩＳＨ遺伝子検出は、例えば遺伝子が安定な二染色体性、安定な三染色体性又は安定な多染色体性であるかといった、該遺伝子の状態の検出を可能にすることができる。

本発明は、銀インサイチュハイブリダイゼーションを含む方法をも使用し得る。この技術では、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素が、銀イオンから金属銀への還元の触媒として作用し、プローブに対しハイブリッド形成された標的の部位に金属粒子が被着する（Ｈｏｆｆら、２００２年、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．第１１７号：９１６〜２１頁；図２０参照）。例えば、ゲノムＤＮＡの増幅、欠失及び再配置を測定するために、銀インサイチュハイブリダイゼーションを使用することができる。

患者から採取した癌組織切片が、ＥＧＦ経路のメンバー又はその任意の陽性治療応答が予測される組合せの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化について、免疫組織化学により本発明の方法に従って分析される。本発明の方法においては、「発現」の変化は、バイオマーカーが検出される細胞の数の変化を意味し、または代替的には、陽性細胞の数は同じであり得るものの強度（又はレベル）が変化しうる。発現という用語は、分子活性化レベルのレベル変化を表わす代用語としても使用可能である。

これらの測定は、例えば組織マイクロアレイを使用することにより達成可能である。均一の染色及び評定条件下で多数の組織試料を高速スクリーニングするための、充分に立証された方法である本発明の方法においては、組織マイクロアレイを使用することが有利である。（Ｈｏｏｓら、２００１年、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．第１５８号：１２４５〜５１頁）。染色されたアレイの評定は、標準的０から３＋のスケールを用いて手動で達成でき、または観察された染色を正確に定量化する自動化されたシステムによって達成可能である。この分析結果は、治療後の患者の転帰を最も良く予測するバイオマーカーを同定する。少数のリガンドのセット、受容体、シグナリングタンパク質又はそれらの予測される組合せの発現、リン酸化又は両方に基づいて、０〜１００パーセントの範囲の患者の「応答確率」を予測することができる。癌患者からの付加的な試料を、組織マイクロアレイ結果の代替として又はその追加として、分析することができる。例えば、患者の応答が受容体発現及び／又は下流側シグナリングの特定のパターンと相関関係をもつ場合、乳癌患者からの試料の分析が、組織アレイからの結論を確認し得る。

本発明は、一部には本発明の方法を実施するためのキットを提供する。例えば、該方法は、ＥＧＦ経路内のポリペプチドの発現、リン酸化又は両方を検出できる少なくとも２つの試薬好ましくは抗体を含む、個体の体内の結腸直腸癌を評価するためのキットを提供する。例えば、該キットは、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、ｐＭＥＫ、ｐＨＥＲ１、ｐＥＲＫ、又はＫｉ６７に結合する少なくとも２つ、３つ又は４つの試薬を含むことができる。さらにキットは、付加的な抗体を含んだ、以上で同定された試薬以外の付加的構成要素を含むことができるが、これらに限定されない。かかるキットは例えば、臨床医又は医師が特定の患者のための適切な療法を選択するための補助として使用することができる。

以下の例は、本発明の特定の実施形態及びそのさまざまな用途を示している。これらの例は説明を目的として示されているにすぎず、本発明を限定するものとして解釈すべきものではない。

実施例１
結腸直腸腫瘍の進行におけるＥＧＦ経路内の下流側分子の免疫組織化学染色
癌腫の病理学的病期分類と相関関係をもつバイオマーカープロファイルを結腸直腸癌について同定できるか否かを判定するために、個々の症例からの組織試料及び市販の組織アレイを用いて、結腸直腸癌内のＥＧＦＲの発現にリンクされるバイオマーカーの発現レベルを検討した。バイオマーカーは免疫組織化学（「ＩＨＣ」）を用いて評価された。

免疫組織化学によるＨＥＲ１／ＥＧＦＲ発現の検出のために、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓのマウス抗体クローン３Ｃ６を使用した。３Ｃ６クローンは、受容体の細胞外ドメインと反応する。調査されたその他のバイオマーカーは、ｐＨＥＲ１、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、ｐＭＥＫ、Ｋｉ６７及びｐＥＲＫであった。ｐＴＹＲも、活性化の代用として評価された。全ての試薬を以下および表１に記されている通りに、かつ規定の添付文章に従って使用した。

自動化されたＩＨＣプロトコルにおいてタンパク質マーカーを検出するためのプローブ及び抗体の性能を、ＦＦＰＥ単一スライド切片内及び多重組織アレイにおいて評価した（表２参照）。全てのＩＨＣ分析は、ＶｅｎｔａｎａのＢｅｎｃｈ Ｍａｒｋ（登録商標）ＸＴ及び／又はＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＸＴ染色プラットホーム上で実施された。

単一スライド切片については、細胞を採取し、１０％の中性緩衝ホルマリン（「ＮＢＦ」）中で固定し、次にパラフィン包埋（「ＦＦＰＥ」）した。ＦＦＰＥ細胞を１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を取出し、Ｓｈａｎｄｏｎ Ｃｙｔｏｂｌｏｃｋ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｂｌｏｃｋ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（「Ｓｈａｎｄｏｎ Ｃｙｔｏｂｌｏｃｋ」）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の試薬１を３滴加えた。３０００ｒｐｍで２分間細胞を遠心分離した。試薬２が細胞ペレット縣濁の下を流れることができるようにするため管の側面を下へとＳｈａｎｄｏｎ Ｃｙｔｏｂｌｏｃｋ試薬２を３滴滴下させた。試料を１０分間インキュベートし、その後、７０％のエタノール５ｍｌを加えた（ペレットはエタノールの上面まで浮動した）。最終的に、３０００ｒｐｍで２分間試料を回転させ、その後生検カセットに移し、パラフィン包埋用に処理した。

ＩＨＣ及びインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に対する切片の適切性を確認するため、ヘマトキシリン及びエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）染色を精査した（図３）。Ｈ＆Ｅ染色には、キシレン、１００％のエタノール及び９５％のエタノール中での脱パラフィン工程、その後の水中浸漬工程などの工程を含んでいた。３分間ヘマトキシリン中にスライドを浸漬し、水中で洗い流し、１分間青色染色試薬中に浸漬し、水中で洗い流し、エオシン中に浸し、最終的にカバースリップを加えた。

免疫検定には、抗原脱マスキング工程、及び関連する一次及び二次抗体でのインキュベーションに後続する検出工程を含んでいた。負の対照として、Ｂｅｎｃｈ Ｍａｒｋ ＸＴ（登録商標）又はＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ（登録商標）Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｖｅｎｔａｎａ）のいずれかを、関連するスライドと共にインキュベートした。ＤＡＢＭａｐ^ＴＭ、ＯｍｎｉＭａｐ^ＴＭ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ（登録商標））、又はｉＶｉｅｗ^ＴＭＤＡＢ（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＸＴ（登録商標））検出キットを用いて、メーカーの取扱説明書に従って、一次抗体を検出した。簡単に述べると、ｉＶＩＥＷ^ＴＭＤＡＢ検出キットは、パラフィン包埋した又は凍結させた組織切片内で抗原に結合した特異的マウスＩｇＧ、ＩｇＭ及びウサギＩｇＧ抗体を検出した。該特異的抗体は、ビオチン接合体二次抗体により位置特定された。この工程の後には、二次抗体上に存在するビオチンを結合させたストレプトアビジン−酵素接合体の添加が続いた。その後該錯体を、沈殿発色酵素製品を用いて視覚化した。

各インキュベーション工程の終りでは、自動スライド染色装置が切片を洗浄して未結合材料を除去し、スライドからの水性試薬の蒸発を最小限におさえる液体カバースリップを適用した。結果は光学顕微鏡を用いて解釈され、特定の抗原と結びつけられていてもいなくてもよい病態生理学的プロセスの示差的診断を補助した。

具体的例として、ｐＭＥＫの検出は以下の方法で達成された。すなわち、病理学者により、組織については腫瘍の存在を又細胞系及び組織については細胞生存能力を確認するべく、Ｈ＆Ｅが精査された。一次抗体ｐＭＥＫは、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（「ＣＳＴ」）（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から得られた。

ｐＭＥＫＩＨＣ検定のために、１００℃で６０分間ＣＣ１条件緩衝液を用いてＶｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（登録商標）シリーズの計器上で細胞条件づけを行った。ここでＣＣ１は高ｐＨの細胞培養条件溶液、すなわちｐＨ８のトリス／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｖｅｎｔａｎａ）である。スライドを、室温で１時間、一次ｐＭＥＫ抗体（表１）の原液濃度の１／４０希釈物と共にインキュベートした。原液抗体濃度は、抗体の市販濃度を意味する。この情報は一部のメーカーからは入手できず、適切な希釈は実験的に決定される。負の対照としては、メーカー（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）の取扱説明書に従って使用されるＶｅｎｔａｎａ抗体希釈剤を、同じ条件下で、関係するスライドと共にインキュベートした。Ｖｅｃｔｏｒビオチニル化抗ウサギＩｇＧで置き換えた汎用二次抗体を除いて、Ｖｅｎｔａｎａ ｉＶｉｅｗ ＤＡＢ検出キットをメーカーの取扱説明書に従って使用し、３７℃で３２分適用して、ｐＭＥＫ抗体を検出した。ｐＭＥＫの酵素検出／局在化は、ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合体（Ｖｅｎｔａｎａ）とその後に続く、メーカーの取扱説明書及び使用されたキットに従ったジアミノベンチジン（「ＤＡＢ」）及び硫酸銅の存在下での過酸化水素との反応を用いて達成された（表１参照）。接合体と全ての発色試薬は、Ｖｅｃｔｏｒビオチニル化二次ウサギ抗体を除いて、同様にｉＶｉｅｗ検出キットの構成要素であり、メーカーが推奨する時点で適用された。

結腸直腸進行組織マイクロアレイ（ＴＭＡ；ＣＨＴＮ２００３ＣＲＰｒｏｇ）は、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から得た。該アレイの詳細は図４中に示され、表２中に要約されている。簡単に言うと、このホルマリン固定及びパラフィン包埋された（「ＦＦＰＥ」）結腸直腸癌進行アレイは、ドナーから試料を収集することによって作製された。このＴＭＡは、示差的遺伝子発現における強い傾向を検出し得る少数の症例を表している。未染色組織学的切片は厚みが４ミクロンであり、荷電ガラススライド上に提供された。ＣＨＴＮ２００３ＣＲＣＰｒｏｇＴＭＡは、最高２０の非腫瘍性結腸粘膜症例、１４の腺腫性ポリープ症例、１４の原発性結腸直腸腺癌、７の局所リンパ節転移、腺癌症例及び７の遠隔部位転移腺癌症例を含んでいる。各症例は、０．６ｍｍのコアを伴って３回試料採取される。

手作業での評点が、専門委員会認定病理学者により行なわれた。染色強度、反応性細胞の百分率及び細胞局在化が記録された。ＩＨＣの病理学者評価については、染色強度の評点は、０（陰性）から３＋（最大陽性）までであった。

光学画像化には、数値的評点に換算された染色強度（平均光学密度つまりａｖｇ．ＯＤで表わされたもの）に基づいた画像定量化を伴うデジタルアプリケーションが用いられた。高解像度の画像が各試料について捕捉され、ＯＤ値は、陽性染色細胞についての色範囲の特定的分類子に基づいていた。解析用画像は、４０倍対物レンズを用いて捕捉された。一部のケースでは、組合せ評点＝（陽性％）×（光学密度評点）という式に従って、陽性細胞の百分率及び染色強度の両方を取込む「組合せ評点」又は乗法的指数が導出された。

活性化代用尺度としてｐｔｙｒ活性を用いた組織化学組織評価の結果は、癌及び非癌症例由来の正常な結腸粘膜と比べて、新生組織形成及び炎症性非腫瘍性組織内の発現の増加を示した（図５）。ＴＭＡ内のＥＧＦＲ経路分子由来の発現レベルの組織化学評価の結果は、図６−９に示されている。個々の症例におけるＥＧＦＲ経路分子由来の発現レベルの組織化学評価の結果は、図１０に示されている。両方の実験からの結果は、逐次的病期分類カテゴリを通して結腸直腸癌が進行するにつれて、ｐＭＥＫ、Ｋｉ６７、及びｐＨＥＲ１タンパク質レベルは増大し、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ及びｐＡＫＴタンパク質レベルは減少することを示している（図１１）。これらの発見事実は、早期小腺腫におけるＥＧＦＲ（タンパク質）、ＰＴＥＮの高いレベル及びｐＭＥＫの低いレベルそして悪性表現型を含む進行性疾患におけるＰＴＥＮの低いレベル及びｐＭＥＫの高いレベルを含めた、結腸直腸腫瘍の進行の診断及び追跡において有用であり得るバイオマーカープロファイルを同定している。

実施例２
インサイチュハイブリダイゼーションを用いたＥＧＦＲ遺伝子コピー数と結腸直腸癌腫瘍病期分類の相関性
ＥＧＦＲについての螢光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、個々の症例からの単一スライド切片及び多重組織アレイについて実施し、結腸直腸癌の進行における遺伝子の状態を評価した。

２色ＦＩＳＨを用いて、細胞１個あたりのＥＧＦＲ遺伝子コピー数を、ホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）単一スライド切片内及び多重組織アレイ内で評価した（図１２）。単一スライド切片及び多重組織アレイの詳細は、実施例１で概略的に説明されている。

ＥＧＦＲ遺伝子のインサイチュハイブリダイゼーション検出は、Ｖｅｎｔａｎａ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｒａｎｇｅラベル付き）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＳＰＯＴＬｉｇｈｔ^ＴＭ−ＥＧＦＲ、ＤＩＧラベル付き）、又はＶｙｓｉｓ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｒａｎｇｅ ＥＧＦＲ及びＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ ＣＥＰ７ラベル付きプローブ）からのいずれかのプローブを用いて行なわれた。Ｖｅｎｔａｎａ及びＺｙｍｅｄからのＥＧＦＲプローブをＶｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＸＴ上の完全自動化プロトコルを用いて検出した。Ｖｙｓｉｓプローブの検出は、半自動化されており、プローブハイブリダイゼーションはメーカー（Ｖｙｓｉｓ、Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）の説明通りオフラインで行なわれた。ＦＩＳＨプロトコルは、メーカーの添付文書（Ｖｙｓｉｓ、カタログ番号３２−１９１０５３）に従って実施された。ＦＩＳＨ評価は、Ｈｉｒｓｃｈら、ＪＣＯ、第２１号：３７９８〜３８０７頁中の記述通りに行われた。図１２は、安定な二染色体性、安定な三染色体性、安定な多染色体性及び遺伝子増幅を標示する代表的な顕微鏡写真を示す。

細胞１個あたりの遺伝子コピー平均数は、病理学精査によりＥＧＦＲ及びＣＥＰ７について決定された。個々の症例及びＴＭＡにおけるＥＧＦＲＦＩＳＨ検定の結果は、ＥＧＦＲ遺伝子状態が、表３に示されているように小腺腫から腺癌まで、安定な二染色体性（正常）から安定な三染色体性／多染色体性（異常）へと進化すること（表１３）を実証している。高いＥＧＦＲ遺伝子コピーレベル（三染色体＋）をもつ試料は全て、ＩＨＣにより検定されるように高いタンパク質レベルをもつ無集団（３＋、＞５０％）を有していた（実施例１）。実施例１及び２の発見事実は同様に、早期癌病期における遺伝子増幅（正常）をタンパク質発現（高）のレベル不一致をも示唆している。

実施例３
腫瘍内部のＥＧＦＲ経路分子の発現レベルの不均質性
ＥＧＦＲ経路分子の発現レベルは、単一の腫瘍内のこれらの分子の発現レベルの考えられる不均質性を評価するべく、結腸直腸癌の事例研究において評価された。

直腸出血及び腹部疝痛を呈する４１才の男性が３ｃｍの直腸塊の診断を受けた。放射線治療後の遠隔結腸切除は、病期Ｔ３の高分化型直腸腺癌を明らかにした。実施例１で記述した通りに、腫瘍のさまざまな領域から単一のスライド切片を調製した。実施例１で記述した通り、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ｐＡＫＴ、Ｋｉ６７、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ及びＶＥＧＦについての発現レベルを判定するためにＩＨＣを実施した。室温で２時間インキュベートすることにより、Ｎｏｖｕｓからの抗体（ＮＢ５００−２０１）を用いてＳｕｒｖｉｖａｎを検出した。室温で１時間内含することにより、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚからの抗体（ＳＣ−７２６９）を用いてＶＥＧＦを検出した。

図１４−１９は、同じ腫瘍内で、腫瘍バイオマーカーの発現レベルが著しく変動し得ることを示している。これらの結果は、特定の腫瘍の個々の発現形跡に合わせて調整された個別組合せ療法から患者が恩恵を享受し得るということを実証している。

以上の開示は本発明のいくつかの特定的実施形態を強調していることそしてそれと等価のすべての修正又は変形形態が、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神及び範囲の中に入るものであることを理解すべきである。

ＥＧＦＲ経路の概略図である。 結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃｏｌｏｎ）の進行の概略図である。 ＣＨＴＮ結腸直腸癌進行についての代表的なヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色の顕微鏡写真である。図３Ａは、最大寸法で２ｃｍ未満の腺腫の代表的Ｈ＆Ｅ染色である。図３Ｂは、最大寸法で２ｃｍ超の腺腫の代表的Ｈ＆Ｅ染色である。図３Ｃは、原発性侵襲性病理学的病期Ｔ１又はＴ２の腫瘍試料の代表的Ｈ＆Ｅ染色である。図３Ｄは、原発性侵襲性病理学的病期Ｔ３又はＴ４の腫瘍試料の代表的Ｈ＆Ｅ染色である。図３Ｅは、リンパ節転移である結腸直腸腺癌の代表的Ｈ＆Ｅ染色である。図３Ｆは、遠隔部位転移である結腸直腸腺癌の代表的Ｈ＆Ｅ染色である。 Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ （ＣＨＴＮ）から得た結腸直腸進行組織マイクロアレイ（ＴＭＡ：ＣＨＴＮ２００３ＣＲＣＰｒｏｇ）に対するマップを表わす。 組織化学的組織評価の結果を表わす；ＩＨＣにより検定された通りの結腸直腸組織試料内のｐｔｙｒ発現が、平均陽性百分率単位で表わされている。 結腸直腸癌の進行についての代表的ＥＧＦＲ発現レベルの顕微鏡写真である。図６Ａは、最大寸法で２ｃｍ未満の腺腫のＥＧＦＲ染色の代表的画像である（Ｃ１０）。試料は、１００％の陽性百分率の細胞質／膜染色で３＋の評点を有する。図６Ｂは、最大寸法で２ｃｍ超の腺腫のＥＧＦＲ染色の代表的画像である（Ｆ５）；試料は、１００％の陽性百分率の細胞質／膜染色で３＋の評点を有する。図６Ｃは、原発性侵襲性病理学的病期Ｔ１又はＴ２の腫瘍試料のＥＧＦＧ染色の代表的画像である（Ｅ４）；試料は、１００％の陽性百分率の細胞質／膜染色で３＋の評点を有する。図６Ｄは、原発性侵襲性病理学的病期Ｔ３又はＴ４の腫瘍試料のＥＧＦＲ染色の代表的画像である（Ｈ１０）；試料は、９０％の陽性百分率の細胞質／膜染色で３＋の評点を有する。図６Ｅは、リンパ節転移である結腸直腸腺癌のＥＧＦＲ染色の代表的画像である（Ｊ２０）；試料は、８５％の陽性百分率の細胞質／膜染色で２＋の評点を有する。図６Ｆは、遠隔部位転移である結腸直腸腺癌のＥＧＦＲ染色の代表的画像である（Ｂ１３）；試料は、１％の陽性百分率の膜染色で１＋の評点を有する。 結腸直腸癌の進行についての代表的ＰＴＥＮ発現レベルの顕微鏡写真である。図７Ａは、最大寸法で２ｃｍ未満の腺腫のＰＴＥＮ染色の代表的画像である（Ｃ４）。試料は、８０％の陽性百分率の細胞質染色で３＋の評点を有する。図７Ｂは、最大寸法で２ｃｍ超の腺腫のＰＴＥＮ染色の代表的画像である（Ｆ３）；試料は、７５％の陽性百分率の細胞質染色で１＋の評点を有する。図７Ｃは、原発性侵襲性病理学的病期Ｔ１又はＴ２の腫瘍試料のＰＴＥＮ染色の代表的画像である（Ｅ２）；試料は、８０％の陽性百分率の細胞質染色で２＋の評点を有する。図７Ｄは、原発性侵襲性病理学的病期Ｔ３又はＴ４の腫瘍試料のＰＴＥＮ染色の代表的画像である（Ｈ４）；試料は、４０％の陽性百分率の細胞質染色で１＋の評点を有する。図７Ｅは、リンパ節転移である結腸直腸腺癌のＰＴＥＮ染色の代表的画像である（Ｊ１８）；試料は、陰性であった。図７Ｆは、遠隔部位転移である結腸直腸腺癌のＰＴＥＮ染色の代表的画像である（Ｂ７）；試料は、陰性であった。 結腸直腸癌の進行についての代表的ｐＭＥＫ発現レベルの顕微鏡写真である。図８Ａは、最大寸法で２ｃｍ未満の腺腫のｐＭＥＫ染色の代表的画像である（Ｃ４）。試料は、１０％の陽性百分率の細胞質／膜染色で１＋の評点を有する。図８Ｂは、最大寸法で２ｃｍ超の腺腫のｐＭＥＫ染色の代表的画像である（Ｆ３）；試料は、７０％の陽性百分率の細胞質染色で１＋の評点を有する。図８Ｃは、原発性侵襲性病理学的病期Ｔ１又はＴ２の腫瘍試料のｐＭＥＫ染色の代表的画像である（Ｅ２）；試料は、８０％の陽性百分率の細胞質染色で１＋、および１０％の陽性百分率の核染色で１＋の評点を有する。図８Ｄは、原発性侵襲性病理学的病期Ｔ３又はＴ４の腫瘍試料のｐＭＥＫ染色の代表的画像である（Ｈ４）；試料は、１００％の陽性百分率の細胞質染色で２＋の、および５％の陽性百分率の核染色で２＋の評点を有する。図８Ｅは、リンパ節転移である結腸直腸腺癌のｐＭＥＫ染色の代表的画像である（Ｊ１８）；試料は、１００％の陽性百分率の細胞質染色で３＋の評点を有する。図８Ｆは、遠隔部位転移である結腸直腸腺癌のｐＭＥＫ染色の代表的画像である（Ｂ７）；試料は、１００％の陽性百分率の細胞質染色で２＋の、および１５％の陽性百分率の核染色で３＋の評点を有する。 結腸直腸癌の進行についての代表的Ｋｉ６７発現レベルの顕微鏡写真である。図９Ａは、最大寸法で２ｃｍ未満の腺腫のＫｉ６７染色の代表的画像である（Ｃ４）。試料は、１０％の陽性百分率の核染色で２＋の評点を有する。図９Ｂは、最大寸法で２ｃｍ超の腺腫のＫｉ６７染色の代表的画像である（Ｆ３）；試料は、２５％の陽性百分率の核染色で２＋の評点を有する。図９Ｃは、原発性侵襲性病理学的病期Ｔ１又はＴ２の腫瘍試料のＫｉ６７染色の代表的画像である（Ｅ２）；試料は、８５％の陽性百分率の核染色で２＋の評点を有する。図９Ｄは、原発性侵襲性病理学的病期Ｔ３又はＴ４の腫瘍試料のＫｉ６７染色の代表的画像である（Ｈ４）；試料は、４０％の陽性百分率の核染色で２＋の、および１５％の陽性百分率の核染色で３＋の評点を有する。図９Ｅは、リンパ節転移である結腸直腸腺癌のＫｉ６７染色の代表的画像である（Ｊ１０）；試料は、４５％の陽性百分率の核染色で３＋の評点を有する。図９Ｆは、遠隔部位転移である結腸直腸腺癌のＫｉ６７染色の代表的画像である（Ｂ７）；試料は、７０％の陽性百分率の細胞質染色で２＋の評点を有する。 単一の個体の症例（男性、７１才）からの結腸直腸癌の進行のバイオマーカー発現レベルの代表的な顕微鏡写真である。図１０Ａは、最大寸法で２ｃｍ未満の腺腫；最大寸法で２ｃｍ超の腺腫、原発性侵襲性病理学的病期Ｔ３又はＴ４の腫瘍；及びリンパ節転移である結腸直腸腺癌の代表的な免疫組織化学的（ＩＨＣ）画像である。ＥＧＦＲ、ｐＨＥＲ１、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、ｐＭＥＫ、及びＫｉ６７に対する反応性をもつ抗体が使用された。図１０Ｂは、コンピューター援用画像解析の結果（Ａ）、及び病理学評点（Ｂ）の両方を用いて、グラフ形態で結果を示している。 画像解析を用いて判定されるような結腸直腸癌の進行中のＥＧＦＲ発現経路内のバイオマーカー評価の要約を表わしている。該結果は、平均評点の変化％として示されている。 上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、赤色）；染色体７（ＣＥＰ７、緑色）についてのプローブを用いた２色螢光インサイチュハイブリダイゼーション検定の顕微鏡写真である。図１２Ａは、安定な二染色体性を示し、図１２Ｂは安定な三染色体性を示し、図１２Ｃは安定な多染色体性を示し、図１２Ｄは遺伝子増幅を示す。 結腸直腸癌の進行におけるＥＧＦＲ ＦＩＳＨ遺伝子検出の顕微鏡写真である。図１３Ａは、安定な二染色体性である最大寸法が２ｃｍ未満の腺腫の代表的ＥＧＦＲ ＦＩＳＨ遺伝子検出である。図１３Ｂは、安定な二染色体性である、最大寸法で２ｃｍ超の腺腫の代表的なＥＧＦＲ ＦＩＳＨ遺伝子検出である。図１３Ｃは、安定な二染色体性である、原発性侵襲性病理学的病期Ｔ１又はＴ２の腫瘍試料の代表的なＥＧＦＲ ＦＩＳＨ遺伝子検出である。図１３Ｄは、安定な多染色体性である原発性侵襲性病理学的病期Ｔ３又はＴ４の腫瘍試料の代表的ＥＧＦＲ ＦＩＳＨ遺伝子検出である。図１３Ｅは、安定な多三染色体である、リンパ節転移である結腸直腸腺癌の代表的なＥＧＦＲ ＦＩＳＨ遺伝子検出である。図１３Ｆは、遺伝子増幅二染色体性を示す遠隔部位転移である結腸直腸腺癌の代表的ＥＧＦＲ ＦＩＳＨ遺伝子検出である。 結腸直腸癌におけるＥＧＦＲ発現レベルの顕微鏡写真である。図１４Ａは、２０×の走査パスでの２つの領域（領域１及び領域２）を示し、図１４Ｂは、２つの領域についてのＥＧＦＲ組合せ評点（ＡＲＩＯＬ）の結果を示す。 結腸直腸癌におけるＨＥＲ２発現レベルの顕微鏡写真である。図１５Ａは、２０×の走査パスでの２つの領域（領域１及び領域２）を示し、図１５Ｂは、２つの領域についてのＨＥＲ２組合せ評点（ＡＲＩＯＬ）の結果を示す。 結腸直腸癌におけるｐＡＫＴ発現レベルの顕微鏡写真である。図１６Ａは、２０×の走査パスでの２つの領域（領域１及び領域２）を示し、図１６Ｂは、２つの領域についてのｐＡＫＴ組合せ評点（ＡＲＩＯＬ）の結果を示す。 結腸直腸癌におけるＫｉ６７発現レベルの顕微鏡写真である。図１７Ａは、２０×の走査パスでの２つの領域（領域１及び領域２）を示し、図１７Ｂは、２つの領域についてのＫｉ６７組合せ評点（ＡＲＩＯＬ）の結果を示す。 結腸直腸癌におけるＳｕｒｖｉｖｉｎ発現レベルの顕微鏡写真である。図１８Ａは、２０×の走査パスでの２つの領域（領域１及び領域２）を示し、図１８Ｂは、２つの領域についてのＳｕｒｖｉｖｉｎ組合せ評点（ＡＲＩＯＬ）の結果を示す。 結腸直腸癌におけるＶＥＧＦ発現レベルの顕微鏡写真である。図１９Ａは、２０×の走査パスでの２つの領域（領域１及び領域２）を示し、図１９Ｂは、２つの領域についてのＶＥＧＦ組合せ評点（ＡＲＩＯＬ）の結果を示す。 銀インサイチュハイブリダイゼーションの概略図を示す。

Claims (17)

1. 個体内での結腸直腸癌の進行を評価するための方法であって、２つ以上の生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンを検出するために前記個体から得た組織又は細胞試料を検定する工程を含み、
   前記２つ以上の生物学的マーカーは、ＥＧＦＲとＰＴＥＮを含み、
   前記２つ以上の生物学的マーカーの前記発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンが、結腸直腸の進行病期が立証された、異なる個体由来の組織もしくは細胞試料由来の、前記２つ以上の生物学的マーカーの前記発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンと比較した時に実質的に類似している、又は同じ個体由来の非結腸直腸癌組織もしくは細胞試料由来の、前記２つの生物学的マーカーの前記発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンと異なる、方法。
2. 前記２つ以上の生物学的マーカーがｐＡＫＴ、ｐＭＥＫ、ｐＥＲＫ、Ｋｉ６７およびｐＨＥＲ１からなる群より選択される少なくとも１種をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 標識された核酸ベースのプロープを用いてＥＧＦＲをコードするゲノムＤＮＡの増幅、欠失又は再配列を測定する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 小腺腫期での個体内の結腸直腸癌の進行を評価する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. ２つ以上のマーカーがｐＭＥＫをさらに含み、前記個体から得た前記組織又は細胞試料由来の前記２つ以上の生物学的マーカーの前記発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンが、非腫瘍組織又は細胞試料内で発現、リン酸化又は発現およびリン酸化されるものよりも高いＥＧＦＲの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方、それよりも高いＰＴＥＮの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方、それよりも低いｐＭＥＫの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方を含む、請求項４に記載の方法。
6. 標識された核酸ベースのプローブを用いてＥＧＦＲをコードするゲノムＤＮＡの増幅、欠失又は再配列を測定する前記工程をさらに含み、前記個体から得た前記組織又は細胞試料内の前記増幅、欠失又は再配列の度合が安定な二染色体性である、請求項４又は５に記載の方法。
7. 腺癌期での個体内の結腸直腸癌の進行を評価する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記個体から得た前記組織又は細胞試料由来の前記１つ以上の生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンが、小腺腫組織又は細胞試料内で発現、リン酸化又は発現かつリン酸化されるものよりも低いＰＴＥＮの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方、又はそれよりも大きいｐＭＥＫの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方が含まれる、請求項７に記載の方法。
9. 標識された核酸ベースのプローブを用いてＥＧＦＲをコードするゲノムＤＮＡの増幅、欠失又は再配列を測定する前記工程をさらに含み、前記個体から得た前記組織又は細胞試料内の前記増幅、欠失又は再配列の度合が安定な二染色体性および安定な三染色体性である、請求項７又は８に記載の方法。
10. 悪性腺癌期での個体内の結腸直腸癌の進行を評価する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記個体から得た前記組織又は細胞試料由来の前記２つ以上の生物学的マーカーの前記発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方のパターンが、小腺腫組織又は細胞試料内で発現、リン酸化又は発現かつリン酸化されるものよりも低いＰＴＥＮの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方、又はそれよりも大きいｐＭＥＫの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方が含まれ、かつ標識された核酸ベースのプローブを用いてＥＧＦＲをコードするゲノムＤＮＡの増幅、欠失又は再配列を測定する前記工程をさらに含み、前記個体から得た前記組織又は細胞試料の遺伝子形態が安定な二染色体性および安定な多染色体性である、請求項１０に記載の方法。
12. 標識された核酸ベースのプローブを用いてＥＧＦＲをコードするゲノムＤＮＡの増幅、欠失又は再配列を測定する前記工程をさらに含み、前記個体から得た前記組織又は細胞試料の前記増幅の度合が安定な二染色体性および安定な多染色体性である、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 前記検定する工程が、標識された特異的結合試薬を用いた染色後の組織切片のコンピューター援用画像解析を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. ２つ以上の生物学的マーカーの発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方を検出するための少なくとも３つの試薬を含み、
    前記２つ以上の生物学的マーカーは、ＥＧＦＲとＰＴＥＮを含む、個体内の結腸直腸癌の進行を評価するためのキット。
15. 前記２つ以上の生物学的マーカーがｐＡＫＴ、ｐＨＥＲ１、ｐＭＥＫ、ｐＥＲＫおよびＫｉ６７からなる群より選択される少なくとも１種をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
16. 前記２つ以上の生物学的マーカーがｐＭＥＫをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
17. ＥＧＦＲ遺伝子増幅、欠失又は再配列の検出のための試薬をさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のキット。

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