ES2621812T3 - Detección de anomalías cromosómicas asociadas con el cáncer endometrial - Google Patents

Detección de anomalías cromosómicas asociadas con el cáncer endometrial Download PDF

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ES2621812T3 ES11780917.8T ES11780917T ES2621812T3 ES 2621812 T3 ES2621812 T3 ES 2621812T3 ES 11780917 T ES11780917 T ES 11780917T ES 2621812 T3 ES2621812 T3 ES 2621812T3
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Abstract

Un método para detectar la presencia de carcinoma endometrial en una muestra biológica de un sujeto, donde el método consiste en lo siguiente: poner en contacto la muestra con una o más sondas para una o más regiones o subregiones cromosómicas, o combinaciones de estas, seleccionadas del grupo compuesto por: la región centromérica del cromosoma 18, 1q, 2p, 2q, 3p, 3q, 7p, 8p, 8q, 9p, 9q, la región centromérica del cromosoma 10, 10q, 15q, 16q, 17p, 18q, 19p, 20q, y 22q, donde dicha sonda o sondas con las que se pone en contacto la muestra incluyen una sonda para la región centromérica del cromosoma 18; incubar la sonda o sondas con la muestra en condiciones en las que cada sonda se une selectivamente con una secuencia de polinucleótidos de su región cromosómica o cromosoma diana para formar un complejo de hibridación estable; y detectar la hibridación de la sonda o sondas, donde un patrón de hibridación que muestra una ganancia en la región centromérica del cromosoma 18 es indicativo de carcinoma endometrial.

Description

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DESCRIPCION
Deteccion de anomaKas cromosomicas asociadas con el cancer endometrial Campo de la invencion
La presente invencion se refiere en general al ambito de la deteccion, el diagnostico y control del carcinoma e hiperplasia endometrial.
Antecedentes de la invencion
El cancer uterino es la cuarta enfermedad maligna mas comun diagnosticada entre las mujeres estadounidenses (se estimaron unos 42 000 casos en 2009) y la septima causa mas comun de muerte por cancer en este mismo grupo. Mas del 95% de todos los canceres uterinos son canceres de endometrio (mucosa que recubre el cuerpo del utero). La probabilidad de desarrollar un cancer de utero a lo largo de la vida es de 1:40 (EE. UU.). El 35-50% de las mujeres de entre 35 y 70 anos presentan uno o mas factores de riesgo de padecer cancer endometrial.
Se reconocen dos subtipos clinicopatologicos diferentes en base a su aspecto bajo la luz del microscopio, su comportamiento clmico y la epidemiologfa: el tipo relacionado con estrogenos (endometrioide, tipo I) y el tipo no relacionado con estrogenos (no endometrioide, tipo II, como el seroso papilar y de celulas claras). A pesar de su agresividad, el cancer endometrial resulta diffcil de diagnosticar, por lo que muchas pacientes presentan los smtomas del cancer en un estadio avanzado.
Sonoda et al., Genes, Chromosomes and Cancer, vol. 18, n.° 2, 1998, paginas 115 - 125, describe el uso de la hibridacion genomica para analizar desequilibrios cromosomicos en muestras de tumor primario congeladas de pacientes con carcinoma endometrial, y detecta una ganancia en una serie de cromosomas.
Konig et al., Human Pathology, vol. 27, n.° 7, 1996, paginas 720-727, investiga las ganancias y perdidas de una serie de cromosomas en los canceres de prostata, cuyos metodos utilizan una combinacion de sondas.
Resumen de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo para detectar la presencia de carcinoma endometrial en una muestra biologica de un sujeto. El metodo implica poner en contacto la muestra con una o mas sondas para una o mas regiones o subregiones cromosomicas, o combinaciones de las mismas, seleccionadas del grupo compuesto por: la region centromerica del cromosoma 18, 1q, 2p, 2q, 3p, 3q, 7p, 8p, 8q, 9p, 9q, la region centromerica del cromosoma 10, 10q, 15q, 16q, 17p, 18q, 19p, 20q, y 22q, donde dicha sonda o sondas con las que se pone en contacto la muestra incluyen una sonda para la region centromerica del cromosoma 18. La sonda o sondas se incuban con la muestra en condiciones en las que cada sonda se une selectivamente con una secuencia de polinucleotidos de su region cromosomica o cromosoma diana para formar un complejo de hibridacion estable. Se detecta la hibridacion de una o mas sondas, donde un patron de hibridacion que muestra al menos una ganancia en la region centromerica del cromosoma 18 es indicativo de carcinoma endometrial.
En determinadas realizaciones, un patron de hibridacion que muestra una ganancia en la region centromerica del cromosoma 18 y al menos una ganancia o perdida o desequilibrio en la region cromosomica a la que se dirigen una o mas de las demas sondas es indicativo de cancer endometrial. En determinadas realizaciones, un patron de hibridacion que muestra una ganancia en la region centromerica del cromosoma 18 y una ganancia en una o mas regiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por: 1q, 2p, 3q, 8q, 10q, y 20q es indicativo de carcinoma endometrial. En realizaciones espedficas, un patron de hibridacion que muestra una ganancia en la region centromerica del cromosoma 18 y una ganancia en una o mas regiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por: 1q, 10p, y 10q es indicativo de carcinoma endometrial. En otras realizaciones espedficas, un patron de hibridacion que muestra una ganancia en la region centromerica del cromosoma 18 y una ganancia en una o mas regiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por: 3q, 8q, 18q, y 20q es indicativo de carcinoma no endometrial.
En determinadas realizaciones, la sonda o sondas son para una o mas subregiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por: 1q25, 2p24, 2q26, 3p21, 3q27-q29, 7p21, 8p11, 8q24, 9q34, la region centromerica del cromosoma 10, 10q23, 10q26, 15q11-q13, 16q24, la region centromerica del cromosoma 18, 18q21, 20q12 y 20q13, y una de las sondas es para la region centromerica del cromosoma 18.
En realizaciones concretas de la divulgacion, la muestra se pone en contacto con una combinacion de al menos tres sondas para un conjunto de subregiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por:
1q25, 8q24, 15q11-q13;
1q25, 10q26, 15q11-q13;
1q25, 2p24, 8q24
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1q25, 8p11, 15q11-q13;
1q25, 2p24, 8p11;
1q25, 8pll, 10q26;
1q25, 8p11, 8q24;
1q25, 2p24, 10q26;
1q25, 2p24, 15q11-q13;
8q24, 10q26, 15q11-q13;
1q25, 8p11, 20q13;
1q25, 8q24, 20q13;
1q25,15q11-q13, 20q13;
1q25, 10q26, 20ql3;
8p11, 10q26, 15q11-q13;
1q25, 2p24, 20q13;
2p24, 8p11, 10q26;
2p24, 8q24, 10q26;
2p24, 10q26, 15q11-q13;
2p24, 8q24, 15q11-q13;
10q26,15q11-q13, 20q13;
1q25, 8pll, 18q21;
1q25, 8q24, 18q21;
1q25, 10q26, 18q21;
1q25,15q11-q13, 18q21;
8p11, 8q24, 10q26;
8q24, 10q26, 20q13;
1q25, 2p24, 18q21;
2p24, 8p11, 8q24;
2p24, 8p11, 15q11-q13;
8p11, 8q24, 15q11-q13;
2p24, 10q26, 20q13;
8p11, 10q26, 20q13;
2p24, 8p11, 20q13;
2p24, 8q24, 20q13;
8q24, 15q11-q13, 20q13; y 8p11, 15q11-q13, 20q13.
En determinadas realizaciones de la divulgacion, la muestra se pone en contacto con una combinacion de al menos tres sondas para un conjunto de subregiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por:
1q25, 18q21, CEP18, 8q24;
2p24, 2q26, 10q26, 2q13; y 10q23, CEP10, y 8p11.
En realizaciones concretas de la divulgacion, la muestra se pone en contacto con una combinacion de al menos dos sondas para un conjunto de subregiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por:
18q21, 1q24, 8q24, CEP18;
1q24, 8q24, 10q26, CEP18;
18q21, 1q24, 10q26, CEP18;
1q24, 8q24, CEP18, 3q27-q29;
18q21, 1q24, 8q24, 10q26;
1q24, 2p24, 10q26, CEP18;
1q24, 10q26, CEP18, 3q27-q29;
1q24, 10q26, CEP18, 3q27-q29;
1q24, CEP18, 3q27-q29, 20q13;
1q24, 2p24, CEP18, 3q27-q29;
18q21, 1q24, 10q26, 20q13;
1q24, 8q24, CEP18;
18q21, 1q24, CEP18; y 1q24, CEP18.
En realizaciones ilustrativas de la divulgacion, la muestra se pone en contacto con una combinacion de al menos cuatro sondas para un conjunto de subregiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por:
1q24, 8q24, CEP18, 20q13;
1q24, CEP18, 3q27-q29, 20q13;
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1q24, CEP18, 20ql3, 10q26;
CEP10, 8q24, CEP18, 1q24;
10q26, CEP 10, 1q24, 8q24;
8q24, 1q24, 20q13, CEP18; 10q26;
20q13, CEP 10, 1q24, 10q26,
donde un patron de hibridacion que muestra una ganancia en una o mas de estas subregiones cromosomicas es indicativo de carcinoma endometrial.
En realizaciones concretas, una ganancia en CEP 18, y opcionalmente una o mas de una ganancia en una o mas de 1q24, 8q24, y 20q13, es indicativo de carcinoma endometrial. En realizaciones concretas alternativas de la divulgacion, una o mas de una ganancia en 20ql3, una ganancia en lq24, un desequilibrio en CEP 10, y una ganancia en 10q26 son indicativos de carcinoma endometrial.
En realizaciones concretas de la divulgacion, la muestra se pone en contacto con una combinacion de al menos dos sondas para un conjunto de subregiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por:
18q21, 1q25, 8q24, CEP18;
1q25, 8q24, 10q26, CEP18;
18q21, 1q25, 10q26, CEP18;
1q25, 8q24, CEP18, 3q27-q29;
18q21, 1q25, 8q24, 10q26;
1q25, 2p24, 10q26, CEP18;
1q25, 10q26, CEP18, 3q27-q29;
1q25, 10q26, CEP18, 20q13;
1q25, CEP18, 3q27-q29, 20q13;
1q25, 2p24, CEP18, 3q27-q29;
18q21, 1q25, 10q26, 20q13;
1q25, 8q24, CEP18;
18q21, 1q25, CEP18; y 1q25, CEP18.
En realizaciones ilustrativas de la divulgacion, la muestra se pone en contacto con una combinacion de al menos cuatro sondas para un conjunto de subregiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por:
1q25, 8q24, CEP18, 20q13;
1q25, CEP18, 3q27-q29, 20q13;
1q25, CEP18, 20q13, 10q26;
CEP 10, 8q24, CEP18, 1q25;
10q26, CEP 10, 1q25, 8q24;
8q24, 1q25, 20q13, CEP18; 10q26;
20q13, CEP 10, 1q25, 10q26,
donde un patron de hibridacion que muestra una ganancia en una o mas de estas subregiones cromosomicas es indicativo de carcinoma endometrial.
En realizaciones concretas, una ganancia en CEP18, y opcionalmente una o mas ganancias en una o mas de 1q25, 8q24, y 20q13, es indicativa de carcinoma endometrial. En realizaciones concretas alternativas de la divulgacion, una o mas de una ganancia en 20q13, una ganancia en 1q25, un desequilibrio en CEP10, y una ganancia en 10q26 son indicativos de carcinoma endometrial.
En variaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, la combinacion de sondas puede distinguir muestras que contienen carcinoma endometrial de muestras que no contienen carcinoma endometrial con una sensibilidad de al menos el 93% y una especificidad de al menos el 90%. Por ejemplo, la sensibilidad puede ser al menos del 95% y la especificidad puede ser al menos del 90,4%. En realizaciones concretas, la sensibilidad es al menos del 96% y la especificidad es al menos del 91%.
En variaciones de cualquiera de las realizaciones precedentes, la combinacion de sondas puede incluir entre 2 y 10 sondas. En realizaciones concretas, la combinacion de sondas incluye entre tres y ocho sondas. En una realizacion ilustrativa, la combinacion de sondas incluye cuatro sondas.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, el metodo se puede realizar por array de hibridacion genomica comparada (aCGH) con sondas inmovilizadas sobre un sustrato.
Alternativamente, el metodo se puede realizar mediante hibridacion in situ con fluorescencia y cada sonda de la combinacion de sondas se puede etiquetar con un fluoroforo diferente.
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En cualquiera de las realizaciones precedentes, la muestra puede ser una muestra tomada por raspado endometrial o una muestra de biopsia endometrial.
La divulgacion tambien proporciona, en determinadas realizaciones, una combinacion de sondas que incluyen entre 2 y 10 sondas seleccionadas de cualquiera de los grupos anteriormente indicados, donde la combinacion de sondas tiene una sensibilidad de al menos el 93% y una especificidad de al menos el 90% para distinguir las muestras con carcinoma endometrial de las muestras sin carcinoma endometrial. En realizaciones concretas, la combinacion de sondas tiene una sensibilidad de al menos el 95% y una especificidad de al menos el 90,4%. En realizaciones ilustrativas, la combinacion de sondas tiene una sensibilidad de al menos el 96% y una especificidad de al menos el 91%. En diversas realizaciones, la combinacion de sondas incluye entre 3 y 8 sondas, por ejemplo, 4 sondas.
Otro aspecto de la divulgacion incluye un kit de diagnostico de carcinoma endometrial, donde el kit incluye una combinacion de sondas que incluyen entre 2 y 10 sondas seleccionadas de cualquiera de los grupos anteriormente indicados, donde la combinacion de sondas tiene una sensibilidad de al menos el 93% y una especificidad de al menos el 90% para distinguir las muestras con carcinoma endometrial de las muestras sin carcinoma endometrial. En realizaciones concretas, la combinacion de sondas tiene una sensibilidad de al menos el 95% y una especificidad de al menos el 90,4%. En realizaciones ilustrativas, la combinacion de sondas tiene una sensibilidad de al menos el 96% y una especificidad de al menos el 91%. En diversas realizaciones, la combinacion de sondas incluye entre 3 y 8 sondas, por ejemplo, 4 sondas.
En diversas realizaciones de la divulgacion, una ganancia, una perdida o un desequilibrio detectado por al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sondas es indicativo de carcinoma endometrial.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1A-C: La frecuencia de los cambios genomicos en todos los canceres segun los datos de la CGH.
Figura 2A(1-3)-B(1-3): La frecuencia de los cambios genomicos en A, canceres endometrioides; B, canceres no endometrioides segun los datos de la CGH.
Figura 3: Complementacion de clones de arrays genomicos seleccionados. A, anomalo (ganancia o perdida); NC, sin cambio en el numero de copias.
Figura 4A-I: Conjuntos de sondas 1 y 2 mostrados sobre el resultado de los datos de la aCGH.
Figura 5: Ejemplo representativo de celulas con senales FISH (amplificacion). Figura 6A-C: Conjuntos de sondas 1 y 2. Porcentaje medio de celulas anomalas en todas las muestras evaluadas. A, % celulas con ganancia; B, % celulas con perdida; C, % celulas con ganancias y perdidas.
Figura 7: Curva ROC para CEP18+1q24+MYC+DCC, % anomalo (% celulas con una ganancia o perdida en el numero de copias en al menos uno de cuatro loci).
Figura 8: Sondas individuales y combinaciones (curvas ROC, % anomalo).
Figura 9: Curvas ROC, combinacion de cuatro sondas, ganancias de 1q24, MYC, CEP18 y 20q13.2.
Figura 10: Evaluacion de sondas adicionales para mejorar la sensibilidad de la deteccion del cancer endometrial. Descripcion detallada
La presente invencion proporciona un metodo para la deteccion de anomalfas cromosomicas asociadas con el carcinoma endometrial de tipo endometrioide y no endometrioide, asf como combinaciones de sondas, conforme con las reivindicaciones. Los metodos pueden utilizar tecnicas conocidas como la hibridacion genomica comparativa en microarray (aCGH) y la hibridacion in situ (por ejemplo, la hibridacion in situ con fluorescencia (FISH)), utilizando una combinacion de Identificador Espedfico de Locus (LSI) y Sondas Enumeradoras de Cromosomas (CEP) para detectar celulas que presentan anomalfas cromosomicas coherentes con un diagnostico del cancer endometrial. Los metodos descritos en el presente se pueden utilizar para detectar el cancer endometrial en diversos tipos de muestras (por ejemplo, una muestra de raspado endometrial o de biopsia endometrial) obtenida en la consulta medica o en quirofano.
Actualmente no existe ningun test de diagnostico citologico para la deteccion temprana del cancer endometrial ni existe ningun test o procedimiento para explorar rutinariamente a las mujeres con riesgo de cancer endometrial. La biopsia endometrial esta recomendada como evaluacion inicial de las mujeres con un sangrado uterino anomalo. Las desventajas de la biopsia son que se trata de un procedimiento invasivo y molesto para la paciente. Por otra parte, es posible que en el caso de los tumores que comprenden menos del 50% del endometrio la muestra tomada mediante biopsia endometrial resulte inadecuada. La muestra inadecuada por biopsia puede dar falsos negativos y
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requerir nuevas biopsias endometriales para determinar la causa de un sangrado uterino anomalo persistente. Dado que los canceres endometriales tienen un crecimiento relativamente rapido, a menudo las pacientes acuden cuando el cancer ya se ha desarrollado y extendido localmente.
La citologfa convencional recogida con un dispositivo de muestreo endometrial, como el raspador Tao Brush, ofrece la ventaja de ser relativamente no invasiva y, por tanto, menos molesta para la paciente. Por otra parte, el muestreo endometrial para la citologfa tiene menos probabilidades que la biopsia de dar falsos negativos debido a una muestra inadecuada. El problema con la citologfa convencional es que la mayona de patologos no tienen experiencia interpretando la citologfa endometrial y muchos consideran que resulta diffcil de interpretar. Por otra parte, incluso los citopatologos experimentados consideran que hay una importante proporcion de casos que no se pueden diagnosticar de forma definitiva como muestras positivas o negativas de cancer y que se deben clasificar como indeterminadas por lo que respecta a la presencia de cancer.
Los metodos y composiciones que se describen en el presente proporcionaran medios para detectar y mejorar el diagnostico del cancer endometrial. Espedficamente, la metodologfa que se describe aqrn puede proporcionar una o mas de las siguientes ventajas: distinguir el cancer de enfermedades benignas complejas; distinguir el tejido benigno de lesiones precancerosas y lesiones precancerosas de cancer; distinguir tumores endometrioides y no endometrioides; proporcionar una herramienta de deteccion temprana para tests ambulatorios con muestras de citologfas; ayudar al diagnostico del cancer endometrial en muestras de biopsias o quirurgicas (contribuir a la evaluacion histologica del tejido); y ayudar a controlar los estados cancerosos y precancerosos durante la terapia.
Las ventajas de los metodos descritos en el presente pueden incluir una o mas de las siguientes: uso de ADN estable para la deteccion de anomalfas cromosomicas (delecion, amplificacion, aneusoirna, translocacion); deteccion rapida: los resultados se podnan obtener en 18-36 horas; las posibilidades de implementacion incluyen metodos multiplexados (por ejemplo, microarray) y FISH multicolor; uso como test independiente o complementario de otros tests (histologfa, PSA, nomograma, metilacion, mutacion); uso en muestras de citologfa o biopsia (recien congelada o FFPE); la combinacion de varias sondas aumenta la sensibilidad y especificidad en comparacion con un ensayo de un unico analito; mayor sensibilidad en comparacion con la citologfa convencional.
Definiciones
Los terminos utilizados en las reivindicaciones y la memoria descriptiva tienen las definiciones siguientes, a menos que se especifique lo contrario.
El termino "carcinoma endometrial" se refiere a una neoplasia maligna del endometrio, que es la membrana mucosa que recubre el utero. Basado en su aspecto bajo la luz del microscopio, comportamiento clmico y epidemiologfa se reconocen dos subtipos clinicopatologicos diferentes: el tipo relacionado con estrogenos ("endometrioide", tipo I) y el tipo no relacionado con estrogenos ("no endometrioide", tipo II, como el seroso papilar y de celulas claras).
Los terminos "tumor" o "cancer" en un animal se refieren a la presencia de celulas que presentan caractensticas como una morfologfa o un crecimiento atfpicos, incluyendo la proliferacion no controlada, la inmortalidad, el potencial metastasico, el rapido crecimiento y proliferacion, y determinados rasgos morfologicos caractensticos. A menudo, las celulas cancengenas seran en forma de tumor, pero estas celulas pueden existir solo en un animal. El termino tumor incluye tanto las neoplasias benignas como malignas. El termino "neoplasico" se refiere a un crecimiento atfpico tanto benigno como maligno.
El termino "muestra biologica" o "muestra" significara una muestra obtenida de un sujeto que se sospecha que padece o padece carcinoma endometrial. En algunas realizaciones, la muestra incluye una biopsia introducida en parafina y fijada con formalina. Ademas de los sujetos que se sospecha que padecen carcinoma endometrial, la muestra biologica se puede obtener tambien de un sujeto al que se le ha diagnosticado un carcinoma endometrial con el fin de confirmar el diagnostico o de determinar que se ha extrafdo todo el tumor ("margen limpio"). La muestra se puede obtener de una muestra de raspado endometrial o de biopsia endometrial.
Los terminos "acido nucleico" o "polinucleotido", a efectos del presente, se refieren a un desoxirribonucleotido o ribonucleotido en forma de cadena simple o doble. El termino incluye acidos nucleicos, es decir oligonucleotidos, que contienen analogos conocidos de nucleotidos naturales con propiedades de union similares o mejoradas para los propositos perseguidos.
El termino tambien incluye estructuras similares a los acidos nucleicos con esqueletos sinteticos. Los analogos de los esqueletos de ADN proporcionados por la invencion incluyen fosfodiester, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, alquil fosfotriester, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno(metilimino), 3'-N-carbamato, morfolino carbamato, y acidos peptidonucleicos (PNA); vease Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, editado por F. Eckstein, IRL Press en Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, Eds. Baserga y Denhardt (NyAS 1992); Milligan (1993) J. Med. Chem. 36:1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press). Los PNA contienen segmentos principales no ionicos, como unidades de N-(2-aminoetil)glicina. Los enlaces de fosforotioato se describen en WO 97/03211;
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WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197. Otros segmentos principales sinteticos incluidos en el termino incluyen enlaces de metil-fosfonato o enlaces que alternan metilfosfonato y fosfodiester (Strauss- Soukup (1997) Biochemistry 36: 8692-8698), y enlaces de becilfosfonato (Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 153 y 156).
Los terminos “hibridacion espedfica”, “hibridacion espedfica” e “hibridacion selectiva”, a efectos del presente, se refieren a la union, el duplexado o la hibridacion de una molecula de acido nucleico, preferiblemente con una secuencia de nucleotidos concreta en condiciones rigurosas. El termino "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones en las que una sonda se hibridara preferiblemente a su secuencia diana y, en menor medida, o no se hibridara en absoluto, a otras secuencias. Una "hibridacion rigurosa" y "condiciones de lavado de hibridacion rigurosas" en el contexto de la hibridacion del acido nucleico (por ejemplo, como en array, hibridacion Southern o Northern, o FISH) dependen de la secuencia y son diferentes en funcion de los distintos parametros ambientales. Una extensa grna sobre la hibridacion de acidos nucleicos se encuentra, por ejemplo, en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I, cap. 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” Elsevier, NY (“Tijssen”). Por lo general, las condiciones de hibridacion y lavado altamente rigurosas se seleccionan de forma que sean 5°C inferiores al punto de fusion termico (Tm) para la secuencia espedfica a una potencia ionica y un pH definido. La Tm es la temperatura (con una potencia ionica y un pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda con una coincidencia perfecta. Las condiciones sumamente rigurosas se seleccionan para que sean iguales a la Tm para una sonda concreta. Un ejemplo de condiciones de hibridacion rigurosas para la hibridacion de acidos nucleicos complementarios que tienen mas de 100 residuos complementarios en un array o en un filtro de un ensayo Southern o Northern blot son 42°C utilizando soluciones de hibridacion estandar (vease, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, y la explicacion detallada que se recoge mas abajo).
Una "sonda cromosomica" o "composicion de sondas cromosomicas" se refiere a uno o mas polinucleotidos que se hibridan espedficamente con una region de un cromosoma. Las secuencias diana a las que se puede unir la sonda tienen una longitud variable, por ejemplo, entre unos 25 000 y 800 000 nucleotidos. Tambien se pueden utilizar sondas mas pequenas, por ejemplo, que se hibridan con una region de menos de 100 000 nucleotidos o con una region de menos de 10 000 nucleotidos. De este modo, en diversas realizaciones, la sonda se puede hibridar con secuencias diana que tienen 25 000 nucleotidos, 30 000 nucleotidos, 50 000 nucleotidos, 100 000 nucleotidos, 150 000 nucleotidos, 200 000 nucleotidos, 250 000 nucleotidos, 300 000 nucleotidos, 350 000 nucleotidos, 400 000 nucleotidos, 450 000 nucleotidos, 500 000 nucleotidos, 550 000 nucleotidos, 600 000 nucleotidos, 650 000 nucleotidos, 700 000 nucleotidos, 750 000 nucleotidos, u 800 00 nucleotidos de longitud o que tienen una longitud incluida en cualquier rango con alguno de estos valores como parametros. Una sonda para una region cromosomica concreta puede incluir multiples fragmentos de polinucleotidos, por ejemplo, de un tamano que vana entre unos 50 y unos 1000 nucleotidos de longitud.
Una sonda enumeradora de cromosomas (CEP) es cualquier sonda capaz de enumerar el numero de cromosomas espedfico en una celula.
Por lo general, el termino "fraccion que contiene una etiqueta" o "fraccion de deteccion" se refiere a un grupo o grupos moleculares asociados con una sonda cromosomica, de forma directa o indirecta, que permite la deteccion de esa sonda tras la hibridacion con su diana.
El termino "region diana" o "diana de acido nucleico" se refiere a una secuencia de nucleotidos que se encuentra en una ubicacion cromosomica concreta cuya perdida y/o ganancia es indicativa de la presencia de un carcinoma endometrial.
Introduccion
Los metodos descritos en el presente se basan, en parte, en la identificacion de combinaciones de sondas cromosomicas altamente sensible y espedficas que se pueden utilizar para detectar selectivamente un carcinoma endometrial. Las combinaciones de sondas proporcionan una mayor sensibilidad y especificidad que las sondas individuales. Las sondas abarcan sondas espedficas de locus, asf como sondas enumeradoras de cromosomas (CEP) que se hibridan tfpicamente en las regiones centromericas. Los metodos se realizan hibridando una o mas sondas con acidos nucleicos de, por ejemplo, muestras de citologfa (raspados, lavados o hisopos uterinos) o celulas de muestras congeladas o fijadas, como tejidos introducidos en parafina y fijados con formalina.
Sondas cromosomicas
Las sondas para la invencion se utilizan para la hibridacion con acidos nucleicos que estan presentes en muestras biologicas de sujetos con respecto a los que se sospecha en cierta medida que padecen un carcinoma endometrial. En determinadas realizaciones, las sondas son etiquetadas con etiquetas detectables, por ejemplo, etiquetas fluorescentes.
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Sonda enumeradora de cromosomas
Tfpicamente, una sonda enumeradora de cromosomas reconoce y se une a una region cercana al centromere (denominada "pericentromerica") o al centromere de un cromosoma espedfico, por lo general una secuencia de ADN repetitiva. Se considera que el centromere de un cromosoma representa tipicamente la entidad de dicho cromosoma, dado que el centromere es necesario para la segregacion fiel durante la division celular. La delecion o amplificacion de una region cromosomica concreta se puede diferenciar de la perdida o ganancia del conjunto del cromosoma (aneusoirna), en el que normalmente reside, comparando el numero de senales correspondientes al locus particular (numero de copias) con el numero de senales para el centromere correspondiente. Un metodo para realizar esta comparacion consiste en dividir el numero de senales que representan el locus por el numero de senales que representan el centromere. Los ratios inferiores a uno indican una perdida relativa o delecion del locus, mientras que los ratios superiores a uno son indicativos de una ganancia o amplificacion del locus. Del mismo modo, se puede realizar una comparacion entre dos loci diferentes del mismo cromosoma, por ejemplo, en dos brazos diferentes del cromosoma, para indicar un desequilibrio de ganancias o perdidas dentro del cromosoma.
En lugar de una sonda centromerica para un cromosoma, un experto en la tecnica reconocera que la sonda de un brazo cromosomico se puede utilizar alternativamente para calcular aproximadamente la perdida o ganancia cromosomica total. Sin embargo, estas sondas no son tan precisas enumerando cromosomas, dado que la perdida de senales para dichas sondas puede no siempre indicar una perdida de todos los cromosomas. Entre los ejemplos de sondas enumeradoras de cromosomas se incluyen las sondas CEP® (por ejemplo, CEP® 12 y sondas X/Y) comercializadas por Abbott Molecular, DesPlaines, IL (anteriormente Vysis, Inc., Downers Grove, IL).
Los expertos en la tecnica pueden preparar facilmente sondas enumeradoras de cromosomas y de sondas espedficas de locus dirigidas a una region o subregion cromosomica o adquirirlas en, por ejemplo, Abbott Molecular, Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), o Cytocell (Oxfordshire, UK). Estas sondas se preparan utilizando tecnicas estandar. Se pueden preparar sondas cromosomicas, por ejemplo, con acidos nucleicos de proternas, ADN humano clonado como plasmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC), y cromosomas artificiales PI (PAC) que contienen insertos de secuencias de ADN humano. Se puede obtener una region de interes via clonacion o amplificacion por PCR. Alternativamente, se pueden preparar sondas cromosomicas sinteticamente.
Sondas espedficas de locus
Entre las sondas que se pueden utilizar en el metodo descrito en el presente se incluyen sondas que se hibridan selectivamente a regiones cromosomicas (por ejemplo, 1q, 2p, 2q, 3p, 3q, 7p, 8p, 8q, 9p, 9q, 10q, 15q, 16q, 17p, 18q, 19p, 20q, y 22q) o subregiones de las regiones cromosomicas (por ejemplo, 1q25, 2p24, 2q26, 3p21, 3q27-q29, 7p21, 8p11, 8q24, 9q34, 10q23, 10q26, 15q11-q13, 16q24, 18q21, 20q12 y 20q13). (Las designaciones de las subregiones utilizadas en el presente incluyen la banda designada y tfpicamente unas 10 megabases de la secuencia genomica en cualquiera de los lados). Estas sondas tambien se denominan "sondas especificas de locus". Una sonda espedfica de locus se une selectivamente a un locus espedfico de una region cromosomica que se sabe que se somete a una ganancia o perdida en el carcinoma endometrial. Una sonda se puede focalizar a regiones de codificacion o de no codificacion, o a ambas, incluyendo exones, intrones y/o secuencias reguladoras, como secuencias de promotores y similares.
Cuando se desea focalizar un locus de un gen concreto, las sondas que se hibridan a lo largo de toda la longitud del gen diana son preferibles en ciertas realizaciones, aunque no imprescindibles. En realizaciones espedficas, una sonda espedfica de locus puede estar disenada para hibridar a un oncogen o gen supresor del tumor, cuya aberracion genetica esta correlacionada con el carcinoma endometrial.
Por lo general, las sondas utiles en los metodos descritos en el presente incluyen una serie de uno o mas fragmentos de acidos nucleicos cuya hibridacion con una diana se puede detectar. Las sondas se pueden producir a partir de una fuente de acidos nucleicos de una o mas porciones (preseleccionadas) concretas del genoma, por ejemplo, uno o mas clones, un cromosoma completo o fragmento de cromosoma aislado, o una serie de productos de amplificacion por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Las sondas utiles en el metodo descrito en el presente se pueden producir a partir de los acidos nucleicos que se encuentran en las regiones descritas en el presente. La sonda puede ser procesada de alguna manera, por ejemplo, bloqueando o eliminando los acidos nucleicos repetitivos o enriqueciendo con acidos nucleicos unicos.
En determinadas realizaciones, por ejemplo, en las realizaciones con hibridacion in situ (como la basada en FISH), las dianas de las sondas espedficas de locus incluyen preferiblemente al menos 100 000 nucleotidos. Para las celulas de una muestra determinada, con respecto a las de un control, los incrementos o las disminuciones del numero de senales de una sonda indican una ganancia o perdida, respectivamente, para la correspondiente region.
Tambien se pueden utilizar sondas como acidos nucleicos aislados inmovilizados sobre una superficie solida (por ejemplo, nitrocelulosa) como en la aCGH. En algunas realizaciones, las sondas pueden ser miembros de un array de acidos nucleicos tal y como se describe, por ejemplo, en WO 96/17958, que proporciona una descripcion de un array de CGH. Las tecnicas capaces de producir arrays de alta densidad son bien conocidas (vease, por ejemplo, Fodor et
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al. Science 767-773 (1991) y la Patente USA N° 5.143.854).
Tal y como se describe detalladamente mas abajo, fueron identificados los loci putativamente asociados con el cancer endometrial y la sensibilidad y especificidad de esta asociacion se examino de forma detallada utilizando un array de hibridacion genomica comparativa (aCGH) y una hibridacion in situ con fluorescencia (FISH). Los clones seleccionados del analisis aCGH inclman: LAMC2 (1q25-q31), MYCN (2p24.1), RASSF (3p21.3), TP63 (3q27-q29), IL6 (7p21), FGFR1 (8p11.2-p11.1), MYC (8q24), TSC1 (9q34), PTEN (10q23.3), FGFR2 (10q26), UBE3A/D15S10 (15q11-q13), FANCA (16q24.3), DCC (18q21.3), NCOA3 (20q12), y ZNF217 (20q13.2). Las sondas del analisis FISH inclman: 1q25, PTEN (10q23.3), DCC (18q21.2), CEP10, CEP18, FGFR1 (8p11.2), MYC (8q24), MYCN (2p24.3), PIK3CA (2q26.32), FGFR2 (10q26.13), y ZNF217 (20q13.2). Se desarrollaron nuevas sondas FISH para NMYC, FGFR1, y FGFR2.
Metodos de seleccion de sondas
Las combinaciones de sondas se pueden seleccionar por su capacidad para detectar simplemente el carcinoma endometrial, pero tipicamente se seleccionan por su capacidad por discriminar entre el carcinoma endometrial y otras condiciones. Por tanto, los analisis de combinaciones de sondas se realizan tipicamente para determinar los valores DFI de diferentes combinaciones de sondas para discriminar entre el carcinoma endometrial y otras condiciones o tejido normal. En realizaciones concretas, se pueden analizar combinaciones de sondas para discriminar entre los tipos endometrioides y no endometrioides de carcinoma endometrial.
Las combinaciones de sondas para su uso en los metodos de la presente invencion se pueden seleccionar utilizando los principios descritos en los ejemplos. Las combinaciones de sondas cromosomicas dentro de una combinacion de sondas se seleccionan por la sensibilidad, especificidad y detectabilidad respecto al carcinoma endometrial. La sensibilidad se refiere a la capacidad de un test (por ejemplo, FISH) para detectar la enfermedad (por ejemplo, carcinoma endometrial) si esta presente. Mas concretamente, la sensibilidad se define como Verdaderos Positivos/(Verdaderos Positivos+Falsos Negativos). Un test con una elevada sensibilidad presenta escasos resultados falsos negativos, mientras que un test de baja sensibilidad presenta numerosos resultados de falsos negativos. En determinadas realizaciones, la combinacion de sondas tiene una sensibilidad aproximada de al menos: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%, o una sensibilidad comprendida en un intervalo de cualquiera de estos valores como parametros.
La especificidad, por otra parte, se refiere a la capacidad de un test (por ejemplo, FISH) para dar un resultado negativo cuando la enfermedad no esta presente. Mas concretamente, la especificidad se define como Verdaderos Negativos/(Verdaderos Negativos+Falsos Positivos). Un test con una elevada especificidad presenta escasos resultados falsos positivos, mientras que un test de baja especificidad presenta numerosos resultados de falsos positivos. En determinadas realizaciones, la combinacion de sondas tiene una especificidad de al menos: 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, o 95%, o una especificidad comprendida en un intervalo de cualquiera de estos valores como parametros.
En general, las combinaciones de sondas cromosomicas con la sensibilidad y especificidad combinadas mas altas para la deteccion del carcinoma endometrial resultan preferibles. En ejemplos de realizaciones, la combinacion de sondas tiene una sensibilidad y especificidad aproximada de al menos: 93% y 88%, 95% y 90%, 96% y 91%, 97% y 92%, respectivamente, o cualquier combinacion de sensibilidad y especificidad basada en los valores anteriormente indicados para cada uno de estos parametros.
La sensibilidad y especificidad combinadas de una combinacion de sondas se pu2ede representar por la distancia de los parametros con respecto al ideal (DFI), que se define como [(1-sensibilidad) +(1- especificidad )] . Los valores de DFI oscilan entre 0 y 1414, donde 0 representa una combinacion de sondas que tiene un 100% de sensibilidad y un 100% de especificidad y 1414 representa una combinacion de sondas que tiene un 0% de sensibilidad y un 0% de especificidad.
No existe un lfmite para el numero de sondas que se pueden emplear en una combinacion, aunque, en determinadas realizaciones no se combinan mas de 10 sondas. Por otra parte, en algunas realizaciones, el numero de sondas de un conjunto que van a ser visualizadas por un observador humano (y no por tecnicas de captura de imagenes por ordenador) puede ser limitado por razones practicas, por ejemplo, por el numero de fluoroforos unicos que proporcionan senales visualmente distinguibles tras la hibridacion. Por ejemplo, tfpicamente cuatro o cinco fluoroforos unicos (que pueden aparecer como senales rojas, verdes, acuosas y doradas al ojo humano) pueden ser empleados convenientemente en una unica combinacion de sondas. Por lo general, la sensibilidad de un ensayo aumenta cuanto mayor es el numero de sondas de un conjunto. Sin embargo, los incrementos de la sensibilidad son cada vez menores con la adicion de nuevas sondas y en algun punto la inclusion de nuevas sondas a una combinacion de sondas no esta asociada con incrementos significativos en la sensibilidad del ensayo ("disminucion del rendimiento"). Al aumentar el numero de sondas de una combinacion de sondas puede reducirse la especificidad del ensayo. Por consiguiente, una combinacion de sondas de la presente invencion tfpicamente incluye dos, tres o cuatro sondas cromosomicas, conforme sea necesario para proporcionar un equilibrio optimo entre sensibilidad y especificidad.
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Las sondas individuales pueden ser seleccionadas para su inclusion en una combinacion de sondas en funcion de su capacidad para complementar a otras sondas de la combinacion. Concretamente, estan dirigidas a cromosomas o subregiones cromosomicas que no se suelen alterar simultaneamente dentro de un carcinoma endometrial dado. Por tanto, cada sonda de una combinacion de sondas complementa a la otra u otras, es decir que identifica el carcinoma endometrial cuando las demas sondas de la combinacion en ocasiones no consiguen identificarlo. Un metodo para determinar que sondas se complementan entre sf consiste en identificar sondas unicas con los valores DFI mas bajos para un grupo de muestras de tumores. A continuacion, se pueden probar sondas adicionales con las muestras de tumores que la sonda inicial no consiguio identificar, y la sonda con el valor DFI mas bajo medida en combinacion con la sonda o sondas iniciales se anade al conjunto. Esto se puede repetir hasta que se consigue un conjunto completo de sondas cromosomicas con el valor DFI deseado.
El analisis de discriminacion es el metodo que se puede utilizar para determinar que sondas pueden detectar mejor el carcinoma endometrial. Este metodo evalua si las sondas individuales son capaces de detectar un porcentaje estadfsticamente diferente de celulas anomalas en muestras de ensayo (por ejemplo, carcinoma endometrial) en comparacion con muestras normales. La deteccion de celulas con ganancias cromosomicas (o locus) o perdidas cromosomicas (o locus) se puede utilizar para identificar celulas neoplasicas en pacientes con carcinoma endometrial. Sin embargo, en ocasiones se producen perdidas cromosomicas como un artefacto en las celulas normales debido a que una senal aleatoria se solapa y/o a una mala hibridacion. En secciones de material introducido en parafina y fijado con formalina, normalmente utilizado para evaluar las biopsias, la truncacion de nucleos en el proceso de seccionamiento tambien puede producir una perdida artefactual de material cromosomico. Por consiguiente, las ganancias cromosomicas son a menudo un indicador mas fiable de la presencia de celulas neoplasicas.
Los valores de corte para las ganancias y perdidas cromosomicas individuales se deben determinar a la hora de elegir una combinacion de sondas. El termino "valor de corte" pretende significar el valor de un parametro asociado con la aberracion cromosomica que divide una poblacion de muestras en dos grupos —las muestras por encima del valor de corte y las muestras por debajo del valor de corte—. Por ejemplo, el parametro puede ser el numero absoluto o el porcentaje de celulas de una poblacion que presenta aberraciones geneticas (por ejemplo, perdidas o ganancias para regiones diana). Si el numero o porcentaje de celulas de la muestra que presente perdidas o ganancias para una sonda concreta es superior al valor de corte, se determina que la muestra es positiva en carcinoma endometrial.
Las combinaciones de sondas utiles se debaten detalladamente en el Ejemplo que se recoge mas abajo. En ejemplos de combinaciones, una o mas ganancias en uno o mas brazos de 1q24, 8q24, CEP18, y 20q13 son indicativas de un carcinoma endometrial, al igual que lo son (i) una o mas ganancias en una o mas de 1q25, 8q24, CEP 18, y 20q13 y (ii) una o mas de una ganancia en 20q13, una ganancia en 1q24, un desequilibrio en CEP 10, y una ganancia en 10q26. Tambien cabe senalar que se observaron diferentes cambios genomicos a la hora de comparar los subtipos endometrioides y no endometrioides. Las ganancias en los brazos cromosomicos 1q, 10p y 10q fueron habituales en los carcinomas endometrioides. En los carcinomas no endometrioides se observaron multiples ganancias en el genoma y las ganancias mas habituales se observaron en 3q, 8q y 20q.
Hibridacion de sondas
Por lo general, las condiciones para la hibridacion espedfica de sondas a sus dianas de acido nucleico incluyen las combinaciones de condiciones que se pueden emplear en un determinado procedimiento de hibridacion para producir hubridos espedficos, cuyas condiciones pueden ser facilmente determinadas por un experto en la tecnica. Estas condiciones implican tfpicamente la temperatura controlada, la fase lfquida y el contacto entre una sonda cromosomica y una diana. Las condiciones de hibridacion vanan dependiendo de multiples factores, incluyendo la concentracion de la sonda, la longitud de la diana, el contenido G-C de la diana y la sonda, la composicion del solvente, la temperatura y la duracion de la incubacion. Al menos un paso de desnaturalizacion puede preceder al contacto de las sondas con las dianas. Alternativamente, tanto la sonda como la diana de acido nucleico se pueden someter a condiciones de desnaturalizacion juntos, mientras estan en contacto entre sf, o durante el posterior contacto de la sonda con la muestra biologica. La hibridacion se puede conseguir con la posterior incubacion de la sonda/muestra en, por ejemplo, una fase lfquida de una mezcla con un ratio de volumen aproximado de 50:50 de 2-4 veces SSC y formamida, a una temperatura en el rango de unos 25 a 55°C durante un tiempo ilustrativo en un rango aproximado de entre 0,5 y 96 horas, o mas preferiblemente a una temperatura de unos 32 a unos 40°C durante un tiempo en un rango aproximado de entre 2 y 16 horas. A fin de aumentar la especificidad, se puede utilizar un agente bloqueante como un acido nucleico bloqueante no etiquetado como el que se describe en la Patente USA N° 5.756.696 (cuyo contenido proporciona una descripcion del uso de un acido nucleico bloqueante) conjuntamente con los metodos de la presente invencion. Otras condiciones se pueden emplear facilmente para hibridar de forma espedfica las sondas con sus dianas de acido nucleico presentes en la muestra, tal y como resultara evidente para un experto en la tecnica.
Una vez completado un periodo de incubacion adecuado, la union no espedfica de sondas cromosomicas al ADN de la muestra se puede eliminar mediante una serie de lavados. La temperatura y las concentraciones de sal se seleccionan convenientemente para la rigurosidad deseada. El nivel de rigurosidad requerido depende de la
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complejidad de una secuencia de sonda espedfica en relacion con la secuencia genomica, y se puede determinar hibridando sistematicamente sondas con muestras de una composicion genetica conocida. En general, se pueden realizar lavados de elevada rigurosidad a una temperatura en un rango aproximado de entre 65 y 80°C con aproximadamente entre 0,2x y 2xSSC y aproximadamente 0,1% y 1% de un detergente no ionico como Nonidet P40 (NP40). Si se requieren lavados de menor rigurosidad, los lavados se pueden realizar a una temperatura inferior con una mayor concentracion de sal.
Deteccion de patrones de hibridacion de sondas
Las sondas de hibridacion se pueden detectar utilizando cualquier medio conocido en la tecnica. Las fracciones que contienen etiquetas se pueden asociar directa o indirectamente con sondas cromosomicas. Se pueden seleccionar diferentes fracciones que contienen etiquetas para cada sonda individual de una combinacion concreta de forma que cada sonda hibridada sea visualmente distinta de las demas tras la deteccion. Cuando se emplea la FISH, las sondas cromosomicas pueden ser convenientemente etiquetadas con distintas fracciones que contienen etiquetas fluorescentes. En estas realizaciones, los fluoroforos, las moleculas organicas que se vuelven fluorescentes bajo la radiacion a una longitud de onda concreta, por lo general se unen directamente a las sondas cromosomicas. Hay un gran numero de fluoroforos a la venta en formas reactivas adecuadas para el marcado de ADN.
La union de fluoroforos a sondas de acido nucleico es bien conocida en la tecnica y se puede realizar utilizando cualquier medio disponible. Los fluoroforos se pueden unir covalentemente a un nucleotido concreto, por ejemplo, y el nucleotido etiquetado se puede incorporar a la sonda utilizando tecnicas estandar como la traslacion de mellas, el marcaje aleatorio, el etiquetado por PCR y similares. Alternativamente, el fluoroforo se puede unir covalentemente a traves de un enlazador a los nucleotidos de desoxicitidina de la sonda que han sido transaminados. Los metodos para etiquetar sondas se describen en la Patente USA N° 5.491.224 y en Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications (2002), Y.-S. Fan, Ed., capttulo 2, “Labeling Fluorescence In Situ Hybridization Probes for Genomic Targets,” L. Morrison et al., p. 21-40, Humana Press, ambos proporcionan descripciones del etiquetado de sondas.
Entre los ejemplos de fluororofos que se pueden utilizar para el etiquetado de sondas se incluyen TEXAS RED (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), CASCADE blue acetylazide (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), SPECTRUMORANGE™ (Abbott Molecular, Des Plaines, IL) y SPECTRUMGOLD™ (Abbott Molecular).
Un experto en la tecnica reconocera que se pueden utilizar otros agentes y colorantes en lugar de fluoroforos como fracciones que contienen una etiqueta. Las etiquetas adecuadas que se pueden unir a las sondas incluyen, entre otros, radioisotopos, fluoroforos, cromoforos, etiquetas de masas, partfculas densas de electrones, partfculas magneticas, etiquetas de espm, moleculas que emiten luminiscencia, moleculas electroqmmicamente activas, enzimas, cofactores y sustratos de enzimas. Los agentes luminiscentes incluyen, por ejemplo, fracciones que contienen etiquetas radioluminiscentes, quimioluminiscentes, bioluminiscentes y fosforescentes. Alternativamente, se pueden utilizar fracciones de deteccion que se visualizan a traves de medios indirectos. Por ejemplo, las sondas se pueden etiquetar con biotina o digoxigenina utilizando metodos rutinarios conocidos en la tecnica y, a continuacion, se pueden procesar para su deteccion. La visualizacion de una sonda que contiene biotina se puede conseguir a traves de la posterior union de avidina conjugada con un marcador detectable. El marcador detectable puede ser un fluoroforo, en cuyo caso la visualizacion y discriminacion de sondas se puede conseguir tal y como se ha descrito anteriormente para la FISH.
Las sondas cromosomicas hibridadas con regiones diana se pueden visualizar alternativamente a traves de reacciones enzimaticas de fracciones etiquetadas con los sustratos adecuados para la produccion de productos de color insolubles. Cada sonda se puede discriminar de las demas sondas del conjunto mediante la seleccion de una fraccion etiquetada distinta. Una sonda que contiene biotina dentro de un conjunto se puede detectar a traves de la incubacion posterior con avidina conjugada con fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa de rabano (HRP) como sustrato adecuado. 5-bromo-4-cloro-3- indolilfosfato y nitro blue tetrazolio (NBT) sirven como sustratos para la fosfatasa alcalina, mientras que la diaminobenzidina sirve como sustrato para la HRP.
En realizaciones en las que se utilizan sondas o composiciones de sondas etiquetadas con fluoroforos, el metodo de deteccion puede implicar la microscopfa de fluorescencia, la citometna de flujo u otro medio para determinar la hibridacion de la sonda. Se puede utilizar cualquier metodo de captura de imagenes microscopicas adecuado conjuntamente con los metodos de la presente invencion para observar multiples fluoroforos. En caso de que se emplee la microscopfa de fluorescencia, las muestras hibridadas se pueden visualizar bajo la luz adecuada para detectar la excitacion de cada fluoroforo y con el uso de un filtro o filtros adecuados. Alternativamente se pueden utilizar sistemas de captura de imagenes digitales automaticos, como MetaSystems, BioView o Applied Imaging Systems.
En el array de CGH, las sondas no son etiquetadas, sino que se inmovilizan en distintos lugares sobre un sustrato, tal y como se describe en WO 96/17958. En este contexto, las sondas se denominan a menudo "acidos nucleicos diana". Los acidos nucleicos de muestra son tfpicamente etiquetados para permitir la deteccion de complejos de hibridacion. Los acidos nucleicos de muestra utilizados en la hibridacion pueden ser etiquetados de forma detectable antes de la reaccion de hibridacion. Alternativamente, se puede seleccionar una etiqueta detectable que se une al
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producto de la hibridacion. En la aCGH bicolor o multicolor, el array de acido nucleico diana es hibridado con dos o mas colecciones de acidos nucleicos etiquetados de forma diferente, sea de forma simultanea o en serie. Por ejemplo, los acidos nucleicos de muestra (por ejemplo, de biopsia de carcinoma endometrial) y los acidos nucleicos de referencia (por ejemplo, de endometrio normal) son etiquetados con una etiqueta separada y distinguible. Las diferencias de la intensidad de cada senal en cada punto de acido nucleico diana se pueden detectar como una indicacion de una diferencia en el numero de copias. A pesar de que se puede utilizar cualquier etiqueta detectable adecuada para una aCGH, las etiquetas fluorescentes son tipicamente las mas convenientes.
Los metodos preferibles para visualizar senales se describen en WO 93/18186. Para facilitar la visualizacion de resultados y para mejorar la sensibilidad de deteccion de pequenas diferencias en la intensidad de la fluorescencia, se puede utilizar un sistema de analisis de imagenes digitales. Un ejemplo de sistema es QUIPS (que significa sistema de procesamiento cuantitativo de imagenes), que es un sistema de analisis de imagenes automatico basado en un microscopio de fluorescencia estandar equipado con una platina automatica, control del enfoque y rueda de filtros (Ludl Electronic Products, Ltd., Hawthorne, N.Y.). La rueda de filtros esta montada en la trayectoria de la excitacion de fluorescencia del microscopio para seleccionar la longitud de onda de excitacion. Los filtros especiales (Chroma Technology, Brattleboro, Vt.) del bloque dicroico permiten la excitacion de los multiples colorantes sin cambiar el registro de la imagen. El microscopio tiene dos puertos de camaras, uno de ellos con una camara CCD intensificada (Quantex Corp., Sunnyvale, Calif.) para la visualizacion de imagenes de video sensibles a alta velocidad, que se utiliza para encontrar areas interesantes en el portaobjetos y para el enfoque. El otro puerto de camara tiene una camara CCD refrigerada (modelo 200 de Photometries Ltd., Tucson, Ariz.) que se utiliza para la captura real de imagenes a alta resolucion y sensibilidad. La camara CCD refrigerada esta interconectada con una estacion de trabajo SUN 4/330 (SUN Microsystems, Inc., Mountain View, Calif.) a traves de un bus VME. Toda la captura de imagenes multicolor se controla con un paquete de software de procesamiento de imagenes SCIL-Image (Delft Centre for Image Processing, Delft, Netherlands).
Deteccion y diagnostico de pacientes con carcinoma endometrial
Los metodos de deteccion de la invencion incluyen el uso de una muestra biologica obtenida de un sujeto que padece carcinoma endometrial o que se sospecha que padece carcinoma endometrial. La muestra biologica puede ser la muestra de una citologfa (por ejemplo, raspados, lavados o hisopos uterinos). En realizaciones concretas, la muestra biologica es una muestra congelada o fijada, como una muestra introducida en parafina y fijada con formalina. La muestra se pone en contacto con una o mas sondas cromosomicas para detectar de forma selectiva el carcinoma endometrial en la muestra, si procede, bajo condiciones para la hibridacion espedfica de las sondas con sus dianas de acido nucleico presentes en la muestra. Las sondas de una combinacion se pueden hibridar de forma simultanea o secuencial, capturandose imagenes digitales de los resultados de cada hibridacion, separando la sonda o sondas, e hibridando despues la muestra con la otra sonda o sondas. Tambien se pueden hibridar multiples combinaciones de sondas con la muestra de esta manera.
La muestra biologica puede ser de una paciente que se sospecha que padece carcinoma endometrial o de una paciente a la que se le ha diagnosticado un carcinoma endometrial, por ejemplo, para la confirmacion del diagnostico o para establecer un margen limpio, o para la deteccion de celulas de carcinoma endometrial en otros tejidos como los nodulos linfaticos. La muestra biologica tambien puede ser de un sujeto con un diagnostico ambiguo, con el objeto de aclararlo. La muestra biologica tambien puede ser de un sujeto con una lesion histopatologicamente benigna para confirmar el diagnostico. Las muestras biologicas se pueden obtener utilizando cualquiera de una serie de metodos conocidos en la tecnica.
Como se ha senalado, una muestra biologica se puede tratar con un elemento de fijacion como formaldetudo y se puede introducir en parafina y seccionarse para su uso en los metodos de la invencion. Alternativamente, se puede prensar el tejido fresco o congelado contra el portaobjetos para formar monocapas de celulas conocidas como improntas, que contienen nucleos intactos y no sufren de los artefactos de truncacion que supone el seccionamiento. Estas celulas se pueden fijar, por ejemplo en soluciones alcoholicas como etanol al 100% o en 3:1 de metanol:acido acetico. Los nucleos tambien se pueden extraer de secciones gruesas de muestras introducidas en parafina para reducir los artefactos de truncacion y eliminar material extrano introducido. Tfpicamente las muestras biologicas, una vez obtenidas, se recogen y procesan antes de la hibridacion utilizando metodos estandar conocidos en la tecnica. Este procesamiento incluye rtpicamente el tratamiento con proteasa y una fijacion adicional en solucion de aldehfdo, como formaldetudo.
Preseleccion de muestras
Antes de la deteccion, las muestras de celulas pueden ser opcionalmente preseleccionadas, en base a anomalfas citologicas evidentes. La preseleccion identifica las celulas sospechosas, permitiendo asf centrar el estudio en esas celulas. La preseleccion permite una deteccion mas rapida y aumenta la probabilidad de que no se pierda un resultado positivo. Durante la preseleccion, las celulas de una muestra biologica se pueden colocar en el portaobjetos de un microscopio y se pueden explorar visualmente para detectar anomalfas citologicas habitualmente asociadas con celulas displasicas o neoplasicas. Estas anomalfas incluyen anomalfas en el tamano del nucleo, la forma del nucleo, la tincion del nucleo, evaluadas por contratincion de nucleos con colorantes para acidos nucleicos
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como yoduro de propidio o 4,6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI), normalmente tras la hibridacion de las sondas con sus AdN diana. ^picamente, las celulas neoplasicas contienen nucleos de mayor tamano, de forma irregular y/o muestran un patron de tincion moteado. El yoduro de propidio, tipicamente utilizado a una concentracion aproximada de entre 0,4 mu.g/ml y 5 mu.g/ml, es un colorante espedfico para ADN de fluorescencia roja que se puede observar a una longitud de onda maxima de emision de 614 nm. El DAPI, tfpicamente utilizado a una concentracion aproximada de entre 125ng/ml y 1000 ng/ml, es un colorante espedfico para ADN de fluorescencia azul que se puede observar a una longitud de onda maxima de emision de 452 nm. En este caso, solo las celulas preseleccionadas para la deteccion se someten a recuento para detectar las perdidas y/o ganancias cromosomicas. Preferiblemente, se eligen del orden de al menos 20, y mas preferiblemente al menos 30-40, celulas preseleccionadas para evaluar las perdidas y/o ganancias cromosomicas. La preseleccion de una region sospechosa en una seccion de tejido se puede realizar en una seccion en serie tenida con medios convencionales, como tincion con H&E o PAP, y la region sospechosa puede ser marcada por un patologo u otro tecnico debidamente formado. La misma region puede ser posteriormente ubicada en la seccion en serie tenida mediante FISH y se pueden enumerar los nucleos de esa region. Dentro de la region marcada, la enumeracion se puede limitar a los nucleos que muestran caractensticas anomalas como las anteriormente descritas.
Alternativamente, las celulas para la deteccion se pueden seleccionar con independencia de sus caractensticas citologicas o histologicas. Por ejemplo, todas las celulas que no se solapan de una determinada area o areas del portaobjetos de un microscopio pueden ser evaluadas para detectar perdidas y/o ganancias cromosomicas. En otro ejemplo, se pueden seleccionar las celulas del portaobjetos, por ejemplo, celulas que muestran una morfologfa alterada, del orden de al menos unas 50 y mas preferiblemente de al menos una 100, que aparecen en orden consecutivo en el portaobjetos de un microscopio para detectar perdidas y/o ganancias cromosomicas.
Patron de hibridacion
Hibridacion in situ
El patron de hibridacion para el conjunto de sondas cromosomicas en las regiones diana se detecta y registra para las celulas seleccionadas para la deteccion de perdidas y/o ganancias cromosomicas. La hibridacion se detecta por la presencia o ausencia de las senales concretas generadas por cada una de las sondas cromosomicas. El termino "patron de hibridacion" se refiere a la cuantificacion de perdidas/ganancias cromosomicas de las celulas seleccionadas para la evaluacion, en comparacion con el numero presente en una muestra de control correspondiente, para cada sonda de una muestra de celulas seleccionada. La cuantificacion de perdidas/ganancias puede incluir determinaciones que evaluan el ratio de un locus con respecto a otro en el mismo cromosoma o en un cromosoma diferente. Una vez que el numero de regiones diana de cada celula se ha determinado, evaluado por el numero de regiones que presentan hibridacion con cada sonda, se pueden cuantificar las ganancias y/o perdidas cromosomicas relativas.
La ganancia o perdidas relativa de cada sonda se determina comparando el numero de senales distintas de la sonda en cada celula con el numero previsto en una celula normal, es decir donde el numero de copias debena ser dos. Las celulas no neoplasicas de la muestra, como queratinocitos, fibroblastos y linfocitos, se pueden utilizar como celulas normales de referencia. Mas del numero normal de senales de la sonda se considera una ganancia y menos del numero normal se considera una perdida. Alternativamente, puede ser necesario un numero mmimo de senales por sonda por celula para considerar que la celula es anomala (por ejemplo, cinco o mas senales). Al igual que para la perdida, donde puede ser necesario un numero maximo de senales por sonda para considerar que la celula es anomala (por ejemplo, cero senales o una o menos senales).
Los porcentajes de celulas con al menos una ganancia y/o perdida se registraran para cada locus. Una celula se considera anomala si al menos una de las aberraciones geneticas identificadas por una combinacion de sondas de la presente invencion se encuentra en esa celula. Una muestra se puede considerar positiva en una ganancia o perdida, si el porcentaje de celulas con la correspondiente ganancia o perdida excede del valor de corte para cualesquiera sondas utilizadas en un ensayo. Alternativamente, pueden ser necesarias dos o mas aberraciones geneticas para considerar la celula anomala con el efecto de aumentar la especificidad. Por ejemplo, cuando las ganancias son indicativas de un carcinoma endometrial, una muestra se considera positiva si contiene, por ejemplo, al menos cuatro celulas que presentan ganancias de al menos dos o mas regiones que contienen sondas.
aCGH
El array de CGH se puede realizar en modo monocolor, bicolor o multicolor.
En modo monocolor, solo los acidos nucleicos de la muestra son etiquetados e hibridados con arrays de acidos nucleicos. Las diferencias en el numero de copias se pueden determinar detectando una intensidad de la senal en un determinado punto del acido nucleico diana del array que difiere de forma significativa de la intensidad de la senal observada en uno o mas puntos correspondientes a uno o mas loci presentes en los acidos nucleicos de la muestra en un numero de copias normal. Para facilitar esta determinacion, el array puede incluir elementos diana para uno o mas loci que no se espera que presenten diferencias en el numero de copias en el carcinoma endometrial.
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En el modo bicolor o multicolor, la senal correspondiente a cada coleccion de acidos nucleicos etiquetada (por ejemplo, acidos nucleicos de la muestra y acidos nucleicos normales de referencia) se detecta en cada punto del acido nucleico diana del array. Las senales de cada punto se pueden comparar, por ejemplo, calculando un ratio. Por ejemplo, si el ratio de senal del acido nucleico de la muestra con respecto a la senal del acido nucleico de referencia es superior a uno, esto indica una ganancia en los acidos nucleicos de la muestra en el locus correspondiente al punto de acidos nucleicos del array. Por el contrario, si el ratio de la senal del acido nucleico de la muestra con respecto a la senal del acido nucleico de referencia es inferior a uno, esto indica una perdida en los acidos nucleicos de la muestra en el correspondiente locus.
Otros metodos para detectar variaciones en el numero de copias asociadas con el carcinoma endometrial
Los expertos en la tecnica apreciaran que las variaciones en cualquiera de los loci descritos en el presente se puede detectar utilizando otros metodos, incluyendo metodos basados en la amplificacion y secuenciacion de ADN de alto rendimiento.
Deteccion basada en la amplificacion
En los ensayos basados en la amplificacion, los acidos nucleicos diana actuan como plantilla o plantillas de la reaccion o reacciones de amplificacion (por ejemplo, la reaccion en cadena de la polimerasa o PCR). En una amplificacion cuantitativa, la cantidad del producto de la amplificacion es proporcional a la cantidad de plantilla en la muestra original. Los protocolos detallados para la PCR cuantitativa se proporcionan en Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.). Existen diversos sistemas de PCR cuantitativa disponibles en el mercado, tales como el sistema TaqMan de Applied Bio systems.
Otros metodos de amplificacion adecuados, incluyen, entre otros, la reaccion en cadena de ligasa (LCR) (vease Wu y Wallace (1989) Genomics 4: 560; Landegren et al. (1988) Science 241: 1077; y Barringer et al. (1990) Gene 89: 117), la amplificacion de sondas dependiente de ligandos multiples (MLPA), la amplificacion por transcripcion (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173), la replicacion de secuencia autosostenida (Guatelli et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874), la PCR dot y la PcR con adaptador del enlazador, etc.
La amplificacion se realiza tipicamente utilizando cebadores que amplifican de forma espedfica uno o mas loci dentro de cada cromosoma o region cromosomica a analizar. La deteccion se puede realizar utilizando cualquier medio estandar, incluyendo una sonda de diana espedfica, una sonda universal que se une, por ejemplo, a una secuencia introducida en todos los ampliconos a traves de uno o de los dos cebadores, o un colorante de union a ADN de cadena doble (como, por ejemplo, SYBR Green). En realizaciones ilustrativas, se emplean sondas candado o sondas de inversion molecular para la deteccion.
Secuenciacion de ADN de alto rendimiento
En realizaciones concretas, se utilizan metodos de amplificacion para producir ampliconos adecuados para la secuenciacion de ADN de alto rendimiento (es decir, automatizada). Por lo general, los metodos de amplificacion que proporcionan una amplificacion sustancialmente uniforme de las secuencias de nucleotidos diana se emplean para preparar bibliotecas de secuenciacion de ADN que tienen buena cobertura. En el contexto de la secuenciacion de ADN automatizada, el termino "cobertura" se refiere al numero de veces que la secuencia se mide tras la secuenciacion. Los recuentos obtenidos son tfpicamente normalizados con respecto a una muestra o muestras de referencia para determinar el numero de copias relativo. Por tanto, despues de realizar una secuenciacion automatizada de una pluralidad de ampliconos diana, el numero normalizado de veces que se mide la secuencia refleja el numero de ampliconos diana que incluye esa secuencia, lo que a su vez refleja el numero de copias de la secuencia diana en el ADN de muestra.
La amplificacion para la secuenciacion puede implicar aislados de la PCR de emulsion en la que las moleculas de ADN individuales junto con los granulos recubiertos de cebador se encuentran presentes en forma de pequenas gotas acuosas en una fase oleosa. A continuacion, la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) recubre cada granulo con copias clonales de la molecula de ADN, seguida de la inmovilizacion para la posterior secuenciacion. La PCR de emulsion se utiliza en los metodos de Marguilis et al. (comercializada por 454 Life Sciences), Shendure y Porreca et al. (tambien conocida como “secuenciacion Polony”) y secuenciacion SOLiD, (desarrollada por Agencourt, actualmente Applied Biosystems). Otro metodo para la amplificacion clonal in vitro para la secuenciacion es la PCR de puente, donde los fragmentos se amplifican despues de unir los cebadores a una superficie solida, como la utilizada en el Illumina Genome Analyzer. Algunos metodos de secuenciacion no requieren amplificacion, como por ejemplo el metodo de molecula unica desarrollado por el laboratorio Quake (posteriormente comercializado por Helicos). Este metodo utiliza fluoroforos brillantes y excitacion laser para detectar eventos de pirosecuenciacion de moleculas de ADN individuales fijadas a una superficie. Pacific Biosciences tambien ha desarrollado un metodo de secuenciacion de molecula unica que no requiere amplificacion.
Tras la amplificacion clonal in vitro (si resulta necesaria), las moleculas de ADN que se unen ffsicamente a una superficie son secuenciadas. La secuenciacion por smtesis, como la secuenciacion electroforetica por terminacion
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fluorescente, utiliza una polimerasa de ADN para determinar la secuencia de base. Los metodos del terminador reversible (utilizados por Illumina y Helicos) utilizan versiones reversibles de terminadores fluorescentes, anadiendo un nucleotido cada vez, y detectando la fluorescencia en cada posicion en tiempo real, mediante la eliminacion repetida del grupo de bloqueo para permitir la polimerizacion de otro nucleotido. La pirosecuenciacion (utilizada por 454) tambien emplea la polimerizacion de ADN, anadiendo una especie de nucleotido cada vez y detectando y cuantificando el numero de nucleotidos anadidos a un determinado lugar a traves de la luz emitida por la liberacion de pirofosfatos unidos.
La secuenciacion de Pacific Biosciences Single Molecule Real Time (SMRT™) se basa en la procesividad de la polimerasa de ADN para secuenciar moleculas unicas y utiliza nucleotidos fosfoenlazados, cada tipo etiquetado con un fluoroforo de un color diferente. Dado que los nucleotidos son incorporados en una cadena de ADN complementaria, cada uno es contenido por la polimerasa de ADN dentro de un volumen de deteccion durante una mayor cantidad de tiempo de la que tarda el nucleotido en entrar y salir del volumen de deteccion. A continuacion, la polimerasa de ADN cliva el enlace que anteriormente mantema el fluoroforo en su lugar y el colorante sale del volumen de deteccion de forma que la senal de fluorescencia vuelve al contexto de fondo. El proceso se repite a medida que avanza la polimerizacion.
La secuenciacion por ligacion utiliza la ligasa de ADN para terminar la secuencia diana. Utilizado en el metodo Polony y en la tecnologfa SOLiD, este metodo emplea un conjunto de todos los oligonucleotidos posibles de una longitud determinada, etiquetados en funcion de la posicion secuenciada. Los oligonucleotidos son renaturalizados y ligados; la ligacion preferible por ligasa de ADN para las correspondientes secuencias produce una senal informativa del nucleotido en esa posicion.
Combinaciones de sondas y kits para aplicaciones de diagnostico y/o pronostico
La invencion incluye combinaciones de sondas altamente espedficas y sensibles, como las descritas en el presente, que se pueden utilizar para detectar el carcinoma endometrial. La divulgacion incluye kits para su uso en aplicaciones de diagnostico, investigacion y pronostico. Los kits incluyen combinaciones de sondas y tambien pueden incluir reactivos como tampones y similares. Los kits pueden incluir materiales instructivos con indicaciones (es decir, protocolos) para la practica de los metodos de esta divulgacion. A pesar de que los materiales de instrucciones incluyen tipicamente materiales escritos o impresos, no se limitan a esto. Cualquier medio capaz de almacenar estas instrucciones y transmitirlas al usuario final esta contemplado por la presente divulgacion. Estos medios incluyen, entre otros, medios de almacenamiento electronico (por ejemplo, discos magneticos, cintas, cartuchos, chips), medios opticos (como CD ROM) y similares. Estos medios pueden incluir direcciones de sitios de internet que proporcionan los mencionados materiales instructivos.
Referencias
I.Int J Mol Med. 2003 Nov;12(5):727-31. Una perdida en 11q23-24 esta asociada con una inestabilidad cromosomica en el cancer endometrial. Kawasaki K, Suehiro Y, Umayahara K, Morioka H, Ito T, Saito T, Tsukamoto N, Sugino N, Kato H, Sasaki K.
2. Hum Genet. 1997 Oct; 100(5-6):629-36. Ganancias frecuentes enlos brazos cromosomicos 1q y/o 8q en el cancer endometrial humano. Suzuki A, Fukushige S, Nagase S, Ohuchi N, Satomi S, Horii A.
3. Cancer Genet Cytogenet. 2008 Feb;181(l):25-30. Amplificaciones de genes recurrentes en el adenocarcinoma endometrial humano de tipo I detectadas mediante hibridacion in situ con fluorescencia. Samuelson E, Levan K, Adamovic T, Levan G, Horvath G.
4. Cytogenet Genome Res. 2006; 115(1): 16-22. Alteraciones cromosomicas en 98 adenocarcinomas endometroides analizadas con hibridacion genomica comparativa. Levan K, Partheen K, Osterberg L, Helou K, Horvath G.
5. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2005 May 1; 120(1): 107-14. Desequilibrios geneticos en la hiperplasia endometrial y el carcinoma endometrioide detectados por hibridacion genomica comparativa. Muslumanoglu HM, Oner U, Ozalp S, Acikalin MF, Yalcin OT, Ozdemir M, Artan S.
6. Am J Clin Pathol. 2004 Oct;122(4):546-51. Sobrerrepresentacion de 8q en carcinosarcomas y adenocarcinomas endometriales. Schulten HJ, Gunawan B, Enders C, Donhuijsen K, Emons G, Fiizesi L.
7. Hum Genet. 1997 Oct; 100(5-6):629-36. Ganancias frecuentes en los brazos cromosomicos 1q y/o 8q en el cancer endometrial humano. Suzuki A, Fukushige S, Nagase S, Ohuchi N, Satomi S, Horii A.
8. Genes Chromosomes Cancer. 1997 Feb; 18(2): 115-25. Deteccion de ganancias y perdidas de ADN en carcinomas endometriales primarios mediante hibridacion genomica comparativa. Sonoda G, du Manoir S, Godwin AK, Bell DW, Liu Z, Hogan M, Yakushiji M, Testa JR.
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9. USPN 5713369 titulada “Uterine endometrial tissue sample brush.”
10. USPN 4227537 titulada “Endometrial brush with slidable protective sleeve.”
11. Guido RS, Kanbour-Shakir A, Rulin MC, Christopherson WA. Pipelle endometrial sampling. Sensitivity in the detection of endometrial cancer. J Reprod Med 1995;40(8):553-5.
12. Critchley HO, Warner P, Lee AJ, Brechin S, Guise J, Graham B. Evaluation of abnormal uterine bleeding: comparison of three outpatient procedures within cohorts defined by age and menopausal status. Health Technol Assess 2004;8(34):iii-iv, 1-139.
13. Del Priore G, Williams R, Harbatkin CB, Wan LS, Mittal K, Yang GC. Endometrial brush biopsy for the diagnosis of endometrial cancer. J Reprod Med 2001;46(5):439-43.
14. Kipp BR, Medeiros F, Campion MB, Distad TJ, Peterson LM, Keeney GL, et al. Direct uterine sampling with the Tao brush sampler using a liquid-based preparation method for the detection of endometrial cancer and atypical hyperplasia: a feasibility study. Cancer 2008;114(4):228-35.
15. Maksem JA. Performance characteristics of the Indiana University Medical Center endometrial sampler (Tao Brush) in an outpatient office setting, first year's outcomes: recognizing histological patterns in cytology preparations of endometrial brushings. Diagn Cytopathol 2000;22(3): 186-95.
16. Williams AR, Brechin S, Porter AJ, Warner P, Critchley HO. Factors affecting adequacy of Pipelle and Tao Brush endometrial sampling. Bjog 2008; 115(8): 1028- 36.
17. Yang GC, Wan LS. Endometrial biopsy using the Tao Brush method. A study of 50 women in a general gynecologic practice. J Reprod Med 2000;45(2):109-14.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes se ofrecen a tttulo ilustrativo y no limitan la invencion reivindicada. Todos los ejemplos que no estan dentro del alcance de las reivindicaciones se aportan con fines comparativos.
Ejemplo 1
Estudios de array de CGH Diseno del estudio
En un estudio colaborativo de Abbott Molecular y Mayo Clinic realizado en 2007-2009, se obtuvieron muestras congeladas de biopsias de carcinoma endometrial confirmado de 62 pacientes con el consentimiento informado en el momento de la cirugfa en el Rochester Methodist Hospital de Mayo Clinic, Rochester, MN. Se cortaron secciones de 5 pm del tejido recogido y estas secciones se tineron con hematoxilina y eosina (H&E) para el analisis histologico. Las muestras con mas de un 70% de tumor se seleccionaron para un analisis aCGH y las restantes secciones se dejaron sin tenir para futuros estudios clmicos.
El ADN de las muestras seleccionadas se extrajo y amplifico con anterioridad al analisis CGH con el sistema GenoSensor™. Los portaobjetos de microarrays de ADN de Vysis GenoSensor obtenidos de Abbott Molecular (Des Plaines, IL) se utilizaron para el analisis cGh. Los portaobjetos de microarrays conteman 287 dianas de ADN consistentes en oncogenes conocidos, genes supresores de tumores, y regiones de ganancia, perdida o perdida de heterocigosidad habitualmente asociada con el cancer (Adjunto 1). Las dianas obtenidas de bibliotecas de BAC se dispusieron en arrays por triplicado.
Las muestras de ADN de ensayo y de referencia normales se etiquetaron con cebado aleatorio, utilizando reactivos de etiquetado Vysis GeneSensor, con Cyanine3-dCTP, and Cyanine5-dCTP (Perkin Elmer/NEN), respectivamente. El cebado aleatorio se refiere al proceso por el que los octameros de ADN sinteticos de una secuencia aleatoria se unen a secuencias de ADN complementarias (a lo largo de una plantilla de ADN) y sirven como plantillas para la smtesis de ADN y la elongacion mediante ADN polimerasa I (fragmento de Klenow). Tras la purificacion adicional, el ADN de ensayo y de referencia se mezclo en una proporcion igual (en tampon de hibridacion), se desnaturalizo y se hibrido con el microarray de ADN genomico humano Vysis GenoSensor ™ Array 300. La hibridacion se produjo a 30°C durante 72 horas, tras el lavado y el analisis de los arrays. Las imagenes de los arrays se analizaron con el software GenoSensor ™, que segmenta e identifica cada diana utilizando el plano de imagen azul (DAPI). El software mide las intensidades medias de los planos de imagen verde y rojo, elimina el fondo, determina el ratio medio de senal verde/roja, y calcula el ratio mas representativo del numero de copias de ADN modal del ADN de la muestra. Las hibridaciones sin coincidencia de genero (hombre/mujer o mujer/hombre) proporcionaron el control con respecto a la deteccion de los desequilibrios del numero de copias autosomicas. Los arrays se hibridaron en la Mayo
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Clinic y los datos de la aCGH obtenidos fueron analizados por Abbott Molecular.
En total, se dispoma de 57 muestras de cancer (44 endometrioides y 13 no endometrioides) y de nueve muestras normales para el analisis.
Resultados
Los datos de la CGH revelaron diversas dianas genomicas prometedoras para estos
conjuntos de sondas FISH de investigacion (Figura 1). Las ganancias mas frecuentes observadas en todos los carcinomas endometriales incluyeron areas en los brazos cromosomicos 1q, 2p, 3q, 8q, and 20q. Las perdidas mas comunes observadas en todos los carcinomas incluyeron 9p, 9q, 16q, 17p, 18q, and 22q. Cabe senalar que se observaron diferentes cambios genomicos a la hora de comparar los subtipos endometrioides y no endometrioides. Las ganancias en los brazos cromosomicos 1q, 10p y 10q fueron habituales en los carcinomas endometrioides. En los carcinomas no endometrioides se observaron multiples ganancias en el genoma y las ganancias mas habituales se observaron en 3q, 8q y 20q.
El analisis bruto de los cambios cromosomicos demostro que los cambios mas frecuentes en todos los canceres analizados fueron los siguientes:
1. Ganancias en 1q31-qtel (20-30%)
2. Ganancias en 3q, 8q y 10q (aprox. 20%)
3. Ganancia en 2p (aprox. 15%)
4. Perdidas en 9q (aprox. 18%)
5. Perdidas en 15q11-q13 (aprox. 18%)
6. Perdidas en 18q21.3 y 19ptel (aprox. 18-19%)
7. Perdidas en 16q y 17p (aprox. 12%)
La Tabla1 proporciona datos de los loci afectados con mayor frecuencia (por clon del array).

Claims (35)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para detectar la presencia de carcinoma endometrial en una muestra biologica de un sujeto, donde el metodo consiste en lo siguiente:
    poner en contacto la muestra con una o mas sondas para una o mas regiones o subregiones cromosomicas, o combinaciones de estas, seleccionadas del grupo compuesto por: la region centromerica del cromosoma 18, 1q, 2p, 2q, 3p, 3q, 7p, 8p, 8q, 9p, 9q, la region centromerica del cromosoma 10, 10q, 15q, 16q, 17p, 18q, 19p, 20q, y 22q, donde dicha sonda o sondas con las que se pone en contacto la muestra incluyen una sonda para la region centromerica del cromosoma 18;
    incubar la sonda o sondas con la muestra en condiciones en las que cada sonda se une selectivamente con una secuencia de polinucleotidos de su region cromosomica o cromosoma diana para formar un complejo de hibridacion estable; y detectar la hibridacion de la sonda o sondas, donde un patron de hibridacion que muestra una ganancia en la region centromerica del cromosoma 18 es indicativo de carcinoma endometrial.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, donde un patron de hibridacion que muestra una ganancia en la region centromerica del cromosoma 18 y al menos una ganancia o perdida o desequilibrio en la region cromosomica a la que se dirigen una o mas de las demas sondas es indicativo de carcinoma endometrial.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, donde la muestra se pone en contacto con una combinacion de sondas que comprende sondas para las subregiones cromosomicas CEp18 y 1q24.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, donde la muestra se pone en contacto con una combinacion de sondas que comprende sondas para las subregiones cromosomicas CEp18, 1q24, y 8q24 (MYC).
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, donde la muestra se pone en contacto con una combinacion de sondas que comprende sondas para las subregiones cromosomicas CEp18, 1q24, 8q24 (MYC), 20q13.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, donde la muestra se pone en contacto con una combinacion de sondas que comprende sondas para las subregiones cromosomicas CEp18, 1q24, 10q26 (FGFR2), 20q13.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, donde la muestra se pone en contacto con una combinacion de sondas que comprende sondas para las subregiones cromosomicas CEp18, 1q24, PIK3CA, 20q13.
  8. 8. El metodo de las reivindicaciones 1 a 7, donde un patron de hibridacion que muestra una ganancia en una o mas regiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por: 1q, 2p, 3q, 8q, 10q, y 20q es indicativo de carcinoma endometrial.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, donde un patron de hibridacion que muestra una ganancia en una o mas regiones cromosomicas:
    (i) 1q, 10p, y 10q es indicativo de carcinoma endometrioide; y
    (ii) 3q, 8q, 18q, y 20q es indicativo de carcinoma no endometrioide.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 1, donde la muestra se pone en contacto con una combinacion de sondas para un conjunto de subregiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por:
    1q25, 18q21, CEP18, 8q24;
    18q21, 1q24, 8q24, CEP18;
    1q24, 8q24, 10q26, CEP18;
    18q21, lq24, 10q26, CEP18;
    1q24, 8q24, CEP18, 3q27-q29;
    1q24, 2p24, 10q26, CEP18;
    1q24, 10q26, CEP18, 3q27-q29;
    1q24, CEP18, 3q27-q29, 20q13;
    1q24, 2p24, CEP18, 3q27-q29; y 18q21, 1q24, CEP18.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 1, donde la muestra se pone en contacto con una combinacion de al menos cuatro sondas para un conjunto de subregiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por:
    1q24, 8q24, CEP18, 20q13;
    1q24, CEP18, 3q27-q29, 20q13;
    1q24, CEP18, 20q13, 10q26;
    CEP 10, 8q24, CEP18, 1q24;
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    8q24, 1q24, 20q13, CEP18; 10q26;
    donde un patron de hibridacion que muestra una ganancia en una o mas de estas subregiones cromosomicas es indicativo de carcinoma endometrial.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 1, donde la muestra se pone en contacto con una combinacion de sondas para un conjunto de subregiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por:
    18q21, 1q25, 8q24, CEP18;
    1q25, 8q24, 10q26, CEP18;
    18q21, 1q25, 10q26, CEP18;
    1q25, 8q24, CEP18, 3q27-q29;
    1q25, 2p24, 10q26, CEP18;
    1q25, 10q26, CEP18, 3q27-q29;
    1q25, 10q26, CEP18, 20q13;
    1q25, CEP18, 3q27-q29, 20q13;
    1q25, 2p24, CEP18, 3q27-q29;
    1q25, 8q24, CEP18;
    18q21, 1q25, CEP18; y 1q25, CEP18.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 1, donde la muestra se pone en contacto con una combinacion de al menos cuatro sondas para un conjunto de subregiones cromosomicas seleccionadas del grupo compuesto por:
    1q25, 8q24, CEP18, 20q13;
    1q25, CEP18, 3q27-q29, 20q13;
    1q25, CEP18, 20q13, 10q26;
    CEP 10, 8q24, CEP18, 1q25;
    8q24, 1q25, 20q13, CEP18; 10q26;
    donde un patron de hibridacion que muestra una ganancia en una o mas de estas subregiones cromosomicas es indicativo de carcinoma endometrial.
  14. 14. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la combinacion de sondas comprende entre 2 y 10 sondas o entre 3 y 8 sondas.
  15. 15. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la combinacion de sondas comprende 4 sondas.
  16. 16. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el metodo se lleva a cabo a traves de:
    (i) array de hibridacion genomica comparativa (aCGH) con sondas inmovilizadas sobre un sustrato; o
    (ii) hibridacion in situ con fluorescencia y cada sonda de la combinacion de sondas se etiqueta con un fluoroforo diferente.
  17. 17. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde:
    (i) la muestra consiste en una muestra tomada con un raspador endometrial o una muestra de una biopsia endometrial.
  18. 18. Una combinacion de sondas seleccionadas de las combinaciones definidas en cualquiera de las reivindicaciones 3-13, donde la combinacion se compone de las sondas enumeradas en cada una de las combinaciones indicadas.
  19. 19. El uso de una combinacion de sondas en el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde la combinacion de sondas comprende entre 2 y 10 sondas, siendo dicha combinacion una combinacion de sondas como la que se define en cualquiera de las reivindicaciones 3-12.
  20. 20. El uso de una combinacion de sondas en el metodo de detectar la presencia de carcinoma endometrial, donde la combinacion de sondas comprende entre 2 y 10 sondas, siendo dicha combinacion una combinacion de sondas como la que se define en cualquiera de las reivindicaciones 3-12.
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    ■ Normal ■ Hiperplasia simple □ Hiperplasia compleja
    □ Endometrioide ■ Carcinosarcoma/MMMT ■ Celulas daras
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    FIG. 6A
    % de celulas con perdida
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    ■ Normal
    ■ Hiperplasia simple D Hiperplasia compleja
    □ Endometrioide
    ■ Carcinosarcoma/MMMT ■ Celulas daras
    ■ Seroso
    FIG. 6B
    imagen27
    imagen28
    iff ~~~ :
    %OCC/CEP18 %DCC %CEP18 %MYC %1q24 %20q13 %NMYC %FGFR2 %PIK3CA
    ■ Normal ■ Hiperplasia simple □ Hiperplasia compleja
    □ Endometrioide ■ Carcinosarcoma/MMMT ■ Cdulasdaras
    ■ Seroso
    FIG. 6C
    imagen29
    Cu rva ROC —---------------
    1,00 -1
    U,oU
    O U,oU ‘J5
    QJ ln
    UjZU
    u,uu - s c
    ■ C r c r c i * c $ r c 1-es 5 r c pec s r c ficid L f r c lad 8 S? 8 r © CT r-"
    Cortes (% celulas con ganancia o
    perdida del numero de copias)
    1q24 26
    CEP18 28
    MYC 36
    DCC 38
    FIG. 7
    imagen30
    Sensibilidad
    Curva ROC
    imagen31
    FIG. 9
    imagen32
    Sp n
    Tlpo de gGr n.D tumor iTest o Ref? Sp n,° Edad MYC% gan >4 CPE18% gan >4 1q24% % gan >6 20q13,2% % gan >4 MAX de 4 Max /50 :EP10% CPE10%F6FTR% PTEN % deseq perd gan perd l>12 >10 >1 >1B
    101
    1 Normal N+Hiperi 101 Edad=64 0 0 0 0 0 0 10 10 0 12
    102
    1 Normal N+Hiper] 102 Edad=40 0 0 0 0 0 0 6 6 0 S
    103
    1 Normal N+Hiper| 103 Edad=48 0 0 0 0 0 0 8 8 0 14
    104
    1 Normal N+Hiperi 104 Edad=47 0 0 0 4 4 2 2 2 0 S
    105
    1 Normal N+Hiperi 105 Edad=64 0 0 0 0 0 0 6 6 0 18
    105
    1 Normal N+Hipen 106 Edad=60 0 0 0 0 £> 0 4 4 0 4
    107
    1 Normal N+Hiperi 107 Edad=83 0 0 0 0 0
    108
    1 Normal N+Hiper| 108 Edad=55 0 0 0 0 0
    109
    1 Normal N+Hiperi 109 Edad=62 0 0 0 0 0
    110
    1 Normal N+Hiperi 110 Edad=38 0 0 0 4 4
    86
    2 Hiperplasia simple N+Hiperf 86 Edad®72 0 2 2 0 2 1 26 0 28
    SB
    2 Hiperplasia simple N+Hiperi 88 Edad=78 12 6 8 0 12 6 6 3 0 10
    96
    2 Hiperplasia simple N+Hiper| 96 Edad=5o □ 2 2 0 2
    97
    2 Hiperplasia simple N+Hiper| 97 Edad=5Q 0 2 2 4 4 2 10 10 0 14
    100
    2 Hiperplasia simple N+Hiperi 100 Edad=55 0 0 0 0 0 0 8 8 0 10
    85
    3 Hiperplasia compleja N+Hiperi 85 Edad-68 72 a 6 2 72
    87
    3 Hiperplasia compleja N+Hiper| 87 Edad=59 2 A 0 2 4 2 2 2 0 6
    89
    3 Hiperplasia compleja N+Hiper| 89 Edad=38 0 2 0 0 2 1 4 4 0 6
    90
    3 Hiperplasia compleja N+Hipeq 90 Edad-52 4 2 2 0 4
    91
    3 Hiperplasia compleja N+Hiper| 91 Edad=58 0 4 4 0 4
    93
    3 Hiperplasia compleja N+Hiperi 93 Edad=60 2 2 6 2 &
    2
    4 2 Edad=5B □ 0 0 0 0 0 18 18 2 26
    3
    4 Ca grado endometroide 3 Edad=58 58 8 10 4 63 29 18 14 0 18
    4
    4
    Ca grado endometroide 4 Edad=77 14 8 82 12 82 41 12 8 0 8
    5
    4 Ca grado endometroide 5 Edad=79 26 16 38 10 38 19 26 12 24 14
    14
    4 Ca grado endometroide 14 Edad=47 56 44 38 16 56 2B 23 [ 8 12 10
    15
    4 Ca grado endometroide 15 Edad=60 4 4 4 10 10 S 18 18 2 13
    16
    4 Ca grado endometroide 16 Edad=64 0 2 4 4 4 2 26 26 4 28
    18
    4 Ca grado endometroide 18 Edad =0 8 10 80 0 B0 40 8 4 2
    56
    4 Ca grado endometroide 56 Edad=57 0 4 0 0 4 2 22 22 0 26
    57
    4 Ca grado endometroide 57 Edad=58 8 2 2 0 8 4 22 22 0 26
    se
    4 Ca grado endometroide 58 Edad=76 2 6 2 12 12 6 26 16 8 16
    59
    4 Ca grado endometroide 59 Edad=65 0 0 8 2 e 4 16 16 0 22
    61
    4 Ca grado endometroide 61 Edad=B1 4 8 6 2 B 4 14 12 O 12
    63
    4 Ca grado endometroide 63 Edad =81 8 6 86 2 86 43 14 C 10 0 14
    65
    4 Ca grado endometroide 65 Edad =55 2 6 2 0 6 3 34 34 4 38
    7
    5 Ca grado endometroide 7 Edad =69 74 16 8 0 74
    8
    5 Ca grado endometroide 8 Edad = 54 14 10 — 2 — 4 14
    33
    5 Ca grado endometroide 33 Edad=56 6 14 83 2 88
    34
    s 34 Edad =70 26 0 2 4 26 13 10 8 52 16
    35
    5 Ca grado endometroide 35 Edad =70 18 6 12 2 18
    36
    s Ca grado endometroide 36 Edad =79 62 28 68 56 63
    37
    5 Ca grado endometroide 37 Edad =54 10 12 70 2 70
    66
    5 Ca grado endometroide 66 Edad=59 14 24 90 10 90
    67
    5 Ca grado endometroide 67 Edad =85 0 0 0 2 2
    70
    5 Ca grado endometroide 70 Edad =60 80 8 12 A 60
    83
    5 Ca grado endometroide 83 Edad=48 28 10 26 12 28
    9
    6 Ca grado endometroide 9 Edad =44 62 18 18 0 62
    42
    6 Ca grado endometroide 42 Edad«77 16 18 82 16 82
    43
    6 Ca grado endometroide 43 Edad =71 80 30 92 10 62
    44
    6 Ca grado endometroide 44 Edad =66 14 12 90 4 90
    45
    6 Ca grado endometroide 45 Edad=42 24 28 32 6 32
    47
    6 Ca grado endometroide 47 Edad =68 98 76 78 80 98
    75
    6 Ca grado endometroide 75 Edad =56 30 18 34 10 34
    76
    6 Ca grado endometroide 76 Edad =59 42 I 0 28 16 42
    77
    6 Ca grado endometroide 77 Edad =47 82 88 58 44 88
    1
    7 Seroso Ca 1 Edad=60 74 50 64 48 74
    6
    7 Seroso Ca 6 Edad=$2 84 76 84 74 84
    10
    7 Seroso Ca 10 Edad=64 94 72 50 50 94
    49
    7 Seroso Ca 49 Edad=42 94 100 92 65 100
    50
    7 Seroso Ca 50 Edad=76 82 22 64 34 82
    51
    7 Seroso Ca 51 Edad=80 92 66 84 98 93
    79
    7 Seroso Ca 79 Edad=77 62 30 64 82 62
    80
    7 Seroso Ca 80 Edad=87 96 42 84 98 98
    94
    7 Seroso Ca 94 Edad=59 84 70 78 18 84
    11
    8 Carcinosarcoma/MMMT Ca 11 Edad-86 90 2 6 56 90
    12
    8 Carcinosarcoma/MMMT Ca 12 Edad=68 76 12 56 66 76
    78
    8 Carcinosarcoma/MMMT Ca 78 Edad =67 90 52 86 60 50
    54
    9 Celulas claras Ca 54 Edad =75 94 22 92 88 34
    81
    9 Celulas claras Ca S1 Edad=84 94 60 90 42 94
    Total
    42 41 38 29 H I * t
    FIG. 10
ES11780917.8T 2010-05-10 2011-05-10 Detección de anomalías cromosómicas asociadas con el cáncer endometrial Active ES2621812T3 (es)

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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2621812T3 (es) 2010-05-10 2017-07-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detección de anomalías cromosómicas asociadas con el cáncer endometrial
WO2015195949A2 (en) 2014-06-18 2015-12-23 Clear Gene, Inc. Methods, compositions, and devices for rapid analysis of biological markers
US9994912B2 (en) * 2014-07-03 2018-06-12 Abbott Molecular Inc. Materials and methods for assessing progression of prostate cancer
US11401558B2 (en) 2015-12-18 2022-08-02 Clear Gene, Inc. Methods, compositions, kits and devices for rapid analysis of biological markers
US11244311B2 (en) * 2018-09-26 2022-02-08 International Business Machines Corporation Decentralized smart resource sharing between different resource providers
CN113621705A (zh) * 2021-07-28 2021-11-09 苏州宏元生物科技有限公司 一种女性生殖系统肿瘤筛查、诊断和预后评估试剂盒

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4227537A (en) 1978-03-08 1980-10-14 Tucson Medical Instruments, Inc. Endometrial brush with slidable protective sleeve
US5756696A (en) 1986-01-16 1998-05-26 Regents Of The University Of California Compositions for chromosome-specific staining
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5491224A (en) 1990-09-20 1996-02-13 Bittner; Michael L. Direct label transaminated DNA probe compositions for chromosome identification and methods for their manufacture
ATE205542T1 (de) 1992-03-04 2001-09-15 Univ California Vergleichende genomhybridisierung
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
EP0831854A4 (en) 1995-06-06 2001-01-24 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGONUCLEOTIDS WITH PHOSPHOROTHIOATE BINDINGS OF HIGH CHIRAL PURITY
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US5713369A (en) 1995-09-13 1998-02-03 Vance Products Inc. Uterine endometrial tissue sample brush
US20040248107A1 (en) * 2003-06-09 2004-12-09 Sokolova Irina A. Detection of high grade dysplasia in cervical cells
ES2618858T3 (es) * 2005-09-02 2017-06-22 The Regents Of The University Of California Métodos y combinaciones de pruebas para detectar melanoma
EP1991701A4 (en) * 2006-02-14 2010-03-17 Dana Farber Cancer Inst Inc COMPOSITIONS, KITS, AND METHODS FOR IDENTIFYING, EVALUATING, PREVENTING, AND TREATING CANCER
EP3733871A1 (en) * 2008-05-27 2020-11-04 Dako Denmark A/S Compositions and methods for detection of chromosomal aberrations with novel hybridization buffers
ES2621812T3 (es) 2010-05-10 2017-07-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detección de anomalías cromosómicas asociadas con el cáncer endometrial

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