CN1771334A - 用于确定肿瘤对抗肿瘤药剂的治疗的敏感性的方法 - Google Patents

Abstract

测定在含有癌细胞的样品中一种或者多种葡萄糖转运蛋白的水平，并将该水平与参照值相比较，以确定该癌症对该抗癌药剂的治疗是否敏感，所述的抗癌药剂含有可由葡萄糖转运蛋白转运进入癌症细胞的葡萄糖或者葡萄糖类似物。

Description

用于确定肿瘤对抗肿瘤药剂的治疗的敏感性的方法

相关专利申请的交叉参考

[0001]本申请要求2003年3月7日提交的美国临时申请60/453,083的权益，其全部内容在此并入，作为参考。

技术领域

[0002]本发明涉及确定肿瘤对抗肿瘤药剂治疗的敏感性的方法，在生物学和医学中具有用途。

背景技术

[0003]术语“癌症(cancer)”通常是指一类由异常细胞的不受控制的生长和播散引起的超过100种的疾病中的一种，它可以是实体瘤(solid tumors)、淋巴瘤和非实体癌(non-solid cancers)如白血病的形式。治疗癌症患者的医生有各种各样的药物疗法和非药物疗法供选择。然而，在对具体的患者确定适当的疗法时，却是有问题的，原因是，虽然某些治疗可以匹配于某些癌症类型，但是患者对一特定治疗的反应却是不一致的。

[0004]许多有希望的抗癌药剂包含葡萄糖或者葡萄糖样部分(glucose-likemoiety)，并且因此可以是协助细胞摄取葡萄糖的膜蛋白——葡萄糖转运蛋白的底物。例子包括抗癌药链脲菌素(STZ)、glucofosfamide和2gluSNAP，其它的含葡萄糖或者含葡萄糖类似物的药物正在开发之中。这些药物的葡萄糖样部分介导向癌细胞内的转运，因此这里利用了这样一个事实：相对于正常细胞，许多癌细胞显示出增加的葡萄糖代谢，这被认为是部分地归因于葡萄糖转运蛋白数量的增加(参见Medina et al.，2002，Biol Res.35：9-26)。然而，不是所有的患者(或者癌症)对药物治疗例如链脲霉素、glucofosfamide和2gluSNAP都起反应。帮助预测哪些患者最可能受益于采用特定的抗癌药剂和特定类型的药剂的特定治疗的方法，可以使医生更有效地治疗癌症和对患者提供显著的益处。本发明便提供了这样的方法。

发明概述

[0005]本发明包括多个方面，但是一般地，提供了方法和试剂，它们用于筛选癌症患者，以确定他们所患有的癌症对采用含葡萄糖或葡萄糖类似物的抗癌药剂的治疗是否敏感。

[0006]在一个方面，本发明提供了方法，用于将癌细胞中一种或者多种葡萄糖转运蛋白的水平与所述细胞对抗癌药剂的敏感性相关联，其中所述抗癌药剂是由所述转运蛋白运送的，例如含葡萄糖或者葡萄糖类似物的抗肿瘤药剂。在一种实施方案中，药剂含有葡萄糖部分(moiety)；在其它的实施方案中，药剂含有2-脱氧葡萄糖部分或者果糖部分。

[0007]在一种实施方案中，本发明提供了方法，用于确定癌症对抗肿瘤药剂治疗是否敏感，通过下列步骤实施：(a)获取癌症样品；(b)测定该样品中至少一种葡萄糖转运蛋白的水平；(c)将该水平与预先确定的值比较；(d)如果测定的水平比预先确定的值高，则确定该癌症对该抗肿瘤药剂治疗是敏感的。在一个相关的方面，本发明提供了方法，用于确定人类癌症对抗癌药剂治疗是否敏感，其中所述抗癌药剂含有葡萄糖或者葡萄糖类似物，并由葡萄糖转运蛋白转运，所述方法包括：获取所述癌症的样品；测定所述样品中葡萄糖转运蛋白的量；将所述样品中的所述量与预先确定的值相比较；如果所述量比预先确定的值高，则确定，所述癌症对所述抗癌药剂敏感并且可以用该药剂治疗，或者，如果所述量比所述预先确定的值低，则确定，所述癌症对所述抗癌药剂不敏感或者具有降低的敏感性。

[0008]在一种实施方案中，癌症样品中多于一种的葡萄糖转运蛋白的水平被测定。在一种实施方案中，I类和/或II类和/或III类GLUT葡萄糖转运蛋白的水平被测定。各种方法可以被用来测定样品中的葡萄糖转运蛋白的水平。一种方法是免疫学分析。另一种合适的方法涉及RNA扩增或者cDNA扩增。在一种实施方案中，处理所述的人类癌症样品，它可以是例如，新鲜的、冷冻的、固定化的或者固定化并用石蜡包埋的肿瘤细胞样品，从所述样品分离出总蛋白，用特异于所述葡萄糖转运蛋白中的一种或者多种的抗体接触分离物，通过检测抗体和所述葡萄糖转运蛋白之间形成的复合物，确定所述分离物中葡萄糖转运蛋白的水平。在其它的实施方案中，通过用有别于抗体的试剂检测葡萄糖转运蛋白，例如，通过测定新鲜组织样品中的葡萄糖摄取，或者通过测定一个或者多个葡萄糖转运蛋白基因的信使RNA，或者，通过测定葡萄糖转运蛋白或其相应基因的活性，确定样品中葡萄糖转运蛋白的水平或者含量。

[0009]在本方法的一种实施方案中，癌症样品中的GLUT2水平被测定。在本方法的另一种实施方案中，抗癌药剂是链脲菌素治疗。在另一种实施方案中，癌症是胰腺癌或者胰岛细胞癌。在一种优选的实施方案中，GLUT2水平被测定，抗癌药剂是链脲菌素、glucofosfamide或者gluSNAP化合物，癌症是胰腺癌或者胰岛细胞癌。

[00010]在另一个方面，本发明提供了在本发明的实践中有用的试剂盒。在一种实施方案中，试剂盒包括本方法的诊断筛查试剂及其使用说明书。在另一种实施方案中，试剂盒进一步包括含有葡萄糖或者葡萄糖类似物的抗肿瘤治疗药剂。

[00011]下面的详细描述、实施例和权利要求，更加详细地描述了本发明的这些方面和其它方面以及实施方案。

发明详述

1.引言

[00012]本发明提供了方法、试剂和设备，它们在评价癌症对抗癌药剂治疗是否敏感，或者癌症对抗癌药剂的敏感程度方面，是有用的。在一个方面，抗癌药剂是由葡萄糖转运蛋白运送的药物，例如包含葡萄糖或者葡萄糖类似物部分的药物，其是葡萄糖转运蛋白的底物。如本文所应用，如果确定了一种癌症对药物治疗“敏感”，这便意味着，与被确定为对该药剂不“敏感”的肿瘤相比，对该药剂“敏感”的肿瘤被该药物有效地在治疗上抵抗的可能性更高。因此，癌症对一种药物或者一类药物的治疗是否敏感的判断，提供了确定用于治疗患者的化学治疗方案的方法。

[00013]在本发明的一些方法中，从患者获得癌症样品并进行检测，以确定一种或者多种葡萄糖转运蛋白的水平；将表达高水平的葡萄糖转运蛋白的癌症确定为，对抗癌药剂的化学治疗敏感，其中所述的抗癌药剂含有葡萄糖或者葡萄糖部分并且由葡萄糖转运蛋白运输。相反地，将表达低水平的葡萄糖转运蛋白的癌症确定为，对这样的化学治疗不敏感(或者较不敏感)。根据本发明方法的治疗前筛选(pre-therapy screening)使医生可以更有效地治疗癌症，因为其提供给了医生一种方法，用以确定抗癌药剂治疗是否会有效，如果不是有效的，则应用可能更有效的化合物治疗该癌症，如果是有效的，则应用该药剂进行治疗。

[00014]术语“葡萄糖转运蛋白”以两种相关但略微不同的意义，被用在医学文献中。在第一种意义中，葡萄糖转运蛋白是转运化合物(不论是葡萄糖、葡萄糖类似物、其它糖类例如果糖或者肌醇，或者非糖类例如抗坏血酸)穿过细胞膜的蛋白质，并且基于结构相似性(例如，与其它葡萄糖转运蛋白的同源性)，它们归为葡萄糖转运蛋白“家族”成员。然而，相信一些“葡萄糖转运蛋白”的主要底物是不同于葡萄糖的物质。例如，葡萄糖转运蛋白GLUT5主要是果糖的转运蛋白，据报道，它以低亲和力转运葡萄糖本身。类似地，葡萄糖转运蛋白HMIT的主要底物是肌-肌醇(myo-inositol，一种糖醇)。如本文所应用，除非另有指明，术语“葡萄糖转运蛋白”包括果糖和肌醇的转运蛋白。在一个方面，本发明预期了，测定任何葡萄糖转运蛋白的水平，以评价肿瘤对抗癌药剂的敏感性，其中所述的抗癌药剂由葡萄糖转运蛋白(包括但不限于，选自GLUT1-12、HMIT和SGLT1-6转运蛋白的葡萄糖转运蛋白)转运进入肿瘤细胞。在一种优选的实施方案中，本发明预期了，测定葡萄糖转运蛋白的水平，该转运蛋白以高于果糖、肌醇、H+-肌肌醇或者非糖类例如抗坏血酸的亲和力转运葡萄糖，以评价肿瘤对抗癌药剂的敏感性，其中所述抗癌药剂包含葡萄糖或者葡萄糖类似物部分，由葡萄糖转运蛋白转运进入肿瘤细胞。

[00015]在本发明的一种优选的实施方案中，测定癌症样品中一种或者多种葡萄糖转运蛋白的水平，并与参照值(多个值)相比较。相对于所述参照值，癌症细胞中高的转运蛋白水平提示，肿瘤对含有葡萄糖或者葡萄糖类似物部分的一类抗癌药剂中的成员的治疗敏感。

[00016]因此，在一种实施方案中，本发明包含了用于确定癌症对抗肿瘤药剂治疗是否敏感的方法，其中所述药剂包含由葡萄糖转运蛋白转运进入癌症细胞的葡萄糖或者葡萄糖类似物，所述方法包括下列步骤：(a)获取所述癌症的样品；(b)测定所述样品中葡萄糖转运蛋白的量或者活性；(c)将步骤(b)中测定的所述量或者活性与预先确定的量或者活性相比较；和(d)如果所述的测定量或者测定活性大于所述预先确定的量或者活性，则确定所述癌症对所述治疗敏感，如果所述的测定量小于所述预先确定的量或者活性，则确定所述癌症对所述治疗不敏感或者较不敏感。

[00017]在一种实施方案中，本发明包含了用于确定患者对抗肿瘤药剂治疗是否敏感的方法，其中所述的药剂包含由葡萄糖转运蛋白转运进入癌症细胞的葡萄糖或者葡萄糖类似物，所述方法包括下列步骤：(a)诊断患者患有癌症；(b)从所述患者获取所述癌症的样品；(c)测定所述样品中葡萄糖转运蛋白的量或者活性；(d)将步骤(c)中测定的所述量或者活性与预先确定的量或者活性相比较；和(e)如果所述的测定量或者测定活性大于所述预先确定的量或者活性，则确定所述患者对所述治疗敏感，如果所述的测定量或者测定活性小于所述预先确定的量或者活性，则确定所述患者对所述治疗不敏感。

[00018]在一种实施方案中，本发明包含了用抗肿瘤药剂治疗癌症患者的方法，其中所述的抗肿瘤药剂包含由葡萄糖转运蛋白转运进入癌症细胞的葡萄糖或者葡萄糖类似物，所述方法包括下列步骤：(a)从所述患者获取所述癌症的样品；(b)测定所述样品中葡萄糖转运蛋白的量或者活性；(c)将步骤(b)中测定的所述量或者活性与预先确定的量或者活性相比较；和(d)如果所述的测定量或者测定活性大于所述的预先确定的量或者活性，则确定所述癌症对所述治疗敏感，如果所述的测定量或者测定活性小于所述预先确定的量或者活性，则确定所述癌症对所述治疗不敏感；和如果所述的测定量或者测定活性大于所述预先确定的量或者活性，则(e)用该抗肿瘤药剂治疗癌症患者。

[00019]在一种实施方案中，本发明包含了用抗肿瘤药剂治疗患者的方法，其中所述的抗肿瘤药剂包含由葡萄糖转运蛋白转运进入癌症细胞的葡萄糖或者葡萄糖类似物，所述方法包括下列步骤：(a)诊断患者患有癌症；(b)从所述患者获取所述癌症的样品；(c)测定所述样品中葡萄糖转运蛋白的量或者活性；(d)将步骤(c)中测定的所述量或者活性与预先确定的量或者活性相比较；(e)如果所述的测定量或者测定活性大于所述的预先确定的量或者活性，则确定所述癌症对所述治疗敏感，如果所述的测定量或者测定活性小于所述的预先确定的量或者活性，则确定所述癌症对所述治疗不敏感；和如果所述的测定量或者测定活性大于所述的预先确定的量或者活性，则(f)用该抗肿瘤药剂治疗癌症患者。

2.“抗癌药剂(ANTI-CANCER AGENTS)”和“抗肿瘤药剂(ANTI-NEOPLASTICAGENTS)”

[00020]抗癌药剂是预防或者阻止患者癌细胞生长和/或播散的化合物。给予抗癌药剂可以引起疾病进程的延迟或者减慢、疾病状态的改善或者减轻、好转(不论部分地或者完全地)，和/或延长存活(与没有接受治疗的情形下的期望存活相比)。目前正在应用或者在开发中的抗癌药剂包括但不限于，烷化剂、蒽环类药物、抗生素、代谢毒物、放射性核苷酸、金属毒物、酶抑制剂、芳香化酶抑制剂、双磷酸脂、环加氧酶抑制剂、雌激素受体调节剂、叶酸拮抗剂、无机砷酸盐、微管抑制剂、修正剂(modifiers)、亚硝基脲、核苷类似物、正长石抑制剂(orthoclaseinhibitors)、含铂化合物、类视色素(retinoid)、拓扑异构酶1抑制剂、拓扑异构酶2抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。

[00021]本发明的主要兴趣在于，由葡萄糖转运蛋白转运进入癌细胞的抗癌药剂。就此而言，术语“抗肿瘤药剂”被用来指代这样的抗癌药剂，从而将它们与不由葡萄糖转运蛋白转运进入癌细胞的抗癌药剂(例如，顺铂、Bevacizumab、Pemetrexed和类似药剂)区分开来。抗肿瘤药剂包括含有葡萄糖部分或者葡萄糖类似物部分的分子，所述的葡萄糖部分或者葡萄糖类似物部分有助于通过葡萄糖转运蛋白转运进入细胞，或者否则，允许通过葡萄糖转运蛋白转运进入细胞。在一种实施方案中，葡萄糖类似物本身是抗肿瘤药剂。这样的药剂的例子是2-脱氧葡萄糖(2-DG)。其它的例子包括2-氟-2-脱氧葡萄糖(2-FDG)和放射标记的2-FDG化合物如2-18FDG。在另一种实施方案中，将葡萄糖部分或者葡萄糖样部分连接到(conjugated to)另一部分，该另一部分例如是细胞毒性化合物，其本身(即，当不与葡萄糖部分或者葡萄糖样部分相连接时)可以是如上面列举的那些抗癌药剂。例如，葡萄糖或者葡萄糖类似物部分可以仅仅起靶分子的作用，将附着在其上的细胞毒性药剂带入细胞。PCT出版物WO03/082301中描述了含有连接于毒性部分的葡萄糖或者葡萄糖类似物的抗肿瘤药剂。在一种实施方案中，当以非连接的形式被给予时，葡萄糖样部分和其它部分均是无毒性的。在一种可选择的实施方案中，当被独立地给予时，葡萄糖样部分和其它部分均是有毒性的。

[00022]对于含有连接于葡萄糖或者葡萄糖类似物的部分的抗肿瘤药剂，可以应用任何链接，只要其与葡萄糖或者葡萄糖类似物部分以及非葡萄糖部分相容；例如，在WO03/082301或者在美国专利5,622,936中描述的任何链接。抗肿瘤药剂可以在任何功能位点附着于葡萄糖或者葡萄糖类似物，例如，在葡萄糖或者葡萄糖类似物的1位、2位、3位或者4位上。

[00023]作为可适用本发明筛选方法的抗肿瘤药剂或者其一部分的葡萄糖类似物，在本领域中是已知的，包括但不限于，葡萄糖衍生物如D-(+)-2-脱氧葡萄糖、D-(+)-2-氨基-2-脱氧葡萄糖或者N-乙酰D-(+)-2-氨基-2-脱氧葡萄糖；D-甘露糖和甘露糖衍生物；D-葡萄糖和D-葡萄糖衍生物，包括但不限于D-3-氨基-3-脱氧-葡萄糖和D-2-氨基-2-脱氧-葡萄糖；以及D-半乳糖和半乳糖衍生物包括但不限于D-2-脱氧-D-半乳糖、D-4-氨基-4-脱氧-半乳糖和D-2-氨基-2-脱氧-半乳糖。因此，葡萄糖或者葡萄糖部分与D-葡萄糖或者衍生物如2-DG和2-葡糖胺的不同之处可以在于，它是其差向异构体。此外，葡萄糖或者葡萄糖类似物部分可以是前述化合物中任意一个的氟化衍生物。而且，前述化合物中任意一个的环中的氧，可以用选自S、砜和类似物的电子等排物(isostere)所取代。例如，葡萄糖类似物可以是5-硫代-D-葡萄糖或者其衍生物。术语“葡萄糖类似物”也包括葡萄糖衍生物，包括但不限于，具有(C1-C12)酰基或者(C1-C12)烷基基团的衍生物，其中所述的酰基基团或者烷基基团通过-O-或-NH-基团连接于葡萄糖分子的3位或者4位。另外，葡萄糖衍生物可以具有连接于1-、3-或者4-位的溶解或分配效应物或者成分(solubility or partitioning effector or component)。

[00024]在一些实施方案中，葡萄糖类似物是果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、肌醇(例如，肌-肌醇(myo-inositol)、scillo-inositol、muco-inositol和chiro-inositol)或者可作为葡萄糖转运蛋白的底物的其它糖醇(sugar alcohol)，或者可作为葡萄糖转运蛋白的底物的其衍生物，如表1中所列举的那些。

[00025]包含葡萄糖或者葡萄糖类似物的大量抗肿瘤药剂是已知的，而其它的正在实验或者开发中，以便用于将来的临床用途。出于说明而非限制的目的，这样的抗肿瘤药剂的例子包括链脲菌素(streptozotocin)、glucofosfamide、糖基-S-亚硝基硫醇(glyco-S-nitrosothiol)(包括2gluSNAP)、单质子发射放射性示踪剂(singleproton-emitting radio tracers)(包括2-O-(3′-碘苯甲基)-D-葡萄糖和N-(4′-碘苯甲基)-D-葡糖胺)、WO03/082301中描述的2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)和2-DG结合物(conjugates)、WO02/058741中描述的结合物、WO99/20316中描述的结合物、美国专利6,489,302中描述的结合物、美国专利5,622,396中描述的结合物，和它们的衍生物和类似物。

[00026]链脲菌素[2-脱氧-2-(3-甲基-3-亚硝基-脲基)-D-葡萄糖；N-甲基亚硝基氨基甲酰-D-葡糖胺；STZ；Zanosar^TM]是一种抗有丝分裂的烷化剂，其中具有细胞毒性的N-亚硝基脲基团附着于葡萄糖胺的2位。FDA已经证实，链脲菌素治疗胰岛细胞癌和类癌瘤。与其它的亚硝基脲类似物相比，链脲菌素选择性地靶向于胰腺的β-细胞，这归因于该化合物中存在葡萄糖部分，其似乎介导了被表达GLUT2的细胞摄入的过程(参见，Schnedl et al.，Nov.1994，Diabetes 43：1326-33；Elsner etal.，Dec.2000，Diabetologia 43：1528-33；Hosokawa et al.，Dec.2001，Biochem.Biophys.Res.Commun.289：1114-17；Wang et al.，Jan.1998，Diabetes 47：50-56；andWang et al.，1995，Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes 103 Suppl.2：83-97)。参见，例如，美国专利3,694,428和3,940,383。

[00027]抗肿瘤药剂glucofosfamide(β-D-葡糖基-异环磷酰胺芥；glc-IPM)含有细胞毒剂异环磷酰胺，它通过在葡萄糖1位的氧原子处的酯键和葡萄糖相连接(参见美国专利5,622,936和美国专利6,489,302)。已经测试了glucofosfamide对接受一线治疗的胰腺癌患者，和接受二线化学疗法的非小细胞肺癌患者，以及胶质母细胞瘤、乳腺癌和结肠癌患者的治疗。参见，Niculescu-Duvaz，2002，Curer.Opin.Investit.Drug 3：1527-32。Briasoulis et al.，2000，J.Clin.Oncol.18：3535-44报道了，glucofosfamide的细胞摄取是由Na+-依赖型葡萄糖转运蛋白介导的。

[00028]糖基-S-亚硝基硫醇化合物可以被描述为与糖连接的细胞毒剂，已有报道称，它优选地靶向于过量表达GLUT1的肿瘤细胞(参见，Ramirez et al.，1996，Bioorg.Med.Chem.Lett.6：2575-80和Cantuaria et al.，2000，Cancer 88：381-88)。代表性的糖基-S-亚硝基硫醇，2gluSNAP具有的结构是，其中供给一氧化氮的细胞毒性部分(S-亚硝基-N-乙酰青霉胺)通过酰胺键在2位连接于2-脱氧葡糖胺。已经报道，这些化合物靶向于过量表达GLUT1的肿瘤细胞(参见Ramirez et al.，supra，andCantuaria et al.，supra)。

[00029]对其而言本发明的筛选方法可以被应用的其它抗肿瘤药剂，是含有葡萄糖部分的化合物，其中所述的葡萄糖部分通过杂环基团、烃基团或者芳香族基团连接于单光子发射部分，如PCT出版物WO99/20316中描述。这些化合物包括，例如，2-O-(3’-碘苯甲基)-D-葡萄糖和N-(4’-碘苯甲基)-D-葡糖胺。可以连接于上面描述的葡萄糖或者葡萄糖类似物的抗肿瘤药剂的其它例子包括，例如，钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、羟基脲、triapine、5-HP、喜树碱和其类似物、卡铂及其类似物、DOTA和其它的radiomethal离子螯合剂、甲氨蝶呤及其类似物、米托蒽醌和相关的蒽醌结构、小的激酶抑制剂、达卡巴嗪(dacarbazine)或者丙卡巴肼(Procarbazine)，和丝裂霉素。

[00030]不同于葡萄糖和葡萄糖类似物的化合物由一种或者多种葡萄糖转运蛋白转运。例如，也已报道，抗坏血酸以脱氢抗坏血酸的形式通过葡萄糖转运蛋白被转运进入细胞。参见，Vera et al.，1004，Blood 84：1628-34和Agus et al.，1997，J：Clin.Invest.100：2842-48。质子/肌肌醇共转运蛋白(HMIT)是葡萄糖易化扩散转运蛋白类别(facilitative glucose transporter class)的一个成员，其对于myo-、scillo-、muco-和chiro-inositol是具有选择性的。转运是高亲和力的(Km＝100uM)，并且在低pH时会增加，在pH＝5.0时达到最大速率。

[00031]本文所描述的抗肿瘤药剂可以作为基本的、单一药剂治疗而用于癌症治疗，也可以与放射疗法、手术或其它的抗癌药剂以及这些疗法的组合进行联合治疗。

3.葡萄糖转运蛋白

[00032]如上面所指出，在本发明的一个方面，癌症样品中的一种或者多种葡萄糖转运蛋白的水平被测定。因此，了解葡萄糖转运蛋白的性质及类型，可以提供给实践者有关本发明的指导。

[00033]葡萄糖转运蛋白包括葡萄糖易化扩散转运蛋白家族成员(GLUT/SLC2A)、钠依赖性葡萄糖共转运蛋白(SGLT/SLC5A)、H+/肌-肌醇共转运蛋白(HMIT1)，以及前述的人或哺乳动物同源物(homologs)和直向同源物(orthologs)。出于说明而非限制的目的，代表性的葡萄糖转运蛋白，包括表1中列举的那些。

                                        表1

葡萄糖转运蛋白	核酸序列编号(Accession No.)*	蛋白序列编号*	类别	被报道表达转运蛋白的选择的组织	主要参考文献
						GLUT1	NM_006516	P11166	I	所有组织(在红细胞和脑中丰富)	1，2
GLUT2	NM_000340	P11168	I	肝脏、胰腺、胰岛细胞、视网膜、肠、肾脏	2，3
						GLUT3	NM_006931	P11169	I	脑	2，4
GLUT4	NM_001042	P14672	I	心脏、肌肉、脂肪、脑	5，6
						GLUT5	BC001692	P22732	II	肠、睾丸、肾脏、红细胞	7，8
GLUT6	NM_017585	Q9UGQ3	III	脑、脾脏、白细胞	9，10
						GLUT7			II	未知	11
GLUT8	NM_014580	Q9NY64	III	睾丸、脑、胚泡	10，12，13，14，29
						GLUT9	BC018897	Q9NRM0	II	肝脏、肾脏	15
GLUT10	NM_030777	Q95528	III	肝脏、胰腺	16，17
						GLUT11	NM_030807	Q9BYW1	II	心脏、肌肉	18，19，20
GLUT12	NM_145176	NP_660159	III	心脏、前列腺、肌肉、小肠、脂肪	21
						HMIT	NM_052885	NP_443117	III	脑	22
GLUT14	NM_153449AF481879	AAL89709AAL89710	I	睾丸	28
						SGLT1	NM_000343	P13866		小肠、肾脏、心脏、肝脏、肺	23
SGLT2	NM_003041.1	P31639		广泛存在(主要是肾脏)	24，25
						SGLT3	AJ133127**	Q9NY91		小肠、骨骼肌(基于猪SGLT 3)	26
SGLT5	NM_152351				27

^*对具体序列的引用是为了说明的目的，而不是要以任何方式限制本发明。例如，对于第1栏中列举的转运蛋白，可以存在其它的或者可选择的序列，包括但不限于，多态序列和其它的变异体。

^**EMBL序列编号

1.Mueckler et al.1985，Science 229：941-5；2.Gould et al.1991，Biochem.30：5139-45；3.Fukumoto et al.1988，PNAS 85：5434-8；4.Kayano et al.1988，J.of Biol.Chem.263：15245-8；5.Fukumoto et al.1989，J.of Biol.Chem.264：7776-9；6.Jameset al.1989，Nature 338：83-7；7.Kayano et al.1990，J.of Biol.Chem.265：13276-82；8.Davidson et al.1992，Am.J.of Physiol.262：C795-C800；9.Doege et al.2000a，Biochem.J.350：771-6；10.Lisinski et al.，2001，Biochem.J.358：517-22；11.Joost &Thorens，2001，Mol.Membrane Biol.18：247-56；12.Carayannopoulos et al.2000，PNAS 97：7313-8；13.Doege et al.2000b，J.of Biol.Chem.275：16275-80；14.Ibberson et al.2000，J.of Biol.Chem.275：4607-12；15.Phay et al.2000，Surgery 128：946-51；16.Dawson et al.2001，Mol.Genetics and Metabol.74：186-99；17.McVie-Wylie et al.2001，Genomics 72：113-7；18.Doege et al.2001，Biochem.1 J 359：443-9；19.Wu et al.2002，Mol.Genetics and Metabol.76：37-45；20.Sasaki et al.2001，Biochem.and Biophys.Res.Comm.289：1218-24；21.Rogers et al.2002，Am.J.ofPhysiol.282：E733-8；22.Udry et al.2001，EMBO J.20：4467-7；23.Hediger et al.1989，PNAS，86(5)：5748-52；24.Wells et al.，1992，Am.J.Physiol.263(3)：F459-65；25.Kanai et al.，1994，J Clin Invest.93(1)：397-404；26.Diez-Sampedro，2003，PNAS，100(20)：11753-8；27.Wood & Trayhurn，2003，British J.Nutr.89：3-9；28.Wu et al.，2002，Genomics 80：553-7；29.美国专利申请20030228592。

3.1GLUTs

[00034]在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白是非Na⁺依赖型易化扩散糖转运蛋白或者葡萄糖易化扩散转运蛋白。“葡萄糖易化扩散转运蛋白(facilitative glucosetransporter)”或者“非Na⁺依赖型易化扩散糖转运蛋白(facilitative Na⁺ independentsugar transporter)”或者“GLUT”是指葡萄糖转运蛋白，其利用底物如葡萄糖的跨细胞质膜的扩散梯度来转运底物。葡萄糖易化扩散转运蛋白包括但不限于，GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT4、GLUT6、GLUT7、GLUT8、GLUT9、GLUT10、GLUT11、GLUT12、H+-偶联的肌肌醇转运蛋白HMIT1。GLUT14与GLUT3具有94.5％的同一性，并且也包括在GLUT家族中。

[00035]葡萄糖易化扩散转运蛋白通常具有12个跨膜螺旋。该蛋白的跨膜结构域可以含有由水填充的通路，底物可以移动通过该通路，在一些情况下，该蛋白的胞浆外结构域可以含有带有N连接寡糖部分的大环。该环可以在任何两个连续的跨膜螺旋之间形成，例如，在第一个和第二个跨膜螺旋之间，或者在第九个和第十个跨膜螺旋之间形成。

[00036]在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白包括一种或者多种“葡萄糖转运蛋白标志(glucose transporter signature)”。如本文所应用，“葡萄糖转运蛋白标志”是指两种或者更多种转运蛋白上的保守残基，其参与了该蛋白作为转运蛋白的功能。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白标志是跨膜螺旋1、2、4、5、7、8和10中7个甘氨酸残基的存在。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白标志是该蛋白的细胞质一面上的一个或者多个带电残基，它们在已知的GLUTs中是保守的。参见Joost et al.，2001，Mol.Membrane Biol.18：247-256。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白标志是下列中的一个或者多个：螺旋6中的色氨酸、螺旋11中的色氨酸、螺旋4中的酪氨酸、螺旋7中的酪氨酸。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白标志是螺旋6之后的PXXPR基序。在其它的实施方案中，葡萄糖转运蛋白不包括这样的PXXPR基序。

[00037]在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白标志是紧接着螺旋10保守GXXPXP基序的色氨酸残基(当序列是与GLUT1比对时，则对应于GLUT1中的色氨酸388)。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白标志是螺旋10中的色氨酸残基(当序列是与GLUT1比对时，则对应于GLUT1中的色氨酸412)。已经显示，这些色氨酸残基对于配体细胞松弛素B和弗司可林(forskolin)的结合是重要的，并赋予了葡萄糖转运蛋白对细胞松弛素B或弗司可林的敏感性。Garcia et al.，1992，J.Biol.Chem.267：7770-76；Schurmann et al.，1993，Biochem.J.290：497-501.因此，本发明的一些实施方案包含对细胞松弛素B或者弗司可林治疗敏感的葡萄糖转运蛋白的分析。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白对细胞松弛素B或者弗司可林的结合亲和力低。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白对细胞松弛素B或者弗司可林的结合亲和力高。

[00038]在本发明的实践中分析的葡萄糖转运蛋白对葡萄糖或者葡萄糖类似物具有不同的亲和力。因此，在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白显示了对葡萄糖的高亲和力。如文中所应用，对于GLUTs，“高亲和力”意味着，应用Burant et al.，1992，J.Biol.Chem.267：14523-26中描述的非洲爪蟾卵母细胞分析，KM小于5mM；对于SGLTs，“高亲和力”意味着K0.5值小于1mM，优选地小于0.5mM，这是应用Panayotova-Heiermann et al.，1996，J.Biol.Chem.271：10029-34中描述的双微电极钳分析(two-microelectrode clamp assay)测定的。在其它的实施方案中，葡萄糖转运蛋白显示了对葡萄糖的低亲和力。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白对葡萄糖/葡萄糖类似物的结合亲和力在不同的组织中是不同的，或者在不同的生理条件下，例如在疾病状态如癌症时，是不同的。

[00039]根据序列相似性和特征性元件，可以将已知的GLUT蛋白组分为三个更小的亚组，即I类(GLUT1-4)、II类(GLUT5、GLUT7、GLUT9和GLUT11)和III类(GLUT6、8、10、12和HMIT1)。参见Joost et al.，2001，Mol.Membr.Biol.18：247-56。在一些肿瘤组织中观察到GLUT的异常和/或过量表达(参见综述Smith，1999，Br.J.Biomed.Sci.564：285-92；Bell et al.，1990，Diabetes Care 13：198-206)。

3.1.1 I类GLUTs

[00040]I类葡萄糖转运蛋白可以含有序列基序(葡萄糖转运蛋白标志)例如螺旋5处的谷氨酰胺(当序列与GLUT1比对时，对应于GLUT1中的Q161)。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白含有在细胞外的环7(即，在跨膜螺旋7和跨膜螺旋8之间的环)中的STSIF基序。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白含有在螺旋7处的QLS基序。据报道，I类葡萄糖转运蛋白在各种实体肿瘤中表达，例如乳腺癌、肾细胞癌、脑肿瘤、胃肠恶性瘤和宫颈癌。

[00041]在本发明的一些实施方案中，I类葡萄糖转运蛋白的水平被测定。

[00042]在本发明的一些实施方案中，GLUT1水平被测定。已经报道，GLUT1在各种恶性组织中被过量表达，包括膀胱、乳腺、宫颈、结直肠、胃、食道、头和颈部的肿瘤、平滑肌肉瘤、肺、卵巢、胰腺、阴茎、甲状腺、子宫、脉管的肿瘤和青少年的血管瘤。Medina et al.，2002，Biol.Res.35：9-26.也已显示，GLUT1的表达与肿瘤缺氧有关。Airley et al.，2001，Clin.Cancer Res.7：928-34；Chen et al.2001，J.Biol.Chem.12：9519-25。

[00043]在本发明的一些实施方案中，GLUT2水平被测定。已经报道，GLUT2在胃癌中被过量表达。

[00044]在本发明的一些实施方案中，GLUT3水平被测定。已经报道，GLUT3在脑癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、头部和颈部癌症、脑脊膜瘤和卵巢癌中被过量表达。GLUT3对葡萄糖有高亲和力，并且被认为在对作为养料的葡萄糖具有强烈需求的组织中例如脑中对葡萄糖的转运负有责任。

[00045]在本发明的一些实施方案中，GLUT4水平被测定。已经报道，GLUT4在乳腺癌、胃癌、肺癌和胰腺癌中被过量表达。

[00046]在本发明的一些实施方案中，GLUT14水平被测定。已经报道，GLUT14有两种剪接形式：GLUT14的较短的形式是497个氨基酸的蛋白质，与GLUT3有94.5％的一致性。长的形式是520个氨基酸的蛋白质，仅在N末端不同于短的形式。据报道，两种异构体在睾丸中均特异地表达。

3.1.2II类GLUTs

[00047]在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白是II类GLUT。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白缺乏邻接螺旋10保守GXXPXP基序的色氨酸残基(当序列与GLUT1比对时，对应于GLUT1中的色氨酸388)，该残基赋予了葡萄糖转运蛋白对细胞松弛素B的敏感性。II类葡萄糖转运蛋白对细胞松弛素B的抑制不敏感(参见Joost et al.，2001，Mol.Mern.Biol.18：247-56)。

[00048]在本发明的一些实施方案中，II类葡萄糖转运蛋白的水平被测定。

[00049]在本发明的一个实施方案中，GLUT5水平被测定。已经报道，GLUT5在肺癌和乳腺癌中被过量表达。

[00050]在本发明的一个实施方案中，GLUT7水平被测定。

[00051]在本发明的一个实施方案中，GLUT9水平被测定。最近鉴定出了GLUT9的一种另外的剪接形式，它仅在N末端与GLUT9不同。Auguatin et al.，2004，January22，J.Biol.Chem。

[00052]在本发明的一些实施方案中，GLUT11的水平被测定。对于GLUT11，已经描述了两种剪接变异体，一种长的形式(503个氨基酸)和一种短的形式(493个氨基酸)。Doege et al.，2001，Biol.J.359：443-49；Sasaki et al.，2001，Biochem.Biophys.Res.Comm.289：1218-24。已经报道，短形式的GLUT11介导低亲和力的葡萄糖转运，已经显示，短形式的GLUT11主要在心脏和骨骼肌中表达。已经报道，长形式的GLUT11在肝脏、肺、气管和脑中表达，已经显示，长形式的GLUT11增加果糖转运。因此，在本发明的一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白是GLUT11的长的形式。在其它的实施方案中，葡萄糖转运蛋白是GLUT11的短的形式。在别的实施方案中，葡萄糖转运蛋白是GLUT11的衍生物、变异体或者密切的同源物(close homologue)。

3.1.3III类GLUTs

[00053]在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白是III类GLUT。在一些III类GLUT中发现的基序包括，环9(即，跨膜螺旋9和跨膜螺旋10之间的环)上的糖基化位点和靶基序(targeting motifs)。

[00054]在本发明的一些实施方案中，III类葡萄糖转运蛋白的水平被测定。

[00055]在本发明的一个实施方案中，GLUT6的水平被测定。据报道，GLUT6主要在脑、脾脏和外周白细胞中表达。

[00056]在本发明的一个实施方案中，GLUT8的水平被测定。GLUT8在乳腺癌细胞中表达。

[00057]在本发明的一个实施方案中，GLUT10的水平被测定。

[00058]在本发明的一个实施方案中，GLUT12的水平被测定。已发现，GLUT12在乳腺肿瘤中表达。参见Rogers et al.，2003，Cancer Letters，93：225-33；Rogers et al.，2002，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.282(3)：E733-8。

[00059]在本发明的一个实施方案中，HMIT1的水平被测定。

3.2SGLTs

[00060]在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白是Na⁺依赖型葡萄糖共转运蛋白(Na⁺-dependent glucose co-transporter)。“Na⁺依赖型葡萄糖共转运蛋白”或者“Na⁺/葡萄糖共转运蛋白”是指葡萄糖转运蛋白，其以能量依赖的方式主动转运葡萄糖或者葡萄糖类似物。一些Na⁺依赖型葡萄糖转运蛋白利用Na⁺沿电化学梯度的运动来驱动葡萄糖或者葡萄糖类似物的摄取。Na⁺依赖型葡萄糖转运蛋白包括但不限于，SGLT1、SGLT2、SGLT3、SGLT4、SGLT5和SGLT6。参见表1；也参见Coady et al.，2002，″Identification of a novel Na+/myo-inositol cotransporter.″J BiolChem.277：35219-24。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白是高亲和力、低容量(capacity)的Na⁺依赖型葡萄糖转运蛋白。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白是低亲和力、高容量的Na⁺依赖型葡萄糖转运蛋白。

[00061]在一些实施方案中，Na⁺依赖型葡萄糖转运蛋白包括14个跨膜螺旋。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白进一步包括位于螺旋6和螺旋7之间的N-链接糖基化位点，并且已经显示，该位点在几种已知的SGLT间保守。参见，Wright，Am.J.Physiol.Renal Physiol.2001，280(1)：F10-8。

[00062]在本发明的一些实施方案中，SGLT1水平被测定。SGLT1具有高的葡萄糖亲和力，报道的Na⁺/葡萄糖结合比是2∶1。据报道，SGLT1在几种肠肿瘤细胞系和原发肺癌中表达。Bissonette et al.，1996，Am.J.Physiol.，270：G833-G843；Delezay et al.，1995，J Cell Playsiol.163：120-128；Ishikawa et al.，2001，Jpn.J CancerRes.92：874-79。

[00063]在本发明的一些实施方案中，SGLT2的水平被测定。已经报道，SGLT2是低亲和力、高容量的转运蛋白，报道的Na⁺/葡萄糖结合比是1∶1。

[00064]在本发明的一些实施方案中，SGLT3的水平被测定。已经报道，SGLT3(原来的名称是SAAT1)介导化疗剂β-D-葡糖苷异磷酰胺芥(glucosyllisophosphoramide mustard)(D-19575)转运进入肿瘤细胞。Vehyl et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：2914-19。最近，已有人提出，SGLT3不是Na⁺/葡萄糖共转运蛋白，而是胆碱能神经元的细胞质膜、骨骼肌和其它组织中的葡萄糖感受器(Diez-Sampedro et al.，2003，″A glucose sensor hiding in a family oftransporters″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：11753-8)。因此，在本发明的一些实施方案中，水平被测定的葡萄糖转运蛋白不是SGLT3，或者不包括SGLT3。

[00065]在本发明的一个实施方案中，SGLT4的水平被测定。

[00066]在本发明的一个实施方案中，SGLT5的水平被测定。

[00067]在本发明的一个实施方案中，SGLT6的水平被测定。

[00068]明显的是，除表1中描述的转运蛋白之外的其它葡萄糖转运蛋白的水平，可以在本发明的实践中被测定。例如，表1中列举的葡萄糖转运蛋白中的任意一种的衍生物、同工型、变异体、突变体和同源物，包括在其它哺乳动物中的同源物，可以被测定，或者它们的水平或者活性被测定。进一步地，本发明的方法适用于将来可能被发现的葡萄糖转运蛋白，例如具有已知的转运蛋白的结构特征或者序列特征的转运蛋白(包括，例如，与表1中列举的葡萄糖转运蛋白的氨基酸序列相似性为至少28％、至少30％、至少50％、至少60％、至少80％、至少90％的葡萄糖转运蛋白)。

4.确定癌症对抗肿瘤药剂治疗的敏感性

[00069]在一方面，本发明的方法涉及，测定患者的癌症样品中葡萄糖转运蛋白的水平。将该水平与参照值(reference value)相比较，以确定该癌症是否由于表达高水平的一种或者多种转运蛋白而对抗肿瘤药剂治疗敏感。如下面更详细的解释，在本发明的不同方面，癌症样品中单一的转运蛋白的水平被测定，癌症样品中多种不同的转运蛋白的水平被独立地测定(即，对于每一种转运蛋白的水平，不同的值被测定)，和/或用联合的测定方法测定癌症样品中两种或者更多种不同的转运蛋白(例如，通过应用识别多于一种的转运蛋白的探针的分析，或者通过应用多个探针的分析)。

[00070]如此处所应用，词语“水平(level)”是指可以反映癌症样品中葡萄糖转运蛋白的数目的任何量度，在不同的实施方案中，它可以是定量的、半定量的或者是相对的(例如，仅仅被确定为“多于”或者“少于”另一个类似地测定的水平)。此数目可以从各种各样的不同量度中推断出来。例如，此数目可以从葡萄糖转运蛋白的含量、信使RNA的丰度，或者从样品中的葡萄糖转运蛋白活性被推断出来。下面描述了可以在本发明中应用的许多分析方法，并且，对于实施者来说，经本公开指导后，其它的分析方法将是显然的。

[00071]在一些实施方案中，将样品中葡萄糖转运蛋白的测定值标准化为，每个细胞、每克组织、每mm³组织或者类似标准中的量(或者数目)。如同本领域中所知，也可以通过参考在样品中的第二种蛋白的丰度，将癌症样品中的转运蛋白水平标准化，将转运蛋白的水平表示为转运蛋白与第二种蛋白的数量比值。这种方法的优势在于，通过选择一种在不同条件下以相对恒定的水平表达的蛋白，可以使蛋白质合成的普遍抑制、细胞凋亡或者分析过程中的物质丢失所造成的影响最小化。合适的“第二种蛋白”包括但不限于，结构蛋白，如肌动蛋白、微管蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶。当转运蛋白RNA水平被测定时，可以应用比较的标准化(例如，通过将转运蛋白RNA水平和核糖体RNA或者编码结构蛋白的mRNA相比较)。在一个方面，肿瘤中的葡萄糖-6-磷酸酶活性也被测定，并且将葡萄糖转运蛋白水平表示为转运蛋白(蛋白、RNA或者活性)与葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)蛋白、RNA或者活性的比值。高比值提示，对抗肿瘤药剂治疗的敏感性增加。葡萄糖和一些葡萄糖类似物在进入细胞后被磷酸化，导致累积，并且在某些类似物的情形下，由于细胞中磷酸化形式的累积，导致了增加的毒性。对葡萄糖-6-磷酸酶的表达分析和活性分析是已知的(参见，例如，Schmoll et al.，2001，Cancer Letters，167：85-90；Taketa et al.，1998，Cancer Res.48：467-74)。在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白水平对葡萄糖-6-磷酸酶水平的比率被测定。比率越高，患者的癌症对含有葡萄糖或者葡萄糖类似物的抗肿瘤药剂的治疗越敏感。

[00072]在另一种实施方案中，癌症样品中的转运蛋白水平被表示为，癌症样品中的转运蛋白水平与同一患者的匹配的非肿瘤组织中的转运蛋白水平的比值。“匹配的非肿瘤组织(matching non-tumor tissue)”是指非癌组织的样品，优选地，匹配的非肿瘤样品或者非恶性样品来源于，与肿瘤样品的来源器官相同的器官。最优选地，匹配的非肿瘤样品来源于，与肿瘤样品的来源相同的器官组织层。而且，优选的是，在对肿瘤样品进行活组织检查的同时，获取匹配的非肿瘤组织样品。例如，当从胰腺肿瘤获取组织以用于本发明用途时，实施者也可以从远离肿瘤的位置获取非恶性的胰腺组织。然后，测定每一样品中的葡萄糖转运蛋白水平，如果肿瘤样品中的测定水平超过正常样品中的水平，则确定该肿瘤对葡萄糖转运蛋白抗癌药剂治疗是敏感的。

[00073]在一种相关的实施方案中，将癌症样品中的转运蛋白水平表示为，癌症样品中的癌(恶性转化的)细胞的转运蛋白水平与来自相同样品的非癌细胞中转运蛋白水平的比。此比值可以被方便地测定，因为当从对象获取癌症样品(例如，通过活组织检查)时，该样品通常也包括非癌细胞，非癌细胞可以通过观察或者应用组织学方法，或者通过检测癌症特异性分子标记物的缺失而被鉴定。

[00074]尽管转运蛋白水平最通常地是在来自对象的单个癌症样品(和可任选的单个非癌症样品)中被测定；但在一些实施方案中，该癌组织和/或正常组织的几份生物样品可以从单个对象中获得，以便得到针对该对象的平均值。

4.1.参照值

[00075]将癌症样品中葡萄糖转运蛋白的表达水平与参照值比较，以确定对抗肿瘤药剂治疗的相对敏感性。对于特定的转运蛋白，将被理解的是，对于不同的癌症，用于确定对治疗的敏感性的参照值可以不同。可以应用各种方法来确定具体转运蛋白的参照值。

[00076]在本发明的一种实施方案中，一种癌症类型的参照值是通过评价癌症样品中的转运蛋白水平(多个水平)而被确定的，所述癌症样品来自许多不同的患者，此处被称为“调查人群(survey population)”。通常地，调查人群中的患者和癌症样品的来源对象，均患有相同类型的癌症。例如，在一种实施方案中，分析来自10、50、100、200、500或者1000或者更多个患者的胰腺癌样品的GLUT2水平。癌症的“类型(type)”分类，在实践者掌握的技能范围内和判断能力范围内。通常地，癌症“类型”是基于起源的组织(例如，胰腺癌、乳腺癌)，但是也可以基于阶段、转移、缺氧程度、预后标志物的存在和类似的因素。用于将癌症按类型分类的另一个参数是，某种抗癌药剂或者某类抗癌药剂(包括某些抗肿瘤药剂或者某种特异性的抗肿瘤药剂)在患有该癌症“类型”的患者中所显示出的效应。如文中所应用，“效应(effect)”包括对抗癌药剂(多种药剂)治疗的反应(或缺乏反应)、被治疗的患者增加的存活时间长度，以及类似的效应。除了匹配于癌症类型之外，也可以根据患者特征例如性别、年龄和种族以及其它标准而匹配于调查人群和对象。

[00077]调查人群的转运蛋白水平(即，此处被称为“调查值(survey values)”)将形成一种分布，它可以是单峰的、双峰的或者多峰的。在本发明的一种实施方案中，应用此分布来确定合适的参照值，如前面所讨论，将转运蛋白的表达水平高于参照值的癌症鉴定为，对抗肿瘤药剂治疗敏感。参照值可以是单个截止值(cut-off value)，例如调查值分布的中位数或者均值，其中，将转运蛋白值高于均值或者中位数的患者样品鉴定为，对抗肿瘤药剂治疗敏感。在一种相关的实施方案中，参照值是调查值分布的百分位数，如60^th百分位数、75^th百分位数、90^th百分位数和类似的数值。或者，参照值是一个范围，例如，调查值的分布被划分为相等的(或者不等的)部分，如象限，每一象限与对治疗的敏感性水平相关联(例如，最低的象限被关联于最小的敏感性，最高的象限被关联于最高的敏感性)。在一些情形下，调查值的分布是双峰的(具有一个低范围和一个高范围)。在这样的情形下，将具有在较高范围内的或者高于较高范围的葡萄糖转运蛋白水平的癌症样品鉴定为，起源于对抗肿瘤药剂治疗敏感的癌症。在一些情形下，调查值的分布是多峰的(带有一个低范围和多于一个的较高范围)。在这种情形下，将葡萄糖转运蛋白水平大于低范围的癌症样品，优选地，将在较高范围中又较高的范围内的癌症样品鉴定为，起源于对抗肿瘤药剂治疗敏感的癌症。

[00078]在一些情形下，参照值可以是零或者接近零，例如当一种癌症类型(为了讨论的目的，此处称为“组织x”的癌症)包括不表达指定的一种葡萄糖转运蛋白或者多种转运蛋白的一些肿瘤，又包括表达该转运蛋白或者多种转运蛋白的其它肿瘤时。在这种情形下，转运蛋白(多种转运蛋白)的任何可检测到的表达足以提示，患者是抗肿瘤药剂治疗的候选者。

[00079]将被理解的是，只要调查值(以及参照值)的单位与用于表示在癌症样品中转运蛋白水平的单位相同或者相似(或者，调查值和癌症样品水平可以被比较)，那么描述转运蛋白水平的具体方法就不是严格限定的，它将取决于癌症的性质、应用的分析方法和实施者的优先选择。

[00080]在另一种实施方案中，调查人群是由不患有癌症的对象(例如，健康的个体)组成的，并且对于一种癌症类型，参照值是通过评价正常(非恶性)样品中转运蛋白水平(多个水平)而确定的，所述样品来自未被诊断为患有癌症的对象(例如，健康对象)的匹配组织，所述的未被诊断为患有癌症的对象构成“调查人群”。由于正常样品来自与肿瘤样品的来源器官相同的器官，优选地，来自相同的组织层，所以可以将正常样品匹配于癌症类型。参照值是大于正常值的中位数或者平均数的值，优选地，是比正常样品的75％的值大的值，常常是比正常样品的90％的值大的值，有时比95％的大或者甚至比99％的大。

[00081]因此，可以应用常规方法确定参照值，例如，收集癌症样品(或者正常样品)并测定转运蛋白水平。经本公开的指导后，用于评价肿瘤对治疗敏感性的具体阈水平的确定，合适范围、患者类型、癌症类型和类似因素的选择，在医学人员的技能范围内。将被理解的是，在作出这样的确定时，实践者可以应用标准的统计学方法。参见，例如，Marcello Pagano等的Principles of Biostatistics(BrookCole；2000)；Bernard Rosner的Fundamentals of Biostatistics(Duxbury Press，5th Ed，1999)；Wayne W.Daniels的Biostatistics：a Foundation for Analysis in the HealthScience(John Wiley & Sons，3rd Ed.；1983)；以及Knapp和Miller的ClinicalEpidemiology and Biostatistics(William and Wilkins，Harual Publishing Co.Malvern，PA 1992)。

[00082]如下面更详细的讨论，可以确定单一的转运蛋白的转运蛋白水平。选择性地，可以确定几种不同转运蛋白的水平(例如，同时和/或总计，而不区分每一转运蛋白的水平)。在一种不同的实施方案中，针对细胞运送化合物(例如指定的抗肿瘤药剂或者化合物，所述化合物应该由运送所述指定抗肿瘤药剂的转运蛋白相同的转运蛋白运送)的能力，对样品中的所有转运蛋白进行分析。

4.2.分析

[00083]测定生物样品中葡萄糖转运蛋白水平的方法在本领域中是已知的，仅仅是出于说明的目的和为了方便实践者，此处进一步描述了这样的分析。合适的方法包括，例如，对转运蛋白的蛋白分析、对转运蛋白RNA的分析，以及对转运蛋白活性的分析。

[00084]在下面以及在实施例中描述了分析方法。如无另外的指明，分析方法应用的是传统的分子生物学技术(包括重组技术)、微生物学技术、细胞生物学技术、生物化学技术、核酸化学技术和免疫学技术，所有技术均在普通技术人员的技能范围之内。这样的技术在文献中被充分解释，例如，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版(Sambrook et al.，1989)和MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，第三版(Sambrook and Russel，2001)(前面引用的两份文献在此被统称为″Sambrook″)；CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，包括2003全年的增刊和修订本)；PCR：THE POLYMERASE CHAIN REACTION(Mullis et al.，eds.，1994)；Harlow and Lane，1988，ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold SpringHarbor Publications，New York和Harlow and Lane，1999，USING ANTIBODIES：ALABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(此处被统称为″Harlow and Lane″)，METHODS IN CELL BIOLOGY VOLUME37：ANTIBODIES IN CELL BIOLOGY，Asai，ed.Academic Press，Inc.New York(1993)；BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY 7th Edition，Stites & Terr，eds.(1991)；Hames et al.，ed.，NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION，A PRACTICALAPPROACH IRL Press，(1985)；和Beaucage et al.，eds.，CURRENT PROTOCOLS INNUCLEIC ACID CHEMISTRY，2000，John Wiley & Sons，Inc.，New York)。

[00085]考虑到本文中的公开内容，针对给定的患者，对具体分析方法进行选择是在实践者的技术范围内，其依赖于许多因素，包括癌症的类型和阶段、是否进行了切除术、癌症样品的可利用性，以及样品的类型，样品的类型可以是，例如，组织样品或者组织提取物或者细胞或者细胞裂解物或者细胞提取物或者来自上述样品类型的上清液，还依赖于实施者的方便和试剂是否可获得以及花费。

4.2.1生物样品

[00086]通过从对象获取生物样品并检测葡萄糖转运蛋白的蛋白、mRNA、转运蛋白活性和转运蛋白表达的其它标志物的存在或者含量，可以确定癌症样品中或者非癌组织中的葡萄糖转运蛋白水平。为了方便起见，术语“癌症样品(cancersample)”被用来表示其中葡萄糖转运蛋白被测定的物质(或是细胞的或是细胞衍生的)。通常地，癌症样品来源于人。应用本领域中的已知方法，可以测定在组织样品、组织提取物、细胞、细胞裂解物、细胞提取物、体液、肿瘤前细胞裂解物的上清液或者瘤裂解物的上清液中的转运蛋白水平。

[00087]可以从任何癌症获得癌症样品，并且本发明的方法适用于任何癌症，所述的癌症包括但不限于白血病、乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈部癌症、结肠癌、胃癌、支气管癌和肾癌；基底细胞癌、溃疡型鳞状细胞癌和乳头型鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewing′s sarcoma)、网状细胞肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺肿瘤、胰岛细胞癌、原发性脑肿瘤、急性和慢性淋巴细胞瘤和粒细胞瘤、毛细胞瘤、腺瘤、过度增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、肠神经节细胞瘤(intestinal ganglloneuromas)、增生性角膜神经瘤、类马伐氏症候群肿瘤(marfanoid habitus tumor)、肾母细胞瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌肿瘤(leiomyomater tumor)、子宫颈发育不良和原位癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌、局部皮肤病损、蕈样肉芽肿病、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、骨源性肉瘤和其它肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、腺癌、多形性胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、恶性黑素瘤和表皮癌。

[00088]获取组织样品的方法在本领域中是已知的，并且将根据肿瘤的类型和定位以及医生的偏好而不同。在一种实施方案中，样品是从手术切除的组织中获得的。组织样品和细胞样品也可以不经侵入性手术而获得，例如，通过用细针插入胸壁或者腹壁或者从乳房块、甲状腺块或者其它位点插入，并抽出细胞物质(细针吸引活组织检查)。

[00089]在另一种实施方案中，生物样品是可能含有癌细胞的体液，其可以是，例如，血液、乳腺渗出液(例如，乳头抽吸液)、粪便悬浮液、痰、粘液、尿液、淋巴液、胞液、腹水、胸膜渗出液、羊水或者膀胱清洗液。

[00090]获得的生物样品可以以新鲜的、冷冻的或者固定化的(例如，石蜡包埋)形式被使用，这取决于样品的性质、使用的分析和实施者的便利。尽管新鲜材料、冷冻材料和固定化材料均适合于各种RNA分析和蛋白分析，但是通常地，新鲜组织对于体外活性测定将是优选的。

[00091]也可以应用固定化的组织样品。通过活体组织检查获得的组织常常被固定，通常是通过应用例如，福尔马林、甲醛或者戊二醛，或者通过酒精浸没。通常将固定化的生物样品脱水并在石蜡或者其它固相支持物中包埋，如本领域中所已知。参见参考文献Plenat et al.，2001，Ann.Pathol.21：29-47。未包埋的、固定化的组织，以及固定化并包埋的组织，都可以被用于本发明中。用于包埋固定化组织的固相支持物可以用有机溶剂除去，以便被保存的组织能够随后再水化。

[00092]在一些情形下，对转运蛋白水平的分析包括细胞或组织培养的步骤。培养方法在本领域是公知的。例如，可以用酶(如胶原酶和透明质酸酶)将来自活组织检查样品的细胞离解，和/或使用物理破裂方法(例如，使其重复通过25号针(25-gauge needel))来解散细胞，细胞经离心收集，在所需的缓冲液或者培养液中重悬浮，它们可以用于培养、即刻的分析或者进一步的处理。

4.2.2基于蛋白的检测

[00093]在本发明的一个方面，通过测定转运蛋白蛋白本身来确定葡萄糖转运蛋白的水平。最方便地，这是应用免疫分析来进行(例如但不限于，蛋白质印迹(Western)分析、流式细胞分析、EIA、ELISA、RIA、竞争性免疫分析、双抗体夹心分析、免疫化学、免疫细胞化学和免疫组织化学方法、凝聚分析和免疫沉淀)。

[00094]用于免疫分析用途的抗体可以很容易地得到。应用常规的方法，可以制备得到特异于葡萄糖转运蛋白蛋白质的抗体(包括单克隆抗体和多克隆抗体、Fab和F(ab′)2片段、重组生产的等效物)。参见，例如，Harlow and Lane，supra；Kohlerand Milstein，1975，Nature 256：495。

[00095]可以应用纯化的转运蛋白或者其一部分(不论是从组织纯化的还是重组表达的)，来产生抗体。选择性地，可以应用合成的肽或多肽序列来生产或者选择感兴趣的抗体。参见，Huse et al.，1989，Science 246：1275-81；和Ward et al.，1989，Nature 341：544-46。对于一些分析，可以优选地应用与转运蛋白(多种转运蛋白)的细胞外区域结合的抗体，可以通过在抗体的生产或者选择过程中应用细胞外表位而获得这种特异性。同样地，可以选择识别在多于一个的转运蛋白中发现的表位(例如，保守序列)的抗体，以便允许对多种转运蛋白同时进行分析。表1提供了有所选择的转运蛋白和基因的DNA序列和蛋白质序列的编号(accessionnumbers)，其可以被用于表达或者合成抗原。

[00096]葡萄糖转运蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体已在科学文献中有所描述(参见，Bukhard et al.，2004，Oral Oncology，40：28-35[抗-SGLT1]，Hasper et al.，1988，J.Biol.Chem.263：398-403[描述了用对应于GLUT1的C末端的13个氨基酸的肽培育出的兔抗血清]；Rogers er al.，2003，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab..282：E733-738[描述了兔多克隆抗GLUT12抗体，R1396，其特异于人GLUT12独特的16个C末端氨基酸]，并且可以从各种广泛的商业渠道获得[例如，ResearchDiagnostics Inc.，Alpha Diagnostics，Inc.，East Acres Biologicals，DAKO，Hamburg，Germany，Chemicon International，Inc.，Temecula，CA，(参见表2)。

                                 表2

                  示例性的可经商业途径得到的抗体的特征

兔抗-SGLT-1(抗原：合成肽，其对应于兔小肠SGLT-1的推定的细胞外环的氨基酸402-420)
	兔抗-GLUT-1[MYH抗体，由于其检测细胞外区域，因此它是具有优势的](抗原：15个氨基酸的合成肽，其对应于人GLUT-1的外面环(苏氨酸-色氨酸-天冬酰胺-组氨酸-精氨酸-酪氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸-苏氨酸-亮氨酸))
兔抗-GLUT-2(抗原：合成肽(40-55个氨基酸)，其对应于GLUT2的螺旋1和螺旋2之间的胞浆外环)
	兔抗-GLUT-3(抗原：12个氨基酸的合成肽，其对应于人GLUT-3的羧基末端(SIEPAKETTTNV))
兔抗-GLUT-4(抗原：合成肽，其对应于鼠Glut-4的C-末端(氨基酸498-510))
	兔抗-GLUT-5(抗原：12个氨基酸的合成肽，特异于人GLUT-5序列的羧基末端(ELKELPPVTSEQ))
兔抗-GLUT-8(抗原：11个氨基酸的序列，接近鼠Glut-8的C-末端)

[00097]存在着多种基于蛋白的方法可以用来检测葡萄糖转运蛋白的水平。例如，来自样品的的转运蛋白可以被纯化(例如，通过色谱法或者电泳法)或者被富集(例如，通过细胞分级分离)，并通过Western分析被测定，或者可以应用竞争性免疫分析或者非竞争性免疫分析(如ELISA或者其它的夹心分析)，其伴有或者不伴有转运蛋白的纯化或者富集。在下列文献中提供了关于各种抗体分析方法的方法学和步骤的进一步指导，例如，授予Greene的美国专利4,376,110；ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL，COLD SPRING HARBORLABORATORY，CHAP.14(1988)中的“Immunometric Assays Using MonoclonalAntibodies”；Blackwell Scientific Publications于1986年出版的HANDBOOK OFEXPERIMENTAL IMMUNOLOGY(D.M.Weir，ed.)，第1卷第26章中，Bolton和Hunter所著的“Radioimmunoassay and Related Methods”；Blackwell ScientificPublications于1986年出版的HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY(D.M.Weir，ed.)，第1卷第27章中，Nakamura等人所著的“Enzyme Immunoassays：Heterogeneous and Homogenous Systems”；和Coligan，supra。

[00098]例如，蛋白印迹(免疫印迹)分析可以被用来检测并定量样品中存在的转运蛋白。蛋白印迹对于检测同质的组织样品和体液样品中的葡萄糖转运蛋白，是有用的。蛋白印迹技术在本领域中被常规地用于确定样品中的蛋白水平。参见，Sambrook，supra。通常地，应用去污剂如Triton-100，将样品均质化并裂解细胞。然后，通过凝胶电泳分离物质，转移至合适的固相支持物(如硝酸纤维素膜、尼龙膜或者衍生的尼龙膜)上，并与特异地结合转运蛋白的抗体温育。这些抗体可以被直接标记，或者可选择地，可以应用特异地结合于抗转运蛋白抗体的标记抗体在随后被检测出来(例如，标记的羊抗鼠抗体)。

[00099]在另一种方法中，应用免疫组织学方法或者免疫细胞学方法，分析葡萄糖转运蛋白的水平。组织样品制备方法在本领域中是已知的(参见，例如，Harlow，supra)，并且在实施例中有所描述。典型地，从活组织检查得到的组织被固定化，在石蜡或者其它固相支持物中包埋，或者不包埋而将其放置在固相支持物上。也可以应用冷冻切片。参见Plenat et al.，2001，Ann.Pathol.21(1)：29-47。在免疫染色之前、其间或者之后，可以对组织切片进行进一步处理；例如，表位修复方法，例如可以在柠檬酸盐缓冲液中加热组织样品。参见，例如，Leong et al.，1996，Appl.Immunohistochem.4：201。在可任选的封闭步骤之后，在合适的条件下，将组织切片暴露于一抗(如上面描述的那些抗体，优选地是那些与细胞外表位结合的抗体)，持续足够长的时间，以便一抗和组织样品中的葡萄糖转运蛋白结合。可以通过常规的实验方法来确定用于获得这样结果的合适条件。抗体和样品结合的程度可以被直接或者间接地分析。例如，在一种实施方案中，一抗或者二抗被荧光标记，应用免疫荧光显微镜检测结合情况。

[000100]在另一种方法中，让抗葡萄糖转运蛋白的抗体直接与细胞(例如，表达转运蛋白的细胞)结合，并直接(例如，应用荧光标签或者酶标记的一抗)或间接(例如，应用标记的二抗)测定抗体。这种结合分析的例子是流式细胞分析如荧光活化细胞分析(参见，例如，Salih et al.，2000，J.Immunology 165：2903-10)。在FASC分析之前，可以先使肿瘤组织样品解离开。具体地，将肿瘤切除并在缓冲液中切碎。通过加入酶(例如胶原酶和透明质酸酶)来分离细胞，获得肿瘤细胞悬液。然后，在清洗缓冲液中清洗细胞，并使之通过25号针数次。离心之后，将细胞重悬于缓冲溶液中。在一种实施方案中，流式细胞分析结果被显示为，细胞数目对染色强度(例如，转运蛋白数目)，以及相对于调查人群中的分布情况的样品中分布情况。

[000101]可以应用与分析方法相适应的任何合适方法，对葡萄糖转运蛋白的表达进行定量。例如，对于蛋白质印迹分析，可以扫描条带的密度并加以定量。对于肿瘤活组织检查的免疫组织化学分析，可以根据葡萄糖转运蛋白染色的强度，对活组织检查切片进行评分，例如，0分是指无染色，1分是指轻度染色，2分是指中度染色，3分是指重度染色。在一些实施方案中，区分膜染色和细胞质染色是可能的。在那些实施方案中，可以对膜染色进行评分。对于定量的方法，也参见，例如，Raleigh et al.，2001，″Semiquantitative immunohistochemical analysis forhypoxia in human tumors″Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.，2001 Feb 1，49(2)：569-74和Hatanaka et al.，2001，″Quantitative immunohistochemical evaluation of HER2/neuexpression with HercepTest^TM in breast carcinoma by image analysis″Pathol.Int.51：33-6。

[000102]如上面所讨论，在一些实施方案中，也测定参照蛋白的水平，参照蛋白对于癌症状态来说是相对不变的。合适的参照蛋白包括肌动蛋白、微管蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶。应用参照蛋白时，葡萄糖转运蛋白水平可以相对于参照蛋白被“标准化”，这是通过用葡萄糖转运蛋白除以参照蛋白实现的。如本文所描述，将得到的比值与预先确定的比值相比较。

4.2.3基于RNA的检测

[000103]在另一种实施方案中，葡萄糖转运蛋白的水平是通过测定转运蛋白mRNA水平而被测定的。对样品中一种或者多种葡萄糖转运蛋白信使RNA水平的分析包括：Northern分析，聚合酶链式反应(PCR)包括定量PCR，连接酶链式反应(LCR)、RNase保护分析、原位杂交、基因表达系列分析(SAGE)、差异显示(DD)分析、RNA随机引物(RAP)-PCR、差异表达序列的限制性内切酶分析(READS)、扩增限制性片段长度多肽性(AFLP)、总基因表达分析(TOGA)、内部标准竞争模板引物(CTs)在定量多重RT-PCR方法中的应用[StaRT-(PCR)]、高密度cDNA滤膜杂交(HDFCA)分析、抑制性扣除杂交(SSH)、差异筛选(DS)、高密度cDNA阵列或寡核苷酸阵列。对于综述，参见Ahmed，2002，″Moleculartechniques for studying gene expression in carcinogenesis″J.Environ.Sci.Health PartC Environ.Carcinog.Ecotoxicol.Rev.20：77-116。也参见：Lipshutz et al.Nat.Genet.1999，21：20-4；美国专利5,445,934；5,578,832；5,556,752和5,510,270；Schena et al.，1995，Science 270：467-70(高密度cDNA阵列)；Lynn et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.80：2656；Zinn et al.，1983，Cell 34：865；和Sambrook and Ausubel，supra(核糖核酸酶保护分析)。

[000104]用于从组织中分离RNA的方法是已知的(参见，例如，Ausubel，supra；Rapley et al.，″RNA Isolation and Characterization Protocols″1998.Humana Press，Inc.Totowa，New Jersey；Farrell et al.，″RNA Methodologies″1993.Academic Press，Inc.San Diego，California)。也可以从固定化的和/或石蜡包埋的组织切片中分离出用于扩增的RNA。参见Stanta et al.，″RNA Extracted from Paraffin-Embedded HumanTissues is Amenable to Analysis by PCR Amplification″Bio Techniques 11(3)：304-308.1991；Finke et al.，″An Improved Strategy and a Useful Housekeeping Gene for RNAAnalysis from Formalin-Fixed，Paraffin-Embedded Tissues by PCR″Bio Techniques 14(3)：448-453.1993；De Andres et al.，″Improved Method for mRNA Extraction fromParaffin-Embedded Tissues.BioTechniques 18(1)：42-43.1995″；Rupp et al.，″Purification and Analysis of RNA from Paraffin-Embedded Tissues″.BioTechniques6(1)：56-60.1988；Sorg et al.，″Detection of Borna Disease Virus RNA inFormalin-Fixed，Paraffin-embedded Brain Tissues by Nested PCR″.Journal of ClinicalMicrobiology 33(4)：821-823.1995；Werner et al.，″Effect of formalin tissue fixationand processing on immunohistochemisty″American Journal of Surgical Pathology 24(7)：1016-1019.2000。也参见美国专利6,602,670和在其说明书和“references cited”中引用的出版物。

[000105]出于说明的目的，在一种实施方案中，应用定量PCR，测定葡萄糖转运蛋白的水平。定量PCR是指能够定量cDNA的方法，cDNA是来自源于组织样品的细胞中的mRNA的反转录。可以通过本领域中的已知方法，对源于组织样品的细胞中的mRNA进行反转录，这包括例如，Sambrook，supra和Ausubel，supra中的方法。定量PCR可以这样来进行，例如根据标准的PCR方法来扩增RNA，其中所应用的引物被修饰以便能够在固体表面上捕获得到的产物。例如，可以分别将5’引物或者3’引物在5’末端或者3’末端生物素化，以便能够在抗生物素蛋白包被的微量反应板上捕获得到的产物。然后，对附着在固体表面上的产物进行定量，例如，通过与附着有可定量的标记的寡核苷酸探针杂交来实施。“可定量的标记”可以是，例如，放射性原子或者放射性基团。然后，通过测定样品中的放射活性的水平，评价转运蛋白mRNA表达的水平。选择性地，“可定量标记”是基团或者部分(moiety)例如地高辛。在该实施方案中，通过加入1)与碱性磷酸酶偶联的抗地高辛抗体和2)碱性磷酸酶的生色底物，之后进行吸光度分析，来定量PCR产物。可任选地，可以根据cDNA标准曲线将结果标准化。

[000106]也可以应用被称为“实时扩增”方法或者“实时定量PCR”的各种方法，来确定样品中存在的葡萄糖转运蛋白mRNA的量。这样的方法涉及，在扩增过程的期间测定形成的扩增产物的量。产荧光核酸酶分析是可以被用来检测和定量葡萄糖转运蛋白转录子的实时定量方法学的一个具体例子。总之，此类分析方法应用双重标记的产荧光寡核苷酸探针，持续测定PCR产物累积量，这样的方法在文献中通常被简单地称为“TaqMan”方法。用于这样的分析的探针典型地是短的(大约20-25个碱基)多核苷酸，用两种不同的荧光染料标记。尽管染料也可以附着在探针上的其它位置，但探针的5’末端典型地被附着报告染料(reporter dye)，3’末端附着淬灭染料(quenching dye)。为了测定葡萄糖转运蛋白转录子，将探针设计为，具有与葡萄糖转运蛋白转录子上的探针结合位点互补的至少大部分序列。与葡萄糖转运蛋白编码序列两侧的区域结合的PCR上游引物和下游引物也被加入反应混合物，以用于扩增葡萄糖转运蛋白多核苷酸。当探针完整无损时，在两种荧光团之间发生能量转移，淬灭染料使来自报告染料的发射淬灭。在PCR的引物延伸期间，探针被核酸聚合酶例如Taq聚合酶的5’核酸酶活性切割，从而从多核苷酸-淬灭染料复合物中释放出报告染料，这导致报告染料的发射强度增加，报告染料的发射强度可以由合适的检测系统来测定。

[000107]在一种实施方案中，应用原位杂交来检测样品中的葡萄糖转运蛋白序列。原位杂交分析方法是已知的，在Angerer et al.，METHODS ENZYMOL.152：649-660(1987)中被一般性地描述。例如，可以按Ruglowski et al.，2003，Am.J.Clin.Pathol.120：691-698中的描述进行原位杂交。可以应用石蜡包埋的组织样品。简言之，将载片用蛋白酶K和乙酰基化试剂预处理，并与葡萄糖转运蛋白RNA的³³P-标记的正义和反义cRNA核糖探针温育。温育之后，将载片在洗涤液中清洗，用RNase A消化，再次清洗，并进行脱水。脱水后，用银乳剂包被载片并暴露一定时间(例如，8-10天)。可以用本领域中已知的方法，例如，应用暗视场显微镜，来测定银染料的强度。也可以检查数字化的图像。原位杂交方法也在Harris，1996，Anal.Biochem.243：249-256；Singer et al.，1986，Biotechniques 4：230-250；Haase etal.，1984，METHODS IN VIROLOGY，vol.VII，pp.189-226；和NUCLEIC ACIDHYBRIDIZATION：A PRACTICAL APPROACH(Hames et al.，eds.，1987)中被描述。

[000108]可以应用与分析的方法相容的任何方法，对葡萄糖转运蛋白的表达进行定量。

[000109]基于葡萄糖转运蛋白的核苷酸序列，应用常规的方法，可以容易地获得或制备出对于检测葡萄糖转运蛋白RNA有用的探针和引物。根据对靶序列(欲被检测的序列)的了解，可以容易地设计出对基于扩增的检测有用的引物。对于一些分析来说，特别合适的引物具有接近60℃的T_M，长度在100bp至600bp之间[这似乎更像是探针长度，而不是引物长度]，并且它对于欲扩增的区域是特异的(这可以通过GenBank的BLAST分析和预期的引物来确定，例如应用软件如Oligo 6.0(Molecular Biology Insights，Inc.； http：//www.oligo.net)。优选的引物跨越外显子/内含子剪接接头处，这样，可以容易地将所需RNA/cDNA的扩增与污染的基因组DNA的扩增分离开来。已知的是，选择的引物应满足，引物自身不形成二聚体，也不与用于扩增的引物对中的其它引物(如果存在的话)形成二聚体。探针和引物在文献中有所描述，参见，例如，Helmke et al.，2004，Oral Oncology，40：28-35(SGLT1、SGLT2)；美国专利申请20030228592(GLUT8)；Rogers，2003，CancerLetters 193：225-33(GLUT12、GLUT4)；Brukhard et al.，2004，Oral Oncology 40：28-35(SGLT1和SGLT2)和Auguatin et al.，Jan 22，2004，J Biol.C′hem.(GLUT9)。在科学文献中描述了许多其它的引物和探针。其它的引物和探针显示在表3中，这是为了说明而非限制的目的。可以用常规方法制备其它的探针，例如，可以用表3中列举的引物扩增出它们。

                                   表3

基因	引物名称	引物序列	引物长度(bp)	Tm(℃)	CG％	产物长度(bp)
							GLUT1	F_1_(1231-＞1252)	TGACCATCGCGCTAGCACTGC	21	61.7	61.9	759

GLUT1	R_2_(1969＜＝1990)	TCCACCCTCAGGCATGGAACC	21	61.2	61.9
GLUT1	F_4_(1341-＞1362)	TGGTTCATCGTGGCTGAACTC	21	57	52.4	1017
							GLUT1	R_1_(2337＜＝2358)	TGAGTTTGCAGGCTCCCACAG	21	59.5	57.1
							GLUT1	F_2_(1192-＞1213)	TCATAGGCCTCGCTGGCATGG	21	61.3	61.9	1171
GLUT1	R_3_(2342＜＝2363)	AGCAGTGAGTTTGCAGGCTCC	21	59.8	57.1
GLUT2	F_3_(980-＞1001)	TGTCTGGTGTGCGAGCCATCC	21	61.5	61.9	2295
							GLUT2	R_3_(3254＜＝3275)	GATCAGTGCTCCAGTTGGTGG	21	57.9	57.1
							GLUT2	F_2_(1232-＞1253)	TGATGCTGCATGTGGCTCAGC	21	60.3	57.1	2044
GLUT2	R_1_(3255＜＝3276)	TGATCAGTGCTCCAGTTGGTG	21	56.9	52.4
GLUT2	F_3_(980-＞1001)	TGTCTGGTGTGCGAGCCATCC	21	61.5	61.9	868
							GLUT2	R_2_(1827＜＝1848)	ACAGCAGCTTTTGGCCTGTGG	21	60.6	57.1
							GLUT3	F_1_(1451-＞1472)	AGTGGCCGGCTGCTCCAACTG	21	64.2	66.7	2254
GLUT3	R_3_(3684＜＝3705)	AGACGGAGTCTCGCCCTGTGG	21	62.5	66.7
GLUT3	F_4_(1589-＞1610)	AGTCCCTGAGACCCGTGGCAG	21	62.7	66.7	700
							GLUT3	R_1_(2268＜＝2289)	ACAAACCTGCACATTCGGCAC	21	58.6	52.4
							GLUT4	F_2_(762-＞783)	TGGGCCTCACAGTGCTACCTG	21	60.9	61.9	379
GLUT4	R_2_(1420＜＝1441)	AAGTTGCTCGTCCAGTTGGAG	21	57	52.4
GLUT4	F_3_(720-＞741)	TGGAGTCCCTCCTGGGCACTG	21	62.7	66.7	664
							GLUT4	R_3_(1363＜＝1384)	TGGCTGAAGAGCTCGGCCACG	21	63.6	66.7

							GLUT4	F_3_(720-＞741)	TGGAGTCCCTCCTGGGCACTG	21	62.7	66.7	721
GLUT4	R_2_(1420＜＝1441)	AAGTTGCTCGTCCAGTTGGAG	21	57	52.4
GLUT5	F_1_(102-＞123)	TGCCCTGGCAACCCTGATAGC	21	61.7	61.9	1071
							GLUT5	R_2_(1152＜＝1173)	TATGGCATCCAGGACACTGTG	21	56.5	52.4
							GLUT5	F_2_(619-＞640)	GATGGCTGGCCGATCCTGCTG	21	62.7	66.7	1229
GLUT5	R_1_(1827＜＝1848)	AGCCACGTTACCAGGAGCCAC	21	61.3	61.9
GLUT5	F_3_(148-＞169)	GGGTACAACGTGGCTGCTGTC	21	60.5	61.9	1025
							GLUT5	R_2_(1152＜＝1173)	TATGGCATCCAGGACACTGTG	21	56.5	52.4
							GLUT6	F_1_(482-＞503)	ACAGCTGCCTGCATCCCGGTG	21	64.2	66.7	991
GLUT6	R_7_(1452＜＝1473)	TGAACACCAGGCTCACCAAGC	21	59.7	57.1
GLUT6	F_2_(762-＞783)	TCGATGTCCACTGGGAGTTCG	21	58.3	57.1	980
							GLUT6	R_1_(1721＜＝1742)	AGCAGTGCTACCTGTCCCGAG	21	60.5	61.9
							GLUT6	F_3_(266-＞287)	ACCAAATCCCAGGCATCCTGG	21	59.5	57.1	1485
GLUT6	R_4_(1730＜＝1751)	TGGCTGGACAGCAGTGCTACC	21	61.3	61.9
GLUT8	F_1_(956-＞977)	TCCAGGTGCTGTTCACAGCTG	21	59.4	57.1	775
							GLUT8	R_4_(1710＜＝1731)	ACCGCAGGTCTGCAAAGCTCG	21	62	61.9
							GLUT8	F_2_(944-＞965)	TCGTGGGTGTCATCCAGGTGC	21	61.3	61.9	588
GLUT8	R_5_(1511＜＝1532)	AGCTTGGAGTCACAGGCTTGC	21	59.8	57.1
GLUT8	F_1_(956-	TCCAGGTGCTGTTCACAGCTG	21	59.4	57.1	416

	＞977)
							GLUT8	R_3_(1351＜＝1372)	TCCATAGGGCCTGAGGACCTC	21	59.7	61.9
							GLUT9	F_2_(3-＞24)	TGGCTCTAGGGCTGGCACCAG	21	63.2	66.7	668
GLUT9	R_2_(650＜＝671)	AGCCACGGATCTCCTTGGGTG	21	61	61.9
GLUT9	F_1_(422-＞443)	TCGCCATCGGTGGACTTGTGG	21	61.4	61.9	612
							GLUT9	R_1_(1013＜＝1034)	TCACGGTGACCACCTGCCAGC	21	63.8	66.7
							GLUT10	F_1_(1068-＞1089)	ACTCAGGCCCAAGCTGTCTGG	21	61.3	61.9	1256
GLUT10	R_1_(2303＜＝2324)	TGGTTGCATGCGCCTGTAGTC	21	59.9	57.1
GLUT10	F_4_(1642-＞1663)	ACGGTTCACCCTGAGCTTTGG	21	59.5	57.1	1591
							GLUT10	R_2_(3212＜＝3233)	TGGCAAAGCCAGCTCCAGCAC	21	62.7	61.9
							GLUT11	F_1_(701-＞722)	TCTTTACGGCTCTGGGGATCG	21	58.2	57.1	561
GLUT11	R_4_(1241＜＝1262)	AGCAGGTCATCAGGCTGTACC	21	58.6	57.1
GLUT11	F_2_(211-＞232)	TCCTTACGGCCTCGGACGCAG	21	62.8	66.7	951
							GLUT11	R_3_(1141＜＝1162)	AGTCCCGATGATCGCGTACTG	21	58.2	57.1
							GLUT11	F_3_(749-＞770)	AGCTCCTAGGTGGCCCTCAGG	21	62.4	66.7	657
GLUT11	R_6_(1385＜＝1406)	ACAGCTCTGTGGCCAGGATCC	21	61.1	61.9
GLUT11	F_5_(450-＞471)	TGGAGCACTGCTTGCAGGTCC	21	61.9	61.9	615
							GLUT11	R_7_(1044＜＝1065)	TCCATGGCACTGCCCAGAACC	21	61.9	61.9
							GLUT12	F_1_(541-＞562)	ACGCATTGCCATAGGGGTCTC	21	59.2	57.1	1061
GLUT12	R_2_(1581	TCTCGCTGAGCACCAGCCAGG	21	63.3	66.7

	＜＝1602)
GLUT12	F_4_(1091-＞1112)	TCCACTGGGGTTGGAGTCGTC	21	60.5	61.9	1384
							GLUT12	R_1_(2454＜＝2475)	TGGGCAGTTGTCCACACTGTG	21	59.7	57.1
							GLUT12	F_4_(1091-＞1112)	TCCACTGGGGTTGGAGTCGTC	21	60.5	61.9	511
GLUT12	R_2_(1581＜＝1602)	TCTCGCTGAGCACCAGCCAGG	21	63.3	66.7
SGLT1	F_1_(1083-＞1104)	AGGTTGGCTGTACCAACATCG	21	57.1	52.4	477
							SGLT1	R_1_(1539＜＝1560)	AGTTGCTGGGCTCCATGCAGC	21	62.5	61.9
							SGLT1	F_4_(209-＞230)	TGGTGGCCGATTGGAGCCTCC	21	63.7	66.7	1143
SGLT1	R_2_(1331＜＝1352)	TGCTGACTGCACAATGGGCAC	21	60.5	57.1
SGLT1	F_3_(1122-＞1143)	TGGAGCTCATGCCCAATGGAC	21	59.6	57.1	964
							SGLT1	R_3_(2065＜＝2086)	TCCCTTCAACACCACAGGACG	21	58.9	57.1
							SGLT2	F_2_(175-＞196)	TGGGCGGCTACTTCCTGGCAG	21	63.5	66.7	909
SGLT2	R_4_(1063＜＝1084)	ACACGCGCCTGCACACCTCAG	21	64.2	66.7
SGLT2	F_3_(394-＞415)	TGCCACAGTACCTGCGCAAGC	21	62.3	61.9	758
							SGLT2	R_1_(1131＜＝1152)	ACCGTTGGGCATGAGCTTCAC	21	60	57.1
							SGLT2	F_4_(894-＞915)	TGCAGCGACCAGGTCATCGTG	21	61.5	61.9	449
SGLT2	R_7_(1322＜＝1343)	AGCCAGGCCACCGACACTACC	21	63.2	66.7
SGLT5	F_6_(643-＞664)	TCGCAGCTTTTGACCAGATCG	21	57.4	52.4	934
							SGLT5	R_7_(1556＜＝1577)	TGCTCGTTGGCACGTCGCCAG	21	64.2	66.7

SGLT5	F_1_(843-＞864)	TGCACCGACCAGGTCATCGTG	21	61.3	61.9	597
							SGLT5	R_1_(1419＜＝1440)	ACTCACGCCGATGAGTGCCAC	21	61.5	61.9
							SGLT5	F_2_(739-＞760)	TGCCACGTACAGACGCCATGC	21	62	61.9	745
SGLT5	R_5_(1463＜＝1484)	AGTTGCCCGCTGTTGGAGTCC	21	61.8	61.9

4.2.4.功能分析

[000110]在一种实施方案中，通过测定葡萄糖转运蛋白活性，例如，在体外或者体内对葡萄糖或者葡萄糖类似物的摄取，确定葡萄糖转运蛋白的水平。例如，可以用葡萄糖摄取分析在体外测定葡萄糖转运蛋白活性。葡萄糖摄取分析在本领域是已知的(参见，例如，Gnudi et al.，1997，Mol.Endocrinol.11：67-76；也参见PCT出版物WO03/082301)。在一种情形中——为了说明而不是限制——葡萄糖摄取分析是测定标记的已糖的摄取。如上所述，细胞是通过使肿瘤组织样品解离而获得的。可任选地，细胞被培养，并且可任选地，细胞被传代培养至汇合，随后被分离并重悬浮。然后，在细胞松弛素B(用于GLUTs)或者根皮甙(phlorizin)(用于SGLTs)存在或者不存在的条件下，放射标记(例如，¹⁴C-标记或者³H-标记)的葡萄糖或者葡萄糖类似物(如2-脱氧葡萄糖)与细胞温育。温育后，洗涤细胞并分析其放射性。细胞松弛素B抑制I类和III类葡萄糖转运蛋白，因此，评价此类转运蛋白的活性是有用的。根皮甙抑制SGLTs，因此，对评价此类转运蛋白的活性是有用的。

[000111]在一些实施方案中，测定SGLTs的水平，葡萄糖类似物a-甲基-D-葡萄糖苷(a-MDG)被使用。a-MDG可以以钠依赖的方式被运输，表观亲和力(K_0.5)是0.4(SGLT1)和2mM(SGLT2和SGLT3)。在一些实施方案中，葡萄糖类似物仅由一种或者少数的特异葡萄糖转运蛋白运输，因此，葡萄糖示踪剂的摄取与葡萄糖转运蛋白的表达水平直接相关。例如，已报道，宫颈癌细胞对葡萄糖摄取的增加与GLUT1的独有的跨膜过量表达相关。因此，在葡萄糖摄取分析中，增加的葡萄糖摄取提示，GLUT1的表达增加。

[000112]在一些实施方案中，葡萄糖类似物是由多于一种的葡萄糖转运蛋白运输的。因此，总葡萄糖摄取量将和该细胞表达的葡萄糖转运蛋白的总体水平相关。

[000113]用于评价葡萄糖转运蛋白的表达水平的另一种分析是，细胞松弛素B结合分析(参见，Ogura et al.，1999，J.Endocrinology，160：443-452；Ozaki et al.，1996，Mech Ageing Dev.88：149-158；and Gorga & Lienhard，1981，Biochem.20：5108-13)。简言之，从组织样品或者细胞样品制备膜提取物，并和放射标记(如，³H-标记)的细胞松弛素B混合。在反应结束时，将膜结合的细胞松弛素B和游离的细胞松弛素B分离(例如，通过过滤或者离心)。计算膜部分的放射性。细胞松弛素B结合的水平和GLUTs的水平相关。

[000114]在另一种实施方案中，通过在体内测定葡萄糖摄取，确定葡萄糖转运蛋白的水平。在此方法中，在葡萄糖转运蛋白表达和葡萄糖摄取之间形成关联。例如，Kato et al.，2003，Anti-Cancer Res.23：3263-72，报道了在食道鳞状细胞癌中，18-F-氟脱氧葡萄糖累积和GLUT1表达的关联。葡萄糖摄取分析在本领域中是已知的。参见，例如，Reske et al.，1997，J.Nucl.Med.，38：1344-48。通常地，用不可代谢的葡萄糖类似物，如2-氟脱氧葡萄糖(2-FDG)、2-脱氧葡萄糖(2-DG)和3-O-甲基葡萄糖，评价葡萄糖摄取。葡萄糖转运蛋白活性可以被测定，例如，应用荧光标记的葡萄糖类似物，通过正电子放射X线体层摄影术来实施。

5.抗肿瘤药剂的选择

[000115]某些抗肿瘤药剂是由某些葡萄糖转运蛋白优选地运输的。例如，药物链脲菌素通过GLUT2转运蛋白被运输进入胰腺癌细胞。根据本发明的方法，癌组织中高水平GLUT2转运蛋白的检测，为预测该肿瘤对链脲菌素治疗敏感提供了基础。通常地，特定的转运蛋白的水平越高，该肿瘤对由该特定转运蛋白运输的抗肿瘤药剂的治疗越敏感。

[000116]因此，在一些实施方案中，在选择抗肿瘤药剂进行治疗之前，确定葡萄糖转运蛋白的量。一旦发现，葡萄糖转运蛋白水平大于预先确定的量，则确定，该癌症对特定抗肿瘤药剂的治疗是敏感的。抗肿瘤药剂的选择可以基于许多因素，包括但不限于，统计学分析或者葡萄糖转运蛋白的底物特异性。

[000117]在一些实施方案中，葡萄糖转运蛋白已经被知道是特异性地运输某抗肿瘤药剂。则葡萄糖转运蛋白的更大的量和对该抗肿瘤药剂的敏感性之间的关联立即形成。例如，已经报道，glucofosfamide，也被称为glufosfamide，是由SGLT1运输的。那么，根据本发明的方法，SGLT1的量比预先确定的量多，则提示，该癌症对glucofosfamide的治疗是敏感的。在另一种实施方案中，已知葡萄糖转运蛋白运输某一类型的抗肿瘤药剂。例如，已知GLUT2运输2位不被修饰的葡萄糖类似物。

[000118]在一些实施方案中，抗肿瘤药剂被预先选出，并确定该药剂是其底物的葡萄糖转运蛋白的水平，从而观察患者患有的癌症是否是对此治疗敏感的类型。如果来自患者的癌症样品中，葡萄糖转运蛋白的水平高于参照值，则用该抗肿瘤药剂治疗患者。

[000119]应用本领域已知的方法(如下面所描述)，可以将一种药剂鉴定为一种具体转运蛋白的底物。选择性地，可以通过鉴定一群患者，已证明药剂对该群体是有效的，并确定什么样的转运蛋白被表达，从而建立转运蛋白水平和对该药剂的敏感性之间的关联。然后，将具体患者的水平或表达情况与已证明该治疗对其有效的群体的参照情况相比较。

[000120]可以应用各种底物分析。例如，利用原代细胞培养物或者爪蟾卵母细胞进行的已糖摄取和竞争性分析，已经被习惯地用于确定葡萄糖转运蛋白是否运输特定的底物。参见，例如，Garcia et al.，2003，J Neurochemistry，86：709；Burant et al.，J.Biol.Chem.，1992，267：14523-6；和Veyhl et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：2914-29。可以制备来自葡萄糖转运蛋白的正义cRNA，如Veyhl等人所描述，并注射入去卵泡爪蟾卵母细胞。在细胞松弛素B(用于GLUTs)或者根皮甙(用于SGLTs)存在或者不存在的条件下，温育卵细胞，其中含有欲检测的各种放射标记的(¹⁴C、³H等)葡萄糖或者葡萄糖类似物。温育之后，分析卵细胞中的放射活性。对于SGLTs，可以通过应用双微电极电压钳技术，来分析葡萄糖或者葡萄糖类似物的摄取。

[000121]其它的分析利用原代细胞例如人癌细胞进行，已知其表达特定的葡萄糖转运蛋白。让细胞生长并传代培养至汇合，然后分离和重悬浮。然后，在细胞松弛素B(用于GLUTs)或者根皮甙(用于SGLTs)存在或者不存在的条件下，将细胞与各种欲检测的放射标记的(例如，¹⁴C-或者³H-标记)葡萄糖或者葡萄糖类似物温育。温育之后，洗涤细胞并分析其放射活性。

[000122]在本发明的一个相关方面，应用体外活性分析，来确定具体肿瘤(或者肿瘤类型)对具体抗肿瘤药剂的敏感性。根据该方法，将来自所述肿瘤的细胞和多种浓度的所述抗肿瘤药剂温育，所述抗肿瘤药剂的浓度包括了当该药剂被给予人类患者时估计的体内浓度。在一个或多个时间间隔(例如，10分钟、30分钟、1小时和3小时)之后，测定药剂对细胞生长和存活能力的影响，并将该影响与不加入药剂的对照和/或加入了不同的抗肿瘤药剂或者不同的抗癌药剂的对照比较。相对于对照的细胞生长减少(例如，通过测定细胞数目或者替代指标如DNA含量而得以评价)或者存活能力降低(例如，通过监测培养物中的凋亡而得以评价)提示，该肿瘤对该药剂敏感。在一种实施方案中，根据该方法，筛选一系列的几种(例如，至少2、至少3、至少4、至少5或者至少10)不同药剂，以鉴定可用于给予患者的最有希望的候选药剂。

6.用于测定转运蛋白——包括多种转运蛋白——的水平的设备和方法

[000123]本文描述了许多用于确定葡萄糖转运蛋白的水平的方法，并且，在考虑了本公开内容之后，对于相关领域的技术人员而言，其它的方法将是显而易见的。在本发明的一些实施方案中，仅仅采用分析方法中的一种，来确定葡萄糖转运蛋白的水平。在其它的实施方案中，联合采用两种或者更多种方法，来确定葡萄糖转运蛋白的水平。例如，可以将在免疫组织化学分析中显示为高的葡萄糖转运蛋白表达水平的样品作进一步的处理，以便通过蛋白质印迹(Western blot)分析对蛋白水平进行定量，如果该信息对于实施者来说是有用的话。类似地，可以对显示出高的葡萄糖摄取的样品作进一步的检测，测定葡萄糖转运蛋白的蛋白水平或者mRNA水平。

[000124]在一些实施方案中，仅测定一种葡萄糖转运蛋白的表达水平。在其它的实施方案中，测定两种或者更多种葡萄糖转运蛋白的表达水平。对两种或者更多种葡萄糖转运蛋白的测定，可以相继进行或者同时进行。

[000125]在一些实施方案中，测定多于一种的葡萄糖转运蛋白的表达。这在多种葡萄糖转运蛋白被表达于同一样品时，是特别有意义的。实施者可以(1)通过分析数种转运蛋白，确定该组织中哪些转运蛋白的表达水平高于参照值；(2)基于哪些转运蛋白运送哪些药物的知识，选择抗肿瘤药剂。

[000126]例如，已经显示，多种葡萄糖转运蛋白，包括GLUT1、GLUT4、GLUT5、GLUT8、GLUT12和HMIT均在脂肪细胞中表达。可以借助于允许检测或者测量多种葡萄糖转运蛋白的方法，不论是相继的或者是同时的，对多种葡萄糖转运蛋白进行检测。

[000127]同时测定多于一种的蛋白的表达水平的方法，在本领域中是已知的，此处提供的进一步描述仅仅是为了说明目的。例如，微阵列分析既可以被用在测定蛋白水平中，又可以被用在测定RNA水平中，包括用于测定多于一种的转运蛋白或者RNA的水平。

[000128]用于测定细胞或者组织中表达的多种RNA的水平的方法，是本领域中已知的，包括高密度多核苷酸阵列或者寡核苷酸阵列(Lipshutz et al.，Nat.Genet.，1999，21：20-4；美国专利5,445,934；5,578,832；5,556,752；和5,510,270)、高密度cDNA阵列(参见，例如，Schena et al.，1995，Science 270：467-7)、斑点印迹和狭线印迹(dot and slot blots)、蘸棒(dip sticks)、针(pins)、芯片或者珠子(beads)。所有这些技术和设备在本领域中是已知的，并且是许多可经商业渠道得到的诊断试剂盒的基础。通过本公开内容的指导，这些技术可以容易地被采用，以测定葡萄糖转运蛋白的水平。

[000129]在一些实施方案中，应用蛋白质阵列确定葡萄糖转运蛋白(多种转运蛋白)的表达。“蛋白质阵列”含有不同的捕获试剂，捕获试剂被固定在固相支持物的不同位置上，允许每一捕获试剂与其分别的靶蛋白之间独立地相互作用。捕获试剂可以是选择性地结合于靶蛋白的任意分子，如抗体、重组蛋白和小的化学物质。蛋白质阵列可以用于确定样品中特定蛋白的量。参见，Von Eggeling et al.，2000，BioTechniques 29：1066-70；Haab，Proteomics，3：2116-22；Wiesner，2003，J.Lab.Medicine 27：85-91；Kodadek，2002，Trends Biochem.Sci.27：295-300。

[000130]在本发明的一些实施方案中，测定葡萄糖转运蛋白中的仅一种或者少量几种的水平。在一些情形下，例如，已知患者的癌症和特定的葡萄糖转运蛋白的过量表达在一定的频率上相关联。例如，已经报道，GLUT1过量表达与膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、直肠癌、食道癌、胃癌、头部和颈部癌症、平滑肌肉瘤、卵巢癌和甲状腺癌相关。因此，在本发明的一种实施方案中，测定来自对象的癌症样品中的GLUT1水平，所述对象患有膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、直肠癌、食道癌、胃癌、头部和颈部癌症、平滑肌肉瘤、卵巢癌或者甲状腺癌。

[000131]已经报道，GLUT2过量表达与胰腺癌或者胃癌相关联。因此，在本发明的一些实施方案中，测定来自对象的癌症样品中的GLUT2水平，所述对象患有胰腺癌或者胃癌。在一种实施方案中，癌症是胰腺癌，癌症样品中的GLUT2的水平被测定，抗癌药剂选自链脲菌素、glucofosfamide和gluSNAP化合物。

[000132]已经报道，GLUT3过量表达与脑癌或者肺癌相关联。因此，在本发明的一个实施方案中，来自患有脑癌或者肺癌的对象的癌症样品中的GLUT3的水平被测定。

[000133]在一些实施方案中，癌症和葡萄糖转运蛋白过量表达之间的关联是未知的。在这些实施方案中，在确定患者中所选择的葡萄糖转运蛋白的水平之前，首先通过例如作表达图谱的方法，建立葡萄糖转运蛋白和不同类型的癌症之间的关联。或者，可以简单地测定癌症样品中的转运蛋白的总水平，如果该总水平超过参照值，则以施用该药物时所选择的所需剂量，施用该药物。

7.试剂盒和设备

[000134]在一方面，本发明提供了用于筛选患者肿瘤的试剂盒和设备，以确定对具体抗肿瘤药剂的敏感性。

[000135]本发明的试剂盒包括用于评价一种或者多种葡萄糖转运蛋白基因的表达的试剂，如用于检测或者扩增葡萄糖转运蛋白基因产物的探针和/或引物。在一种实施方案中，探针是核酸探针或引物，其特异性地结合于由葡萄糖转运蛋白基因转录的一个或者多个多核苷酸。在一种实施方案中，试剂盒含有特异于不同的人葡萄糖转运蛋白中的一种或者多种(至少2种，优选地为3种，常常是4种，有时是5种或者更多种)的抗体。本发明的试剂盒可以任选地包括对实施本发明的方法有用的其它成分，如用于分离细胞或者从细胞中分离蛋白或者核酸的设备。此外，试剂盒可以含有校准曲线、用于与预先确定的值进行比较的参照样品(或是蛋白或者是核酸)，和/或如本文描述的参照值(例如，以表格的格式)。

[000136]本发明也提供了用于确定人类组织或者体液样品中葡萄糖转运蛋白的水平或者量的试剂盒。在一种实施方案中，试剂盒包括诊断筛选试剂及其在本发明的方法中的使用说明书。

[000137]本发明也提供了对本发明的筛选方法有用的设备。在一方面，提供了包括固定化的探针(多种探针)的设备，所述探针特异于一种或者多种葡萄糖转运蛋白基因产物(多核苷酸或者蛋白)。探针可以结合多核苷酸(例如，基于杂交)、多肽或者表达多肽的细胞。

[000138]在一些实施方案中，将包括单一的固定化探针的设备用于筛选。在一种实施方案中，应用阵列格式，其中多种(至少2种，通常至少4种或者更多)不同的探针被固定化。术语“阵列”以其通常的含义被应用，并且意味着，被固定在基质上的多种探针中的每一个，在底物上都具有明确的定位(地址)。根据设备的性质和用途，阵列上探针的数目可以不同。例如，尽管通常存在至少2种或者多于2种不同的探针，但用于检测葡萄糖转运蛋白的蘸棒式阵列(dipstick formatarray)可以具有少至1种的探针。

[000139]各种结合和杂交形式是已知的，包括核苷酸阵列、cDNA阵列、蘸棒(dipsticks)、针式(pins)、芯片(chips)或者珠子(beads)、Southern印迹、Northern印迹、斑点印迹和狭线印迹。因此，本发明提供了包括固定于固体基质上的葡萄糖转运蛋白基因产物探针的设备。可以应用各种固相支持物，其可以由玻璃(例如，玻璃载片)、塑料(例如，聚丙烯、尼龙)、聚丙烯酰胺、硝酸纤维素或者其它材料制成。将核酸附着在表面上的一种方法是，通过在玻璃板上进行印刷，如在Schena et al.，1995，Science 270：467-470；Shalon et al.，1996，Genome Res.6：639-645中所一般性地描述的。用于制作微阵列的另一种方法是通过制作高密度寡核苷酸阵列。参见，Fodor et al.，1991，Science 251：767-73；Lockhart et al.，1996，Nature Biotech 14：1675；和美国专利号5,578,832；5,556,752和5,510,270。

[000140]尽管含有用于葡萄糖转运蛋白的探针的阵列(例如，包含针对基因组的实质片段的探针的阵列)是已知的，本发明的设备着重于测定葡萄糖转运蛋白。因此，在实施方案中，在设备或者阵列上的固定化探针的至少大约10％，有时至少大约25％，至少大约50％或者至少大约75％，特异性地结合(例如，杂交到)葡萄糖转运蛋白基因产物。在一种实施方案中，基质包括少于大约100种不同的探针，少于大约50种不同的探针，少于大约10种不同的探针，少于大约5种不同的探针或者少于大约3种不同的探针。如本文中所应用，如果两种探针不是特异地结合于相同的多肽或者多核苷酸(即，例如针对不同基因的cDNA探针)，则一种探针“不同于”另一种探针。

[000141]在一种实施方案中，探针选自单克隆抗体或者其它特异的结合蛋白(例如，抗体衍生物或者片段)，其特异地和葡萄糖转运蛋白或者表达这种蛋白的细胞结合。用于多肽的探针也可以以阵列方式被固定，例如，采用多孔板的ELISA形式。

8.实施例

[000142]前面的章节已经详细地描述了本发明。下面的实施例阐述了本发明的各方面。在每一情形下，将在癌症样品中确定的葡萄糖转运蛋白水平与参照值相比较，以确定肿瘤对含有葡萄糖部分的抗肿瘤药剂的治疗是否敏感。

                           实施例1

                对胰腺肿瘤中GLUT2水平的Western分析

[000143]本实施例描述了基于抗体的葡萄糖转运蛋白分析，其用于确定来自胰腺癌患者的样品中的GLUT2水平。

[000144]人胰岛细胞癌或者类癌瘤癌组织是从经历了用于治疗胰腺癌的手术的患者获得的。在手术室中，将切取的组织放置在容器中，清楚地标记并送至病理部门。在进行病理评定以评价肿瘤的病理学特征并且确保该样品含有肿瘤细胞之后，将肿瘤的一部分放置在作好标记的容器中，并且于干冰上送至实验室，在实验室将其保存在-70℃直至应用。在一些情况下，应用针抽吸活组织检查来评价肿瘤存在和特征。下面的所有步骤适用于样品的任何类型。

[000145]将冰冻样品称重，并于干冰上在thermovac组织粉碎机中粉碎，将组织粉末放置在清洁的管中。使组织粉末在缓冲液中(50mM Tris-HCl-乙二胺四乙酸(EDTA)钠、1％Triton X-100、10％甘油、10mM钼酸钠、10mM硫代甘油、10ug/ml抑肽酶、10ug/ml亮抑蛋白酶肽、0.5mM苯甲基磺酰氟和10ug/ml胃酶抑素)成为匀浆，其中根据组织样品的尺寸使用带有适当的探头的polytrone。匀浆化是在0-4℃进行的，脉冲时间为30秒，各次脉冲匀浆之间有1分钟的冷却时间。在10,000g将组织匀浆物离心10分钟，以将胞浆/膜可溶组分与细胞核组分和细胞碎片分离开。丢弃得到的沉淀，移取上清并冷冻保存直至检测，上清主要含有胞浆蛋白和膜结合蛋白，包括GLUT2。

[000146]通过混合20ml丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(30％-0.8％wt/vol)、7.5mlpH8.8的3M Tris-HCl、31.56ml ddH₂O和0.6ml 10％SDS，制成分离胶(10％)；将得到的混合物除气30分钟。加入TEMED(35μl)，将混合物再次除气30分钟。加入过硫酸胺(APS)(10％，0.33ml)，用60cc的注射器将混合物立即灌入凝胶装置。在分离胶的顶部覆盖上1-丁醇(1ml)以防止干燥，并使凝胶聚合1小时。在灌注浓缩胶(参见下面)的即刻前，通过用水清洗，除去丁醇层。

[000147]浓缩胶由3.75ml丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(30％-8％wt/vol)、1.875mlpH6.8的2M Tris-HCl、24ml ddH₂O和0.3ml 10％SDS组成；制备此凝胶混合物并除气30分钟。向混合物加入TEMED(25∶1)，并将混合物再次除气30分钟。加入过硫酸胺(APS)(10％，0.3ml)，将浓缩胶灌入凝胶装置并正确放入梳子。使浓缩胶聚合1小时。移走梳子，向凝胶架中加入电极缓冲液(25mM Tris、192mM甘氨酸、4mM十二烷基硫酸钠，pH8.3)。用5×样品缓冲液(2g SDS、1.0mlTritonX100、3.126ml 2M Tris-HCl、10.8ml ddH₂O；将终体积调至20ml和pH调至6.8，100mg溴酚兰、1.0ml巯基乙醇和4ml甘油)混合欲分离的蛋白样品，得到1×的终浓度并铺放到凝胶孔中。分子量(MW)标记(BioRad)可以被包含到凝胶中(10μl的MW标记物加入到0.150ml的1×样品缓冲液)。将样品铺放到凝胶上，在17mA和500V条件下，室温电泳12-17小时。

[000148]将凝胶从装置中移出，并放置在BioRad转膜仪中，转膜仪中充满了转移缓冲液(20％甲醇、192mM甘氨酸和20mM Tris，pH8.3)。在0.36A和100V，将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜，0-4℃转移3小时，伴随着搅动。将硝酸纤维素膜放置在两层滤纸之间并在室温保存，或者立即用于蛋白质印迹(Westernblot)分析。

[000149]通过在室温下，在振荡器上，在TBST/5％脱脂奶(10mM Tris、150mM氯化钠，调节pH至8.0；再加入0.5％的Tween 20)中温育1小时，封闭硝酸纤维素膜上的非特异性蛋白结合位点。随后，用TBST清洗膜，并以所需的稀释度(1∶1000或者1∶2000，在TBST/5％奶中)加入抗GLUT2的一抗。室温下轻轻振荡1小时，进行抗体-抗原的相互作用。然后，用TBST清洗膜3次，每次5分钟，去除未结合的一抗。

[000150]向硝酸纤维素膜上加入二抗(免疫纯化的羊抗兔IgG，其偶联于过氧化物酶)(1∶50,000，在TBST/奶中)。在室温下轻轻振荡40分钟，进行此温育。然后，用TBST清洗膜4次，每次5分钟。然后，在一份稳定的过氧化物溶液对一份鲁米诺/增强剂溶液的体系中温育膜3-5分钟(Pierce)，如制造商所建议。将膜包裹在莎纶包裹物中并放置在盒中。在暗室中，将X-光胶片放置在膜上1-30秒种。将膜显影，可见到条带，并进行定量。将样品中的GLUT2蛋白的水平标准化为，单位重量肿瘤中的单位数，并和参照值比较，以确定肿瘤对含有葡萄糖部分的抗肿瘤药剂的治疗是否敏感。

                           实施例2

             对胰腺癌中GLUT2蛋白水平的免疫组织化学分析

[000151]在下面描述的示例性方法中，应用下列缓冲液和溶液：磷酸盐缓冲液(PBS)：5mM Na₂HPO₄、0.9mM KH₂PO₄、72mM NaCl、1.6mM KCl，pH7.4；PBS/TritonX100：PBS，含Triton X100，稀释比例为1∶500；和柠檬酸盐缓冲液：18ml 0.1M柠檬酸和82ml 0.1M柠檬酸钠。

[000152]如实施例1所描述，获得胰腺癌组织样品。切成5μm的切片，并安放在硅烷包被的载片上。使载片干燥过夜。65℃加热载玻片45分钟至1小时，然后脱蜡和再水化，方法为入二甲苯3次，每次5分钟，入100％酒精2次，每次3分钟，和入95％酒精2次，每次2分钟。在45ml甲醇和5ml 30％过氧化氢中温育载片20分钟，封闭内源性的过氧化物酶。用PBS/Triton X-100润洗载片2次，每次2分钟。

[000153]通过向浸有载片的玻璃容器中加入柠檬酸盐缓冲液，并微波高功率加热15分钟，然后50％功率加热5分钟，并50％功率再加热5分钟，来进行抗原修复。然后，将载片冷却至室温大约30分钟，在PBS/Triton X-100中润洗2次，每次2分钟。以合适的稀释比例向每一载片加入GLUT2一抗(用PBS稀释，每一载片加入200μl)，并在湿盒(humidity chamber)中37℃温育1小时。用PBS 5％ TritonX-100洗涤载片2次，每次2分钟。将生物素化的二抗施于载玻片上，室温30分钟。在PBS 5％Triton X-100中清洗载片。

[000154]然后，在湿盒内室温应用链霉抗生物素蛋白30分钟，然后在PBS 5％Triton X-100中清洗载片。加入发色团(2.5ml PBS，1/4片3，3′二氨基苯联胺四盐酸(DAB)和2滴0.8％过氧化氢)，在湿盒内室温温育载片10分钟。用ddH₂O润洗载片5分钟，用Gill’s苏木精中复染1分钟，用流水清洗直至清澈。用0.25％的酸性酒精澄清细胞质(浸蘸3次)。然后，在连续的轻缓水流下清洗载片并在1％氨水中蓝化(differentiated)10秒，随后在流水中清洗。然后，将载片脱水，方法为，在95％酒精中温育2次，每次浸蘸8-10次；在100％酒精中2次，每次浸蘸8-10次；和二甲苯中3次，每次浸蘸10-15次；应用Permount来施加盖玻片，用于光学显微镜观察。用Kodak Ectochrome speed 100胶片为载玻片照相，并确定染色的水平。

                             实施例3

                       GLUT1的免疫组织化学分析

[000155]本实施例描述了基于抗体的免疫组织化学葡萄糖转运蛋白分析，这在确定肿瘤样品中的GLUT1水平中是有用的。

[000156]应用治疗癌症患者过程中的常规方法，通过外科切除术或者肿瘤活组织检查，分离组织样品。分离即刻之后，将组织样品放置在明确标记的容器内并送至病理部门。在进行病理评价以评定肿瘤病理学特征并确认样品含有肿瘤细胞之后，将肿瘤细胞的一部分放置在标记好的容器内，放在干冰上，送至实验室。

[000157]立即将样品浸没在10％福尔马林溶液中，并根据标准方法加工为石蜡包埋组织块。应用恒冷切片机从石蜡包埋的固定组织块切取至少三张连续切片，每张4微米厚，并将切片贴片在Vectabond包被的载玻片上(Vector Laboratories，Burlingame，CA)。让载玻片干燥过夜，再56℃加热30分钟，然后将载玻片脱蜡并再水化，方法为，入二甲苯3次，每次5分钟，入100％酒精2次，每次3分钟，入95％酒精2次，每次2分钟。

[000158]将载玻片在含有0.3％过氧化氢的甲醇中温育20分钟，封闭内源性过氧化物酶。用PBS(5mM Na₂HPO₄、0.9mM KH₂PO₄、72mM NaCl、1.6mM KCl，pH7.4)清洗载玻片2次，每次2分钟。

[000159]通过在10mM pH6.0的柠檬酸盐缓冲液中微波加热载玻片，修复抗原，加热5分钟，三个循环。然后，将载玻片冷却至室温(22℃)大约30分钟，然后在PBS中清洗2次，每次2分钟。为封闭非特异性蛋白结合，将载玻片浸没在的2％的正常羊血清中，2％的正常羊血清溶于含有1％BSA的PBS溶液中，室温30分钟。

[000160]以1∶300的稀释比例(用含有0.1％BSA的PBS稀释，每一载玻片加入200μl)向每一载玻片加入抗人GLUT1一抗(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)，在湿盒中室温温育2小时。该抗GLUT1抗体是亲和纯化的兔多克隆抗体，其用对应于人GLUT-1序列的外表面环的15个氨基酸的合成肽来生成。

[000161]对于阴性对照，可以从相同患者的染病器官或健康器官中的健康部分，分离非肿瘤组织。此外，阴性对照可以包括，未应用一抗的染色，用非免疫的兔IgG(20ug/ml)替代抗葡萄糖转运蛋白抗体，和用靶抗原蛋白预吸附的一抗染色。该分析的阳性对照是，组织切片中存在的血管组织和红细胞中观察到的染色。

[000162]与一抗温育之后，用PBS清洗载玻片2次，每次2分钟。可以应用标准的过氧化物酶标记的链亲和素-生物素检测方法，来检测一抗。向载玻片施用生物素化的二抗，室温30分钟。在PBS中清洗载玻片。然后，在湿盒内室温应用链亲和素30分钟。加入发色团(2.5ml PBS，1/4片3，3′二氨基苯联胺四盐酸(DAB)和2滴0.8％过氧化氢)，并在湿盒内室温温育载玻片10分钟。

[000163]然后，在ddH₂O中清洗载玻片5分钟，在Gill’s苏木精中复染色1分钟，并在流水中清洗直至清澈。用0.25％的酸性酒精澄清细胞质(浸蘸3次)。然后，在连续的轻缓水流下冲洗载玻片并在1％氨水中蓝化10秒，随后在流水中清洗。

[000164]将载玻片脱水，方法为，在95％酒精中温育2次，每次浸蘸8-10次；在100％酒精中2次，每次浸蘸8-10次；和二甲苯中温育3次，每次浸蘸10-15次；应用Permount来施加盖玻片，以便进行光学显微镜观察。用Kodak Ectochromespeed 100胶片为载玻片照相。

[000165]记录下具有膜染色的细胞比例的半定量评价以及染色的密度。可以应用连接于BX60显微镜(Olympus)和KY-F55B(JVC)彩色摄像机的计算机辅助图像分析系统KS-300(Zeiss)，计算出免疫活性蛋白占据的比例面积。根据染色的密度和阳性率，将染色结果按0分至4分评分。重复该实验，计算平均值。

[000166]取决于组织样品和试剂的来源，此分析方法将需要对最佳参数进行判定。可被调整的参数包括但不限于，组织切片在载玻片上的粘附性、一抗的稀释度、与一抗温育的时间和温度，和与一抗温育后清洗的严格程度。

                            实施例4

                       GLUT8 mRNA水平的分析

[000167]本实施例描述了在确定肿瘤样品的GLUT8 mRNA水平中有用的葡萄糖转运蛋白分析。

[000168]应用治疗癌症患者过程中的常规方法，通过外科切除术或者肿瘤活组织检查，分离组织样品。分离即刻之后，将组织样品放置在明确标记的容器内并送至病理部门。在进行病理评价以评定肿瘤病理学特征并确认样品含有肿瘤细胞之后，将肿瘤细胞的一部分放置在标记好的容器内，在干冰上，送至实验室。

[000169]在4M硫氰酸胍中匀浆组织样品。应用Dynabeads mRNA纯化试剂盒(Dynal Biotech)，根据制造商的建议，分离Poly(A)RNAs。

[000170]通过在含有1％甲醛的1％琼脂糖凝胶上进行变性凝胶电泳，分离1-5μg的Poly(A)RNAs。通过毛细管作用，将分离的RNA转移到尼龙膜上(Hybond N+，Amersham Pharmacia Biotech，Braunschweig，Germany)。

[000171]采用随机寡核苷酸引导法(random oligonucleotide priming)，用DNA聚合酶I的Klenow片段和[α-³²P]dCTP，对GLUT8 cDNA进行放射性标记。在ExpressHyb杂交液(Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)中，于42℃杂交尼龙膜。

[000172]随后，用0.12M NaCl、0.012M柠檬酸钠、0.1％SDS，于55℃清洗膜2次，然后使膜被干燥并在磷成像板(phosphoimager plate)(Fugi Photo Film)上暴露过夜。重复该实验，计算平均值。

                              实施例5

                    GLUT12蛋白水平的免疫组织化学分析

[000173]本实施例描述了基于抗体的葡萄糖转运蛋白免疫组织化学分析，这在确定肿瘤样品中的GLUT12蛋白水平中是有用的。

[000174]在进行抗体结合的步骤之前，如实施例2所描述，获取并处理肿瘤组织样品。然后，在湿盒中，用抗GLUT12一抗(R1396)的1∶150或者1∶300的5％FBS/PBS稀释液温育载玻片(每一载玻片200μl)，4℃过夜。该兔多克隆抗GLUT12抗体，R1396，是针对人GLUT12独特的16个C-末端氨基酸培育出的(Rogers et al.，2002，″Identification of a novel glucose transporter-like protein-GLUT-12″Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.282：E733-E738)。

[000175]与一抗温育之后，用含有0.1％Tween-20的PBS清洗载玻片，然后与生物素化猪抗兔IgG(Dako，Carpinteria，USA)温育1小时。可以应用标准的过氧化物酶标记的链亲和素-生物素检测方法，来检测一抗。将生物素化的二抗应用于载玻片，室温30分钟。在PBS中清洗载玻片。然后在湿盒中，于室温应用链亲和素30分钟，再用PBS清洗载玻片。加入发色团(2.5ml PBS，1/4片3，3′二氨基苯联胺四盐酸(DAB)(Sigma，St.Louis，USA)和2滴0.8％过氧化氢)，在湿盒内室温温育载玻片10分钟。

[000176]然后，在ddH₂O中清洗载玻片5分钟，在Gill’s苏木精中复染色1分钟，并在流水中冲洗直至清澈。用0.25％的酸性酒精澄清细胞质(浸蘸3次)。然后，在连续的轻缓水流下冲洗载玻片并在1％氨水中蓝化10秒，随后在流水中清洗。

[000177]将载玻片脱水，方法为，在95％酒精中温育2次，每次浸蘸8-10次；在100％酒精中2次，每次浸蘸8-10次；和二甲苯中3次，每次浸蘸10-15次；应用Permount来施加盖玻片，用于光学显微镜观察。用Kodak Ectochrome speed 100胶片为载玻片照相。

[000178]记录下对具有膜染色的细胞的比例的半定量评价以及染色的密度。用于评价染色的标准是基于Southby等人描述的那些标准。应用连接于BX60显微镜(Olympus)和KY-F55B(JVC)彩色摄像机的计算机辅助图像分析系统KS-300(Zeiss)，可以计算出免疫活性蛋白占据的比例面积。根据染色的密度和阳性率，将染色结果按0至4分来评分。

                             实施例6

                            FDG-PET扫描

[000179]如Manda et al.Anti-cancer Res.(2003)23(4)：3263-72中所描述，应用18-F-氟脱氧葡萄糖(FDG)的正电子发射体层摄影术(PET)被用于确定患有胸食道SCC的患者的葡萄糖转运蛋白水平。该研究是在经历了外科手术前FDG-PET成像的患者中进行的。FDG-PET研究是应用具有59.5cm横轴视场(transaxial fieldof view)和20cm轴向视野(axial field of view)的SET 2400 W PET扫描仪(SchimazuCorporation，Kyoto，Japan)进行的，其产生63个图像面，面间相隔3.125mm。横轴FDG PET图像和冠状FDG PET图像与CT或者MRI的结果相联合，由核医学医师直观地解释。应用感兴趣的区域，评价节段中的FDG摄取，评价区域为4×4平方像素，其包括放射性最高的区域但不包含整个肿瘤。

                              实施例7

                           免疫组织化学分析

[000180]下面的分析可以被用于分析葡萄糖转运蛋白的表达。切取原发性肿瘤的切片，厚度为3-4mm，在二甲苯中脱蜡，并在递减梯度的酒精(100-70％)中再水化。用含有3％过氧化氢的甲醇溶液封闭内源性过氧化物酶活性。用蒸馏水和磷酸盐缓冲液冲洗数次后，用正常马血清的1∶10稀释液温育切片，以最小化背景染色。随后在室温下，与一抗(Chemicon GLUT1抗体)温育1小时。过氧化物酶染色程序是利用ABC Elite Kits(Vector Laboratories，Burlingame，Calif.)进行的。用3-氨基-9-乙基咔唑作为生色团，可看到免疫染色反应。用甲苯胺蓝染色切片和/或细胞离心涂片制备物，并用Permount固定。也制备了阳性和阴性对照免疫染色物。

[000181]由病理学技术人员评价切片。应用半定量标准，记录下该免疫反应的两个特征：阳性细胞的相对数目(0％、＜10％、10-50％和＞50％)和反应的强度(0-3)。分别记录下免疫染色的方式(膜染色、胞浆染色)。如果瘤细胞显示出细胞膜反应活性，则认为该肿瘤过量表达葡萄糖转运蛋白。

[000182]应用计算机图像分析，用整合了Windows软件的SAMBA 4000细胞成像分析系统(Cell Image Analysis System)(Image Products International，Inc.，Chantilly，Va.)，进行葡萄糖转运蛋白免疫染色的定量测定。强染色的肿瘤组织切片被用作阳性对照。用同工型-匹配的但不相关的抗体替代上述一抗，来建立阴性对照阈，将来自十个区域的结果平均化。

                            实施例8

    对细胞松弛素B敏感的葡萄糖转运蛋白的基于活性的葡萄糖转运蛋白分析

[000183]本实施例描述了基于活性的葡萄糖转运蛋白分析，这在确定肿瘤样品中细胞松弛素B敏感的葡萄糖转运蛋白的水平和活性方面，是有用的。

[000184]应用治疗癌症患者过程中的常规方法，通过外科切除术或者肿瘤活组织检查，分离组织样品。分离即刻之后，将组织样品放置在明确标记的容器内并送至病理部门。在进行病理评价以评定肿瘤病理学特征并确认样品含有肿瘤细胞之后，将肿瘤细胞的一部分放置在标记好的容器内，放在冰上送至实验室。

[000185]通过加入酶至下列终浓度：0.02％DNA酶、0.3％胶原酶和0.4％透明质酸酶，获得肿瘤细胞悬浮液，在37℃温育2小时。用PBS清洗细胞3次，使细胞穿过25号针3次。离心之后，用孵育缓冲液(15mM HEPES、135mM NaCl、5mM KCl、1.8mM CaCl₂、0.8mM MgCl₂)重悬浮细胞，并在此介质中室温孵育细胞30分钟。然后，在含有0.5mmol的2-脱氧葡萄糖和6μL的2-[1，2-³H]脱氧-D-葡萄糖(25-50Ci/mmol；NEN Life Science Products，Boston，MA)的0.5ml孵育缓冲液中，于常温进行摄取分析1分钟。用冰冷的PBS 10mL清洗细胞，终止葡萄糖摄取。

[000186]经离心收集细胞并用冷PBS清洗2次。然后，用0.5mL裂解缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.0，0.2％SDS)裂解细胞，通过液体闪烁计数来分析被整合进的放射活性。

[000187]重复实验并计算平均值。在扣除掉在平行样品中的非特异性摄取之后，计算出2-脱氧葡萄糖摄取，所述的平行样品是在10μmol/L细胞松弛素B存在的条件下进行孵育的，细胞松弛素B是葡萄糖转运蛋白的有效抑制物。针对平行样品中确定的细胞数目将结果标准化。

[000188]对于阴性对照，也从相同患者的健康器官中分离非肿瘤样品。可任选的阳性对照可以是，在已知表达高水平的GLUT4的组织中观察到的葡萄糖转运，所述的表达高水平的GLUT4的组织例如人肌肉组织和脂肪组织，或者应用全长GLUT4 cDNA转染的COS细胞培养物。

                            实施例9

        针对GLUT3水平进行的基于流式细胞术的葡萄糖转运蛋白分析

[000189]本实施例描述了基于抗体、基于流式细胞仪的葡萄糖转运蛋白分析，这在确定肿瘤样品的GLUT3蛋白的水平中是有用的。

[000190]应用治疗癌症患者过程中的常规方法，通过外科切除术或者肿瘤活组织检查，分离组织样品。分离即刻之后，将组织样品放置在明确标记的容器内并送至病理部门。在病理评价以评定肿瘤病理学特征并确认样品含有肿瘤细胞之后，将肿瘤细胞的一部分放置在标记好的容器内，放在干冰上，送至实验室。

[000191]应用胶原酶消化Ficoll梯度纯化方法，将样品分散为单细胞悬液。通过在室温(RT)以500×g沉淀30秒，在Dulbecco′s磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.6)中清洗细胞两次。然后，在室温用含有4％多聚甲醛的pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)固定细胞15分钟。将细胞在PBS中清洗3次，用含有3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS重悬浮，并以每管大约10⁵个细胞的密度，分装在1.5ml微量离心管中。

[000192]以1∶60的稀释比例，将抗人GLUT3一抗(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)加入每管，在4℃温育过夜。与一抗温育之后，通过在PBS中以500×g离心30秒，清洗细胞两次。在R-藻红蛋白标记的羊抗兔IgG(Fisher Scientific)中重悬细胞沉淀，4℃温育1小时，并偶尔振荡。通过在PBS中以500×g离心30秒来清洗细胞两次之后，将细胞重悬浮在500μl的PBS中。

[000193]采用流式细胞技术，在FACScan(Becton Dickinson)流式细胞仪上进行IgG结合的测定。装入细胞群以排除死细胞。取决于组织样品和试剂的来源，此分析方法将需要对最佳参数进行判定。可以变化的参数包括，一抗的稀释比例、与一抗孵育的时间和温度、与一抗孵育之后清洗的严格程度。确定每一样品中阳性染色的细胞的比例，并且可以和阴性对照样品比较。在一种实施方案中，流式细胞术的结果被显示为，细胞数目对染色强度(例如，转运蛋白的数目)，以及与调查人群相比较的样品分布。

[000194]尽管已经通过参考具体的实施方案，详细描述了本发明，但本领域的技术人员将认识到，其修改和改进包含在本发明的范围和精神之内，如在权利要求中所阐明的。本文引用的所有出版物和专利文献(专利、公开的专利申请和未公开的专利申请)通过引用方式并入本文作为参考，如同每一份这样的出版物或者文献都被具体地和分别地指出已并入本文作为参考。对出版物和专利文献的引用不是要承认任何这样的文献都是有关的现有技术，也不是构成关于其内容或者时间的任何认可。现在，已经通过书面的描述和实施例的方式描述了本发明，本领域的技术人员将认识到，本发明可以以各种实施方案被实施，并且前面的说明和实施例是为了说明的目的而不是对权利要求的限制。

Claims (23)

1.用于确定癌症对抗肿瘤药剂的治疗是否敏感的方法，其包括下列步骤：

(a)获取癌症的样品；

(b)测定所述样品中至少一种葡萄糖转运蛋白的水平；

(c)将所述水平与预先确定的值比较；和

(d)如果测定出的水平比预先确定的值高，则确定该癌症对该抗肿瘤药剂的治疗是敏感的。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的抗肿瘤药剂包含葡萄糖部分。

3.权利要求2所述的方法，其中所述的抗肿瘤药剂包含葡萄糖类似物部分。

4.权利要求3所述的方法，其中所述的葡萄糖类似物部分是果糖部分。

5.权利要求1所述的方法，其中所述的葡萄糖转运蛋白是I类GLUT。

6.权利要求1所述的方法，其中所述的葡萄糖转运蛋白是II类GLUT。

7.权利要求1所述的方法，其中所述的葡萄糖转运蛋白是III类GLUT。

8.前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中至少两种不同的葡萄糖转运蛋白被测定。

9.权利要求8所述的方法，其中至少一种I类GLUT、至少一种II类GLUT和至少一种III类GLUT的水平被测定。

10.权利要求1所述的方法，其中所述的抗肿瘤药剂是链脲菌素。

11.权利要求10所述的方法，其中所述的葡萄糖转运蛋白是GLUT2。

12.权利要求1所述的方法，其中所述的抗肿瘤药剂是glucofosfamide。

13.权利要求12所述的方法，其中所述的葡萄糖转运蛋白是Na⁺依赖型葡萄糖转运蛋白。

14.权利要求1所述的方法，其中所述的抗肿瘤药剂是糖基-S-亚硝基硫醇。

15.权利要求14所述的方法，其中所述的葡萄糖转运蛋白是GLUT1。

16.权利要求1所述的方法，其中所述样品中的葡萄糖转运蛋白的水平是通过免疫学分析被测定的。

17.权利要求1所述的方法，其中所述样品中的葡萄糖转运蛋白的水平是通过RNA或者cDNA的扩增被测定的。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述的癌症选自：白血病、乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、胰岛癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头部和颈部癌症、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、溃疡型鳞状细胞癌和乳头型鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、网状细胞肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺肿瘤、胰岛细胞癌、原发性脑肿瘤、急性和慢性淋巴细胞瘤和粒细胞瘤、毛细胞瘤、腺瘤、过度增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、肠神经节细胞瘤、增生性角膜神经瘤、类马伐氏症候群肿瘤、肾母细胞瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌肿瘤、子宫颈发育不良和原位癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌、局部皮肤病损、蕈样肉芽肿病、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、骨源性肉瘤和其它肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、腺癌、多形性胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、恶性黑素瘤和表皮癌。

19.权利要求18所述的方法，其中所述的癌症是胰腺癌。

20.权利要求19所述的方法，其中所述的癌症是胰岛细胞癌。

21.权利要求1所述的方法，其中所述的葡萄糖转运蛋白是GLUT2，所述的癌症是胰腺癌或者胰岛细胞癌，所述的抗肿瘤药剂是链脲菌素、glucofosfamide或者gluSNAP化合物。

22.用于确定对患者的化学治疗方案的方法，所述方法包括下列步骤：(a)诊断患者为患有癌症；(b)从所述患者获取癌症样品；(c)测定所述样品中葡萄糖转运蛋白的水平；(d)将在步骤(c)中测定的量与预先确定的值相比较；和(e)如果在步骤(c)中测定的量大于所述预先确定的量，则确定，该患者是用由所述葡萄糖转运蛋白运送的抗肿瘤药剂进行治疗的候选者。

23.用于确定癌症对抗肿瘤药剂的治疗是否敏感的试剂盒，所述试剂盒包括(a)试剂，其用于确定在癌症样品中一种或者多于一种的葡萄糖转运蛋白的水平，和(b)包括参照值的说明书。