CN108449963A - 单次注射竞争分析 - Google Patents

Abstract

这里公开了用于形成分散梯度的方法和在竞争分子存在下确定完全动力学和亲和性分析的SPR注射方法。所述SPR注射提供两个或更多个样品至SPR流槽和检测器的分散梯度。

Description

单次注射竞争分析

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请No.62/191151(2015年7月10日提交)的权益。

背景技术

生物传感器通常用于复杂分子相互作用如药物-靶标、激素-受体、酶-底物和抗源-抗体之间的那些相互作用的动力学研究。生物传感器通常为基于流动注射的流动系统，其中一个或多个感应区容纳在所述流动系统的流槽管道内。所述流动系统还定义了一个或多个引导流体流入流槽管道内的感应区的流路管道。所述感应区提供支撑通常称为“配体”的固定分子的表面。所述配体为称作“分析物”的分子的可能的结合配体，它们存在于经流路管道引入流槽管道的感应区内的流体中。通常，作为亲和对一方的配体被固定到感应区内的表面上，而作为另一方的分析物则暴露于该覆有配体的表面足够时间以在感应区内形成分析物-配体复合物。

竞争分析能够直接通过竞争片段击中对照分子而发现活性位点连接剂。这类分析通常应用表面等离子共鸣(SPR)来进行。但竞争分析通常需要多个步骤以确定竞争分子的完全动力学和亲和性数据。因此，分析是耗时和昂贵的。

发明内容

这里公开了用于在竞争分子存在下确定完全动力学和亲和性分析的单次SPR注射方法。所述单次SPR注射提供两个或更多个样品至SPR流槽和检测器的分散梯度。

部分地，本公开内容提供一种用于进行分散梯度注射以通过传感器进行分析的方法。所述方法提供将含一种或多种分析物的第一样品抽入样品保持管线、接着将含一种或多种分析物的第二样品抽入样品保持管线，从而形成所述第一样品和第二样品的分散梯度。随后，所述方法推动所述分散梯度通过流动管线至传感器。

另外，本公开内容提供一种用于进行两种分析物竞争结合分析的方法。所述方法通过将第一体积的第一分析物抽入样品保持管线和将第二体积的第一分析物也抽入所述样品保持管线来准备第一分析物的对照样品。所述对照样品通过内部有结合的配体的SPR传感器注射。在对照样品通过SPR传感器时，应用SPR分析测量对照样品中第一分析物与所述配体的结合相互作用，以产生结合相互作用曲线。所述方法还通过将包含第一分析物和第二分析物的样品抽入样品保持管线和接着将第一分析物的样品也抽入所述样品保持管线从而形成结合竞争分析分散梯度而准备结合竞争分析分散梯度。在准备结合竞争分析分散梯度之后，所述方法推动所形成的竞争分析分散梯度通过所述SPR传感器和测量所述竞争分析分散梯度与所述配体的结合相互作用以产生结合相互作用曲线。从所述竞争分析分散梯度产生的结合相互作用曲线中减掉所述对照样品产生的结合相互作用曲线，以确定在第一分析物存在下第二分析物与配体的竞争结合。

附图说明

图1为SPR测试系统图，该SPR测试系统可应用一些实施方案的流体输送系统。

图2示意性描述了适用于实施本发明方法的系统的一种构造。

图3为图2中应用的十端口阀的第一位置的示意图。

图4为图2中应用的十端口阀的第二位置的示意图。

图5图2中应用的四端口阀的第一位置的示意图。

图6图2中应用的四端口阀的第二位置的示意图。

图7A-7E以简化方式描述了所述流动系统和两组分梯度的产生。

图8描述的图线代表了根据本发明方法通过按1:1比组合蔗糖和缓冲液形成的梯度，其中蔗糖首先被吸入样品保持管线。

图9描述的图线代表了根据现有技术方法通过按1:1比组合蔗糖和缓冲液形成的梯度。

图10描述的图线代表了根据本发明方法通过按1:1比组合蔗糖和缓冲液形成的梯度，其中蔗糖最后被吸入样品保持管线。

图11描述的图线代表了根据本发明方法通过按2:1比组合蔗糖和缓冲液形成的梯度。

图12描述的图线代表了根据本发明方法通过按1:2比组合蔗糖和缓冲液形成的梯度。

图13描述的图线代表了通过首先吸入缓冲液、接着吸入所涉及的分析物和最后吸入附加缓冲液形成的梯度。

图14描述了根据本发明方法准备的CBS和呋喃苯胺酸的注射分散梯度的结合响应曲线，其中首先将分析物吸入样品保持管线和之后吸入缓冲液。

图15为缓冲液中蔗糖的浓度曲线，用于提供图14应用的结合模型中的浓度近似值。

图16为用于两种分析物结合相互作用竞争分析的CBS和呋喃苯胺酸的相对浓度。

图17描述了在结合相互作用竞争分析中通过分析物注射产生的结合相互作用分析。

图18描述了在呋喃苯胺酸存在下结合的CBS。

具体实施方式

SPR技术是本领域技术人员公知的和在这里不再详细讨论。以下公开内容集中于在单次注射中产生两种或更多种分析物的梯度分布的新手段和应用该产生分散梯度的改进方法对两种或更多种分析物进行竞争分析。可以应用基于感应系统的流动注射分析分散梯度。针对本公开的目的，将从表面等离子共鸣(SPR)的角度描述所述分散梯度分析。在通常用于生物分子相互作用分析应用的基于感应系统的流动注射中，至少包含分析物的样品通过流动注射流过表面感应检测器。在这种情况下，样品流过容纳SPR感应表面的SPR槽。

在以下描述中，在整个说明书和附图中相似部件分别用相同参考标记标注。附图不一定按比例和一些部件的比例已经放大以更好地描述本发明的细节和特征。术语“向内”和“向外”分别为朝向和远离所指部件的几何轴的方向。当应用相对公知设计的部件时，将不再详细讨论它们的结构和操作。

下面参考图1，其中图示了SPR测试系统100。流体注射系统或流体输送系统102包括流路、阀门、泵和/或其它元件的组合，构造所述组合来提供从多个流体源至流槽104基本恒定的流体流动。根据实施方案，流槽104可以在操作上连接至构造用来实施SPR测量的光学接口组件106。SPR光学接口组件是本领域已知的和可以包括薄膜光学底物、棱镜、照明器和检测器。

通常，可以构造流槽以保持SPR偶合表面与多个活性感应区(未示出)之间的电-光关系。通常衍生所述薄膜光学底物以使其具有能使生物分子(“配体”)固定于基质的涂层。所固定的生物分子通常具有用于一种或多种特定多肽、蛋白质、多核苷酸、激酶和/或其它小分子的结合特性。特定的亲和区域也可以被称为活性感应区。通常可以通过耐受上述一种或多种非特定结合的一个或多个连续区域将所述活性感应区分隔开。实验设计通常指定一个或多个活性感应区做参比感应区，其中在薄膜光学底物上对应的考察区内不固定生物分子。

活性感应区包含结合部分如从薄膜光学底物表面向上延伸进入流槽104内和流过其中的流体中的锚定蛋白质。如果流过流槽的分析物包含对特定活性感应区的结合部分具有亲和性的特定分子或生物分子，则所述分子或生物分子可以根据特征性的结合动力学与所述结合部分结合。所述分子或生物分子与活性感应区的结合改变了活性感应区附近体积的折射率。通常，使分析物作为恒定或固定浓度的均相体积片段通过流槽。但是，在现有技术中有其它已知方法，其中使所述分析物体积片段在流入流槽的途中用缓冲溶液或第三溶液分散，从而呈现出至活性感应区的分析物浓度梯度。例如参见美国专利公开US 2011/0295512和US 2013/0273564。

如果然后含分析物的其它样品或缓冲溶液流过流槽，且其它分析物或缓冲液不包含所述特定分子或生物分子，则根据特征性的离解动力学，所结合的分子或生物分子可以从活性感应区的结合部分离解出来。所述缓冲液通常为不包含分析物的接近中性pH或弱酸性或弱碱性的溶液。取决于所需的实验条件，合适的缓冲液通常为含HEPES、磷酸盐、TRIS和/或其它添加剂的盐溶液。

分子或生物分子从活性感应区中离解出来再次改变了活性感应区附近流体体积的折射率。通常，完全的离解可能会减小折射率至或接近初始结合前的初始折射率。在一些实例中，完全离解可能会经过非常长的时间和/或折射率可能不会完全返回其初始值。另外，一系列结合和离解可能会导致折射率的逐渐变化。当变化过大时，可能需要调整或再生所述薄膜光学底物的表面，以使其基本恢复其初始状态。

在感应表面需要再生的情况下，可以通过使洗涤流体如水、清洁剂和/或酸例如流过流槽而实施再生。这种再生通常可以恢复活性感应区附近的折射率至接近其初始值。例如，在再生期间，可以将水、清洁剂、酸或水、清洁剂和酸的序列组合注入流槽以脱除在离解结束后仍粘附于活性感应区的最顽强的分子或生物分子部分。

光学接口组件106可操作照射薄膜光学底物并检测反射光能的量的变化。同样，反射光能的量受分析物的分子或生物分子结合(或不结合)到活性感应区影响。

如上面所讨论，光学接口组件106通常包括构造用来照射薄膜光学底物的照明器。所述照明器可以包括多个操作以产生照射的离散和/或整合的组件。通常，使棱镜对齐以接收来自照明器的光并将其偶合至薄膜光学底物上。可以将光的一部分光子转化为表面等离子体。在一些SPR系统中，从薄膜光学底物上反射剩余光子，和构造棱镜以将它们偶合至检测器。可操作检测器来检测由薄膜光学底物整个表面反射的光子比例的变化，所述变化通常包括与整个分析物分子和/或生物分子部分结合到一个或多个活性感应区和从中离解相关的分量。通常，负载越高(即与特定分子或生物分子结合的结合部分活性位的比例越高)倾向于增加光子向表面等离子体的转化(和因此减少反射的光子数)，和负载越低倾向于减少光子向表面等离子体的转化(和因此增大反射的光子数)。

其它SPR系统通过追踪SPR浸入最小值检测等离子体发射角的偏移。分析物负载较高将导致发射角的增大。

控制器108可以操作性连接至流体输送系统102和光学接口组件106上，和可以包括至外部计算系统或网络110的接口。替代地，可以省略至外部计算系统或网络110的接口，和可以作为独立的系统操作设备100。可以应用控制器108控制照明器的输出，对检测器获得的图像进行图像处理，实施数据分析或将图像数据传输给外部处理器110进行图像处理，在内部组件和外部系统之间传输和接收状态和命令数据，通过键盘、显示器和/或其它状态指示器(未示出)提供人机接口，和控制流体输送系统102。具体地，所述流体输送系统可以包括带有电力控制接口的泵和阀门，和所述控制器108可以传输信号以操作流体输送系统102的泵和阀等。必要时，可以将控制器108操作连接至废物系统112上。

图2的系统为根据一些实施方案的流体输送系统102、流槽104和废物系统112的示意图。流体输送系统102包括构造用来泵送流体通过第一多端口阀300和第二多端口阀500通过流槽104的第一泵202和第二泵204。第一泵202和第二泵204均可以为如注射泵等的泵，如由Tecan推向市场的Cavro XLP6000注射泵或Cavro Centris注射泵。每个泵202、204均有分配阀203、205，从而构造用于泵送出入四个流动管线之一。通常，可以为第一泵202设置分配阀203，从而将缓冲溶液从缓冲罐206经过流动管线214泵送入泵的注射器和经过流动管线211、212和213之一泵送出来。因此，构造分配阀203，从而在任何时刻第一多端口阀300或第二多端口阀500的一个端口由泵202接收流体。在被引入第一泵202之前可以使来自缓冲罐206的缓冲溶液通过脱气罐208。

类似地，通常可以为第二泵204设置分配阀205，从而将缓冲溶液从缓冲罐206经过流动管线224泵送入泵的注射器和经过流动管线221、222和223之一泵送出。因此，构造分配阀205，从而在任何时刻第一多端口阀300或第二多端口阀500的一个端口由泵204接收流体。同样，在被引入第一泵204之前可以使来自缓冲罐206的缓冲溶液通过脱气罐208。对于分配阀203和205，可以应用任何合适的分配阀。

流动管线211和212流体连通第一泵202至第一多端口阀300。流动管线221和222流体连通第二泵204至第一多端口阀300。另外，第一多端口阀300通过流动管线232和234连接至接头230上。接头230也连接至流动管线236，后者使接头230与接头240流体连通。接头240操作性连接至探针244，后者可以由样品架246获得样品，或可以与洗涤站270流体连通。另外，接头240通过流动管线242与第二多端口阀500流体连通。因此，穿过接头240的流体流通过流动管线242在探针244与第二多端口阀500之间，或者通过流动管线236在探针244与接头230之间，这取决于泵202、204的操作以及其相联的分配阀设置。同样，穿过接头230的流体流通过流动管线232或者通过流动管线234在探针244与第一多端口阀300之间，这取决于泵202、204的操作以及其相联的分配阀设置。因此，第一多端口阀300可以通过流动管线232或者通过流动管线234接收来自探针244的流体(通常为样品)。另外，探针244可以通过流动管线232或者通过流动管线234接收来自第一多端口阀300的流体(通常为缓冲溶液)。最后，第一多端口阀300通过管线248与流槽104流体连通，这使其与废物选择器260连通。

流动管线213使第一泵202与接头254流体连通，后者通过流动管线256与第二多端口阀500流体连通。类似地，流动管线223使第二泵202与接头254流体连通，因此通过流动管线256与第二多端口阀500流体连通。因此，穿过接头254的液体流通过流动管线213和256在第一泵202和第二多端口阀500之间，或者通过流动管线223和256在第二泵204和第二多端口阀500之间，或者两个泵202、204之间，这取决于哪个泵在操作和其相联阀设置。

如上面所述，第二多端口阀500可以通过流动管线242与探针244流体连通。另外，第二多端口阀500通过流动管线250与第一多端口阀300流体连通，和通过流动管线252与流槽104流体连通。流动管线250可以包括分散回路251。通过流动管线252进入流槽104的流体与光学接口组件106的薄膜光学底物相互作用。应注意的是通过流动管线248进入流槽104的流体也可以与光学接口相互作用，这取决于废物端口的选择。

流槽104通过流动管线262、264、266和268与废物选择器260流体连通。因此，通过流动管线248或流动管线252进入的流体将被送至废物选择器260。下一步，废物选择器260通过流动管线272与洗涤站270流体连通。洗涤站270通过流动管线276也与废物贮存罐274流体连通。

根据一个实施方案，第一多端口阀300可以按图所示为两位的十端口阀，也可以为两位的八端口阀，从而如下所述取消了跨接流动管线321。图3为在位置A或第一位置301的第一多端口阀300的示意图。阀位置301连接五对端口。端口401经流路311与端口410连接；端口402经流路312与端口403连接；端口404经流路313与端口405连接；端口406经流路314与端口407连接；和端口408经流路315与端口409连接。另外，端口408经流动管线321与端口407相连。在简化形式中，如下端口连接于第一位置301：401-410、402-403、404-405、406-407、408-409。

在第一位置301，用作保持管线的流动管线211中的流体可以被第一泵202推动通过第一多端口阀300。流体在端口403处进入，和在端口402处流出。然后推动流体通过流动管线250至第二多端口阀500。另外，可以通过第二泵204将流体抽入用作保持管线的流动管线221。将流体抽入探针244并经过流动管线236和234经端口410进入第一多端口阀300和经端口401流出。由端口401将流体引入保持管线221。例如，流体可以包含分析物。另外，如下文进一步所述，可以推动缓冲流体通过第一多端口阀300。

图4为在位置B或第二位置302的第一多端口阀300的示意图。阀位置302连接五对端口。端口401经流路316与端口402连接；端口403经流路317与端口404连接；端口405经流路318与端口406连接；端口407经流路319与端口408连接；和端口409经流路320与端口410连接。如在第一位置301中那样，端口408经流动管线321与端口407相连。在简化形式中，如下端口连接于第二位置302：401-402、403-404、405-406、407-408、409-410。

在第二位置302，保持管线221中的流体可以通过第二泵204推动通过第一多端口阀300。流体在端口401处进入和在端口402处流出。然后推动流体通过流动管线250至第二多端口阀500。另外，可以通过第一泵202将流体抽入保持管线211。将流体抽入探针244并经过流动管线236和232经端口404进入第一多端口阀300和经端口403流出。由端口403将流体引入保持管线211。例如，流体可以包含分析物。另外，如下文进一步所述，可以推动缓冲流体通过第一多端口阀300。

在上文中，描述的多端口阀330具有10个通道；但是，很明显也可以是其它构造，比如可以操作所述阀使得一个通道用于两个不同的位置。例如，可以构造所述阀使得所述流路为旋转头上的五个槽，而电机使所述头在两个位置之间旋转。因此，将只有五个通道，每个通道的第一位置连接第一和第二端口和第二位置连接第二端口和第三端口。

根据一些实施方案，第二多端口阀500可以为所示的两位的四端口阀。图5为位置A或第一位置501的第二多端口阀500的示意图。阀的位置501连接两对端口。端口601经流路511连接至端口604上；和端口602经流路512连接至端口603上。在简化形式中，如下端口在第一位置501连接：601-604、602-603。

在第一位置501，引入流动管线213或流动管线223的缓冲流体可以分别由第一泵202或第二泵204推动通过流动管线256并进入第二多端口阀500。流体在端口601处进入和在端口604处流出以经过流动管线252引入流槽104。然后可以推动流体进入废物系统112。通常，所述流体为缓冲流体，用于在流槽104中清冼和离解。

图6为在位置B或第二位置502的第二多端口阀500的示意图。阀的位置502连接两对端口。端口601经流路513连接至端口602；和端口603经流路514连接至端口604。在简化形式中，如下端口在第二位置502连接：601-602,603-604.

在第二位置502，已经被推动进入流动管线256的保持管线211或保持管线221中的流体可以分别由第一泵202或第二泵204推动通过第二多端口阀500。流体在端口603处进入和在端口604处流出，以经过流动管线252引入流槽104。通常，所述流体为样品或分析物。

如同多端口阀300，多端口阀500可以具有不同的构造，从而具有少于所述的四个通道。多端口阀300、500的准确构造不是问题，只要它们各自具有第一位置和第二位置，在各位置中流动管线按如上所述流体连通即可。

图7A-7E提供了流体输送系统102的简化视图。这里提供的方法应用探针244将两种样品抽入样品保持管线213以提供改进的分散梯度，和随后推动所得的分散梯度通过SPR流槽104，所述SPR流槽中包含用于SPR结合分析的SPR感应区。因此，所述方法通过将第一样品抽入样品保持管线(图7B)、随后通过将第二样品抽入相同保持管线(图7C和7D)而形成浓度梯度。优选地，在将第一样品抽入保持管线之前，向所述样品保持管线中吸入气泡。两个样品立即相互接触，并立即开始向彼此中扩散(图7D)。因此，一个样品向另一个样品中扩散产生了各样品的分散梯度。正如图7E中所示，在将第二样品抽入样品保持管线之后，立即推动所得的分散梯度进入包含感应区的SPR流槽。因此，用于产生分散梯率的改进方法应用了两个步骤：将含缓冲液和/或分析物的样品抽入样品保持管线，随后在单个步骤中推动所得的分散梯度经过流槽管道进入SPR流槽104。这种方法在这里也称作用于准备分散梯度的抽-抽-推方法。注：虽然这里提供的讨论集中于两个样品的分散梯度，在推动所准备的分散梯度进入SPR流槽104之前可以在单一体积中将附加的样品抽入样品保持管线以形成附加的分散梯度。

抽入样品保持管线的每种样品的体积通常为约10-500μl。抽吸流率即将样品抽入样品保持管线的流率通常为约250μl/分钟，但是可以为约50-600μl/min。随后推动通过组合两种或更多种组分形成的分散梯度通常在注射流率为约10-200μl/min下进行。所得分散梯度的总样品体积由样品保持管线的大小限制。可以将样品按1:1或适合于待测试的分析物的其它比组合。

形成分散梯度的上述抽-抽-推方法可以用于准备分散梯度形式的单个分析物的本体折射率溶液，也可以用于准备适合于实施竞争结合分析的一种或多种分析物的分散梯度。

可以与这里描述的分散方法结合应用各种结合相互作用模型。例如，可以应用样品1:1拟一级动力学相互作用模型。该模型由描述感应区内亲合复合物浓度变化(dR/dt)的微分方程构成。

其中

R＝生物传感器响应(响应单位(RU))

R_max＝预期所有配体位点均被占据时的最大响应(RU)

C＝在感应表面分析物随时间变化的浓度(M)

k_a＝结合速率常数(m^-1s^-1)

k_d＝离解速率常数(s^-1)。

可用于确定所涉及的具体分析物/配体组合的结合相互作用参数的其它结合相互作用模型对本领域技术人员来说是熟悉的。

在上述相互作用的模型中，很明显结合相互作用的分析需要知道样品注入期间给定时间点处每种分析物的浓度。由于样品负载机理和经SPR槽104注射的分散梯度的抽-抽-推性质的复杂性，可能不太可能开发出梯度浓度曲线的准确数学模型。为了克服给定时间点确定精确分析物浓度的困难，本发明方法提供了如何产生估计的浓度曲线。

产生估计的浓度曲线应用在SPR感应槽产生本体折射率变化的等效液体样品体积和流率。该本体折射率溶液不与SPR感应区内应用的固定配体相互作用。因此，本体折射率溶液提供观察到的响应与浓度梯度之间的直接关系。为了进行结合分析，然后在结合方程式中应用由本体折射率液体测量的浓度曲线作为浓度值。

在一个实施方案中，用于在SPR感应槽处产生本体折射率变化的液体样品为通过混合缓冲液与蔗糖而形成的梯度。假定等体积的缓冲液和蔗糖，通过在缓冲液中分散蔗糖所形成的梯度浓度曲线将取决样品保持管线中缓冲液和蔗糖溶液的负载量级。

图8反映了初始向样品保持管线中吸入蔗糖随后吸入缓冲液所得的浓度曲线。图10反映了初始向样品保持管线中吸入缓冲液随后吸入蔗糖溶液所得的浓度曲线。如上所述，穿过SPR感应槽的样品装载方向与样品注射方向相对。图9描述了按现有技术方法准备的浓度曲线，其中样品回路首先被缓冲液填充，和将蔗糖的样品抽入样品保持管线。随后，迫使蔗糖进入样品回路的缓冲液中以产生分散梯度，然后输送至容纳有感应区的SPR槽。

与现有技术产生分散梯度的方法即推动分析物或样品进入第二分析物或缓冲液以形成分散梯度的方法相对比，本发明方法在向样品保持管线中吸入两种组分后立即形成分散梯度。因此，所公开的方法可以描述为分散梯度的抽-抽-推方法。具体地，本方法提供将第一样品抽入样品保持管线，随后接着将第二样品也抽入所述样品保持管线。最后，所述方法将所得的分散梯度推动进入容纳有SPR感应区的SPR槽104。在推动所得的梯度进入SPR槽104之前，可以将附加的样品抽入样品保持管线。

正如图8-9的表格所证实的，本发明方法改变了蔗糖分散梯度所得浓度曲线的斜率。正如上文所讨论的，图9的浓度曲线得自于传统的将蔗糖推入缓冲液和确定所得分散梯度的浓度曲线。图9的曲线反映了流过SPR槽的样品中蔗糖的初始零浓度。由图9反映的蔗糖浓度在很长时间段内保持为0。当斜率最终开始显示蔗糖通过SPR槽时，斜率很陡，很快过渡至蔗糖的高浓度。作为结果，浓度曲线对于结合相互作用模型方程式只能提供有限个数的数据点。与之相对比，由按本发明方法准备的蔗糖分散梯度即本体折射率溶液得到的浓度曲线使得可获得的用于结合相互作用模型方程式的数据点明显增加。因此，由图8反映的斜率变化表明从低浓度至高浓度有一个更长的过渡期，从而增加了SPR测量点的个数并改进了分辨率。

由抽-抽-推分散梯度方法为浓度曲线提供的改进在随后的结合相互作用曲线中也可以发现，因为由抽-抽-推方法准备的改进分散梯度在竞争结合分析期间也提供改进的分辨率。另外，由于不需要用缓冲液或第二分析物预填充样品回路，将缩短进行测试的总时间。相反，本发明方法只需要简单地向样品保持管线直接吸入即抽入含所涉及分析物的样品，并随后推动所得的分散梯度通过SPR槽。

图11和12提供了缓冲液与蔗糖不同比的浓度曲线。在图11中，图线反映了蔗糖溶液与缓冲溶液比为2:1且蔗糖溶液首先吸入样品保持管线的浓度曲线。图12反映了蔗糖溶液与缓冲溶液比为1:2且蔗糖溶液首先吸入样品保持管线的浓度曲线。

图13反映了本发明方法提供的另一选择。图13描述了当样品保持管线已经装载三种样品时的浓度曲线。在这种情况下，向样品保持管线装载只含缓冲液的样品，接着装载含蔗糖溶液的样品和接着最后装载只含缓冲液的样品。因此，如上面所讨论，装载入样品保持管线的物质数量只受保持管线的体积限制。但是，在大多数情况下，两种或三种目标分析物将是分析极限。

当准备本体折射率溶液和随后的分析物分散梯度时，填充样品保持管线的程序通常应用如下步骤：

1.注射泵202吸入气泡段，以将系统缓冲液与第一样品分隔开。通过用泵202经如下路径吸入而向系统装载第一样品：样品架246→探针244→管线242→管线256→管线213。

2.在吸入所需体积的第一样品后，将自动取样探针移动至含第二样品的样品架位置，此时在第一和第二样品之间不引入气泡或者其它分隔。然后沿与第一样品相同的路径吸入第二样品。

3.在吸入所需体积的第二样品后，将自动取样探针移动至初始位置，从而使针尖暴露于局部大气。泵202吸入附加体积的空气从而使第一和第二样品移入待注入流槽的位置处–也就是说，到达的位置点处只有少许安全体积保留在管线242中，而剩余量被抽入管线256和管线213中(～5μl)。

4.在该点处，使第一和第二样品分散入彼此中并形成梯度。

5.下面通过改变2/4阀500的位置将单个梯度片段注入流槽，从而泵202可以通过如下路线将梯度样品分散入流槽：管线213→管线256→管线252→流槽104。如上所述，泵202、样品保持管线和至流槽104的流槽管线在图7A-7E中以简化形式表示。

在这些步骤中应用的体积和流率按上文所讨论。

如果向样品保持管线中装载两种以上样品，如所描述的应用以上抽-抽-推程序。但是，在装载第二样品后，自动取样器将会移至下一个样品位置，和吸入即向样品保持管线中抽入附加样品。

如上面所讨论，应用前述方法准备本体折射率溶液将会提供改进的浓度曲线，该曲线适用作模型拟合随后的分析物分散梯度的参考点。这里公开的方法特别适合于竞争结合相互作用分析。

用于结合竞争分析的含分析物的样品的分散梯度准备方法遵循以上所讨论的相同抽-抽-推过程。下面参考图14-18讨论实施竞争分析的方法。

图14，线1反映了4-羰基-苯磺酰胺(CBS)的结合相互作用响应，和线2反映了呋喃苯胺酸的结合相互作用响应。结合相互作用分析应用具有感应区的SPR槽实施，其中结合的配体为通过胺偶合至～6500RU固定在生物传感器表面上的碳酸酐酶I I酶。呋喃苯胺酸的分散梯度应用200μl 1μM的呋喃苯胺酸溶液和100μl的磷酸盐缓冲的盐水(缓冲液)准备。根据上述方法，通过将呋喃苯胺酸初始吸入(抽入)样品保持管线，随后将缓冲液也抽入所述样品保持管线，准备分散梯度。以50μl/min的流率将所得的呋喃苯胺酸在缓冲液中的分散梯度立即注射(推动)经过含结合的配体的SPR感应区。应用200μl 2μM的CBS和100μl的缓冲液准备CBS的分散梯度。通过首先向样品保持管线中吸入CBS，随后将缓冲液也抽入所述样品保持管线，准备在缓冲液中CBS的分散梯度。以50μl/min的流率将所得的分散梯度立即注射经过含结合的配体的SPR感应区。

应用相同的技术准备和注射蔗糖(1.5％w/v)在PBS中的本体折射率溶液，从而提供如图12所示的浓度曲线。如上面所讨论，浓度曲线用于拟合结合相互作用模型与通过注射分散梯度经过SPR槽产生的结合结果曲线。正如本领域技术人员已知的，结合相互作用模型与结合响应曲线的拟合可以确定k_a、k_d和K_D。因此，图15证实了依据这里所公开的抽-抽-推方法准备分散梯度的有效性。

在已经确认能够准备适合于产生结合相互作用曲线的含分析物的样品的分散梯度之后，本发明方法能够提供用于实施竞争结合分析的快速低成本方法。实施竞争结合分析的方法适合于确定是否一种分析物阻止了另一种分析物与目标配体的结合还是增加了分析物的结合能力。

有关确定竞争结合分析的方法参考图16-18。图16反映了当实施竞争结合分析时分析物的相对浓度。在竞争结合分析中应用的分析物为呋喃苯胺酸和CBS。设计所述分析以确定在呋喃苯胺酸存在时CBS是否会与配体结合。

参考图16，在竞争分析过程中呋喃苯胺酸的相对浓度线1不发生变化。与之相对比，在竞争分析过程中CBS的相对浓度将随分散梯度增加。

图17的结合响应曲线通过注射两种样品产生。通过吸入第一体积的呋喃苯胺酸，随后吸入第二体积的呋喃苯胺酸，应用抽-抽-推方法准备注射的样品。将所得的呋喃苯胺酸溶液的对照样品注射通过SPR槽用于分析。所得的结合相互作用曲线在图17中由线2和4表示。呋喃苯胺酸溶液的这种注射是竞争分析物的对照注射，其证实了SPR槽内竞争分析物与配体的结合。在呋喃苯胺酸存在下CBS的竞争结合将用下一个梯度分散注射来确定。正如下文更为详细地讨论的，竞争分析物的对照注射是任选的。

在一个优选的实施方案中，第二分散梯度注射通过如下过程准备：吸入CBS/呋喃苯胺酸混合物的第一样品、随后吸入呋喃苯胺酸的样品，从而在两个样品间产生分散梯度。第二注射中吸入的顺序确保配体在遇到CBS之前先遇到呋喃苯胺酸。与第二分散梯度相关的结合相互作用曲线由线1和3表示。在这些条件下，如果在分析过程中CBS与配体结合，人们将预期结合响应曲线随CBS浓度的增加而增加。重复注射以证实该方法的再现性。在一个替代的实施方案中，单次的第二注射将足以定性确定在呋喃苯胺酸存在下CBS的结合。

为了确定第二注射中CBS的结合相互作用响应，人们由与利用CBS/呋喃苯胺酸注射的呋喃苯胺酸相关的结合相互作用曲线中减去只与呋喃苯胺酸相关的结合相互作用曲线。如图18所表示，差值曲线(线1和2)表明在这些条件下没有发生CBS结合。该结果在预料之中，因为这些分子都是磺酰胺和由两个分子上存在的磺酰胺官能团获得它们的亲和性。

在一个替代的实施方案中，当不应用竞争物的对照注射时，人们可以定性分析通过如下过程产生的结合相互作用曲线：抽入含分析物+竞争物的样品、随后抽入只含竞争物的样品以产生分散梯度和推动所得的梯度经过SPR槽。参考图17，线1和3反映了由这种分散梯度产生的结合相互作用曲线。这些曲线的初始结合相互作用只归因于竞争物，即呋喃苯胺酸。通过观察结合相互作用曲线的后一部分可以进行定性分析。如果曲线向上发展，则可以假定所测试的分析物对于结合相互作用有贡献，并因此与竞争物正向竞争。但是，如果按图17所示，在分散梯度通过SPR槽的时间内曲线基本保持稳态，则所测试的分析物如CBS不参加竞争和对结合相互作用没有贡献。因此，人们可以定性判断CBS在呋喃苯胺酸存在下不与配体结合。如上面所讨论，图18支持这一结论。

在又一个实施方案中，可以通过抽入目标分析物、随后抽入竞争物而准备分散梯度来推动所得的梯度进入SPR槽用于分析。在这些条件下，人们优选进行只有竞争物的对照注射，从而建立用于竞争分析物的基准结合相互作用曲线。

因此，用于产生分散梯度的改进方法特别适合于筛选与已知结合剂竞争的分子。竞争分析可以证实一种化合物被另一种所阻止，或在对照化合物存在下一种化合物的结合增强可以表明比对照本身更强的变构或协同结合或亲和性。针对机理特性筛选化合物或其它分析物的能力对于药品开发过程是有用的。

如下为进行竞争结合分析方法的简述。体积和流率均按如上所述。通常，抽入样品保持管线的每种样品均为约10-500μl。吸入流率即样品抽入样品保持管线的流率通常为约250μl/分钟，但可以为约50-600μl/min。随后推动组合两种或更多种组分形成的分散梯度通常以约10-200μl/min的注射流率实施。该方法应用含适当固定的配体的SPR槽，其中已经按结合所测试的分析物的能力选择所述配体。应用所公开的方法可以快速筛选多种竞争物种。

第1步：任选准备只含竞争分析物的对照样品。通过将竞争分析物的第一样品抽入样品保持管线、将竞争分析物的第二样品也抽入样品保持管线，并推动所得的溶液经过SPR槽，实施SPR分析以确定竞争分析物与SPR槽中结合的配体之间的结合相互作用。这种方法确保当产生对照结合响应曲线时注射竞争物和目标分析物的一致性。

第2步：通过将准备好的含目标分析物和竞争物两者的样品抽入样品保持管线、将含竞争物的样品抽入目标物保持管线，并推动所得的分散梯度经过用于利用SPR传感器分析的SPR槽，准备目标分析物和竞争物的结合竞争分析分散梯度和进行分析。记录SPR传感器对于竞争物和竞争物+分析物的分散梯度注射的响应的结合响应曲线。其为分析物结合响应曲线。

第3步-替代步骤：当所抽入的第一样品只含所涉及的分析物时进行分散梯度注射。所抽入的第二样品只含竞争分析物。记录SPR传感器对于所得分散梯度注射响应的结合响应曲线。

第4步：从分析物结合响应曲线中减去对照结合响应曲线，以产生参比分析物结合响应曲线。

第5步：确定在竞争物存在下分析物结合的效果。这可以通过测试在参比分析物结合响应曲线中结合响应是否超过一定的基准阈值来确定。超过所述阈值表明在竞争物存在下有分析物结合，而不超过所述阈值表明在竞争物存在下没有分析物结合。

对于本领域技术人员来说，本发明的其它实施方案是明显的。这样，上述内容只是使本发明方法能够实施和描述了本发明方法的一般应用。因此，以下权利要求定义本发明的实际范围。

Claims (10)

1.一种用于进行分散梯度注射的方法，所述方法包括：

将含一种或多种分析物的第一样品抽入样品保持管线；

将含一种或多种分析物的第二样品抽入样品保持管线，从而形成第一样品和第二样品的分散梯度；

推动所述分散梯度通过流动管线。

2.一种进行分散梯度SPR分析的方法，所述方法包括：

将含一种或多种分析物的第一样品抽入样品保持管线；

将含一种或多种分析物的第二样品抽入样品保持管线，从而形成第一样品和第二样品的分散梯度；

推动所述分散梯度通过流动管线至SPR槽。

3.一种进行分散梯度分析的方法，所述方法包括：

将第一气泡抽入样品保持管线；

将一定体积的第一样品抽入所述样品保持管线；

将一定体积的第二样品抽入所述样品保持管线；

使所述第一样品和所述第二样品分散入彼此之中，从而形成分散梯度；

推动所述分散梯度通过构造用于分析所述分散梯度的传感器。

4.一种用于进行两种分析物竞争结合分析的方法，所述方法包括：

通过将第一分析物的第一样品抽入样品保持管线、将第一分析物的第二样品也抽入所述样品保持管线而形成第一分析物的对照样品；

将所述对照样品注射通过SPR传感器，所述SPR传感器包含结合的配体；

应用SPR分析测量所述对照样品中所述第一分析物与所述配体之间的结合相互作用以产生结合相互作用曲线；

通过将含第一分析物和第二分析物的样品抽入样品保持管线、接着通过将第一分析物的样品抽入样品保持管线从而形成结合竞争分析分散梯度，准备结合竞争分析分散梯度；

推动所形成的竞争分析分散梯度通过所述SPR传感器；

测量所述竞争分析分散梯度与所述配体的结合相互作用，以产生结合相互作用曲线；

从所述竞争分析分散梯度产生的结合相互作用曲线中减掉所述对照样品产生的结合相互作用曲线，以确定在第一分析物存在下第二分析物与配体的竞争结合。

5.权利要求1、2、3或4的方法，其中抽入样品保持管线的每种样品的体积为约10-500μl。

6.权利要求1、2、3或4的方法，其中每种样品抽入样品保持管线的流率为约50-600μl/min。

7.权利要求1、2、3或4的方法，其中每种样品抽入样品保持管线的流率为约250μl/min。

8.权利要求1、2或3的方法，其中推动分散梯度的流率为约10-200μl/min。

9.权利要求4的方法，其中推动竞争分析分散梯度的流率为约10-200μl/min。

10.权利要求4的方法，其中推动对照样品的流率为约10-200μl/min。