CN102656464A - 具有改进混合的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是用于表征在液体环境中在溶液中的至少一种物质和固定在流动池表面的靶标之间的相互作用的方法。所述方法包括以下步骤：(a)激活流动池的表面，并将靶标固定在其上；(b)提供在液体流中的至少一种物质；(c)使包含至少一种物质的液体流通过含有固定化靶标的流动池表面；和(d)采用表面等离振子共振(SPR)技术检测至少一种物质和靶标之间的相互作用结果。所述方法的改进包括在步骤(a)或(b)的至少一个中，将至少两种液体溶液进行管道混合以产生混合溶液，然后使其通过流动池的表面。

Description

具有改进混合的分析方法
技术领域
本发明涉及用于改进对液体环境中分子相互作用的表征的方法和系统。更具体地讲，本发明涉及用于在SPR测定法前进行溶液的管道混合(inline mixing)的方法和系统。
发明背景
表面等离振子共振(SPR)是用于研究底物和靶标之间的亲和力的强有力的技术。应用SPR原理的仪器测定紧接传感器芯片的介质的折射率的变化，其是由表面上的质量浓度改变所引起的。
SPR广泛用于检测抗体和抗原(例如蛋白质)之间的相互作用。通常，采用胺偶联方法将针对待分析的蛋白质的抗体固定在传感器芯片上。使用EDC/NHS混合物，先将传感器芯片激活，所述混合物是不稳定的，因此必须在混合后相对快速地通过传感器芯片。目前，在缺乏先进的液体处理的仪器中，由操作人员在临测定前进行EDC和NHS的混合。这由于时间原因而引起活性降低。
SPR的另一种应用是免疫原性测定法。药物治疗有时引起对药物的抗体应答，这导致药效受到妨碍。因此，分析患者血清样品中这些抗体的出现很重要。在分析前，样品因此不得不被酸化以保持药物和抗体相分离。然后使样品通过具有固定化药物的传感器芯片。然而，酸性样品首先不得不被中和以便能够与传感器表面结合。在中和后，样品必须相对快地通过传感器表面，因为抗体开始与溶液中的药物重新结合。目前，中和步骤通常由操作人员在临测定前进行。这导致时间推移，造成测定结果的准确性降低。
SPR的又一种应用是某些样品的浓度分析。基于抗体的药物以非常高的浓度(mg/ml范围)纯化和制备，而且在可进行SPR测定法前，必须以非常高的程度稀释这些制备物。一种典型的应用是分析来自层析法的样品流分，其中pH或离子强度可能是极端的，同时浓度对于正常测定可能太高。因此，存在对以下方面的普遍需求：增加测定某些样品的动态范围，以及在一些应用中亦控制样品基质的pH和离子强度。
SPR技术和其它生物分析仪器通常利用在层流条件下工作的微流体系统。在层流中，混合一般是个问题，因为它需要复杂的流动通道特征或有效的混合元件。因此，存在对快速和容易进行的混合方法的需要，所述方法也极适于流动池应用。
发明简述
本发明涉及用于使SPR测定法的混合得到改进的系统和方法。因此，在第一个方面，本发明是用于表征在液体环境中在溶液中的至少一种物质(species)和固定在流动池表面的靶标之间的相互作用的方法。所述方法包括以下步骤：(a)激活流动池的表面，并将靶标固定在其上；(b)提供在液体流中的至少一种物质；(c)使包含至少一种物质的液体流通过含有固定化靶标的流动池表面；和(d)采用表面等离振子共振(SPR)技术检测至少一种物质和靶标之间的相互作用结果。所述方法的改进包括在步骤(a)或(b)的至少一个中，将至少两种液体溶液进行管道混合以产生混合溶液，然后使混合溶液通过流动池的表面。
在一个实施方案中，管道混合包括以下步骤：(1)将多室流动池置于一体化射流器(integrated fluidic cartridge, IFC)中；(2)将多路针和管模块(multiplex needle and tube block)与一体化射流器连接，其中在各针和连接管间形成管道，即IFC和流动池室的通道；(3)采用泵送装置将第一液体溶液吸入针中；(4)在不引入气泡的情况下，吸入第二液体溶液；和(5)任选重复步骤(3)和(4)；而第一液体溶液和第二液体溶液的混合在所述管道中发生，然后混合溶液到达流动池表面。优选所述步骤被计算机程序控制。
在第二个方面，本发明提供用于分析高度浓缩的样品物质的方法，所述方法包括对样品进行SPR测定法以表征物质和固定在流动池表面的靶标间的相互作用。该方法包括以下步骤：(a)激活流动池的表面，并将靶标固定在其上；(b)提供在液体流中的合适浓度的物质；(c)使包含该物质的液体流通过含有固定化靶标的流动池表面；和(d)采用表面等离振子共振(SPR)技术检测该物质和靶标间的相互作用结果。所述方法的改进包括在计算机控制下使高度浓缩的样品物质与缓冲液进行管道混合，产生用于步骤(b)的混合溶液。管道混合包括以下步骤：(1)将多室流动池置于一体化射流器(IFC)中；(2)将多路针和管模块与一体化射流器连接，其中将多路针中的针和管模块间隔开来，使得各针可达到标准多孔板的单独试剂孔(例如96孔板的孔)中，而且其中在各针和连接管间形成管道，即所述IFC和流动池室的通道；(3)使用泵送装置将缓冲溶液吸入针中；(4)在不引入气泡的情况下，吸入所需量的高度浓缩样品；和(5)在不引入气泡的情况下，吸入第二体积的缓冲溶液。高度浓缩样品的稀释在管道中发生，然后样品到达流动池的表面。
附图简述
图1是用于本发明一个实施方案的管道混合的注入和流动系统的示意图。
图2说明用于本发明一个实施方案的方法的注入和流动系统的变化形式。自动进样器台(auto-sampler table)表示为流动系统的部件。
图3是短程注入(short injection)原理的示意图。在实践中，在到达传感器芯片之前将两种试剂混合。
图4显示各自使用2 µl节段(segment)分别以(A) 10 µl/分钟和(B) 60 µl/分钟进行的运行缓冲液(HBS EP+)和水的管道混合的传感图。
图5分别显示某些节段体积和流速的平均混合水平的偏差。
图6显示以不同流速和节段体积采用管道混合的混合能力。
图7显示用于采用胺偶联方法固定人血清白蛋白的EDC和NHS的管道混合的结果。图7A：在包括EDC和NHS的管道混合的8个平行流动池的4个中得到的结果。图7B：包括EDC和NHS的手工混合的其它4个平行流动池中得到的结果。
图8是针对人血清白蛋白的固定化水平对图7描述的EDC和NHS的手工混合和管道混合之间的比较。
图9按照一个实例说明短程注入响应与样品体积极为相关。
图10是按照一个实例的A蛋白固定的传感器芯片上用显示本体响应(bulk response)的biatest溶液的两次注入和用Xolair抗体的两次注入的重叠曲线图。
图11显示一式两份的Xolair抗体结合的平均响应(A)和标准偏差(B)。所显示的是以1-1000 µg/ml的不同样品浓度、混合流速为10-60 µl/分钟、自25 µl/分钟到100 µl/分钟的接触时间流速和1-4 µl的注入体积进行的短程注入的Xolair抗体的结合水平。1000 µg/ml。
图12显示不同浓度的Xolair抗体通过短程注入的结合水平，但在最低浓度下精确度较低。
图13描绘了以不同浓度和样品体积短程注入Xolair抗体后响应的精确度。由2次测量计算各主题(staple)。
图14是显示0.25 µl样品注入(提供至少40倍稀释)的超短程注入提供线性响应的曲线图(图14)。虚线表示99%置信区间的极限。
图15 A和B显示泵波动试验的结果。用所采用的泵鉴定±4.5 µl/分钟的流速变化，其中10 µl/分钟和20 µl/分钟两者的最低流速与最高流速之间的频率约1 µl。
图16显示组合管道混合原理的示意图。(A)节段的吸入，(B)将样品分配入混合孔，(C)从混合孔吸入样品和注入混合样品。
图17显示缓冲液和15%糖各自的组合管道混合的传感图。
定义
对于本申请的目的，“物质”是任何实体，例如分子、化合物、材料、抗体、抗原、细胞、细胞片段或可在液体环境中提供的任何其它部分。为了可被检出，其应优选能够与另一种物质(或靶标)有某种相互作用，相互作用的结果可通过某种方法检测出。然而，当然的是，在某些情况下，分析物也许不与另一种目标物质相互作用，因此测不出确切的相互作用结果，但是这种结果的缺乏也可被检测出，因此这种类型的无相互作用物质也包括在物质的定义内。
发明详述
本发明的方法可根据标记的使用与各种检测系统一起使用，或者可优选为无标记的。优选检测用传感器例如生物传感器进行，在这种情况下，固相支持体表面是(生物)传感器的传感表面。
生物传感器广义上定义为使用与固态物理化学转换器或与同转换器结合的移动载体珠粒/颗粒直接结合的分子识别组分(例如具有固定化抗体的层)的装置。虽然这种传感器通常根据无标记技术检测固定层的质量、折射率或厚度的变化，但是也有依赖某种标记的生物传感器。用于本发明目的的典型传感器包括但不限于质量检测方法，例如光学方法和压电或声波方法，包括例如表面声波(SAW)和石英晶体微量天平(QCM)方法。代表性的光学检测方法包括检测质量表面浓度的方法，例如反射-光学方法，包括外部和内部反射方法两种，其可以是角度、波长、偏振或相解析的，例如隐失波椭圆光度法(evanescent wave ellipsometry)和隐失波光谱法(evanescent wave spectroscopy, EWS或内反射光谱法(Internal Reflection Spectroscopy))，这两种可包括通过表面等离振子共振(SPR)、布儒斯特角折射法(Brewster angle refractometry)、临界角折射法、受抑全反射(FTR)、散射全内反射(STIR) (其可包括散射增强标记)、光学波导传感器、外反射成像、基于隐失波的成像例如临界角解析成像、布儒斯特角解析成像、SPR-角解析成像等的瞬逝场增强。此外，可提及光度测定方法和成像/显微镜方法“本身“或与基于例如表面增强拉曼光谱法(SERS)、表面增强共振拉曼光谱法(SERRS)、隐失波荧光(TIRF)和磷光的反射方法的组合，以及波导干扰仪、波导漏出型光谱法(waveguide leaking mode spectroscopy)、反射干扰光谱法(RIfS)、传输干扰测量法、全息光谱和原子力显微术(AFR)。
现今，基于SPR和其它检测技术的生物传感器系统是市售可获得的。示例性的这种SPR-生物传感器包括上述BIACORE®仪器。BIACORE®仪器技术方面和SPR现象的详细论述可参见美国专利号5,313,264。例如美国专利号5,242,828和5,436,161给出了生物传感器传感表面基质涂层材料的更详细的信息。另外，与BIACORE®仪器联用的生物传感器芯片的技术方面的详细论述可参见美国专利号5,492,840。上述美国专利的全部公开内容通过引用结合到本文中。
在主要利用SPR的实例中对本发明进行了说明，这不应视为限制本发明的范围。
首先将给出用于Biacore®系统的SPR技术的概述。
在SPR中，测量了紧接传感器芯片的介质的折射率变化，其是由表面上的质量浓度改变引起的。信号以响应单位RU衡量，1 RU相当于大约1 pg/mm2表面浓度，在传感图中图示为时间的函数。用于本申请目的的术语中，与表面连接的分子称为靶标，而待分析的化合物是溶液中的分子(物质)。将含有化合物的溶液注入通常用羧甲基-葡聚糖基质包覆的表面，即传感器芯片，并通过连续流转运。该过程由自动化泵和样品机器人(sample robotics)的系统驱动。
在称为固定化的过程中，靶标与传感器芯片基质共价结合。最常应用的固定化技术是胺偶联，其中反应性酯通过羧甲基的修饰而被引入表面基质。这些酯然后与靶标上的胺和其它亲核基团自发反应形成共价键。共价偶联经受得住断裂靶标和化合物之间的化学键的条件(一种称为再生的过程)。因此同一表面可使用若干次。
在注入期间，化合物分子被连续转运至表面，并允许与靶标分子缔合。当注入停止时，缓冲液流洗掉解离的化合物。通过以下公式描述缔合相(对于1:1结合)：
dR/dt=k a C(R max -R)-k d R (1)
在平衡时得到响应为
R eq =kaCR max/(k a C+k d) (2)
而在解离期间为
dR/dt=-k d R 0 (3)
其中R表示在任何时间t的响应，Req表示在平衡时的响应，R0表示在注入结束时的响应，而Rmax表示表面的最大结合能力，以RU计。C是目的化合物的摩尔浓度。
因此在SPR测定法中第一个挑战与在表面准备用于胺偶联期间EDC/NHS混合物缺乏稳定性有关。EDC/NHS混合物不稳定，因此混合后必须相对快地通过传感器芯片。利用在中间没有气泡的脉冲串，通过使用本文所述管道混合来解决此。这使得有可能以非常简单的方式使靶蛋白或靶抗体的固定自动化。
因此，本发明的一个方面为可用于提供用于SPR测定法的至少两种溶液的管道混合的方法和系统。参照附图和附图说明可更好地理解本发明系统和方法的原理和操作。
现参照附图，图1以示图方式说明实施应用本发明的管道混合原理的方法的系统的部件。它包括注入系统，为了本发明的目的，其包括多室流动池(即传感器)、一体化射流器(IFC)、多路针和管模块以及待表征的液体在其中流过的管道和泵。它还包括流动系统，其包括试剂模块(reagent block) (即自动进样器台)。未显示用于检测至少第一种化合物和另一种物质(靶标)间的相互作用结果的传感器装置的其它部分。
管道混合通过以下步骤实现：(1)将流动池(例如多室流动池)置于一体化射流器(IFC)中；(2)使多路针和管模块与IFC连接，以在各针和接触管间形成管道，即IFC和流动池室的通道；(3)使用泵送装置将第一液体溶液从试剂容器中吸入针中；(4)在不引入气泡的情况下，从不同试剂容器中吸入第二液体溶液；(5)重复步骤(3)和(4)；而第一液体溶液和第二液体溶液的混合发生在溶液到达流动池的表面之前的管道中(图3)。优选将多路针中的针和管模块间隔开来，使得各针可达到标准多孔板的单独试剂孔(例如96孔板的孔)中。任选多路针和管模块包括8或12个被间隔开的针，使得各针可到达96孔板一行孔的各孔中。泵和/或阀用于使液流通过管道，并在控制单元的控制下从各试剂容器(孔)吸入液体。
因此，系统在软件控制下运行，软件呈直接加载到连接系统的处理器内存中的计算机程序产品形式。程序包括用于实施本发明方法的步骤的软件编码器(software code means)。
软件还可呈存储于计算机可用介质中的计算机程序产品形式，包括引起装置中的处理器控制本发明方法步骤的执行的可读程序。
该系统的一个实例提供垂直移动的多路针和管模块，而携带试剂板的流动系统的试剂模块水平移动。
该系统的略微变化见图2。
优选针由不锈钢制成。还优选各个针的直径为0.4 mm。示例性的泵送装置包括蠕动泵、注射泵或任何精确泵。
可在大范围的体积和流速内实现本发明的管道混合方法。在各步骤中，尽管将介于约0.1 μl-约10 μl的溶液吸入针，但实现有效混合。优选在各步骤中，将约0.25 μl-约4 μl的溶液吸入针中。还更优选在各步骤中，将约0.5 μl-约4 μl的溶液吸入针中。样品液体通过流动池的流速可为约10 μl/分钟-约100 μl/分钟、优选约10 μl/分钟-约20 μl/分钟，更优选约10 μl/分钟-约30 μl/分钟。在两种或更多种溶液在到达流动池之前在管道中移动时，实现有效混合。在通过流送管转运期间，通过控制节段大小和流速实现混合。
由图2可见，提供可以保持两个或更多个试剂板(架)的自动进样器台，所述试剂板分别装有不同的溶液，例如样品和缓冲液。用于吸入溶液的针以及试剂板受计算机程序控制，使得针可按需序贯和重复吸入所需溶液。
将针和管模块与一体化射流器(IFC) (一种能够向一个或多个流动池进行受控液体递送的装置)连接。各流动池具有传感器表面，一种或多种合适的靶标被固定在其上。流量受精确泵控制，借此可单调控制实际的流速以提供所需流速，范围为零流速至所需最大流速或其组合(图1)。
在这个方法中的第一步是将少量体积的第一溶液吸入针中，即将针浸入第一管，以及将适当体积吸入针中。然后，将针移至第二管，并吸入合适体积的第二溶液。实际体积可取决于应用和样品种类，并可在大范围内(比如0.1 μl和10 μl之间)变化。
样品的吸入将导致样品和缓冲液通过层流中的抛物线型水面线(parabolic flow profile)混合，并在管道中分散。
因此在一个实施方案中，该系统适用于对EDC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺HCl)和NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)进行管道混合用于传感器表面准备。混合在液体到达传感器表面之前在管道中完成。如下面实施例中所示，这个过程仅花几秒钟(少于约1-2分钟)，避免了混合物不稳定的问题。因此提供用于准备表面用于胺偶联的自动化过程。
在另一个实施方案中，该系统和方法总的来说适于任何两种或更多种液体溶液的管道混合。当至少一种溶液含有至少一种化学不稳定成分时，优选该方法特别有用。因此，该方法的一种应用涉及测定流体样品中分析物的总浓度的方法，其中分析物至少部分可作为具有分析物结合物质的复合物存在，通常作为免疫复合物存在。
在这种情况下，首先使样品经历使样品中存在的任何复合物解离(通过降低分析物和分析物结合物质之间的结合亲和力)的条件(通常通过将解离剂(dissociating agent)加入样品中)，使得所有分析物呈游离形式。然后使样品经历恢复结合亲和力的条件，并且基本上在分析物的任何实质性重新复合发生之前，立即测定样品中的游离分析物浓度，优选通过其与分析物特异性配体结合来测定。
样品可以是含有或疑似含有至少部分呈复合物形式的目标分析物的任何样品。然而，样品通常是哺乳动物(优选人)的血清或血浆样品，复合物是免疫复合物(即抗原-抗体复合物)。
分析物可以是例如因响应药物(例如蛋白质药物)而诱导的抗体，例如治疗性抗体。
本文所用术语“抗体”是指免疫球蛋白，其可以是天然的或者部分或完全合成产生的，还包括活性片段，包括Fab抗原结合片段、一价片段和二价片段。该术语还包括具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任何蛋白质。这类蛋白质可来源于天然来源，或者是部分或完全合成产生的。示例性抗体是免疫球蛋白同种型和Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、dAb和Fd片段。
可能需要解离以允许测量分析物的其它分析物-复合物(通常为蛋白质-复合物)的实例包括PSA (前列腺特异性抗原)，PSA是很大程度上呈复合物形式的蛋白质，对其感兴趣的是能够测定复合物的比例。在血液中，约70-90%的PSA呈与α-1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物，但是还已知PSA与例如C蛋白抑制剂、α-1-抗胰蛋白酶和α-2-巨球蛋白形成复合物。游离PCA与总PCA的比率可能是前列腺癌的有用标志物，但是目前没有可用来检测与α-2-巨球蛋白的复合物的抗体，PSA被复合物中的α-2-巨球蛋白完全封闭(Balk等(2003) J. Clin. Oncology 21，383-391)。据推测其它蛋白质复合物可能也是这种情况。
可以采用各种试剂和条件完成含有分析物的复合物的解离。例如，免疫复合物可被酸性试剂或碱性试剂解离，所述酸性试剂或碱性试剂分别使复合物处于低或高pH条件下。然后可通过使酸化或碱化样品置于大致中性pH中来实现分析物结合活性的恢复。其它试剂和条件包括例如离液序列高的盐、高或低离子强度的有机盐。
本发明实施方案的一个基本特征是大致在例如通过中和酸化或碱化样品对样品进行处理以恢复结合能力(与配体以及与复合物质的结合能力)后，立即能够测量分析物浓度。所谓“大致立即”意指分析物的重新复合(尤其取决于所用的分析物、复合物质和测定装置)不应发生至任何相当可观的程度的时间。另一方面，必须提供足够时间以在进行测量前基本完成恢复分析物结合能力的样品处理，例如中和(这尤其取决于所用试剂和测定装置)。然而，找出各个特定测定系统用于测量的最佳时间在本领域技术人员能力范围内。优选当对分析物浓度进行测量时，不超过约5%，更优选小于约1%的分析物可呈复合物形式。
还可通过亦在无复合物解离的情况下测定分析物浓度，来测定样品中游离分析物与复合物结合的分析物的比例。
优选包括具有固定化分析物特异性配体的传感器表面的多相测定系统(heterogeneous assay system)用来通过直接或间接检测分析物(直接测定，包括夹心测定法或置换测定法)或可检测的分析物类似物(竞争测定法)与表面结合的量，来测定分析物浓度。
在分析物是抗体的情况下，固定化配体可以是抗原。另一方面，当分析物是例如PSA时，固相支持体表面可具有例如抗PSA，还优选具有α-1-抗胰凝乳蛋白酶、C蛋白抑制剂、α-1-抗胰蛋白酶和α-2-巨球蛋白固定在其上。
基于本发明构思的多相测定法还可用于所谓的配体垂钓(ligand fishing)。例如，假定感兴趣的是了解体内与特定蛋白质结合的是哪些物质(例如蛋白质)。然后，可将特定蛋白质固定在传感器表面，在表面被处理以首先解离复合物，然后恢复相互作用物质的结合亲和力后，立即使含有特定蛋白质的样品(例如细胞提取物或血浆)与表面接触。(在不如此处理样品的情况下，如果全部或几乎全部结合蛋白质会早与样品中的特定蛋白质结合，则会无法达到或极少达到结合蛋白质与表面结合)。然后，可通过例如质谱法，鉴定与固定在表面上的特定蛋白质结合的一种或多种蛋白质。
如上所述，重要的是，基本上在处理样品以恢复分析物的结合能力后立即使样品与固相支持体表面或检测区接触。应选择检测区与针之间的距离和流体流速，使得当混合流体到达固相支持体区时，分析物的结合能力基本上恢复，例如酸化样品基本上被碱性流体中和，但分析物的重新复合基本上未发生。
在另一个实施方案中，用于管道混合的系统和方法可用于高度浓缩样品的浓度分析。准确地讲，将高浓度样品按所需比率与缓冲液进行管道混合，对混合物进行SPR型测定法。该方法特别适于含有高盐或低pH的样品的分析。正如预期一样，发现响应水平主要受样品体积和接触时间控制。样品吸入和混合流速并非如此关键。受测样品体积显示与SPR响应呈线性关系，相对精确度为5-10% CV。控制稀释因子介于5-100倍之间、例如介于5-40倍之间是可行的。精确度受蠕动泵性能限制。通过使用更准确的泵例如活塞操作泵，可改进精确度达至少10倍。因此，在Biacore或相关SPR系统中，短程注入可用于样品的同时自动化稀释和浓度分析。
在这个实施方案的情况下要注意的是，只以一小节段吸取样品，且样品通过运行缓冲液自动稀释。它具有以下两个功能；1)使样品浓度降低，和2)如有需要，可改变样品基质(溶液)成适于结合分析的溶液。一种典型应用是层析法的样品流分分析，其中pH或离子强度可能是极端的，同时对于正常测定法浓度可能太高。
在采用Biacore系统的SPR测定法中，结合率通常为5-10 (RU/s)/(µg/ml)，结合能力通常为1000-5000 RU。这意味着对于1 mg/ml浓度的样品，该测定法在0.1-1 s的样品暴露下完全饱和。在Biacore系统中，流速在10-100 µl/分钟的范围内，使得在1秒钟期间在传感器表面转运的实际体积在1 µl范围内。在现有技术系统中，样品的接触时间需要降低至十分之几毫秒，而且需要处理亚微升体积，这在大多数射流系统中具有精确度是不可能的。
本发明通过使用这样的针来解决该问题，所述针可处理很小的体积，通过管道混合稀释样品，并在短时间内暴露传感器表面。这通过非常简单却完全自动化的装置来实现。它只需要流送管、检测流动池和泵。流送管需要比样品体积大得多的内体积。在亚微升样品体积的情况下，内体积优选的体积大于1 µl。
吸入样品作为前后两处接触运行缓冲液的节段。通过层流中的抛物线型水面线和扩散，样品节段被运行缓冲液稀释。经由在通过流送管转运期间控制节段大小和流速，控制稀释度，并通过控制样品暴露于传感器表面时的流速，控制接触时间，从而控制结合水平。
虽然这是利用Biacore系统予以描述的，但是该方法同样适用于具有先进微射流器(IFC)优势的其它仪器。
实施例
本文提供的本实施例仅用于说明目的，不应理解为对由随附权利要求书限定的本发明的限制。
实施例 1. 构思验证—水和运行缓冲液的混合
在Biacore Q100仪器(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)中进行了水(试剂B)和运行缓冲液(试剂A；0.01 mM HEPES、0.15 M NaCl、3 mM EDTA和0.05% v/v表面活性剂P20，pH 7.4)的管道混合作为原理证明。
下面是在Biacore Q100和类似仪器中产生混合的简单的MDL代码。这同样适用于其它实施例。
FLOW 0
WAIT %pumpwait
POS %pos_reagent1
FLOW %FLOW
WAIT %segtime
FLOW 0
WAIT %pumpwait
POS %pos_reagent2
FLOW %FLOW
WAIT %segtime
混合区为15-18 µl，其是从针尖到传感器表面的死体积。实施例有分别7节段的试剂A和试剂B。当自动进样器自A移动至B时，样品泵停止，这个停止时间为约2-3秒钟。然后对于7.5-9次泵停止，以10 µL/分钟的混合时间为1.5-1.8分钟加约24-27秒钟，以60 µl/分钟的混合时间为0.25-0.3分钟加约24-27秒钟。当然较快的自动进样器可将该速度加得更快。图4显示结果。分别以(A) 10 µl/分钟和(B) 60 µl/分钟，各自使用2 µl节段对运行缓冲液(HBS EP+)、试剂A和水、试剂B进行混合。在不同流速和节段大小下的混合表明以从10 µl/分钟至60 µl/分钟的流速和多达2 µl节段的精确度良好。正如预期一样，低流速下的较大节段混合不佳(参见10 µl/分钟下的4µl节段)，图5。理想的是，预期混合能力为50%。所得结果非常接近50%，图6。
实施例 2. 人血清白蛋白的固定
采用包括EDC和NHS的管道混合的胺偶联方法，在8个平行流动池的4个中将人血清白蛋白固定，参见图7A。在其余4个流动池中按相同运行，进行了EDC和NHS的手工混合，参见图7B。对于HAS的固定，除混合以外的所有步骤都相同。对于管道混合，节段(21)具有EDC和NHS，按10 µl/分钟各为2µl，接触时间为9分钟。在10 mM乙酸盐缓冲液(pH 5.0)中的HSA浓度为17 µg/ml。运行缓冲液为HBS EP+。手工混合试剂和管道混合试剂之间的固定化水平几乎相同，管道混合略有利，且流动池间的变化非常小，参见图8。(传感图显示SPR响应记录为时间的函数。该图显示采用胺偶联方法的HSA固定的典型传感图。如图上部所示，通过在缓冲液、样品和试剂溶液间转换，在整个实验中在传感器表面保持连续流。每次注入开始和结束时响应的瞬时变化，由自运行缓冲液引入至各注入溶液的小气泡引起。固定化水平是传感图的起点和传感图的终点之间的差异)。
实施例 3. 浓度分析
1. 材料与方法
1.1. 材料：
Figure 2010800587504100002DEST_PATH_IMAGE001
1.2. 方法：
1.2.1. 固定化
活化 9分钟，使用EDC/NHS的管道混合(活化步骤与实施例2相同)；
固定化 7分钟，用10µg A蛋白/ml固定缓冲液；
钝化 7分钟。
1.2.2. 短程注入
注入非常少的样品节段0.25-4 µl，其与前面的运行缓冲液无空气节段分隔。由此，在至流动池的15-18 µl运送体积内，样品在运行缓冲液中稀释(混合)。因此在无手工稀释的情况下对样品进行分析。在传感器芯片上的混合时间和接触时间受流速设置控制。短程注入原理略图见图3。
2. 结果
2.1.1. 固定化
A蛋白的固定化产生4332 RU固定化A蛋白。
2.1.2. 短程注入
2.1.2.1. 不同的样品浓度
图9显示短程注入响应与样品体积极为相关。用1000µg/ml抗体所得响应因高浓度的样品所致而最接近Rmax，因此不是线性的。使两个流动池平行运行，流动池之间的响应合理地类似。接触流速为100µl/分钟。混合和样品吸入流速为10µl/分钟。
在不考虑吸入样品时的泵波动的情况下，介于10 µl/分钟和60 µl/分钟之间的混合流速不影响样品的混合(数据未显示)。
图10中，以用仅显示本体响应的Biatest溶液样品的两次同样注入，和用显示与传感器芯片的结合的Xolair抗体的其它两次同样注入的重叠曲线图，阐明短程注入。Biatest溶液的本体响应表示样品的实际接触时间和在该接触时间内样品的浓度概况。还显示了样品被稀释达约5倍，其在biatest溶液的峰值响应处测得(22500 RU/4300 RU = 5.2倍稀释度)。样品节段为2 µl，混合流速为30 µl/分钟，接触流速为100 µl/分钟。
图11显示一式两份的结合的Xolair抗体的平均响应和标准偏差。所显示的是以自1µg/ml到1000 µg/ml的不同样品浓度，混合流速为10-60 µl/分钟，接触时间流速为25µl/分钟至100 µl/分钟和注入体积为1-4 µl进行的短程注入的Xolair抗体的结合水平。1000 µg/ml。
可通过短程注入测定介于1000µg/ml和1µg/ml的浓度(为4个数量级)，但是在最低浓度下精确度较低(图12)。采用短程注入在运行缓冲液中稀释的Xolair抗体的结合。各主题是两次测量的平均值。以不同的浓度和样品体积短程注入Xolair抗体后响应的精确度见图13。从2次测量中计算各主题。
2.1.2.2. 析因实验
目的是找出对短程注入的结合水平和结合水平的变化影响最大的参数。设计中的4个参数变化简化至6个重复的10次实验。
参数是：
1. 样品吸入流速。
2. 混合流速。
3. 接触流速。
4. 样品体积。
5. 流动池(额外参数自由)
响应是：
1. 抗体的结合水平RelResp RU
2. 结合抗体的标准偏差(Stdev) RelResp RU
3. 结合抗体的相对标准偏差CV%
A 蛋白固定的结果
注意：钝化在单独运行中进行。因此，第一轮的基线绝对响应和第二轮的绝对响应用来计算固定水平。
如表1所示，所有流动池用A蛋白固定。
表1：A蛋白的固定水平
Figure 441982DEST_PATH_IMAGE002
短程注入 . 运行顺序和结果
表2显示析因实验的运行顺序和结果。实验表明，接触流速和样品体积控制响应水平，并且混合流速和吸入流速对响应水平和响应的变化具有较小作用。实验还表明，接触时间和样品体积与响应水平成正比。精确度在5%CV和10%CV之间变化。
表2. 简化析因实验的设计与结果。n=6
运行顺序 包括/不包括 样品吸入流速 混合流速 接触流速 样品体积 抗体应答平均fc和周期 抗体应答SD fc和周期 抗体应答CV% fc和周期
1 包括 15 105 150 3 896 93 10,4
2 包括 60 70 150 2 648 56 8,7
3 包括 15 35 50 3 1760 96 5,5
4 包括 15 70 100 3 1137 74 6,5
5 包括 30 105 50 2 1141 69 6,1
6 包括 30 35 100 2 836 76 9,1
7 包括 30 70 150 2 622 50 8,1
8 包括 30 70 100 2 794 39 5,0
9 包括 60 105 100 1 436 45 10,2
10 包括 60 70 50 3 1713 104 6,1
2.1.2.3. 超短程注入
通过进行自1.5µl到0.25 µl一系列体积递减的Biatest溶液注入和每个体积9个重复，测定了使用小样品体积的极限。对于样品吸入流速、混合流速和接触流速的流速参数分别为15、35和50µl/分钟。计算了平均峰值相对响应(average peek relative response)、标准偏差和CV%。通过打开BIACORE T100评价软件(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)中的结果文档查寻峰值响应。
查找各响应栏的最大值。该相对峰值响应被假定为最小稀释因子，并将它与相对响应为22 500 RU的未稀释的Biatest溶液进行比较。
在表3中，表明了1.5µl样品产生7倍稀释，其相对标准偏差(CV%)为5%。小于1.5 µl的样品体积产生约10% CV。在z周期之间的响应变化大于在流动池之间的响应变化。这通过蠕动泵的功能来解释。
表3. Biatest溶液的短程注入。样品体积以µl表示。峰值响应和标准偏差表示为RelResp(RU)。稀释因子是Biatest溶液的RelResp (22500 RU)除以峰值响应的RelResp。
Figure 2010800587504100002DEST_PATH_IMAGE003
稀释因子线性下降至40倍稀释(图14)。Y轴是所有流动池和周期的总体平均响应，X轴是在表3用µl表示的样品体积。虚线表示99%置信区间的极限。
2.1.3. 流速波动
为了理解短程注入的峰值响应的变化，查看由蠕动泵引起的实际流速波动可提供帮助。测定了泵波动。
使用流速计测量流速。测定了10和20 µl/分钟的标称流速。短程注入的吸入流速为15 µl/分钟。在图15 A和B中显示了有±4.5 µl/分钟的流速变化，对于10和20 µl/分钟的最低流速与最高流速两者之间，频率约为1 µl。可吸入的体积为吸入时间内的积分体积。在当吸入0.25 µl时的最坏情况下，如果选择三个3乘以标准偏差= 99%置信区间，则可在0.17-0.33 µl或±30%之间变化，其与表3所示结果极相关。然而，对于较大吸入体积，变化将相应减少。
总之，在Biacore Q100中，短程注入可用于样品的同时自动化稀释和浓度分析。在该设置中，可将样品稀释高达40倍。虽然在稀释超过10倍时，变化相对高，但更准确的泵可有助于减轻这种情况，例如使用注射泵或任何更准确的泵。
实施例 4. 构思验证— 15% 糖和运行缓冲液的组合管道混合
材料与方法
1.1 材料
1.2. 方法
在本实施例中，分别以120 µl/分钟吸入27乘以2 µl节段的试剂A和B，导致总的混合物体积为114 µl。作为第一步通过引入3 µl空气节段来进行运行缓冲液的间隔。以1000 µl/分钟的强制流将92 µl的部分分配回到单独的混合孔中。其余的22µl停留在管道中。通过以15 µl/分钟立即注入25 µl混合样品，来测定混合性能(分配泵以30µl/分钟运转，流动泵以15 µl/分钟运转)。(图16)。
2. 结果
表4中显示，组合管道混合的精确度非常好，且达到目标混合水平。结果亦示于图17。通过这种新的组合管道混合方法混合的样品是均质混合的。
表4. Biatest溶液和运行缓冲液的组合管道混合。注入混合溶液的本体响应和标准偏差表示为RelResp(RU)。稀释因子是Biatest溶液的RelResp除以混合样品响应的RelResp。
Figure 2010800587504100002DEST_PATH_IMAGE005
所有专利、专利出版物和本文提及的其它出版的参考文献通过引用以其整体结合到本文中，就像各自单独和明确地通过引用结合到本文中一样。虽然描述了本发明的优选的说明性实施方案，但本领域技术人员应理解的是，可通过所描述的实施方案以外的实施方案实施本发明，所描述的实施方案仅以说明目的提供而非限制。本发明只受随附权利要求书的限制。

Claims (18)

1.一种表征在液体环境中在溶液中的至少一种物质和固定在流动池表面的靶标之间的相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：
(a) 激活所述流动池的表面，并将所述靶标固定在其上；
(b) 提供在液体流中的至少一种物质；
(c) 将包含至少一种物质的液体流通过含有固定化靶标的流动池的所述表面；和
(d) 采用表面等离振子共振(SPR)技术检测至少一种物质和靶标之间的相互作用结果；
改进包括：在步骤(a)或(b)的至少一个中，将至少两种液体溶液进行管道混合以产生混合溶液，然后使其通过所述流动池的表面。
2.权利要求1的方法，其中所述管道混合包括以下步骤：
(1) 将多室流动池置于一体化射流器(IFC)中；
(2) 将多路针和管模块与所述一体化射流器连接，其中所述多路针和管模块中的针被间隔开来，使得各针可达到标准多孔板的单独试剂孔例如96孔板的孔中，而且其中在各个所述针和连接管间形成管道，即所述IFC和流动池室的通道；
(3) 使用泵送装置将第一液体溶液从试剂容器中吸入针中；
(4) 在不引入气泡的情况下，从不同试剂容器中吸入第二液体溶液；和
(5) 任选重复步骤(3)和(4)；而在混合溶液到达所述流动池的表面之前发生第一液体溶液和第二液体溶液的混合。
3.权利要求2的方法，其中所述步骤被计算机程序控制，并且多路针和管模块垂直移动，而携带所述试剂容器的试剂模块水平移动。
4.权利要求1的方法，其中所述混合溶液含有至少一种化学不稳定成分。
5.权利要求1的方法，其中管道混合用于步骤(a)中以将用于抗体与流动池表面的胺偶联的EDC和NHS混合。
6.权利要求1的方法，其中在步骤(b)期间，对含有酸化抗体的溶液和高pH溶液进行的管道混合使抗体中和，然后使所述抗体与流动池表面上的所述靶标进行结合相互作用。
7.权利要求2的方法，其中所述多路针和管模块含有间隔开来的8或12个针，使得各针可到达96孔板一行孔的独立孔中。
8.权利要求2的方法，其中所述泵送装置是蠕动泵或注射泵。
9.权利要求2的方法，其中每个吸入步骤吸取约0.1 μl-约10 μl的溶液。
10.权利要求2的方法，其中每个吸入步骤吸取约0.25 μl-约4 μl的溶液。
11.权利要求2的方法，其中每个吸入步骤吸取约0.5 μl-约4 μl的溶液。
12.权利要求2的方法，其中所述液体通过流动池的流速为约10 μl/分钟-约100 μl/分钟。
13.权利要求2的方法，其中所述液体通过流动池的流速为约10 μl/分钟-约60 μl/分钟。
14.权利要求2的方法，其中所述液体通过流动池的流速为约10 μl/分钟-约30 μl/分钟。
15.一种用于分析高度浓缩的样品物质的方法，所述方法包括对样品进行SPR测定法以表征所述物质和固定在流动池表面的靶标之间的相互作用，所述方法包括以下步骤：
(a) 激活所述流动池的表面，并将所述靶标固定在其上；
(b) 提供在液体流中的合适浓度的所述物质；
(c) 使包含所述物质的液体流通过含有固定化靶标的流动池的所述表面；和
(d) 采用表面等离振子共振(SPR)技术检测所述物质和靶标间的相互作用结果；
改进包括：在计算机控制下进行管道混合所述高度浓缩的样品物质与缓冲液以在步骤(b)之前产生混合溶液，所述管道混合包括以下步骤：
(1) 将多室流动池置于一体化射流器(IFC)中；
(2) 将多路针和管模块与所述一体化射流器连接，其中所述多路针和管模块中的针被间隔开来，使得各针可达到标准多孔板的单独试剂孔例如96孔板的孔中，而且其中在各个所述针和连接管间形成管道，即所述IFC和流动池室的通道；
(3) 使用泵送装置将缓冲溶液吸入针中；
(4) 在不引入气泡的情况下，吸入所需量的高度浓缩样品；和
(5) 在不引入气泡的情况下，吸入第二体积的所述缓冲溶液；
其中高度浓缩的样品的稀释在样品到达所述流动池的表面之前在所述管道中发生。
16.权利要求15的方法，其中将所述样品稀释5-100倍。
17.权利要求15的方法，其中将所述样品稀释10-40倍。
18.权利要求2的方法，其在步骤(5)之后还包括将所述液体溶液自所述管道分配到混合容器中，并将样品自所述混合容器中吸回。
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