JP6746846B2 - 単一注入競合的アッセイ - Google Patents

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Description

[0002]バイオセンサは、薬物と標的、ホルモンと受容体、酵素と基質、及び抗原と抗体の間の複合的な分子間相互作用などの速度論的研究を行うために一般に使用される。バイオセンサは、典型的には、１つ又は複数のセンシング領域が流体システムのフローセル導管の内部に収容されるフロー注入方式の流体システムにある。流体システムは、流体の流れをフローセル導管のセンシング領域に方向付ける１つ又は複数のフローチャネル導管を更に画定する。センシング領域は、一般に「リガンド」と呼ばれる固定化された分子を支持する表面を提供する。リガンドは、フローチャネル導管を介してフローセル導管のセンシング領域に方向付けされる流体に存在する「分析物」として知られる分子のための潜在的結合パートナである。典型的には、親和性ペアの一方の部材、リガンドは、センシング領域の表面に固定化され、その一方、第２の部材、分析物は、分析物リガンド複合体をセンシング領域に形成するのに十分な時間このリガンド被覆表面に晒される。
[0003]競合的アッセイは、フラグメントヒット（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｈｉｔｓ）を対照分子と競合させることによってアクティブサイトバインダを直接見つける能力を提供する。そういったアッセイは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて一般に実行される。しかしながら、競合的アッセイは、競合する分子のための完全速度論及び親和性データを決定する目的で複数のステップを典型的に必要とする。その結果、分析は、時間が掛かり、高価である。
[0004]本明細書に開示するのは、コンペティタ分子の存在下で完全速度論及び親和性分析を決定するための単一ＳＰＲ注入方法である。単一ＳＰＲ注入は、２つ以上の試料の分散勾配をＳＰＲフローセル及び検出器に提供する。
[0005]一部において、本開示は、センサによる分析のための分散勾配の注入を実行するための方法を提供する。方法は、１つ又は複数の分析物を含有する第１の試料を試料保持ラインに引き入れて、それに続いて、１つ又は複数の分析物を含有する第２の試料を試料保持ラインに引き入れて、それにより、上記第１の試料及び上記第２の試料の分散勾配を形成することを提供する。その後に、方法は、分散勾配をフローラインを通してセンサまで押す。
[0006]更に、本開示は、２つの分析物の競合的結合分析を実行するための方法を提供する。方法は、第１の量の第１の分析物を試料保持ラインに引き入れて、第２の量の第１の分析物を試料保持ラインに引き入れることによって、第１の分析物の対照試料を調製する。対照試料は、内部に結合リガンドがあるＳＰＲセンサを通して注入される。対照試料がＳＰＲセンサを通過するとき、測定は、ＳＰＲ分析を用いて、上記リガンドとの対照試料の第１の分析物の結合相互作用について行われて、結合相互作用曲線が生成される。また、方法は、第１の分析物及び第２の分析物を含む試料を試料保持ラインに引き入れて、それに続いて、第１の分析物の試料を試料保持ラインに引き入れて、それにより結合競合的分析分散勾配を形成することによって、結合競合的分析分散勾配を調製する。結合競合的分析分散勾配の調製に続いて、方法は、もたらされる競合的分析分散勾配をＳＰＲセンサに押して通し、リガンドとの競合的分析分散勾配の結合相互作用を測定して、結合相互作用曲線を生成することを提供する。対照試料によって生成される結合相互作用曲線は、競合的分析分散勾配によって生成される結合相互作用曲線から差し引かれて、第１の分析物の存在下でのリガンドへの第２の分析物の競合的結合を決定する。
幾つかの実施形態の流体送達システムを使用できるＳＰＲ試験システムの図である。 本明細書に開示された方法を実施するのに適したシステムの構成を示す概略図である。 図２に使用された１０ポートバルブの第１の位置を示す概略図である。 図２に使用された１０ポートバルブの第２の位置を示す概略図である。 図２に使用された４ポートバルブの第１の位置を示す概略図である。 図２に使用された４ポートバルブの第２の位置を示す概略図である。 フローシステムと２つの成分勾配の生成を簡略化して示す図である。 フローシステムと２つの成分勾配の生成を簡略化して示す図である。 フローシステムと２つの成分勾配の生成を簡略化して示す図である。 フローシステムと２つの成分勾配の生成を簡略化して示す図である。 フローシステムと２つの成分勾配の生成を簡略化して示す図である。 試料保持ラインにスクロースが先ず吸引され、スクロースを緩衝液と１：１の比率で化合することによって、本方法に従って形成される勾配を代表する図式図である。 スクロースを緩衝液と１：１の比率で化合することによって、従来技術方法によって形成される勾配を代表する図式図である。 試料保持ラインにスクロースが最後に吸引され、スクロースを緩衝液と１：１の比率で化合することによって、本方法に従って形成される勾配を代表する図式図である。 スクロースを緩衝液と２：１の比率で化合することによって、本方法に従って形成される勾配を代表する図式図である。 スクロースを緩衝液と１：２の比率で化合することによって、本方法に従って形成される勾配を代表する図式図である。 先ず緩衝液、続いて、当該の分析物、最後に続いて、追加の緩衝液を吸引することによって形成される勾配を代表する図式図である。 分析物が先ず試料保持ラインに吸引されてそれに緩衝液の吸引が続く、本発明の方法に従って調製されるＣＢＳ及びフロセミドの分散勾配の注入のための結合応答曲線を示す図である。 図１４に適用された結合モデルの濃度近似を提供するために使用される緩衝液のスクロースの濃度プロファイルを示す図である。 ２つの分析物の結合相互作用競合的分析で使用されるＣＢＳ及びフロセミドの相対濃度を示す図である。 結合相互作用競合的分析の分析物注入によって生成される結合相互作用分析を示す図である。 フロセミドの存在下でのＣＢＳのもたらされる結合を示す図である。
[0025]ＳＰＲ技術は、当業者によく知られており、本明細書では詳細に論じない。以下の開示内容は、単一注入における２つ以上の分析物の勾配プロファイルを生成して、分散勾配を生成するための改善された方法を用いて２つ以上の分析物の競合的分析を行う、新規のアプローチに焦点を当てている。分散勾配は、フロー注入方式のセンシングシステムを用いて分析されることがある。この開示の目的のために、分散勾配の分析については、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の観点から説明する。生体分子間相互作用の分析の用途のために典型的に使用されるフロー注入方式のセンシングシステムでは、少なくとも分析物を含有する試料は、フロー注入を通して表面高感度型の検出器を横切って流れる。この例では、試料は、ＳＰＲセンシング表面を収容するＳＰＲセルを通って流れる。
[0026]後に続く説明では、同様の部分は、明細書及び図面の全体にわたって同じ参照数字でそれぞれ印付けされる。図面は、必ずしも原寸に比例しておらず、一部の部分の比率は、本発明の詳細及び特徴をより良く図解するために誇張されている。用語「内方に」及び「外方に」とは、参照対象物の幾何軸について、それぞれ向かう方向と離れる方向である。ここでは、比較的よく知られている設計の部分が採用されているが、それらの構造及び動作については、詳細には説明しない。
[0027]さて図１を参照すると、ＳＰＲ試験システム１００の図が示されている。フロー注入システム又は流体送達システム１０２は、複数の流体源からフローセル１０４への実質上一定の流れの流体を提供するように構成されたフローチャネル、バルブ、ポンプ及び／又は他の部分、の複合体を含む。実施形態によれば、フローセル１０４は、ＳＰＲ測定を実行するように構成されている光インターフェース組立体１０６に動作可能に結合されることがある。ＳＰＲ光インターフェース組立体は、当技術分野で公知であり、薄膜光学基板、プリズム、照明器及び検出器を含むことがある。
[0028]典型的には、フローセルは、ＳＰＲ結合表面と複数のアクティブセンシング領域（図示せず）との間の電気光学的な関係を維持するように構成されることがある。薄膜光学基板は、典型的には誘導体化されて、コーティングを保有し、生体分子（「リガンド」）を基板に固定化することができる。固定化された生体分子は、１つ又は複数の特定のポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、キナーゼ、及び／又は他の小分子に関して結合特異性を通常保有する。特異的親和性の区域は、アクティブセンシング領域と呼ぶことがある。アクティブセンシング領域は、上記のうちの１つ又は複数の非特異的結合に抵抗する１つ又は複数の連続区域によって概ね分離されることがある。実験的設計は、生体分子を薄膜光学基板上の対応インタロゲーション領域に固定化しないことによって、１つ又は複数のアクティブセンシング領域を基準センシング領域として典型的に指定する。
[0029]アクティブセンシング領域は、薄膜光学基板の表面から、フローセル１０４の中とそれを通って流れる流体の中に、上に向かって延びるアンカー型タンパク質などの結合部分を含む。フローセルを通って流れる分析物が特定の分子又は生体分子を含み、それに対して特定のアクティブセンシング領域の結合部分が親和性を有する場合に、分子又は生体分子は、特徴的な会合速度に従って結合部分に結合又は結び付くことがある。分子又は生体分子のアクティブセンシング領域への会合は、アクティブセンシング領域近くの体積の屈折率を変化させる。典型的には、分析物は、一定又は固定の濃度の一様な体積セグメントとしてフローセルを通過するように作られる。しかしながら、当技術分野で公知である他の方法が存在しており、それにおいては、分析物体積セグメントは、分析物濃度の勾配をアクティブセンシング領域に提供する目的で、フローセルへの途中で緩衝溶液又は第３の溶液のいずれかを用いて分散を被るように作られる。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２９５５１２号及び米国特許出願公開第２０１３／０２７３５６４号を参照のこと。
[0030]分析物又は緩衝溶液を含有する別の試料が、その後にフローセルを通って流れて、他の分析物又は緩衝液が、特定の分子又は生体分子を含まない場合、結合した分子又は生体分子は、特徴的な解離速度に従ってアクティブセンシング領域の結合部分から解離することがある。緩衝液は、典型的には、ほぼ中性のｐＨ、即ち、弱酸又は弱塩基の溶液であり、分析物を含有していない。適切な緩衝液は、典型的には、所望の実験条件にもよるが、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、ＴＲＩＳ及び／又は他の添加物を含有する食塩水である。
[0031]アクティブセンシング領域からの分子又は生体分子の解離は、アクティブセンシング領域近くの流体体積の屈折率を再度変化させる。一般に、完全な解離は、屈折率を、初期結合の前の開始屈折率に又はその近くに低下させることがある。場合によっては、完全な解離は、非常に長く時間が掛かることがあり、及び／又は、屈折率は、その元の値に完全には戻らないことがある。そのうえ、一連の会合及び解離は、屈折率の漸進的な変化をもたらすことがある。変化が過度に大きくなったとき、薄膜光学基板の表面は、実質上その初期状態に戻すために調整又は再生する必要があることがある。
[0032]センシング表面が再生を必要とする状況では、再生は、例えば、水、洗剤及び／又は酸などの洗浄液体をフローセルに通して流すことによって実行することができる。そういった再生は、アクティブセンシング領域近くの屈折率を、その元の値近くに、概ね戻すことがある。例えば、再生段階中に、水、洗剤、酸、或いは、水、洗剤、酸の逐次組み合わせは、フローセルに注入されることがあり、解離の終結後にアクティブセンシング領域に付着して残る分子又は生体分子の最後の頑強な小片が除去される。
[0033]光インターフェース組立体１０６は、薄膜光学基板を照明して反射光エネルギーの量の変化を検出するように動作可能である。反射光エネルギーの量は、同様に、分析物からアクティブセンシング領域への分子又は生体分子の結合（又は結合せず）によって影響される。
[0034]上で論じたように、光インターフェース組立体１０６は、薄膜光学基板を照明するように構成された照明器を典型的に含む。照明器は、照明を作り出すのに有効な別々の及び／又は一体型の部分を幾つか含むことができる。典型的には、プリズムは、照明器から光を受け取って薄膜光学基板にそれを結合するように位置合わせされる。光の光子の一部は、表面プラズモンに変換されることがある。ＳＰＲシステムによっては、残りの光子は、薄膜光学基板から反射され、プリズムは、それらを検出器に結合するように構成される。検出器は、薄膜光学基板の全表面から反射される光子の割合の変化を検出するように動作可能であり、変化は、分析物からアクティブセンシング領域のうちの１つ又は複数への分子及び／又は生体分子の部分の会合及び解離に関係のある成分を典型的に含む。典型的には、ローディングが多い（即ち、結合部分の活性部位のより多くの割合が特定の分子又は生体分子に結び付いている）ほど、光子の表面プラズモンへの変換を増加させる（従って、反射光子の数を減少させる）傾向があり、ローディングが少ないほど光子の表面プラズモンへの変換を最小にする（従って、反射光子の数を最大化する）傾向がある。
[0035]他のＳＰＲシステムは、ＳＰＲ浸漬最小値を追跡することによってプラズモンの放出角のシフトを検出する。分析物のローディングが多いほど、放出が起こる角度が増大する。
[0036]コントローラ１０８は、流体送達システム１０２及び光インターフェース組立体１０６に動作可能に結合されることがあり、また、外部コンピューティングシステム又はネットワーク１１０へのインターフェースを含むことがある。代替的に、外部コンピューティングシステム又はネットワーク１１０へのインターフェースは、省略されてもよく、装置１００は、スタンドアロンシステムとして動作することがある。コントローラ１０８は、照明器の出力を制御し、検出器によって取得された画像に対する画像処理を実行し、画像処理のためにデータ分析を行うか又は外部プロセッサ１１０に画像データを送信し、内部の部分と外部のシステムとの間でステータス及び命令データを送受信し、キーボード、ディスプレイ、及び／又は他の状態表示器（図示せず）経由のヒューマンインターフェースを提供し、流体送達システム１０２を制御するために、使用されることがある。特に、流体送達システムは、電気制御インターフェースを備えたポンプ及びバルブを含むことがあり、コントローラ１０８は、流体送達システム１０２のポンプ、バルブ等々を動作させるために信号を送信することがある。必要に応じて、コントローラ１０８は、廃棄物システム１１２に動作可能に結合されることがある。
[0037]図２のシステムは、幾つかの実施形態に係る、流体送達システム１０２、フローセル１０４、及び廃棄物システム１１２の概略図である。流体送達システム１０２は、第１のマルチポートバルブ３００及び第２のマルチポートバルブ５００を介して流体をフローセル１０４に圧送するように構成された第１のポンプ２０２及び第２のポンプ２０４を含む。第１及び第２のポンプ２０２、２０４は、個々がポンプ、例えば、シリンジポンプ、例えば、Ｔｅｃａｎ社の市販するＣａｖｒｏ ＸＬＰ６０００シリンジポンプ又はＣａｖｒｏ Ｃｅｎｔｒｉｓシリンジポンプなどにされることがある。各ポンプ２０２、２０４は、分配バルブ２０３、２０５を有し、４つのフローラインのうちの１つに又はそこから、圧送するように構成されている。一般に、分配バルブ２０３は、第１のポンプ２０２が緩衝溶液をフローライン２１４を通して緩衝液貯蔵器２０６からポンプのシリンジに送り込んでフローライン２１１、２１２及び２１３のうちの１つを通して送り出すように、設定されることがある。従って、分配バルブ２０３は、第１のマルチポートバルブ３００又は第２のマルチポートバルブ５００の一方のポートがポンプ２０２から流体をいつでも受け取るように構成されている。緩衝液貯蔵器２０６からの緩衝溶液は、第１のポンプ２０２に導入される前に、脱ガス装置２０８を通過する場合がある。
[0038]同様に、分配バルブ２０５は、第２のポンプ２０４が緩衝溶液をフローライン２２４を通して緩衝液貯蔵器２０６からポンプのシリンジに送り込んでフローライン２２１、２２２、２２３のうちの１つを通して送り出すように、典型的に設定されることがある。従って、分配バルブ２０５は、第１のマルチポートバルブ３００又は第２のマルチポートバルブ５００の一方のポートがポンプ２０４から流体をいつでも受け取るように構成されている。また、緩衝液貯蔵器２０６からの緩衝溶液は、第２のポンプ２０４に導入される前に、脱ガス装置２０８を通過する場合がある。任意の適切な分配バルブは、分配バルブ２０３、２０５用に利用される場合がある。
[0039]フローライン２１１及び２１２は、第１のポンプ２０２を第１のマルチポートバルブ３００に流体流連通状態で接続する。フローライン２２１及び２２２は、第２のポンプ２０４を第１のマルチポートバルブ３００に流体流連通状態で接続する。更に、第１のマルチポートバルブ３００は、フローライン２３２及び２３４を介して合流部２３０に接続されている。合流部２３０は、フローライン２３６にも接続され、フローライン２３６は、合流部２３０を合流部２４０と流体流連通状態に置く。合流部２４０は、プローブ２４４に動作可能に接続され、プローブ２４４は、試料ラック２４６から試料を取得することがあり、又は、洗浄ステーション２７０と流体流連通状態に置かれることがある。更に、合流部２４０は、フローライン２４２を介して第２のマルチポートバルブ５００と流体流連通している。こうして、合流部２４０を横切る流体流は、動作中のポンプ２０２、２０４及びそれに関連する分配バルブの設定に応じて、フローライン２４２経由のプローブ２４４と第２のマルチポートバルブ５００との間にあるか、又は、フローライン２３６経由のプローブ２４４と合流部２３０との間にある。同様に、合流部２３０を横切る流体流は、動作中のポンプ２０２、２０４及びそれに関連する分配バルブの設定に応じて、フローライン２３２経由又はフローライン２３４経由のプローブ２４４と第１のマルチポートバルブ３００との間にある。従って、第１のマルチポートバルブ３００は、フローライン２３２を通して又はフローライン２３４を通し、プローブ２４４から流体、典型的には試料、を受け取ることがある。更に、プローブ２４４は、フローライン２３２を通して又はフローライン２３４を通し、第１のマルチポートバルブ３００から流体、典型的には緩衝溶液、を受け取ることがある。最後に、第１のマルチポートバルブ３００は、ライン２４８を介してフローセル１０４と流体流連通し、フローセル１０４は、第１のマルチポートバルブ３００を廃棄物選別機２６０と連通状態に置く。
[0040]フローライン２１３は、第１のポンプ２０２を合流部２５４と流体流連通状態で接続し、合流部２５４は、フローライン２５６を介して第２のマルチポートバルブ５００と流体流連通している。同様に、フローライン２２３は、第２のポンプ２０２を、合流部２５４と、従って、フローライン２５６を介して第２のマルチポートバルブ５００に、流体流連通状態で接続する。こうして、合流部２５４を横切る流体流は、動作しているポンプ（複数可）及びそれに関連するバルブの設定に応じて、フローライン２１３及び２５６経由の第１のポンプ２０２と第２のマルチポートバルブ５００との間にあるか、又は、フローライン２２３及び２５６経由の第２のポンプ２０４と第２のマルチポートバルブ５００との間にあるか、或いは、両ポンプ２０２、２０４の間にある。
[0041]上で述べたように、第２のマルチポートバルブ５００は、フローライン２４２経由でプローブ２４４と流体流連通することがある。更に、第２のマルチポートバルブ５００は、フローライン２５０経由で第１のマルチポートバルブ３００と、また、フローライン２５２経由でフローセル１０４と、流体流連通している。フローライン２５０は、分散ループ２５１を含む場合がある。フローライン２５２を通ってフローセル１０４に入る流体は、光インターフェース組立体１０６の薄膜光学基板と相互作用する。留意すべきことは、フローライン２４８を通ってフローセル１０４に入る流体も、廃棄ポートの選択に応じて、光インターフェースと相互作用する場合があることである。
[0042]フローセル１０４は、フローライン２６２、２６４、２６６及び２６８を介して、廃棄物選別機２６０と流体流連通状態で接続されている。従って、フローライン２４８又はフローライン２５２を通って入る流体は、廃棄物選別機２６０に送達される。廃棄物選別機２６０は、同様に、フローライン２７２を介して洗浄ステーション２７０と流体流連通している。洗浄ステーション２７０は、フローライン２７６を介して廃棄物貯蔵器２７４とも流体流連通している。
[0043]一実施形態によれば、第１のマルチポートバルブ３００は、図示のような２位置１０ポートバルブである場合があり、或いは、２位置８ポートバルブである場合があり、こうして、下で説明するジャンパフローライン３２１が除かれる。図３は、位置Ａ又は第１の位置３０１の第１のマルチポートバルブ３００の図である。バルブ位置３０１は、５ペアのポートを結合する。ポート４０１は、フローチャネル３１１を介してポート４１０に結合され、ポート４０２は、フローチャネル３１２を介してポート４０３に結合され、ポート４０４は、フローチャネル３１３を介してポート４０５に結合され、ポート４０６は、フローチャネル３１４を介してポート４０７に結合され、ポート４０８は、フローチャネル３１５を介してポート４０９に結合される。更に、ポート４０８は、フローライン３２１を介してポート４０７に結合される。省略形式では、以下のポート、４０１〜４１０、４０２〜４０３、４０４〜４０５、４０６〜４０７、４０８〜４０９は、第１の位置３０１でリンク結合される。
[0044]第１の位置３０１では、保持ラインとして機能するフローライン２１１の流体は、第１のポンプ２０２によって第１のマルチポートバルブ３００に押して通される場合がある。流体は、ポート４０３で入ってポート４０２で出る。流体は、その後にフローライン２５０を介して第２のマルチポートバルブ５００の方に押される。更に、流体は、第２のポンプ２０４によって、保持ラインとして機能するフローライン２２１に引き入れられる場合がある。流体は、プローブ２４４に引き入れられて、フローライン２３６及び２３４を通り、ポート４１０を介して第１のマルチポートバルブ３００に入り、ポート４０１を介して出る。ポート４０１から、流体は、保持ライン２２１に導入される。例えば、これらの流体は、分析物を含むことがある。更に、緩衝液は、下で更に説明するように、第１のマルチポートバルブ３００に押して通される場合がある。
[0045]図４は、位置Ｂ又は第２の位置３０２の第１のマルチポートバルブ３００の図である。バルブ位置３０２は、５ペアのポートを結合する。ポート４０１は、フローチャネル３１６を介してポート４０２に結合され、ポート４０３は、フローチャネル３１７を介してポート４０４に結合され、ポート４０５は、フローチャネル３１８を介してポート４０６に結合され、ポート４０７は、フローチャネル３１９を介してポート４０８に結合され、ポート４０９は、フローチャネル３２０を介してポート４１０に結合される。第１の位置３０１と同様に、ポート４０８は、フローライン３２１を介してポート４０７に結合される。省略形式では、以下のポート、４０１〜４０２、４０３〜４０４、４０５〜４０６、４０７〜４０８、４０９〜４１０は、第２の位置３０２でリンク結合される。
[0046]第２の位置３０２では、保持ライン２２１の流体は、第２のポンプ２０４によって第１のマルチポートバルブ３００に押して通される場合がある。流体は、ポート４０１で入ってポート４０２で出る。流体は、その後にフローライン２５０を介して第２のマルチポートバルブ５００の方に押される。更に、流体は、第１のポンプ２０２によって保持ライン２１１に引き入れられる場合がある。流体は、プローブ２４４に引き入れられて、フローライン２３６及び２３２を通り、ポート４０４を介して第１のマルチポートバルブ３００に入り、ポート４０３を介して出る。ポート４０３から、流体は、保持ライン２１１に導入される。例えば、これらの流体は、分析物を含むことがある。更に、緩衝液は、下で更に説明するように、第１のマルチポートバルブ３００に押して通される場合がある。
[0047]上記では、マルチポートバルブ３３０は、１０個のチャネルを有するものとして説明されているが、他の構成は、１つのチャネルが２つの異なった位置のために働くようにバルブが動作することができるなど、容易に明らかになろう。例えば、バルブは、フローチャネルが回転ヘッド上の５つのスロットであり、モータがヘッドを２つの位置間で回転させるように、構築される場合がある。従って、５つのチャネルだけが存在し、各チャネルが、第１及び第２のポートを接続する第１の位置と、第２のポート及び第３のポートを接続する第２の位置とを有することになろう。
[0048]幾つかの実施形態によれば、第２のマルチポートバルブ５００は、図示のような２位置４ポートバルブである場合がある。図５は、位置Ａ又は第１の位置５０１の第２のマルチポートバルブ５００の図である。バルブ位置５０１は、２ペアのポートを結合する。ポート６０１は、フローチャネル５１１を介してポート６０４に結合され、ポート６０２は、フローチャネル５１２を介してポート６０３に結合される。省略形式では、以下のポート、６０１〜６０４、６０２〜６０３は、第１の位置５０１でリンク結合される。
[0049]第１の位置５０１では、フローライン２１３又はフローライン２２３に導入された緩衝液は、それぞれ第１のポンプ２０２又は第２のポンプ２０４によって、フローライン２５６を通して第２のマルチポートバルブ５００に押し入れられる場合がある。流体は、ポート６０１で入ってポート６０４で出て、フローライン２５２を介してフローセル１０４に導入される。流体は、その後に廃棄物システム１１２の方に押される場合がある。典型的には、流体は、洗浄のため及びフローセル１０４での解離のために緩衝液となる。
[0050]図５は、位置Ｂ又は第２の位置５０２の第２のマルチポートバルブ５００の図である。バルブ位置５０２は、２ペアのポートを結合する。ポート６０１は、フローチャネル５１３を介してポート６０２に結合され、ポート６０３は、フローチャネル５１４を介してポート６０４に結合される。省略形式では、以下のポート、６０１〜６０２、６０３〜６０４は、第２の位置５０２でリンク結合される。
[0051]第２の位置５０２では、フローライン２５６に押し入れられた保持ライン２１１又は保持ライン２２１の流体は、それぞれ第１のポンプ２０２又は第２のポンプ２０４によって、第２のマルチポートバルブ５００に押して通される場合がある。流体は、ポート６０３で入ってポート６０４で出て、フローライン２５２を介してフローセル１０４に導入される。典型的には、流体は、試料又は分析物となる。
[0052]マルチポートバルブ３００のように、マルチポートバルブ５００は、説明した４つのチャネルよりも少なく存在するような異なった構成を有する場合がある。マルチポートバルブ３００、５００の正確な構成は、それらの個々が、フローラインが上で説明したように流体流連通状態で接続される第１の位置及び第２の位置を有する限り、重要ではない。
[0053]図７Ａ〜７Ｅは、流体送達システム１０２の簡略化した図を提供する。ここで提供される方法は、両試料を試料保持ライン２１３に引き入れるプローブ２４４を用いて、その後に、もたらされる分散勾配をＳＰＲ結合分析のためのＳＰＲセンシング領域を包含するＳＰＲフローセル１０４の方に押すことによって、改善された分散勾配を提供する。こうして、本方法は、第１の試料を試料保持ライン（図７Ｂ）に引き入れることによって、続いて、第２の試料を同じ保持ライン（図７Ｃ及び７Ｄ）に引き入れることによって、濃度勾配を調製する。第１の試料を保持ラインに引き入れる前に、気泡は、試料保持ラインに吸引されることが好ましい。２つの試料は、相互に即時に接触して、相互への分散を即時に始める（図７Ｄ）。こうして、一方の試料の、他方への分散は、個々の試料のための分散勾配を作り出す。図７Ｅに示したように、第２の試料を試料保持ラインに引き入れた直後に、もたらされる分散勾配は、センシング領域を包含するＳＰＲフローセルの方に押される。こうして、分散勾配を調製するための改善された方法は、緩衝液及び／又は分析物を含有する試料を試料保持ラインに引き入れて、続いて、もたらされる分散勾配をフローセル導管に通してＳＰＲフローセル１０４まで単一ステップで押す、という２つのステップを利用する。本方法は、本明細書では分散勾配を調製するためのプル−プル−プッシュ法とも呼ぶ。（注記）本明細書で提供する議論は、２つの試料の分散勾配に焦点を当てているが、追加の試料については、調製分散勾配をＳＰＲフローセル１０４に押す前に、追加の分散勾配を単一体積に形成する試料保持ラインに引き入れてもよい。
[0054]典型的には、試料保持ラインに引き入れられる各試料の体積は、約１０〜５００μｌとなる。吸引率、即ち、試料が試料保持ラインに引き入れられる比率は、典型的には約２５０μｌ／分であるが、約５０μｌ／分〜約６００μｌ／分までに及んでいてもよい。２つ以上の成分を化合させることによって形成される分散勾配のその後の押し（ｐｕｓｈ）は、約１０μｌ／分〜約２００μｌ／分の注入流量で典型的に行われる。もたらされる分散勾配の全試料体積は、試料保持ラインの寸法によって制限される。試料は、１：１の比率で、或いは、試験中の分析物に適した他の比率で、化合されることがある。
[0055]上で説明した分散勾配を形成するためのプル−プル−プッシュ法は、分散勾配の形式の単一分析物のバルク屈折率溶液を調製するために、また、競合的結合分析を実行するのに適した１つ又は複数の分析物の分散勾配を調製するために、使用されることがある。
[0056]様々な結合相互作用モデルは、本明細書で説明する分散方法と併せて使用される場合がある。例えば、単純１：１擬似一次速度相互作用モデル（ｓｉｍｐｌｅ １：１ ｐｓｅｕｄｏ−ｆｉｒｓｔ−ｏｒｄｅｒ ｋｉｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ）は、利用されることがある。このモデルは、センシング領域での親和性複合体の濃度変化（ｄＲ／ｄｔ）を説明している微分方程式で構成される。

ここで、
Ｒ＝バイオセンサ応答（応答単位（ＲＵ））
Ｒｍａｘ＝全リガンド部位が占有された場合の予想される最大応答（ＲＵ）
Ｃ＝センシング表面での分析物の時変濃度（Ｍ）
ｋａ＝会合速度定数（ｍ−１、ｓ−１）
ｋｄ＝解離速度定数（ｓ−１）
当業者は、特定の分析物／リガンドの組み合わせのための当該の結合相互作用パラメータを決定するために使用され得る他の結合相互作用モデルを熟知しているであろう。
[0057]上の相互作用モデルで明らかなように、結合相互作用の分析は、試料注入中の所与の時間での各分析物の濃度の知識を必要とする。試料ローディング機構の複雑さと、ＳＰＲセル１０４を通して注入される分散勾配のプル−プル−プッシュの性質のせいで、勾配の濃度プロファイルの正確な数学的モデルは、構築が不可能であることがある。所与の時間点での正確な分析物濃度を決定するときの困難を克服するために、本方法は、推定濃度プロファイルの生成を提供する。
[0058]推定濃度プロファイルの生成は、ＳＰＲセンシングセルでバルク屈折率変化を作り出すであろう液体試料の同等の体積及び流量を利用する。このバルク屈折率溶液は、ＳＰＲセンシング領域の中で使用される固定化されたリガンドと相互作用しない。従って、バルク屈折率溶液は、観測応答と勾配濃度との直接的な関係を提供する。結合分析を実行するために、バルク屈折率液体から測定される濃度プロファイルは、その後に結合方程式における濃度の項として使用される。
[0059]一実施形態では、ＳＰＲセンシングセルでバルク屈折率変化を作り出すために使用される液体試料は、緩衝液にスクロースを混ぜることによって形成される勾配となる。緩衝液とスクロースの体積が等しいと仮定すると、緩衝液中のスクロースの分散によって形成される勾配のもたらされる濃度プロファイルは、試料保持ラインへの緩衝液及びスクロース溶液のローディング順序に依存することになる。
[0060]図８は、試料保持ラインへのスクロースの最初の吸引、それに続く、緩衝液の吸引、からもたらされる濃度プロファイルを映し出している。図１０は、試料保持ラインへの緩衝液の最初の吸引、それに続く、スクロース溶液の吸引、からもたらされる濃度プロファイルを映し出している。上で述べたように、試料ローディング方向は、ＳＰＲセンシングセルを横切る試料注入方向の反対である。図９は、試料ループが緩衝液で最初に充填されて、スクロースの試料が試料保持ラインに引き入れられる、従来技術方法に従って調製される濃度プロファイルを示す。その後に、スクロースは、分散勾配を作り出すために試料ループ内の緩衝液に強制的に入れられ、次いで、センシング領域を収容するＳＰＲセルに輸送される。
[0061]分散勾配を調製する、即ち、分散勾配を形成するために第２の分析物又は緩衝液に分析物又は試料を押し入れるための従来技術方法とは対照的に、本方法は、試料保持ラインへの両成分の吸引時に分散勾配を直ちに形成する。こうして、開示した方法は、分散勾配のプル−プル−プッシュとして説明される場合がある。具体的には、本方法は、試料保持ラインへの第１の試料の引き入れ、それに続く、試料保持ラインへの第２の試料の引き入れ、を提供する。最後に、本方法は、その後に、もたらされる分散勾配をＳＰＲセンシング領域を収容するＳＰＲセル１０４に押す。追加の試料については、もたらされる勾配（複数可）をＳＰＲセル１０４に押す前に、試料保持ラインに引き入れてもよい。
[0062]図８〜９の表によって実証されているように、本方法は、スクロースの分散勾配のためにもたらされる濃度プロファイルの傾斜を変える。上で論じたように、図９の濃度プロファイルは、従来通りスクロースを緩衝液に押し入れること及びもたらされる分散勾配の濃度プロファイルを決定すること、から生まれた。図９のプロファイルは、ＳＰＲセルを通過する試料のスクロースの最初ゼロの濃度を映し出している。図９に映し出されたスクロースの濃度は、かなりの時間の間、ゼロのままである。傾斜が最後に、ＳＰＲセルを通過するスクロースを映し出しているように見えるとき、傾斜は、急であり、高濃度のスクロースに直ちに移行する。その結果、濃度プロファイルは、結合相互作用モデル方程式で使用するための限られた数のデータポイントを提供する。対照的に、本方法に従って調製される、スクロース分散勾配からもたらされる濃度プロファイル、即ち、バルク屈折率溶液は、結合相互作用モデル方程式で使用するための利用可能なデータポイントのかなりの増加を提供する。こうして、図８に映し出された傾斜の変化は、低濃度から高濃度に、より長い移行期間を示しており、それにより、ＳＰＲ測定ポイントの数が増加し、分解能が改善される。
[0063]プル−プル−プッシュ分散勾配方法によって濃度プロファイルに提供される改善は、その後の結合相互作用プロファイルにおいて同じく見出されるが、プル−プル−プッシュ法によって調製される改善された分散勾配が、競合的結合分析の間に改善された分解能を同じく提供するからであろう。更に、試験を行うための総時間は、試料ループを緩衝液又は第２の分析物で再充填する必要性を除去することによって減少することになる。代わりに、本方法は、当該の分析物を含有する試料を試料保持ラインに直接、吸引すること、即ち、引き入れること、そして、その後に、もたらされる分散勾配をＳＰＲセルに押すこと、を単純に要求する。
[0064]図１１及び１２は、緩衝液及びスクロースの異なった比率のための濃度プロファイルを提供する。図１１では、図式は、先ずスクロース溶液が試料保持ラインに吸引される、緩衝溶液に対するスクロース溶液の２：１の比率についての濃度プロファイルを映し出している。図１２は、先ずスクロース溶液が試料保持ラインに吸引される、緩衝溶液に対するスクロース溶液の１：２の比率についての濃度プロファイルを映し出している。
[0065]図１３は、本方法によって提供される他の選択肢を映し出している。図１３は、試料保持ラインが３つの試料をローディングされているときの濃度プロファイルを示している。この例では、試料保持ラインは、緩衝液だけを含有する試料を、それに続く、スクロース溶液を含有する試料を、それに続く、緩衝液だけを含有する最後の試料を、ローディングされている。こうして、上で論じたように、試料保持ラインにローディングされる種の数は、保持ラインの体積によって単に制限されることになる。しかしながら、たいていの場合、２つ又は３つの標的分析物が、分析の限界となる。
[0066]バルク屈折率溶液及びその後の分析物分散勾配を調製する時に試料保持ラインを充填するための手順は、普通以下のステップを使用することになる。
１．シリンジポンプ２０２は、システム緩衝液を第１の試料から分離するために気泡セグメントを吸引する。第１の試料は、ポンプ２０２を用いて経路、試料ラック２４６→プローブ２４４→ライン２４２→ライン２５６→ライン２１３、を介して吸引することによって、システムにローディングされる。
２．所望の量の第１の試料を吸引後に、自動試料採取器プローブは、気泡又は任意の他の分離体を第１及び第２の試料間に導かずに、第２の試料を含有する試料ラック位置に移動する。第２の試料は、その後に第１の試料と同じ経路に沿って吸引される。
３．所望の量の第２の試料を吸引後に、自動試料採取器プローブは、ホーム位置に移動し、従って、先端は、局所的な大気に晒される。ポンプ２０２は、追加の量の空気を吸引し、従って、第１及び第２の試料は、フローセルに注入するための位置に、即ち、ほんの僅かな安全量（〜５μｌ）がライン２４２に残存する一方で残部がライン２５６及びライン２１３に引き入れられるポイントまで、移動する。
４．このポイントで、第１及び第２の試料は、相互に分散されて、勾配が形成される。
５．単一の勾配セグメントは、そのとき２／４バルブ５００の位置を変えることによってフローセルに注入され、従って、ポンプ２０２は、勾配試料をフローセルに、経路、ライン２１３→ライン２５６→ライン２５２→フローセル１０４、を介して、分散させることができる。上で述べたように、ポンプ２０２、試料保持ライン、及び、フローセル１０４に至るフローセルラインは、図７Ａ〜７Ｅに簡略化した形で示されている。
これらのステップで使用される量及び流量については上で論じている。
[0067]２より多い試料が試料保持ラインにローディングされるべき場合、上のプル−プル−プッシュ手順は、説明したように使用される。しかしながら、第２の試料のローディング後に、自動試料採取器は、次の試料位置に移動して、試料保持ラインへの追加の試料の吸引、即ち、引き入れることを提供することになる。
[0068]上で論じたように、バルク屈折率溶液を調製するために以上の方法の使用は、その後の分析物分散勾配のモデル適合化のための基準ポイントとして使用に適した改善された濃度プロファイルを提供することになる。本明細書に開示された方法は、特に競合的結合相互作用分析に適している。
[0069]結合競合分析のために分析物を含有する試料の分散勾配を調製するための方法は、上で論じたように、同じプル−プル−プッシュに従う。競合的分析を実行する方法は、図１４〜１８を参照して論じる。
[0070]図１４のライン１は、４−カルボキシ−ベンゼンスルホンアミド（ＣＢＳ）の結合相互作用応答を映し出し、ライン２は、フロセミドの結合相互作用応答を映し出している。結合相互作用分析は、結合リガンドが、バイオセンサの表面にアミン結合（〜６５００ＲＵ）を介して固定化されたカルボニックアンヒドラーゼＩＩ酵素である、センシング領域を有するＳＰＲセルを使用して実行された。フロセミドの分散勾配は、フロセミドの１μＭ溶液を２００μｌ、及び、リン酸緩衝食塩水（緩衝液）を１００μｌ、使用して調製された。上で説明した方法によれば、分散勾配は、最初にフロセミドを試料保持ラインに吸引して引き入れて、それに続いて、緩衝液を試料保持ラインに引き入れることによって、調製された。緩衝液のフロセミドのもたらされる分散勾配は、直ちに、５０μｌ／分の流量で、結合リガンドを包含するＳＰＲセンシング領域に注入されて押して通された。ＣＢＳの分散勾配は、ＣＢＳの２μＭを２００μｌと緩衝液を１００μｌとを使用して調製された。緩衝液のＣＢＳの分散勾配は、最初にＣＢＳを試料保持ラインに吸引して、それに続いて、緩衝液を試料保持ラインに引き入れることによって、調製された。もたらされる分散勾配は、５０μｌ／分の流量で、結合リガンドを含有するＳＰＲセンシング領域に直ちに注入された。
[0071]ＰＢＳのスクロース（１．５％ ｗ／ｖ）のバルク屈折率溶液は、図１２に示すような濃度プロファイル曲線を提供する目的で同じ技術を用いて調製されて注入される。上で論じたように、濃度プロファイル曲線は、ＳＰＲセルを通した分散勾配の注入によって作り出される結合結果曲線への結合相互作用モデルの適合化において使用される。当業者に知られているように、結合応答曲線への結合相互作用モデルの適合化は、ｋａ、ｋｄ、及びＫＤの決定を可能にする。こうして、図１５は、本明細書に開示されたプル−プル−プッシュ法に従って分散勾配を調製することの有効性を実証している。
[0072]結合相互作用曲線を作り出すのに適した分析物を含有する試料の分散勾配を調製することができることを確認したので、本方法は、競合的結合分析を実行するための高速で低価格の方法を可能にしている。競合的結合分析を実行するための方法は、１つの分析物が標的リガンドへの別の分析物の結合を阻止するか又は分析物の結合可能性を増加させるか否かを決定するのに適している。
[0073]結合競合的分析を決定する方法に関して図１６〜１８を参照する。図１６は、結合競合分析を実行するときの分析物の相対濃度を映し出している。結合競合分析で使用される分析物は、フロセミド及びＣＢＳである。分析は、フロセミドが存在するときにＣＢＳがリガンドに結合するかどうかを決定するために設計される。
[0074]図１６を参照すると、フロセミドの相対濃度（ライン１）は、競合的分析中に変化していない。対照的に、ＣＢＳの相対濃度は、競合的分析中に分散勾配のように増加することになる。
[0075]図１７の結合応答曲線は、２つの試料を注入することによって調製された。注入された試料は、第１の量のフロセミドを吸引して、それに続いて、第２の量のフロセミドを吸引することによって、プル−プル−プッシュ法を使用して調製された。もたらされるフロセミド溶液の対照試料は、分析のためにＳＰＲセルを通して注入された。もたらされる結合相互作用曲線は、図１７のライン２及び４として識別されている。このフロセミド溶液の注入は、ＳＰＲセル中のリガンドに対するコンペティタ分析物の結合を実証するコンペティタ分析物の対照注入である。フロセミドの存在下でのＣＢＳの競合的結合は、次の勾配分散注入を用いて決定されることになる。より詳細に下で論じられるように、コンペティタ分析物の対照注入は、任意選択である。
[0076]好適な一実施形態では、第２の勾配分散注入は、ＣＢＳ／フロセミドの混合物の第１の試料を吸引して、それに続いて、フロセミドの試料を吸引し、それにより２つの試料間に分散勾配を生成することによって、調製された。第２の注入における吸引の順序は、リガンドがＣＢＳに出会う前にフロセミドに出会うことを確実にする。第２の勾配分散に関連する結合相互作用曲線は、ライン１及び３として識別されている。これらの状況下で、ＣＢＳが分析中にリガンドに結合することになれば、ＣＢＳの濃度が増加するにつれて結合応答曲線が上昇することが予期されよう。注入は、本方法の再現性を実証するために繰り返された。代替の実施形態では、第２の注入だけでも、フロセミドの存在下でのＣＢＳの結合を定性的に決定するのに十分であろう。
[0077]第２の注入のＣＢＳの結合相互作用応答を決定するために、フロセミドだけに関連する結合相互作用曲線が、ＣＢＳ／フロセミド注入を有するフロセミドに関連する結合相互作用曲線から、差し引かれる。図１８に映し出されているように、差し引かれた曲線、ライン１及び２は、ＣＢＳの結合がそれらの状況下で起こらないことを示している。結果は、それらの分子が、共にスルホンアミドであり、両分子に存在するスルホンアミド官能基からそれらの親和性を得るので、予期される。
[0078]コンペティタの対照注入が使用されない代替の実施形態では、コンペティタを加えた分析物を含有する試料を引き入れて、それに続いて、コンペティタだけの試料を引き入れてもたらされる勾配をＳＰＲセルに押して通すことによって生成される勾配分散によって生成される結合相互作用曲線の定性分析が実行されることがある。図１７を参照すると、ライン１及び３は、そういった分散勾配によって生成される結合相互作用曲線を映し出している。それらの曲線の最初の結合相互作用は、コンペティタ、即ち、フロセミドだけに起因し得る。定性分析は、結合相互作用曲線の後の部分を観測することによって実行される場合がある。曲線が上向きに進行する場合には、試験された分析物は、結合相互作用に貢献すると想定される場合があり、こうしてコンペティタと積極的に競合する。しかしながら、図１７に示したように、曲線が、ＳＰＲセルを通過する分散勾配の期間中において実質上定常状態のままである場合、試験された分析物、例えば、ＣＢＳは、競合しないし、結合相互作用に貢献しない。こうして、定性的に結論できることは、ＣＢＳがフロセミドの存在下でリガンドに結合しないであろうということである。上で論じたように、この結果は、図１８によって支持される。
[0079]更に別の実施形態では、分散勾配は、標的分析物を引き入れて、それに続いて、コンペティタを引き入れて、もたらされる勾配を分析のためのＳＰＲセルに押すことによって、調製されることがある。それらの状況下で、コンペティタ分析物のための基線結合相互作用曲線を構築する目的で、コンペティタだけの対照注入を実行することが好ましいであろう。
[0080]こうして、分散勾配を作り出すための改善された方法は、公知のバインダと競合するための分子をスクリーニングするのに特に適している。競合分析は、１つの化合物を他の化合物によって阻止することを実証することがあり、或いは、対照化合物の存在下の１つの化合物の拡張した結合が、対照自体よりも大きなアロステリック又は協同の結合又は親和性を示すことがある。化合物又は他の分析物をメカニズム特性に関してスクリーニングすることができることは、創薬プログラムにとって有益であろう。
[0081]以下は、競合的結合分析を実行するための方法の簡潔な要約である。体積及び流量については、上で説明している。一般に、試料保持ラインに引き入れられる各試料は、約１０〜５００μｌの間になる。吸引率、即ち、試料が試料保持ラインに引き入れられる比率は、典型的には約２５０μｌ／分であるが、約５０μｌ／分〜約６００μｌ／分までに及んでいてもよい。２つ以上の成分を化合させることによって形成される分散勾配のその後の押すことは、約１０μｌ／分〜約２００μｌ／分の注入流量で典型的に行われることになる。本方法は、試験中の分析物を結合するその能力のためにリガンドが選択されているほぼ固定化されたリガンドを含有するＳＰＲセルを使用する。本開示方法の使用は、複数のコンペティタ種の迅速なスクリーニングを可能にする。
ステップ１
任意選択でコンペティタ分析物だけを含有する対照試料を調製する。コンペティタ分析物の第１の試料を試料保持ラインに引き入れて、コンペティタ分析物の第２の試料を試料保持ラインに引き入れて、もたらされる溶液をＳＰＲセルに押して通すことによって、ＳＰＲセルに制限されたリガンドとのコンペティタ分析物の結合相互作用を決定するためにＳＰＲ分析を実行する。このアプローチは、対照結合応答曲線を生成するときにコンペティタ及び標的分析物の注入の整合性を確実にする。
ステップ２
標的分析物及びコンペティタの双方を含有する調製済み試料を試料保持ラインに引き入れて、コンペティタを含有する試料を標的保持ラインに引き入れて、もたらされる分散勾配をＳＰＲセンサによる分析のためにＳＰＲセルに押して通すことによって、標的分析物及びコンペティタの結合競合的分析分散勾配を調製及び分析する。結合応答曲線は、コンペティタに対するＳＰＲセンサの応答と、コンペティタ＋分析物分散勾配注入が記録される。これは、分析物結合応答曲線である。
ステップ２（代替案）
分散勾配注入は、実行され、引かれた第１の試料は、当該の分析物種だけを含有する。引かれた第２の試料は、コンペティタ分析物だけを含有する。結合応答曲線は、もたらされる分散勾配注入に対するＳＰＲセンサの応答が記録される。
ステップ４
対照結合応答曲線は、基準の分析物結合応答曲線を作り出すために、分析物結合応答曲線から差し引かれる。
ステップ５
コンペティタ種の存在下での分析物結合の効果の決定。これは、結合応答が基準分析物結合応答曲線の或る基線限界を超えるかを試験することによって行われることがあり、限界を超えることは、コンペティタの存在下での分析物結合を示し、限界を超えないことは、コンペティタの存在下での分析物結合が無いことを示す。
[0082]本発明の他の実施形態については、当業者に明らかになろう。そういうことで、以上の説明は、本発明の一般的な使用と方法を単にできるようにすると共に説明している。従って、以下の特許請求の範囲は、本発明の真の範囲を画定している。
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、２０１５年７月１０日に出願された米国特許仮出願第６２／１９１１５１号の利益を主張する。

Claims (6)

  1. ２つの分析物の競合的結合分析を実行するための方法であって、
    第１の分析物の第１の試料を試料保持ラインに引き入れて、前記第１の分析物の第２の試料を前記試料保持ラインに引き入れることによって、前記第１の分析物の対照試料を調製するステップと、
    前記対照試料を、結合リガンドを含むＳＰＲセンサを通して注入するステップと、
    ＳＰＲ分析を用いて対照試料内の前記第１の分析物の前記リガンドとの結合相互作用を測定して、結合相互作用曲線を生成するステップと、
    結合競合的分析分散勾配を調製するステップであって、前記第１の分析物及び第２の分析物を含む試料を前記試料保持ラインに引き入れて、それに続いて、前記第１の分析物の試料を前記試料保持ラインに引き入れて、それにより前記結合競合的分析分散勾配を形成する、ステップと、
    形成した前記結合競合的分析分散勾配を前記ＳＰＲセンサに押して通すステップと、
    前記リガンドとの前記結合競合的分析分散勾配の前記結合相互作用を測定して、結合相互作用曲線を生成するステップと、
    対照試料によって生成される前記結合相互作用曲線を、前記結合競合的分析分散勾配によって生成される前記結合相互作用曲線から、差し引いて、前記第１の分析物の存在下でのリガンドへの前記第２の分析物の分析物結合応答曲線を生成するステップと、を含む方法。
  2. 前記試料保持ラインに引き入れられる各試料の体積は、１０〜５００μｌの間にある、請求項１に記載の方法。
  3. 各試料が前記試料保持ラインに引き入れられる率は、５０μｌ／分〜６００μｌ／分である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 各試料が前記試料保持ラインに引き入れられる率は、２５０μｌ／分である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記結合競合的分析分散勾配を押す前記ステップは、１０μｌ／分〜２００μｌ／分の流量で行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記対照試料をＳＰＲセンサを通して注入する前記ステップは、１０μｌ／分〜２００μｌ／分の流量で行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
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