JP2007530075A - 乳がんの予後診断のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、新規な組成物ならびに乳房腫瘍を分類する際のその使用方法を提供する。

Description

（発明の属する技術分野）
本発明は一般に、核酸、核酸検出、がん、および乳がんの分野に関する。

（相互参照）
本願は、２００４年４月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／５６４，７５８号、２００４年６月１日に出願された同第６０／５７５，９７８号、２００４年１１月３０日に出願された同第６０／６３１，７０２号、ならびに２００４年１２月７日に出願された同第６０／６３３，８２６号の優先権を主張する。

（参照による援用）
配列表を含んでいるコンパクト・ディスクの提出物は、ここで参照により明らかに組込まれる。提出物は３つのコンパクト・ディスク（「ＣＯＰＹ １−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ ｐａｒｔ」、「ＣＯＰＹ ２−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ ｐａｒｔ」、および「ＣＯＰＹ ３−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ ｐａｒｔ」）を含み、これらは内容において同一である。各ディスクには、２００５年４月２２日に作成された、ファイル名が「０４−１６４−ＰＣＴ ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ＳＴ２５．ｔｘｔ」で、サイズが１０．６ＭＢのファイルが含まれている。

（背景）
乳がんは、女性に最も一般的ながんであり、米国におけるがんによる死の２番目に多い原因である。生殖細胞系列でのＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２遺伝子における突然変異により、その突然変異を持った女性は乳がんに罹患しやすくなるが、これらの乳がん感受性遺伝子に関係しているのは乳がんの約５−１０％のみである。現在使用されている乳がん予後の臨床指標は、予後が好ましいであろう患者の識別においては正確ではない。その結果、補助化学療法から利益を得るであろう患者よりも多くの患者が該治療を受けている。（２００４年３月２５日公開の特許文献１）。

生殖細胞系列の突然変異（「散発的な腫瘍」）に関係しているとは現在認識されていない腫瘍が、大多数の乳がんを構成している（特許文献１）。乳がんがその進行の初期で検出されない場合は罹病率および死亡率が増加するので、乳房腫瘍の発生の早期発見に相当な努力が為されてきた。

乳がんの診断は、典型的には腫瘍の存在を組織病理学的に証明する必要がある。病理組織検査は予後に関する情報も提供し、治療計画を選択するのを支援する。予後診断は、腫瘍のサイズ、腫瘍の等級、患者の年齢およびリンパ節への転移のようなパラメータに基づいて為される場合もある（特許文献１）。

乳がん患者の中で遠隔転移を伴わずに生存するものについて正確に予後診断または判定することにより、最も積極的な治療を受けている予後の比較的悪い女性に、選択的に補助化学療法を投与することが可能になるだろう。

マイクロアレイ技術の成熟は、ゲノム全体に渡る遺伝子発現（ＲＮＡ）データの日常的収集を可能にした。様々な著者により、腫瘍から集められたマイクロアレイデータが鑑別診断、腫瘍ステージの判定および予後診断において有用かもしれないことが示されている。これらの研究によって得られたデータはまさしく新しい診断法の開発に有用な資源に相
当するものである。しかしながら、現在のマイクロアレイ技術にはサンプルの収集と調製のステップが必要であり、日常的な臨床導入が阻まれている。

対照的に、ＤＮＡ系のマーカーは、がんの診断において一般的に使用されている。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）およびＲＴ−ＰＣＲ技術を利用した診断の実施は、広く使用されている。このような一般に受け入れられた技術に基づいた新しい診断用製品は、より速く臨床において認められるであろう。

特定の遺伝子異常が臨床上の特性に関係している場合が多いことは、立証されている。例としては、乳がんにおける１ｐ／１９ｑの欠失と化学療法に対する高い応答性との関係、ならびに８ｑの獲得と前立腺がんにおける予後不良との関係が挙げられる。そのような異常は比較ゲノムハイブリダイゼーション（「ＣＧＨ」）で検出されてきた。しかしながら、腫瘍の核型と表現型との関係は多くの場合微妙であり、少数のサンプルから集められた解像度の低いＣＧＨデータで構成された一般に利用可能なデータセットから決定するのは難しいかもしれない。

いくつかの研究により、遺伝子異常と遺伝子発現の変化との関係が実証されている。独立の研究として、ハイマン（Ｈｙｍａｎ）ら（非特許文献１）とポラック（Ｐｏｌｌａｃｋ）ら（非特許文献２）は、乳房腫瘍における高度の増幅と高表現との強い関連を見いだした。クローレイ（Ｃｒａｗｌｅｙ）ら（非特許文献３）は、遺伝子発現データだけを使用して肝細胞がん中のコピー数が異常な領域を正確に予測するデータ解析方法について報告している。これらの研究は、根本にある遺伝子異常への手がかりとして遺伝子発現データを使用することができるという概念を支持し、したがって、ＤＮＡマーカーを特定する目的で遺伝子発現データおよびＣＧＨコピー数データを併せて分析することは有望であるという考えを支持するものである。
米国特許出願公開第２００４／００５８３４０号明細書 ハイマン（Ｈｙｍａｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００２年１１月１日、第６２巻第２１号、ｐ．６２４０−５ ポラック（Ｐｏｌｌａｃｋ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００２年１０月１日、第９９巻第２０号、ｐ．１２９６３−８ クローレイ（Ｃｒａｗｌｅｙ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．、２００２年、第３巻第１２号：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００７５．Ｅｐｕｂ ２００２年１１月２５日

現在使用されている乳がんの予後の臨床上の指標は、予後が良好と思われる患者の識別においては正確ではない。その結果、補助化学療法から利益を得るであろう患者よりも多くの患者がそのような治療を受けている。したがって、より良好かつより特異的な乳がんの予後の臨床上の予測材料が、当分野において依然必要とされている。

（発明の概要）
本発明は、新規な組成物および乳房の腫瘍の分類におけるそれらの使用方法を提供する。

第１態様では、本発明は、乳がんバイオマーカーを含んでなる組成物または乳がんバイオマーカーで構成される組成物を提供し、該乳がんバイオマーカーは、２〜３５組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該プローブセットで構成され、該プローブセットの少なくとも４０％は、３ｐ２３、８ｑ２１．１３、８ｑ２２．１、８ｑ２２．２、８ｑ
２４．１１、１０ｑ２２．３、１６ｑ２４．３、１７ｑ１１．２、１７ｑ１２、１７ｑ２１．１、１７ｑ２２．２、１７ｑ２５．３、１９ｑ１３．１２および２０ｑ１３．２から成る群から選択されたゲノム領域に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成され、前記異なるプローブセットが全体として、前記列挙されたゲノム領域のうち少なくとも２つに選択的にハイブリダイズすることを特徴とする。

第２態様では、本発明は、２〜４２組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該プローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなる組成物を提供し、該異なるプローブセットの少なくとも４０％は、式１：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
（式中、Ｘ２は、細菌人工染色体（「ＢＡＣ」）内に含まれたヒトゲノム挿入断片であり、配列番号１８−６５（表１を参照）またはそれらの相補体から成る群から選択され、Ｘ１とＸ３は独立にヒトゲノム中でＸ２に隣接する０−５００ｋＢのヒトゲノム核酸である）
の単離核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成され、かつ
前記異なるポリヌクレオチドプローブセットが全体として、少なくとも２つの重なり合わない式１の核酸に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする。

第３態様では、本発明は、２〜４２組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該プローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなる組成物を提供し、該異なるプローブセットの少なくとも４０％は、配列番号１−１７またはそれらの相補体のうちの１つの核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成され、該異なるプローブセットが全体として、配列番号１−１７またはそれらの相補体の前記核酸のうち少なくとも２つに選択的にハイブリダイズすることを特徴とする。

さらなる態様では、本発明は、乳房の腫瘍を分類する方法であって、
（ａ）乳房の腫瘍を有する対象から得られた核酸サンプルを、ポリヌクレオチドプローブであって、全体として３ｐ２３、８ｑ２１．１３、８ｑ２２．１、８ｑ２２．２、８ｑ２４．１１、１０ｑ２２．３、１６ｑ２４．３、１７ｑ１１．２、１７ｑ１２、１７ｑ２１．１、１７ｑ２２．２、１７ｑ２５．３、１９ｑ１３．１２および２０ｑ１３．２から成るグループから選択されたゲノム領域のうち２つ以上に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブと、接触させる工程であって、プローブセットのポリヌクレオチドの、２つ以上のゲノム領域との選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件の下で接触が実施されることを特徴とする工程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程と、
（ｃ）前記ゲノム領域のうち１つ以上が、コピー数が変化した状態で核酸サンプル中に存在するかどうかを判定する工程と、
（ｄ）１または複数のゲノム領域のコピー数の変化を乳がんの分類と関連付ける工程とからなる方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、乳房の腫瘍を分類する方法であって、
（ａ）乳房の腫瘍を有する対象から得られたｍＲＮＡ由来の核酸サンプルを、核酸プローブであって、全体として配列番号１−１７またはそれらの相補体から成る群から選択された２つ以上の核酸標的に選択的にハイブリダイズする核酸プローブと、接触させる工程であって、核酸プローブの、核酸サンプル中に存在する核酸標的またはその相補体との選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件の下で接触が実施されることを特徴とする工程と、
（ｂ）核酸プローブと核酸標的またはその相補体とのハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程であって、そのようなハイブリダイゼーション複合体の数から、配列番号１−１７の核酸のうち１または複数の遺伝子発現の尺度が提供されることを特徴とする工程と、
（ｃ）配列番号１−１７の核酸のうち１または複数の遺伝子発現の、対照に対する変化を、乳がんの分類と関連付ける工程と
からなる方法を提供する。

（発明の詳細な説明）
本明細書に引用された全ての出版物、ＧｅｎＢａｎｋ登録参照事項、細菌人工染色体（「ＢＡＣ」）登録番号（配列）への参照事項、特許文献および特許出願明細書は、あらゆる目的に関して参照により明らかに本願に組み込まれる。

本願においては、別途記載のない限り、使用される技法については、いくつかの有名な参照文献、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ」（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、コールドスプリングハーバー研究所出版社）、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９１年、第１８５巻、ディー．ゲデル（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ）編、米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ））、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（エム．ピー．デューシャー（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ）編、１９９０年、アカデミック・プレス・インコーポレイテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．））の中の「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、１９９０年、米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のアカデミック・プレス）、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」第２版（アール．アイ．フレシュニー（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、１９８７年、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在のリス・インコーポレイテッド（Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．））、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、ｐ．１０９−１２８、イー．ジェイ．マレー（Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ）編、米国ニュージャージー州クリフトン所在のヒューマナ・プレス・インコーポレイテッド（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）、ならびにアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社の１９９８年版カタログ（米国テキサス州オースティン所在のアンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ））などのいずれかに見出すことができる。

本発明は、新規な組成物および乳房の腫瘍の分類における該組成物の使用方法を提供する。本明細書に使用する場合、用語「分類する（こと）」は、乳房の腫瘍の１または複数の特徴を決定すること、または乳房組織サンプルを得た患者の予後診断を意味し、
（ａ）乳がんの診断（良性腫瘍か悪性腫瘍か）；
（ｂ）転移の可能性、特定の器官に転移する可能性、または腫瘍の進行；
（ｃ）腫瘍のステージ；
（ｄ）化学療法またはホルモン療法を行わない状態での患者の予後；
（ｅ）治療（化学療法、放射線療法および／または腫瘍を切除する手術）に対する患者の応答性の予測；
（ｆ）患者にとって最適な治療コースの予測；
（ｇ）治療後の患者の再発に関する予測；および
（ｈ）患者の余命
が含まれる。

マーカーに基づいた予後診断に関する先行技術の方法は、（ａ）ごく一部の腫瘍にのみ関連があると思われる単一の遺伝子またはゲノム領域の発現またはコピー数の分析、あるいは（ｂ）臨床診断の検査室およびほとんどの研究施設で使用するには非実用的な、多くの遺伝子またはゲノム領域の大群の分析、のうちいずれかに注力したものであった。

本発明の組成物は、本明細書において、乳がん分類に有用なマーカーであるとして特定され、次の核酸配列に対して定義される。
１．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＬ０８００５９（配列番号１）
２．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００６２８１（配列番号２）セリン／トレオニンキナーゼ３（「ｓｔｋ３」）
３．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿０００１２７（配列番号３）：Ｅｘｏｓｔｏｓｅｓ１（「ｅｘｔ１」）
４．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００６２６５（配列番号４）：「ｒａｄ２１」（ＡＫＡ、「ＨＲ２１」、「ＳＣＣ１」、「ＮＸＰ１」）
５．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００１１５７（配列番号５）：Ａｎｎｅｘｉｎ Ａｌｌ（「ａｎｘａ１１」）
６．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿０００１３５（配列番号６）：ファンコニ貧血相補群Ａ（「ｆａｎｃａ」）
７．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００７１４４（配列番号７）：亜鉛フィンガータンパク質１１０（ＲＦ１１０）（「ｚｎｆｌ４４」）
８．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００３０７９（配列番号８）：ＳＷＩ／ＳＮＦ関連、マトリクス関連、アクチン依存性クロマチン調節因子、サブファミリーｅ、メンバー１（SWI/SNF related, matrix-associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily e, member 1 ）；「ｓｍａｒｃｅ」）
９．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００１１６８（配列番号９）：バキュロウイルスＩＡＰリピート含有５（Baculoviral IAP-repeat containing 5 ；「ｂｉｒｃ５」、ＡＫＡ、「サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）」）
１０．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿０１３３７４（配列番号１０）：プログラム細胞死関連タンパク質（ＰＤＣＤ６ＩＰ）
１１．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００５３１０（配列番号１１）：成長因子受容体結合タンパク質７（「ＧＲＢ７」）
１２．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００６８０４（配列番号１２）：Ｓｔａｒｔドメイン含有３（Start domain containing 3 ）（「ＭＬＮ６４」）（ＳＴＡＲＤ３とも呼ばれる）
１３．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００５５３６（配列番号１３）：イノシトール（ｍｙｏ）‐１（または４）‐モノホスファターゼ１（「ＩＭＰＡ１」）
１４．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００２１５１（配列番号１４）：「Ｈｅｐｓｉｎ（ヘプシン）」
１５．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｘ７２６３１（配列番号１５）：ｈｒｅｖ遺伝子（「ｎｒ１ｄ１」）
１６．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００３４５７（配列番号１６）：亜鉛フィンガータンパク質２０７「（ＺＮＦ２０７」）
１７．ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿０００７８２（配列番号１７）：シトクロムＰ４５０、ファミリー２４、サブファミリーＡ、ポリペプチド１（「ＣＹＰ２４」）
統計学的に有意であると同時に、発明者は、これら１７個の遺伝子マーカーのサブセットの臨床診断および予後診断への利用は、個々の遺伝子の臨床診断および予後診断への利用よりも優れていると考える。そのような組み合わせにより、乳がんにおける特定の表現型に関連したゲノム異常の複雑さをよりよく分類しうるかもしれない。

多くの研究から、ゲノム領域が（腫瘍などにおいて）増幅される場合、単一の遺伝子について増幅が報告される傾向にあるにもかかわらず、増幅領域（「増幅」）は通常いくつかの遺伝子から構成されることが実証されている。（バーランド（Ｂａｒｌｕｎｄ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２０００年１０月１日、第６０巻第１９号、ｐ．５３４０−４；カウラニエミ（Ｋａｕｒａｎｉｅｍｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００１年１１月１５日、第６１巻第２２号、ｐ．８２３５−４０；ポラック（Ｐｏｌｌａｃｋ）ら、２００２年；ハイマン（Ｈｙｍａｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００２年１１月１日、第６２巻第２１号、ｐ．６２４０−５；モンニ（Ｍｏｎｎｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１年５月８日、第９８巻第１０号、ｐ．５７１１−６）。例えば、「ｈｅｒ−２」の増幅は一般にｈｅｒ−２遺伝子および多くの隣接する遺伝子を含んでいる。

公に利用可能なデータベース（例えばＵＣＳＣヒトゲノム ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）に記述されるように、これらの研究において使用された遺伝子の間の物理的な距離から、増幅のサイズは腫瘍によって様々であるが、「平均的な」増幅のサイズは理論的に少なくとも１メガベースと推定されることが明らかである。

したがって、第１態様では、本発明は、乳がんバイオマーカーを含んでなる組成物または乳がんバイオマーカーで構成される組成物を提供し、該乳がんバイオマーカーは２〜３５組の異なるプローブセットを含んでなるか該異なるプローブセットで構成され、該異なるプローブセットの少なくとも４０％は、３ｐ２３、８ｑ２１．１３、８ｑ２２．１、８ｑ２２．２、８ｑ２４．１１、１０ｑ２２．３、１６ｑ２４．３、１７ｑ１１．２、１７ｑ１２、１７ｑ２１．１、１７ｑ２２．２、１７ｑ２５．３、１９ｑ１３．１２および２０ｑ１３．２から成る群から選択されたゲノム領域に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成され、異なるプローブセットは全体として、前記列挙されたゲノム領域のうち少なくとも２つに選択的にハイブリダイズすることを特徴とする。

前記列挙されたゲノム領域は、前記マーカーの染色体バンドに相当する。本発明の組成物は、例えば、先行技術の診断用および予測用の組成物および方法を使用して可能な乳がんの分類よりも改善された乳がんの分類を提供するために使用することができる。表１は、個々のマーカーの詳細な要約、該マーカーのＧｅｎＢａｎｋ登録番号、マーカーが位置するゲノム領域、およびマーカーを含んでいる細菌人工染色体（「ＢＡＣ」）（以下により詳細に議論する）の名称および配列番号を提示している。

したがって、本発明の各態様および実施形態の組成物は、例えばヒトの乳がんを分類する際に有用である。該組成物は、例えば、ヒト対象の乳房組織のようなヒト標本中の核酸サンプル中に異常なコピー数の状態（例えば染色体伸展標本において１細胞当たりの遺伝子のコピー数が３つ以上または２つ未満）で存在する１または複数のゲノム領域を特定するために使用することが可能であり、このことにより上記および以降に議論されるように乳房腫瘍が分類される。別例として、ある実施形態の組成物（以下により詳細に議論する）を用いて、上記に列挙された遺伝子にコードされるｍＲＮＡの組織中の発現レベルを測定することができる。

本発明のそれぞれの態様および実施形態の組成物は、先行技術の乳がん分類用組成物を改良するものである。先行技術の乳がん分類用組成物は、乳房腫瘍を分類するために非常に多くのプローブを必要とし、かつ、本発明の乳がんバイオマーカーと比較して分類の精度が低い。したがって、本発明の組成物は、先行技術の組成物および乳がんの分類方法におけるその使用よりも、臨床診断および予後診断の試験においてはるかに使用しやすい。

用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において本発明の各態様および実施形態に関して使用する場合、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡを意味する。該用語は上記に列挙された配列およびそれらの相補配列も含むが、このことは当業者には明白に理解されるだろう。用語「ポリヌクレオチド」は、所望の目的に関して、開示されたポリヌクレオチドと同様または改善された結合特性を有している、天然ヌクレオチドの既知のアナログを含んでいる核酸を包含する。該用語は、合成の骨格を備えた核酸類似構造も包含する。本発明によって提供されるＤＮＡ骨格アナログには、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカーバメート、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネート結合またはメチルホスホネート結合とホスホジエステル結合とが交互になっているもの（シュトラウス‐ソーカプ（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ）、１９９７年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３６巻、ｐ．８６９２−８６９８）、ならびに米国特許第６，６６４，０５７号明細書で議論されているようなベンジルホスホネート結合が挙げられる。また、エフ．エクスタイン（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）編「Ｏｌｉｇｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ， ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、オックスフォード大学出版社のＩＲＬプレス、１９９１年；「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｓｔｒａｔｅｒｉｅｓ」、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第６００巻、バセルガ（Ｂａｓｅｒｇａ）およびデンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）編、（ＮＹＡＳ １９９２）；ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）、１９９３年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、第３６巻、ｐ．１９２３−１９３７；「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９３年、ＣＲＣプレス）も参照されたい。

本明細書において本発明の全ての態様および実施形態について使用される「単離（された）」ポリヌクレオチドとは、本明細書に特に記載のある場合を除き、核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡにおいて自然状態では該ポリヌクレオチドに隣接する配列を含まないポリヌクレオチドである。好ましくは、「単離」ポリヌクレオチドとは、組換え技法で生産される場合はその他の細胞成分、ゲル材料、ベクターのリンカー配列および培地を実質的に含まず、あるいは化学合成される場合は前駆化学物質または他の化学物質を実質的に含まない。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリからのＰＣＲ増幅によるなど、標準的技法を使用して様々な供給源から単離されてもよいし、あるいは、米国特許第６，６６４，０５７号明細書および同文献に開示された参照文献で議論されるように、当業者に周知の方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されてもよい。様々な溶液または固相の方法により合成ポリヌクレオチドを調製することができる。ホスファイトトリエステル、ホスホトリエステル、およびＨ−ホスホネートの化学的性質を用いたポリヌクレオチドの固相合成手法に関する詳細な記載は、広く入手可能である。（例えば、米国特許第６，６６４，０５７号明細書および同文献に開示された参照文献を参照されたい）。ポリヌクレオチドを精製する方法には、アクリルアミドゲルネイティブ電気泳動、およびピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、１９８３年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．第２５５巻、ｐ．１３７−１４９に記述されているような陰イオン交換ＨＰＬＣが挙げられる。合成ポリヌクレオチドの配列は標準的方法を使用して確認することができる。

本発明のすべての態様および実施形態に関して本明細書で使用される場合、「プローブセット」とは、例えば乳がんの分類において使用することができる同じ標的（例えば特定のゲノム領域またはｍＲＮＡ）にそれぞれ選択的にハイブリダイズする１または複数のポリヌクレオチドの集団を意味する。したがって、１つの「プローブセット」は、ある標的に選択的にハイブリダイズする任意の数の異なる単離ポリヌクレオチドを含みうる。例えば、配列番号１０に選択的にハイブリダイズするプローブセットは、配列番号１０の１つの１００ヌクレオチド長セグメントについて、また配列番号１０の別の１００ヌクレオチド長セグメントについて、または上記の両方に加えて配列番号１０の別個の１０ヌクレオチド長セグメントについて、または配列番号１０の５００個の異なる１０ヌクレオチド長セグメント（例えば、比較的大きなプローブを多くの個々の短いポリヌクレオチドに分断するなど）についての、１または複数のプローブを含んでなるものでよい。当業者は、多くのそのような置き換えが可能であると理解するだろう。

この第１態様では、乳がんバイオマーカーは、本明細書において定義されるような２〜３５組のプローブセットを含んでなるか該プローブセットで構成される任意の乳がんバイオマーカーであって、該プローブセットの少なくとも４０％は、列挙されたゲノム領域のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるか該ポリヌクレオチドで構成される。従って、そのような乳がんバイオマーカーは、プローブセットの少なくとも４０％が列挙されたゲノム領域のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含む限り、かつ３５組以下のプローブセットが該乳がんバイオマーカーの中に存在する限り、乳がんの分類、診断または分析で使用されるその他のプローブセットを含むことができる。

本発明の第１態様の好ましい実施形態では、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のプローブセットが、列挙されたゲノム領域のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるか該ポリヌクレオチドで構成される。当業者には明白であるように、列挙されたゲノム領域のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されるプローブセットの割合（％）が増加するにつれて、乳がんバイオマーカー中のプローブセッ
トの最大数は減少することになる。したがって、例えば、プローブセットの少なくとも８０％が列挙されたゲノム領域のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるか該ポリヌクレオチドで構成される場合、乳がんバイオマーカーは２〜１７組のプローブセットで構成されることになる。当業者は、本発明の様々な態様の組成物に包含される様々なその他の置き換えを認識するだろう。

本発明の第１態様のさらに好ましい実施形態では、乳がんバイオマーカーは２〜３５組の異なるプローブセットを含んでなるか該プローブセットで構成され、該異なるプローブセットは全体として、少なくとも次のゲノム領域、すなわち２０ｑ１３．２（ＣＹＰ２４を含む）および３ｐ２３（ＰＤＣＤ６ＩＰを含む）に選択的にハイブリダイズする。この実施形態（「ＨＲ＋組成物１」）は、ホルモン受容体陽性の乳房腫瘍の分類に特に有効であることが本明細書において実証されるが、ここで、「ホルモン受容体陽性」とは、本願全体を通じて、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のうちいずれか一方または両方について陽性であるとして定義される。この実施形態では、単離ポリヌクレオチドが全体として１７ｑ２５．３（ＢＩＲＣ５を含む）の領域に選択的にハイブリダイズすることがさらに好ましい。ＨＲ＋組成物１の様々なさらに好ましい実施形態では、プローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が、上記２つまたは３つの列挙されたゲノム領域のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される。

本発明の第１態様のさらに好ましい実施形態では、乳がんバイオマーカーは２〜３５組の異なるプローブセットを含んでなるか該プローブセットで構成され、該異なるプローブセットは全体として、少なくとも次のゲノム領域、すなわち１７ｑ２１．２（ＳＭＡＲＣＥ１を含む）および１７ｑ２１．１（ＮＲ１Ｄ１を含む）に選択的にハイブリダイズする。この実施形態（「ＨＲ−組成物１」）は、ホルモン受容体陰性の乳房腫瘍の分類に特に有効であることが本明細書において実証されるが、ここで、「ホルモン受容体陰性」とは、本願全体を通じて、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のうちいずれか一方または両方について陰性であるとして定義される。この実施形態では、ポリヌクレオチドが全体として１７ｑ２５．３（ＢＩＲＣ５を含む）の領域に選択的にハイブリダイズすることがさらに好ましい。これらの様々なＨＲ−組成物１の実施形態では、プローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が、上記２つまたは３つの列挙されたゲノム領域のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されることがさらに好ましい。

本発明の各態様および実施形態の組成物は、乳がんバイオマーカーと組み合わせて使用するのに有益な他のポリヌクレオチド成分、例えば競合核酸および他の制御配列（比較用の標準ハイブリダイゼーションを提供するための配列など）をさらに含んでもよい。そのような他のポリヌクレオチド成分は、本発明の組成物および方法の目的のためのプローブセットではない。組成物は、任意選択で、バッファ溶液、ハイブリダイゼーション溶液、検出可能な標識、および核酸組成物を保存するための試薬など（これらに限定されない）、他の成分を含んでもよい。

本発明の各態様および実施形態に関して本明細書で使用する場合、用語「選択的にハイブリダイズする」とは、単離ポリヌクレオチドが標的のゲノム領域または他の標的に結合してハイブリダイゼーション複合体を形成し、かつ他の配列には最小限しか結合しないか全く結合しないことを意味する。使用される特定のハイブリダイゼーション条件は、用いられるポリヌクレオチドプローブの長さ、該ポリヌクレオチドプローブのＧＣ含量、ならびに当業者によく知られたその他の種々の要因に依存することになる。（例えば、ティッ
セン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、１９９３年「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ」第Ｉ部第２章の「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」（米国ニューヨーク所在のエルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）（「Ｔｉｊｓｓｅｎ」）を参照されたい）。１実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が、規定のイオン強度およびｐＨでその特定のポリヌクレオチドの融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨ条件下）である。ストリンジェンシーの高い条件は、特定のポリヌクレオチドプローブのＴｍと等しくなるように選択される。ストリンジェントな条件の例は、６５℃の０．２×ＳＳＣ中で所望の時間で単離ポリヌクレオチドがゲノム核酸または他の標的核酸に選択的にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション複合体を形成することが可能である条件、ならびに６５℃の０．２×ＳＳＣで１５分間の洗浄条件である。当然ながら、これらの条件は様々なバッファおよび温度を使用して再現可能である。ＳＳＣ（例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッシュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、コールドスプリングハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年を参照）は、他の適切なハイブリダイゼーションバッファと同様に、当業者によく知られている。

本発明のこの第１態様の様々な好ましい実施形態では、乳がんバイオマーカーは、３ｐ２３、８ｑ２１．１３、８ｑ２２．１、８ｑ２２．２、８ｑ２４．１１、１０ｑ２２．３、１６ｑ２４．３、１７ｑ１１．２、１７ｑ１２、１７ｑ２１．１、１７ｑ２２．２、１７ｑ２５．３、１９ｑ１３．１２および２０ｑ１３．２からなる群から選択されたゲノム領域に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の異なるプローブセットを含み、該異なるプローブセットは全体として、列挙されたゲノム領域のうちの少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする。これらの実施形態の各々では、所与の乳がんバイオマーカーのためのプローブセットのうち少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が、列挙されたゲノム領域のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されることがさらに好ましい。

本発明の組成物および方法のそれぞれの態様および実施形態では、単離ポリヌクレオチドが検出可能な標識で標識されることがさらに好ましい。好ましい実施形態では、１つのプローブセット中の単離ポリヌクレオチド上の検出可能な標識はすべて同じであり、所与の乳がんバイオマーカー中の他のプローブセット中の単離ポリヌクレオチド上の検出可能な標識から識別可能である。単離ポリヌクレオチドをそのように標識することにより、所与の乳がんバイオマーカー中の異なるプローブセットからの信号を区別して測定することが容易になる。有用な検出可能な標識には、^３２Ｐ、^３Ｈおよび^１４Ｃのような放射性の標識；イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニド燐光体、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ（登録商標）、およびＡＬＥＸＩＳ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ＣＹ（商標）色素（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ色素（アボットラボ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ））のような蛍光色素；金のような高電子密度試薬；セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素；金コロイドのような比色定量標
識；ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）として販売されているような磁気標識；ビオチン；ジゴキシゲニン；または抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよびタンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。標識は、ポリヌクレオチドに直接組み入れられてもよいし、または、ポリヌクレオチドにハイブリダイズまたは結合する分子に結合させてもよい。標識は、当業者に周知の任意の手段によって単離ポリヌクレオチドに連結されうる。様々な実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、ニックトランスレーション法、ＰＣＲまたはランダムプライマー伸長法（例えば、前掲のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの文献を参照）を使用して標識される。標識を検出する方法には、分光分析法、光化学的手法、生化学的手法、免疫化学的手法、物理学的手法および化学的手法が挙げられるが、これらに限定はされない。

当業者であれば承知しているように、上記に議論されたゲノム領域に関連する特定のヌクレオチド配列を同定するために多数の情報源を利用することができる。１例では、そのような配列を以下のようにして見つけることができる：
ＵＣＳＣウェブサイト

にアクセスする。このサイトでは、左のメニューのゲノムブラウザ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ）を選択する。次いで「ｐｏｓｉｔｉｏｎ」フィールドで、（このフォーマットでは、例えば染色体１６ｐ１３について）１６：１１，０００，０００−１２，０００，０００を入力し、次に、「ｊｕｍｐ」を選択する（ｐｏｓｉｔｉｏｎの入力は、遺伝子名、クローン名、登録番号など、または塩基対の位置（通常何百万の単位）のいずれかでなければならない）。染色体のイメージが表示されると、イメージの一番上に塩基対、および染色体のバンドがすぐ下に示され、操縦ツールを用いて必要なときにズームインまたはズームアウト、左右への移動を行うことができる。配列自体（例として１６ｐ１３）を得るためには、イメージ内のバンド表示を選択すると、「Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｂａｎｄｓ Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｂｙ ＦＩＳＨ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｃｌｏｎｅｓ（ｐ１３．２）」のページにつながり、同ページには「Ｖｉｅｗ ＤＮＡ ｆｏｒ ｔｈｉｓ ｆｅａｔｕｒｅ」ボタンがある。この「Ｖｉｅｗ ＤＮＡ・・・」ボタンを選択すると、「Ｇｅｔ ＤＮＡ ｉｎ Ｗｉｎｄｏｗ」につながる。そのページの下方の「Ｇｅｔ ＤＮＡ」ボタンを選択すると、配列が現われる。この配列ページの中で一番上に正確な塩基対が示される。

当業者であれば、本明細書に開示されたその他の対象のゲノム領域のヌクレオチド配列を同定するために本開示を適用する方法を理解するであろう。
第２態様では、本発明は、２〜４２組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該プローブセットで構成された乳がんバイオマーカーを含んでなるか組成物を提供し、該異なるプローブセットの少なくとも４０％は、式１：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
（式中、Ｘ２は、細菌人工染色体（「ＢＡＣ」）内に含まれたヒトゲノム挿入断片であり、配列番号１８−６５（表１を参照）またはそれらの相補体から成る群から選択され、Ｘ１とＸ３は独立にヒトゲノム中でＸ２に隣接する０−５００ｋＢのヒトゲノム核酸である）
の単離核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成され、かつ
異なるポリヌクレオチドプローブセットが全体として、少なくとも２つの重なり合わない式１の核酸に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする。

ＢＡＣの配列情報を、以下、表２（および表１でも提示）ならびに表２に記載の数字に提供する。

「Ｘ２」グループにおいて上記に開示された核酸は、ＢＡＣベクターにクローニングされた、上述のマーカー遺伝子（および本発明の第１態様のゲノム領域の一部）を包含するヒトゲノム配列である。（表１を参照。）表１を参照すれば当業者には明白なように、上
記の乳がん分類のためにクローニングされたマーカーの各々についてのゲノム領域（配列番号１−１７）は、上記の「Ｘ２」グループ内にリストされたＢＡＣ挿入断片の中に存在する。１７個のクローニングされたマーカーのうち一部については、重なり合う部分を有する複数のＢＡＣ挿入配列が提供される（表１および２を参照）。

本発明のこの第２態様によって、異なるポリヌクレオチドプローブセットは全体として、少なくとも２つの重なり合わない式１の核酸（つまり表２の（ａ）−（ｑ）のうち少なくとも２つ）に選択的にハイブリダイズする。

本発明のこの第２態様の様々な好ましい実施形態では、乳がんバイオマーカーは、式１の単離核酸配列またはその相補体に選択的にハイブリダイズする３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該プローブセットで構成される。これらの実施形態の各々では、所与の乳がんバイオマーカーのプローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が、式１の核酸またはその相補体に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成され、該異なるポリヌクレオチドプローブセットは全体として、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個の重なり合わない式１の核酸に選択的にハイブリダイズする。

当業者には明らかなように、式１の核酸またはその相補体に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されたプローブセットの割合（％）につれ、その乳がんバイオマーカー中の最大のプローブセット数はそれに従って減少するだろう。したがって、例えば、プローブセットの少なくとも８０％が、式１の核酸またはその相補体に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるか該ポリヌクレオチドで構成される場合、乳がんマーカーは２〜２１組のプローブセットで構成されることになる。当業者であれば、本発明の第２態様の様々な実施形態の組成物に包含される様々な他の置き換えを認識するだろう。

本発明の第２態様のさらに好ましい実施形態では、異なるプローブセットは、少なくとも２つの異なる式１の核酸であって以下の
ａ）配列番号６２−６５（ＣＹＰ２４を含む）またはそれらの相補体のうち１または複数、および、
ｂ）配列番号４４−４６（ＰＤＣＤ６ＩＰを含む）またはそれらの相補体のうち１または複数
のＸ２グループを有する核酸に、全体として選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるか該ポリヌクレオチドで構成される。

この実施形態（「ＨＲ＋組成物２」）はホルモン受容体陽性の乳房腫瘍の分類に特に有効であることが本明細書において実証されるが、ここで「ホルモン受容体陽性」とは、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のうちいずれか一方または両方について陽性であると定義される。ＨＲ＋組成物２のさらなる実施形態では、該組成物は、配列番号４１−４３（ＢＩＲＣ５を含む）またはそれらの相補体に選択的にハイブリダイズする単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されるプローブセットを含む。

ＨＲ＋組成物２の様々なさらなる好ましい実施形態では、異なるプローブセットは、次のグループ：
（ａ）配列番号２５６−３２７（ＣＹＰ２４を含むＢＡＣ由来の固有配列プローブ）、またはそれらの相補体；また
（ｂ）配列番号１６０−２５５（ＰＤＣＤ６ＩＰを含むＢＡＣ由来の固有配列プローブ）、またはそれらの相補体
の各々からの１または複数の核酸に、全体として選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるか該ポリヌクレオチドで構成される。

グループ（ａ）の核酸はＣＹＰ２４を含むＢＡＣ由来の固有配列領域である。また、グループ（ｂ）の核酸はＰＤＣＤ６ＩＰを含むＢＡＣ由来の固有配列領域である。したがって、ＨＲ＋組成物２のこの実施形態は、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて競合ＤＮＡの必要のない、本発明の方法において使用するための固有配列プローブを提供する。さらなる実施形態では、ＨＲ＋組成物用の固有配列プローブは、
（ｃ）配列番号４１６−５１１（ＢＩＲＣ５を含むＢＡＣ由来の固有配列プローブ）、またはそれらの相補体
のグループ由来の１または複数の核酸に選択的にハイブリダイズする単離ポリヌクレオチドを含んでなるか該ポリヌクレオチドで構成されるプローブセットを含む。

ＨＲ＋組成物２のこれらの様々な実施形態では、プローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、前記列挙された２つまたは３つの核酸のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるか該ポリヌクレオチドで構成される。

本発明の第２態様のさらに好ましい実施形態では、異なるプローブセットは、少なくとも２つの異なる式１の核酸に全体として選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるか該ポリヌクレオチドで構成され、式１の核酸は以下の：
（ａ）配列番号５７−５９（ＮＲ１Ｄ１を含む）またはそれらの相補体のうち１または複数、および
（ｂ）配列番号４０（ＳＭＡＲＣＥ１を含む）、またはその相補体
のＸ２グループを有する。

この実施形態（「ＨＲ−組成物２」）は、ホルモン受容体陰性の乳房腫瘍の分類に特に有効であることが本明細書において実証されるが、ここで、「ホルモン受容体陰性」とは、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のうちいずれか一方または両方について陰性であるとして定義される。ＨＲ−組成物２のさらなる実施形態では、組成物は、配列番号４１−４３（ＢＩＲＣ５を含む）またはそれらの相補体のうち１または複数に選択的にハイブリダイズする単離ポリヌクレオチドを含んでなるか該ポリヌクレオチドで構成されるプローブセットを含む。

ＨＲ−組成物２の様々なさらなる好ましい実施形態では、異なるプローブセットは全体として、次のグループ：
（ａ）配列番号３２８−４１５（ＮＲ１Ｄ１を含むＢＡＣ由来の固有配列プローブ）、またはそれらの相補体、および
（ｂ）配列番号６６−１５９（ＳＭＡＲＣＥを含むＢＡＣ由来の固有配列プローブ）、またはそれらの相補体
の各々に由来する１または複数の核酸に選択的にハイブリダイズする。

グループ（ａ）の核酸は、ＮＲ１Ｄ１を含むＢＡＣ由来の固有配列領域であり、グループ（ｂ）の核酸はＳＭＡＲＣＥ１を含むＢＡＣ由来の固有配列領域である。したがって、ＨＲ＋組成物２のこの実施形態は、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて競合ＤＮＡ
の必要のない、本発明の方法において使用するための固有配列プローブを提供する。さらなる実施形態では、異なるプローブセットのＨＲ−組成物２用の固有配列プローブは、全体として、（ｃ）配列番号４１６−５１１（ＢＩＲＣ５を含むＢＡＣ由来の固有配列プローブ）、またはそれらの相補体のうち１または複数に選択的にハイブリダイズする。

ＨＲ−組成物２のこれらの実施形態では、プローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が、前記３つの列挙された核酸のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されることがさらに好ましい。

さらに好ましい実施形態では、本発明の第２態様の上記実施形態の各々において、ＸｌおよびＸ３は、０−４００ｋｂ；０−３００ ｋｂ；０−２００ｋｂ；０−１００ｋｂ；または０ｋｂである。

本発明の第２態様の様々な実施形態のうち好ましい実施形態では、乳がんバイオマーカーの異なるプローブセットは、式１の核酸またはその相補体の少なくとも１０ヌクレオチド長の１または複数のポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される。さらに好ましい実施形態では、乳がんバイオマーカーの異なるプローブセットは、配列番号１８〜配列番号５１１またはそれらの相補体から成る群から選択された核酸の少なくとも１０ヌクレオチド長の１または複数のポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される。

本発明の第１および第２の態様の各々の実施形態の様々なさらなる好ましい実施形態、ならびに以降に記述される関連態様および実施形態では、プローブセット中のポリヌクレオチドは、独立に、前記の関連配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、１０，０００；１５，０００；２０，０００；２５，０００；３０，０００；３５，０００；４０，００００；４５，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；１００，０００；１１０，０００；１２０，０００；１３０，０００；１４０，０００；１５０，０００；１６０，０００；１７０，０００；１８０，０００；１９０，０００；２００，０００；２１０，０００；または２２０，０００ヌクレオチドまたはその相補体を含んでなるかまたはそれらのみで構成される。

本明細書に開示されたＢＡＣは、カリフォルニア大学サンタクルーズ校（ＵＣＳＣ）のゲノムブラウザ（Ｈｕｍａｎ Ａｐｒｉｌ ２００３ Ｆｒｅｅｚｅ）で定義されるものであり、オークランド小児病院研究所（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｏａ
ｋｌａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のｗｗｗ．ｂａｃｐａｃ．ｃｈｏｒｉ．ｏｒｇ．から入手可能である。本明細書に開示されたＢＡＣにクローニングされたヒトゲノム挿入断片のサイズは、約１５０ｋＢ〜２２０の長さの範囲にある。

２００４年３月の時点で、ＢＡＣについての詳細な情報は、オークランド小児病院研究所のウェブサイト、ｗｗｗ．ｂａｃｐａｃ．ｃｈｏｒｉ．ｏｒｇ．にアクセスし、製品メニューの「Ｈｕｍａｎ‘３２Ｋ’ＢＡＣ Ｒｅ−ａｒｒａｙ」へのリンクをクリックすることにより利用可能である。このページ（ｗｗｗ．ｂｃｇｓｃ．ｃａ／ｌａｂ／ｍａｐｐｉｎｇ／ｂａｃｒｅａｒｒａｙ／ｈｕｍａｎ／）から、ゲノムサイエンスセンター（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ）のウェブページへのリンクが提供されている。このページから、アノテーションボックス（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｂｏｘ）にアクセスすると「Ｂｒｏｗｓｅ ｃｌｏｎｅ ｓｅｔ」の別のボックスが見出される。このボックス内にはＵＣＳＣゲノムブラウザへのリンクがあり；「ａｖａｉｌａｂｌｅ」と記載されているリンクをクリックすると、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＴｒａｃｋｓにつながり、そこには添付図面に提供された情報などの詳細なＢＡＣ情報が見出される。ＢＡＣは、ＢＡＣ名または遺伝子名で検索することにより見つけることができる。対象のＢＡＣにクローニングされたヒトゲノム挿入断片の配列は、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＴｒａｃｋｓで見つけることができる。上述したようにして対象のＢＡＣがデータベース内に見出されたら、各ＢＡＣの配列は、ＢＡＣ名を「クリックする」ことにより見出される。最初のクリックでそのＢＡＣの「Ｃｕｓｔｏｍ Ｔｒａｃｋ」に接続する。Ｃｕｓｔｏｍ Ｔｒａｃｋページには、その特定のＢＡＣのための「Ｇｅｔ ＤＮＡ」ウィンドウへのリンクである、「Ｖｉｅｗ ＤＮＡ ｆｏｒ ｔｈｉｓ ｆｅａｔｕｒｅ」と呼ばれるオプションがある。「Ｇｅｔ ＤＮＡ」ページでは、「Ｇｅｔ ＤＮＡ」ボタンでそのＢＡＣクローンの完全長ＤＮＡ配列が読み出される。さらに、対象のＢＡＣに隣接する配列も、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｏｐｔｉｏｎ」の使用により「Ｇｅｔ ＤＮＡ」ページから読み出すことができる：ＢＡＣの上流および下流の両方の所望の塩基数を入力すると、隣接配列がＢＡＣ自体の配列と共に読み出される。さらに、本明細書に提供されるＢＡＣについての詳細な情報から、Ｈｕｍａｎ Ａｐｒｉｌ ２００３ Ｆｒｅｅｚｅの時点のＢＡＣにクローニングされたヒトゲノム挿入断片の塩基対の位置としてのゲノム上の位置が開示される。

当業者によって理解されるように、ヒトゲノム配列は、公に利用可能になった最新版で頻繁に更新される。よって当業者は、ヒトゲノム情報（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）へのアクセスにより、本明細書に開示された対象のＢＡＣにクローニングされたヒトゲノム挿入断片に隣接する配列を特定することができるだろう。したがって、本明細書で述べる「隣接（する）配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、上述のウェブサイトならびにその最新版で開示されるような隣接配列を指す。例えば、上記に開示されるようなＵＣＳＣゲノムブラウザのサイトにアクセスして、対象のＢＡＣにクローニングされたヒトゲノム挿入断片が由来する染色体上の相対的な塩基対の位置を得るために、Ｈｕｍａｎ Ａｐｒｉｌ ２００３ Ｆｒｅｅｚｅの時点のＢＡＣ情報を調査することができる。Ｈｕｍａｎ Ａｐｒｉｌ ２００３ Ｆｒｅｅｚｅの時点で利用可能なヒトゲノム配列データの（上述のような）調査によって、当業者は、本明細書に開示された対象のＢＡＣにクローニングされたヒトゲノム挿入断片に隣接する核酸配列を得ることができる。当業者は、この配列をさらに用いて、対象のＢＡＣにクローニングされたヒトゲノム挿入断片に隣接する配列を、現在ではヒトゲノム配列が更新されている同じサイトから、またはヒトゲノム配列情報を提供する他の同様のサイトから特定することができる。

第３態様では、本発明は、２〜４２組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該
プローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなる組成物を提供し、該異なるプローブセットの少なくとも４０％は、配列番号１−１７またはそれらの相補体のうちの１つの核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成され、該異なるプローブセットは全体として、配列番号１−１７またはそれらの相補体の前記核酸のうち少なくとも２つに選択的にハイブリダイズする。

本発明の第３態様の様々な好ましい実施形態では、組成物は、配列番号１−１７またはそれらの相補体のうちの１つの核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該プローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなり、該異なるプローブセットは全体として、配列番号１−１７またはそれらの相補体の前記核酸のうち少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個に選択的にハイブリダイズする。これらの実施形態の各々では、所与の乳がんバイオマーカーのプローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、配列番号１−１７またはそれらの相補体の核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されることがさらに好ましい。当業者には明白であるように、配列番号１−１７またはそれらの相補体の核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されるプローブセットの割合（％）につれ、その乳がんバイオマーカー中のプローブセットの最大数はそれに応じて減少することになる。したがって、例えば、プローブセットの少なくとも８０％が配列番号１−１７またはそれらの相補体の核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される場合、その乳がんバイオマーカーは２〜２１組のプローブセットで構成されることになる。当業者は、本発明の第３態様の様々な実施形態の組成物に包含される様々な他の置き換えを認識するだろう。

本発明の第３態様の様々な実施形態の好ましい実施形態では、乳がんバイオマーカーの異なるプローブセットは、配列番号１−１７またはそれらの相補体の核酸の少なくとも１０ヌクレオチド長の１または複数のポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される。

本発明の第３態様のさらに好ましい実施形態では、異なるプローブセットは、少なくとも配列番号１７（ＣＹＰ２４）、および配列番号１０（ＰＤＣＤ６ＩＰ）、またはそれらの相補体に全体として選択的にハイブリダイズする単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される。この実施形態（「ＨＲ＋組成物３」）は、ホルモン受容体陽性の乳房腫瘍の分類に特に有効であることが本明細書において実証されるが、ここで「ホルモン受容体陽性」とは、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のうちいずれか一方または両方について陽性であると定義される。このＨＲ＋組成物３の実施形態では、組成物は、配列番号９（ＢＩＲＣ５）またはその相補体に選択的にハイブリダイズする単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されるプローブセットを含むことがさらに好ましい。ＨＲ＋組成物３のこれらの様々な実施形態では、プローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、上記２つまたは３つの列挙された核酸またはそれらの相補体のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されることがさらに好ましい。

本発明の第３態様のさらに好ましい実施形態では、異なるプローブセットは全体として、少なくとも配列番号１５（ＮＲ１Ｄ１）および配列番号８（ＳＭＡＲＣＥ１）、またはそれらの相補体に選択的にハイブリダイズする。この実施形態（「ＨＲ−組成物３」）は、ホルモン受容体陰性の乳房腫瘍の分類に特に有効であることが本明細書において実証されるが、ここで「ホルモン受容体陰性」とは、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のうちいずれかまたは両方について陰性であると定義される。このＨＲ−組成物３の実施形態では、組成物が配列番号９（ＢＩＲＣ５）またはその相補体に選択的にハイブリダイズする単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されるプローブセットを含むことがさらに好ましい。ＨＲ−組成物３のこれらの様々な好ましい実施形態では、プローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が、上記３つの列挙された核酸のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されることがさらに好ましい。

本発明のこの第３態様の組成物は、乳房組織サンプル（バイオプシー、腫瘤摘出サンプル、固形腫瘍サンプルを含むが、これらに限定されない）、類繊維腫、腫瘍から流出した流血中腫瘍細胞、血液サンプル（血液塗抹標本など）および骨髄細胞などの、対象の組織中の遺伝子からのＲＮＡ発現の分析に使用するのに特に好ましい。本発明のこの態様のそのようなポリヌクレオチドは、対象の核酸への選択的なハイブリダイゼーションを可能とする任意の長さでありうる。発明の第３態様および関連する態様の様々な好ましい実施形態ならびに以下に開示する実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１−１７またはそれらの相補体から成る群から選択された核酸のうち少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００ヌクレオチドを含んでなるかまたはそれらのみで構成される。さらなる実施形態では、本発明のこの第３態様の単離ポリヌクレオチドは、配列番号１−１７またはそれらの相補体のうちの１つの核酸を含んでなるかまたは該核酸で構成される。

本発明の様々な態様および実施例の組成物は、凍結乾燥された形態であってもよいし、または好ましくは、バッファ溶液、ハイブリダイゼーション溶液および保存中の組成物を維持するための溶液（これらに限定されない）などの、単離ポリヌクレオチドを含む溶液を含んでなるものであってもよい。そのような溶液はそのようなものとして製造されてもよいし、または、以下に議論されるように、標的配列にポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる時に組成物が調製されてもよい。

別例として、組成物を固体支持体上に配置して、マイクロアレイ、ビーズまたはマイクロプレートの形式にしてもよい。用語「マイクロアレイ」は、本明細書に使用する場合、サンプル核酸にハイブリダイズする複数のプローブセット（乳がんｍＲＮＡまたは誘導したｃＤＮＡなど）が固体表面上に固定化されたものを指す。

したがって、第４の態様では、本発明は、上記に開示されるような、本発明の組成物の１または複数のプローブセットが（アレイ状に）配置された支持体構造を含んでなるマイクロアレイを提供する。この態様では、単一のプローブセットがアレイ上の一つの位置に存在していてもよいし、または単一のプローブセット由来の異なるポリヌクレオチドがアレイ上の異なる所定の位置に存在していてもよい。

この態様では、ポリヌクレオチドはマイクロアレイの固体表面上に固定化される。参照用または対照用の核酸のような他の核酸が、任意選択で同様に固体表面上に固定化されてもよい。様々な固体表面上に核酸を固定化する方法は、当業者に周知である。種々様々の
材料を固体表面用に使用することができる。そのような固体表面材料の例には、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、石英、ジアゾ化された膜（紙またはナイロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金属、メタロイド、半導体材料、コーティングを施したビーズ、磁性粒子；ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリスチレンのようなプラスチック；ならびにタンパク質（例えば、ゼラチン）、リポ多糖類、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミドのようなゲル形成材料が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

様々な異なる材料を用いてマイクロアレイの固体表面を調製して様々な特性を得ることが可能である。例えば、タンパク質（例えばウシ血清アルブミン）または巨大分子の混合物（例えば、デンハルト溶液）を用いて、非特異的な結合を最小限とし、共有結合を単純化し、かつ／またはシグナルの検出を増強することができる。化合物と表面との間の共有結合が所望される場合、一般に表面を官能化するか、または官能化可能な状態にすることになる。表面上に存在させて結合に使用されうる官能基には、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアン基、エチレン基、水酸基、およびメルカプト基が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。種々様々の化合物を様々な固体表面に結合する方法は、当業者に周知である。

この第４の態様の好ましい実施形態では、本発明のプローブセットを含むアレイ上の位置のサイズは、直径で１μｍ〜１ｃｍ、より好ましくは直径で１μｍ〜５ｍｍ、さらにより好ましくは直径で５μｍ〜１ｍｍの範囲である。プローブセットのポリヌクレオチドは、標識の性質、固体支持体およびポリヌクレオチドのサイズのなどの要因に応じて、様々な密度で固体表面上に（アレイ状に）配置されうる。当業者は、マイクロアレイの上の各位置に、あるプローブセット由来の様々な長さおよび配列のポリヌクレオチド混合物が含まれうることを認識するだろう。その位置に固定されるポリヌクレオチドの長さおよび複雑度は、与えられたハイブリダイゼーション法に最適のハイブリダイゼーションおよびシグナル生産が提供され、かつ必要な解像度が提供されるように調節することができる。

第５の態様では、本発明は、乳房腫瘍を分類する方法を提供し、該方法は、
（ａ）乳房腫瘍を有する対象から得られた核酸サンプルをポリヌクレオチドプローブと接触させる工程であって、該ポリヌクレオチドプローブは、全体として、３ｐ２３、８ｑ２１．１３、８ｑ２２．１、８ｑ２２．２、８ｑ２４．１１、１０ｑ２２．３、１６ｑ２４．３、１７ｑ１１．２、１７ｑ１２、１７ｑ２１．１、１７ｑ２２．２、１７ｑ２５．３、１９ｑ１３．１２、および２０ｑ１３．２から成る群から選択された２つ以上のゲノム領域に選択的にハイブリダイズすることを特徴とし、かつ、プローブセットのポリヌクレオチドによる２つ以上のゲノム領域への選択的なハイブリダイゼーションを促進する条件の下で接触が行われることを特徴とする工程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程と、
（ｃ）ゲノム領域の１つ以上が核酸サンプル中にコピー数が変化した状態で存在するかどうかを判定する工程と、
（ｄ）１または複数のゲノム領域のコピー数の変化を乳がんの分類と関連付ける工程とからなる。

本発明の方法において使用される核酸サンプルは、乳房腫瘍の分類において有用な任意の供給源由来であってよく、乳房組織サンプル（バイオプシー、腫瘤摘出サンプル、固形腫瘍サンプルを含むが、これらに限定されない）、類繊維腫、腫瘍から流出した流血中腫瘍細胞、血液サンプル（血液塗抹標本など）および骨髄細胞が挙げられるが、これらに限定されない。核酸サンプルは好ましくは細胞ＤＮＡサンプルである。好ましい実施形態では、核酸サンプルはヒト核酸サンプルである。

本発明の第５の態様では、本方法は乳がんに関連したゲノムの増幅または欠失を検出するために使用される。本明細書に使用する場合、「乳がんに関連した」とは、１または複数のこれらのゲノム領域のコピー数の変化を使用して、乳房腫瘍の特徴や、核酸サンプルが採取された患者の予後、たとえば：
（ａ）乳がんの診断（良性腫瘍か悪性腫瘍か）；
（ｂ）転移の可能性、特定の器官に転移する可能性、または腫瘍の進行；
（ｃ）腫瘍のステージ；
（ｄ）化学療法またはホルモン療法を行わない状態での患者の予後；
（ｅ）治療（化学療法、放射線療法および／または腫瘍を切除する手術）に対する患者の応答性の予測；
（ｆ）患者にとって最適な治療コースの予測；
（ｇ）治療後の患者の再発に関する予測；および
（ｈ）患者の余命
を分類することができることを意味する。

したがって、本発明のこの態様の方法は、例えば、乳がんの診断、および化学療法を実施する場合としない場合の患者の予後診断、患者に最適な治療コースの予測、および患者の余命についての情報を提供する。好ましい実施形態では、乳がんの分類は、乳房腫瘍の再発についての予後診断を含む。さらに好ましい実施形態では、１または複数のゲノム領域のコピー数の変化（すなわち増加または減少）が、乳房腫瘍の再発リスクの増大と関連付けられる。さらに好ましい実施形態では、１または複数の核酸標的の正常な発現レベルの変化が、乳房腫瘍の再発リスクの増大と関連付けられる。

本方法のすべての態様および実施形態について本明細書に使用する場合、「コピー数の変化」とは、そのゲノム領域または標的のコピー数の、正常な二倍体ヒトゲノムにおけるコピー数に対する何らかの増加または減少を意味する。当然ながら、ヒトゲノム中のほとんどの発現遺伝子については、この正常な数は２となる。

当業者にはさらに理解されることであるが、「発現レベルの変化」とは、（以下に記載するように）正常で健康な同一組織の発現レベルからの何らかの逸脱を意味する。さらに理解されるように、「リスクの増大」とは、本明細書に記載のマーカーを使用して得られる情報がない状態では類似または同一の臨床上かつ／または病理学的特性を有するすべての他のものに対してリスクが高いことを意味する。本明細書に使用する場合、「再発」とは局所的な腫瘍の再発（同側性、局所的、または対側性など）、転移、または乳がんによる死を意味する。

好ましい実施形態では、工程（ｃ）における判定は、列挙されたゲノム領域のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個がコピー数の変化した状態で存在し、そのようなコピー数の変化が特定の乳がんの分類、好ましくは乳がんが再発しそうであるかどうかについての分類と関連を有する。

したがって、本発明は、乳がん患者の治療について決定する方法をさらに提供し、該方法は、本発明の様々な態様および実施形態によって乳房腫瘍を分類する方法を実行することと、次にその結果について、乳がん患者の治療コースの決定に際し、他の周知の臨床上かつ病理学的なリスク要因に照らして検討することからなる。

例えば、本発明の方法によって高い再発リスクを有することが示された患者を、化学療法、放射線療法、および／または乳房切除術のような標準的治療法、または臨床開発中の新規治療もしくは実験的治療を用いて、より積極的に治療することができるかもしれない。

本発明の第５の態様の方法の様々な好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、上記に開示された本発明の組成物の様々な態様および実施形態から選択された組成物からなる。ほとんどの好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは上記に開示するような検出可能な標識を含んでなり、かつ、特に本発明の組成物の異なるプローブセットが識別できる検出可能な標識を含んでなり、どのゲノム領域がコピー数の変化した部位であるかを分析しやすくなっている。

本発明の方法の様々な他の好ましい実施形態では、本方法で使用される組成物が全体として、３ｐ２３、８ｑ２１．１３、８ｑ２２．１、８ｑ２２．２、８ｑ２４．１１、１０ｑ２２．３、１６ｑ２４．３、１７ｑ１１．２、１７ｑ１２、１７ｑ２１．１、１７ｑ２２．２、１７ｑ２５．３、１９ｑ１３．１２、および２０ｑ１３．２から成る群から選択されたゲノム領域のうち３、４、５、６、７、８、９、１０、１１の、１２、１３、または１４個に選択的にハイブリダイズし、接触工程が、前記３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個のゲノム領域への１または複数のプローブセットの選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件の下で実施される。

本発明のこの第５の態様の方法の様々なさらなる好ましい実施形態では、組成物は、１または複数の本発明のＨＲ＋組成物およびＨＲ−組成物を含んでなるかまたはそれらで構成され、方法は、ＨＲ＋および／またはＨＲ−の乳房腫瘍を分類するために使用される。好ましい実施形態では、分類は、ＨＲ＋乳房腫瘍またはＨＲ−乳房腫瘍の再発についての予測を含む。したがって、本発明の第５の態様の１つの好ましい実施形態では、乳がんバイオマーカーは、２〜３５組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該プローブセットで構成され、該異なるプローブセットは、少なくとも次のゲノム領域、すなわち２０ｑ１３．２（ＣＹＰ２４を含む）および３ｐ２３（ＰＤＣＤ６ＩＰを含む）に全体として選択的にハイブリダイズする単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される。この実施形態（「ＨＲ＋組成物１」）は、ホルモン受容体陽性の乳房腫瘍の分類に特に有効であることが本明細書において実証されるが、ここで「ホルモン受容体陽性」とは、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のうちいずれか一方または両方について陽性であると定義される。この実施形態では、ＨＲ＋組成物が、ゲノム領域１７ｑ２５．３（ＢＩＲＣ５を含む）にも全体として選択的にハイブリダイズする単離ポリヌクレオチドを含んでなることがさらに好ましい。ＨＲ＋組成物の様々なさらなる好ましい実施形態では、プローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が、前記２つまたは３つの列挙されたゲノム領域のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される。

本発明の第５の態様のさらに好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、２〜３５組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該プローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなるかまたは該バイオマーカーで構成され、かつ該異なるプローブセットは全体として、少なくとも次のゲノム領域、すなわち１７ｑ２１．２（ＳＭＡＲＣＥ １を含む）および１７ｑ２１．１（ＮＲ１Ｄ１を含む）に選択的にハイブリダイズする。この実施形態（「ＨＲ−組成物１」）は、ホルモン受容体陰性の乳房腫瘍の分類に特に有効であることが本明細書において実証されるが、ここで「ホルモン受容体陰性」とは、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のうちいずれか一方または両方について陰性であると定義される。この実施形態では、ポリヌクレオチドが全体としてゲノム領域１７ｑ２５．３（ＢＩＲＣ５を含む）に選択的にハイブリダイズすることがさらに好ましい。これらの様々なＨＲ−組成物の実施形態では、プローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、前記２つまたは３つの列挙されたゲノム領域のうちの１つに選択的に
ハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される。

本発明の方法の様々なさらなる実施形態では、本方法で使用される組成物は、２〜４２組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該プローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなり、該異なるプローブセットの少なくとも４０％は、式１
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
（式中、Ｘ２は、配列番号１８−６５（図１を参照）から成る群から選択された細菌人工染色体（「ＢＡＣ」）内に含まれるヒトゲノム挿入断片であり、Ｘ１およびＸ３は独立に、ヒトゲノム中でＸ２に隣接している０−５００ｋＢのヒトゲノム核酸である）
の核酸またはその相補体に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含み、かつ
該異なるポリヌクレオチドプローブセットは、全体として、少なくとも２つの重なり合わない式１のゲノム配列に選択的にハイブリダイズする。そのようなバイオマーカーは、式１の核酸配列またはその相補体に選択的にハイブリダイズする、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７組の異なるプローブセットで構成されることが好ましい。これらの実施形態の各々では、所与の乳がんバイオマーカーのプローブセットのうち少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が、式１の核酸配列またはその相補体に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成され、該異なるポリヌクレオチドプローブセットは全体として、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個の重なり合わない式１のゲノム配列に選択的にハイブリダイズすることがさらに好ましい。Ｘ１およびＸ３が０−４００ｋｂ；０−３００ｋｂ；０−２００ｋｂ；０−１００ｋｂ；または０ｋｂであることがさらに好ましい。乳がんバイオマーカーの異なるプローブセットが、式１の核酸またはそれらの相補体の少なくとも１０ヌクレオチド長の１または複数のポリヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該ポリヌクレオチド配列で構成されることがさらに好ましい。さらに好ましい実施形態では、乳がんバイオマーカーの異なるプローブセットは、配列番号１８〜５１１またはそれらの相補体から成る群から選択された核酸の少なくとも１０ヌクレオチド長の１または複数のポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される。

本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、異なるプローブセットは全体として、少なくとも２つの異なる式１の核酸であって以下の
ａ）配列番号６２−６５（ＣＹＰ２４を含む）またはそれらの相補体のうち１または複数、および、
ｂ）配列番号４４−４６（ＰＤＣＤ６ＩＰを含む）またはそれらの相補体のうち１または複数
のＸ２グループを有する核酸に選択的にハイブリダイズする。

この実施形態（「ＨＲ＋組成物２」）はホルモン受容体陽性の乳房腫瘍の分類に特に有効であることが本明細書において実証されるが、ここで「ホルモン受容体陽性」とは、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のうちいずれか一方または両方について陽性であると定義される。ＨＲ＋組成物２のさらなる実施形態では、該異なるプローブセットは全体として、配列番号４１−４３（ＢＩＲＣ５を含む）のうち１または複数に選択的にハイブリダイズする。様々なさらなる好ましい実施形態では、該異なるプローブセットは全体として、次のグループ、すなわち：
（ａ）配列番号２５６−３２７（ＣＹＰ２４を含むＢＡＣ由来の固有配列プローブ）、またはそれらの相補体、および
（ｂ）配列番号１６０−２５５（ＰＤＣＤ６ＩＰを含むＢＡＣ由来の固有配列プローブ
）、またはそれらの相補体
の各々に由来する１または複数の核酸に選択的にハイブリダイズする。

グループ（ａ）の核酸はＣＹＰ２４を含むＢＡＣ由来の固有配列領域であり、グループ（ｂ）の核酸はＰＤＣＤ６ＩＰを含むＢＡＣ由来の固有配列領域である。したがって、ＨＲ＋組成物２のこの実施形態は、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて競合ＤＮＡの必要のない、本発明の方法において使用するための固有配列プローブを提供する。さらなる実施形態では、ＨＲ＋組成物２のための固有配列プローブは、
（ｃ）配列番号４１６−５１１（ＢＩＲＣ５を含むＢＡＣ由来の固有配列プローブ）、またはそれらの相補体
のグループ由来の１または複数の核酸に選択的にハイブリダイズする異なるプローブセットを含む。

ＨＲ＋組成物２のこれらの様々な実施形態では、プローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、前記２つまたは３つの列挙された核酸のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるか該ポリヌクレオチドで構成される。

本発明の第５態様のさらに好ましい実施形態では、異なるプローブセットは全体として、少なくとも２つの異なる式１の核酸であって以下の、
（ａ）配列番号５７−５９（ＮＲ１Ｄ１を含む）またはそれらの相補体のうち１または複数、および
（ｂ）配列番号４０（ＳＭＡＲＣＥ１を含む）、またはその相補体
のＸ２グループを有する核酸に選択的にハイブリダイズする。

この実施形態（「ＨＲ−組成物２」）は、ホルモン受容体陰性の乳房腫瘍の分類に特に有効であることが本明細書において実証されるが、ここで、「ホルモン受容体陰性」とは、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のうちいずれか一方または両方について陰性であるとして定義される。ＨＲ−組成物２のさらなる実施形態では、異なるプローブセットは全体として、配列番号４１−４３（ＢＩＲＣ５を含む）またはそれらの相補体のうち１または複数に選択的にハイブリダイズする。ＨＲ−組成物２の様々なさらなる好ましい実施形態では、異なるプローブセットは全体として、次のグループ：
（ａ）配列番号３２８−４１５（ＮＲ１Ｄ１を含むＢＡＣ由来の固有配列プローブ）、またはそれらの相補体、および
（ｂ）配列番号６６−１５９（ＳＭＡＲＣＥを含むＢＡＣ由来の固有配列プローブ）、またはそれらの相補体
の各々に由来する１または複数の核酸に選択的にハイブリダイズする。

グループ（ａ）の核酸は、ＮＲ１Ｄ１を含むＢＡＣ由来の固有配列領域であり、グループ（ｂ）の核酸はＳＭＡＲＣＥを含むＢＡＣ由来の固有配列領域である。したがって、ＨＲ−組成物２のこの実施形態は、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて競合ＤＮＡの必要のない、本発明の方法において使用するための固有配列プローブを提供する。さらなる実施形態では、ＨＲ−組成物２用の固有配列プローブは、
（ｃ）配列番号４１６−５１１（ＢＩＲＣ５を含むＢＡＣ由来の固有配列プローブ）、またはそれらの相補体
のグループに由来する１または複数の核酸に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されるプローブセットを含む。

ＨＲ−組成物２のこれらの実施形態では、プローブセットの少なくとも４５％、５０％
、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が、前記３つの列挙された核酸のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されることがさらに好ましい。

本発明の方法の様々なさらなる好ましい実施形態では、プローブセット中のポリヌクレオチドは、独立に、前記の関連配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、１０，０００；１５，０００；２０，０００；２５，０００；３０，０００；３５，０００；４０，００００；４５，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；１００，０００；１１０，０００；１２０，０００；１３０，０００；１４０，０００；１５０，０００；１６０，０００；１７０，０００；１８０，０００；１９０，０００；２００，０００；２１０，０００；または２２０，０００ヌクレオチドを含んでなるかまたはそれらのみで構成される。

本発明の方法の様々なさらなる実施形態では、組成物は、２〜４２組の異なるプローブセットを含んでなるかまたは該プローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなり、該異なるプローブセットの少なくとも４０％は、配列番号１−１７またはそれらの相補体のうちの１つの核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなり、該異なるプローブセットは全体として、配列番号１−１７またはそれらの相補体の前記核酸の少なくとも２つに選択的にハイブリダイズする。様々な好ましい実施形態では、組成物は、配列番号１−１７またはそれらの相補体のうちの１つの核酸に選択的にハイブリダイズする３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７組の異なるプローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなり、該異なるプローブセットは全体として、配列番号１−１７またはそれらの相補体の前記核酸のうちの少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個に選択的にハイブリダイズする。これらの実施形態の各々では、所与の乳がんバイオマーカーのプローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、配列番号１−１７またはそれらの相補体の核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されることがさらに好ましい。さらに好ましい実施形態では、乳がんバイオマーカーの異なるプローブセットは、配列番号１−１７またはそれらの相補体の核酸の少なくとも１０ヌクレオチド長の１または複数のポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される。様々なさらに好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１−１７またはそれらの相補体から成る群から選択された核酸のうち少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８
０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００ヌクレオチドを含んでなるかまたはそれらのみで構成される。さらなる実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１−１７またはそれらの相補体のうちの１つの核酸を含んでなるかまたは該核酸で構成される。

本発明の第５態様の各実施形態の好ましい実施形態では、本方法は、ロジスティック回帰分析から算出された計数を用いてｌｏｇ（標的のコピー数）の一次結合を行うことにより、予後指数を算出することを含む。予後指数の値に基づいてサンプルを適切なリスク群、例えば低、中、高に分類する。例えば、３つのプローブセットの乳がんバイオマーカーについての予後指数は、
ＰＩ（予後指数）＝ａ１＊ｌｏｇ（遺伝子１コピー数）＋ａ２＊ｌｏｇ（遺伝子２コピー数）＋ａ３＊ｌｏｇ（遺伝子３コピー数）
の形式をとりうる。

例えば、事前の分析により、係数が
ａ１＝１、
ａ２＝１、
ａ３＝−２
であることがわかり、ＰＩ＜１であれば再発リスクが低いことに相当することがわかったとする。

以下の特性、すなわち
遺伝子１コピー数＝４
遺伝子２コピー数＝２
遺伝子３コピー数＝４
の腫瘍を有する乳がん患者について、ＰＩは、
ＰＩ＝１＊ｌｏｇ（４）＋１＊ｌｏｇ（２）＋２＊ｌｏｇ（４）＝−０．６９３＜１
であり、従ってこの患者は遠隔位での再発のリスクが低いと考えられる。

ＣＮｉが、遺伝子ｉのコピー数を表すとする。ＰＩは、
ＰＩ＝ｌｏｇ（（ＣＮ１＾ａ１）＊（ＣＮ２＾ａ２）＊（ＣＮ３＾ａ３））
と表すことが可能であることに留意されたい。ＰＩが再発の予測であるとすれば、ｅｘｐ（ＰＩ）も同じであり、従って新たな予後指数を
ＰＩ＝（ＣＮ１＾ａ１）＊（ＣＮ２＾ａ２）＊（ＣＮ３＾ａ３）
と定義することができる。

正および負の両方の係数がある場合は、このＰＩを比として表すことができる。上記の係数の例については、
ＰＩ＝ＣＮ１＊ＣＮ２／ＣＮ３＾２
である。

別例では、予後指数を遺伝子コピー数の比、例えば
ホルモン＋：ＰＩ＝ＣＹＰ２４＊ＢＩＲＣ５／（ＰＤＣＤ６ＩＰ^２）
（式中、遺伝子名はその遺伝子のコピー数を表す）
とすることができる。例えば、事前の分析により、ＰＩ＜１であると再発リスクが低いことに相当することがわかったとする。以下の特性、すなわち
ＣＹＰ２４＝４
ＢＩＲＣ５＝４
ＰＤＣＤ６ＩＰ＝２
の腫瘍を有する乳がん患者については、ＰＩは、
ＰＩ＝４＊４／（２＾２）＝４＞１
と算出され、従ってこの患者は遠隔位での再発のリスクが高いと考えられる。

ホルモン−：ＰＩ＝ＮＲ１Ｄ１^２／（ＢＩＲＣ５＊ＳＭＡＲＣＥ１）
（式中、遺伝子名はその遺伝子のコピー数を表す）。例えば、事前の分析により、ＰＩ＜（１／２）であると再発リスクが低いことに相当することがわかったとする。以下の特性、すなわち
ＳＭＡＲＣＥ１＝４
ＮＲ１Ｄ１＝２
ＢＩＲＣ５＝４
の腫瘍を有する乳がん患者については、ＰＩは、
ＰＩ＝（２＾２）／（４＊４）＝１／４＜１／２
と算出され、従ってこの患者は遠隔位での再発のリスクが低いと考えられる。

試験の実施に関しては、比の予測値は、一次結合の予測値に対してある長所を有している。上記の比のＰＩ値には単位がない、すなわち遺伝子コピー数の測定のいかなる偏りも相殺する傾向を有することになる。

ハイブリダイゼーション試薬や、結合していないプローブを除去するための洗浄条件など、核酸プローブが核酸サンプル中の標的に選択的に結合してハイブリダイゼーション複合体を形成し、かつ他の配列には最小限または全く結合しないような任意の条件を、上述のように、本発明の方法において使用することができる。任意選択の追加工程には、核酸サンプルのプレハイブリダイゼーションおよび競合核酸の使用が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出し、遺伝子コピー数の変化を測定する任意の方法、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）など）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、アレイを用いる方法、および／またはゲノム比較ハイブリダイゼーションなど（これらに限定されない）を使用することができる。

好ましい実施形態では、検出はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（「ＩＳＨ」）によって行なわれる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは当業者に周知である。一般に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは次の主な工程、すなわち：（１）分析しようとする組織、生体構造物または核酸サンプルの固定、（２）核酸サンプル（その実施形態における組織または生体構造物内の核酸サンプル）へのアクセスしやすさを向上させ、かつ非特異的な結合を低減するための、組織、生体構造物または核酸サンプルのプレハイブリダイゼーション処理、（３）核酸サンプルへのプローブのハイブリダイゼーション、（４）ハイブリダイゼーションにおいて結合しなかったプローブを除去するための、ハイブリダイゼーション後の洗浄処理、ならびに（５）ハイブリダイゼーション複合体の検出、を含む（例えば、米国特許第６，６６４，０５７号明細書を参照）。上記の各工程で使用される試薬および該工程の使用条件は、特定の用途に応じて変わる。特に好ましい実施形態では、ＩＳＨは、全体が参照により本願に組み込まれる米国特許第５，７５０，３４０号および／または同第６，０２２，６８９号明細書に開示された方法によって実施される。

典型的なｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞が、一般にはスライドグラスなどの固体支持体に固定される。細胞は通常、熱またはアルカリで変性され、
次いで標的核酸配列に特異的な標識プローブをアニーリングできるようにハイブリダイゼーション溶液と接触させる。本発明のポリヌクレオチドは一般に、上述のようにして標識される。一部の用途では、反復配列へのハイブリダイゼーションの可能性を阻止することが必要である。この場合、ヒトゲノムＤＮＡまたはＣｏｔ−１ ＤＮＡを用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。

さらなる実施形態では、アレイを用いる形式を使用可能であり、同形式では本発明のポリヌクレオチドを表面にアレイ状に配置することができ、ヒトの核サンプルを該表面上のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる。この種の形式では、多数の異なるハイブリダイゼーション反応を本質的に「並行して」実行することができる。これにより、迅速かつ本質的に同時に多数の核酸プローブを評価することができる。アレイを用いる形式でのハイブリダイゼーション反応を実施する方法は、例えばパスティネン（Ｐａｓｔｉｎｅｎ）、１９９７年、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、第７巻、ｐ．６０６−６１４；（１９９７）ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻、ｐ．１６８５；チー（Ｃｈｅｅ）、１９９５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７４巻、ｐ．６１０；国際公開公報第９６／１７９５８号パンフレットにも記載されている。表面上にポリヌクレオチドを固定化し、表面を誘導体化する方法は当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第６，６６４，０５７号明細書ならびに上述の文献も参照されたい。

第６の態様では、本発明は、乳房の腫瘍を分類する方法を提供し、該方法は、
（ａ）乳房の腫瘍を有する対象から得られたｍＲＮＡ由来の核酸サンプルを核酸プローブと接触させる工程であって、該核酸プローブは全体として、配列番号１−１７またはそれらの相補体から成る群から選択された２つ以上の核酸標的に選択的にハイブリダイズし、接触は、核酸サンプル中に存在する核酸標的またはその相補体との核酸プローブの選択的なハイブリダイゼーションを促進する条件の下で行われることを特徴とする工程と、
（ｂ）核酸プローブと核酸標的またはその相補体との間のハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程であって、そのようなハイブリダイゼーション複合体のいくつかにより、配列番号１−１７の核酸の１または複数の遺伝子発現の尺度が提供されることを特徴とする工程と、
（ｃ）配列番号１−１７の核酸の１または複数の遺伝子発現の対照に対する変化（すなわち増加または減少）を、乳がんの分類と関連付ける工程と
からなる。好ましい実施形態では、分類は乳がんの再発を含む。

本発明の第６の態様の方法は、配列番号１−１７のマーカーの１または複数の遺伝子発現の対照に対する変化を、乳房腫瘍が再発しそうであるという分類と関連している対照に対する発現の変化によって検出する。

当該技術分野で周知の任意の対照を、本発明の方法において使用することができる。例えば、がんおよび非がんの腫瘍組織のいずれにおいても比較的一定のレベルで発現することが知られている遺伝子の発現レベルを、比較のために使用することができる。別例として、プローブが標的とする遺伝子の発現レベルを、試験用サンプルと同等のがんではないＲＮＡサンプルについて分析することができる。当業者は、本発明の方法において多くのそのような対照を使用することができることを認識するだろう。

本発明の第６の態様では、本方法は乳がんに関連した遺伝子発現の変化を検出するために使用される。本明細書に使用する場合、「乳がんに関連した」とは、１または複数のマーカーの発現レベルの変化を用いて乳房腫瘍の特徴または核酸サンプルを得た患者の予後、すなわち
（ａ）乳がんの診断（良性腫瘍か悪性腫瘍か）；
（ｂ）転移の可能性、特定の器官に転移する可能性、または腫瘍の進行；
（ｃ）腫瘍のステージ；
（ｄ）化学療法またはホルモン療法を行わない状態での患者の予後；
（ｅ）治療（化学療法、放射線療法および／または腫瘍を切除する手術）に対する患者の応答性の予測；
（ｆ）患者にとって最適な治療コースの予測；
（ｇ）治療後の患者の再発に関する予測；および
（ｈ）患者の余命
などを分類することができることを意味する。

したがって、本発明のこの態様の方法は、例えば乳がんの診断、および化学療法を行う場合と行わない場合の患者の予後、患者にとって最適な治療コースの予測、および患者の余命についての情報を提供する。好ましい実施形態では、乳がんの分類は、乳房腫瘍の再発の予測を含む。さらに好ましい実施形態では、１または複数の核酸標的の発現レベルの変化が、対照に対する該乳房腫瘍の再発率の増大と関連付けられる。本明細書に使用する場合、「再発」とは、局所における腫瘍の再発（同側性、局所的、または対側性など）、転移、または乳がんによる死を意味する。

さらに好ましい実施形態では、１または複数の核酸標的の正常な発現レベルの変化は、乳房腫瘍の再発リスクの上昇と関連付けられる。当業者は、「発現レベルの変化」が、正常で健康な同一組織に関する発現レベルからの何らかの逸脱を意味すると理解するだろう。さらに「リスクの増大」が、本明細書に記載のマーカーを用いて得られた情報がなければ類似または同一の臨床上かつ／または病理学的特性を有する他のすべてに対して、リスクがより高いことを意味することも理解されるであろう。

本方法のすべての態様および実施形態について本明細書で使用する場合、対照に対する遺伝子発現の変化（すなわち増加または減少）とは、疾病状態に対応する正常組織に対する何らかの増加または減少である。様々な実施形態では、増加または減少は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％またはそれ以上の増加または減少である。

したがって、本発明は、乳がん患者の治療について決定を下す方法をさらに提供し、該方法は、本発明の種々の態様および実施形態に従って乳房腫瘍を分類する方法を実行する工程と、次いで、その結果について、該乳がん患者の治療コースの決定に際し、周知の臨床上および病理学的リスク要因に照らして検討することからなる。例えば、本発明の方法によって再発のリスクが高いことが示された患者を、化学療法、放射線療法、および／または腫瘍の外科的切除のような標準的治療法でより積極的に治療することができるかもしれない。

本発明の方法において使用されるｍＲＮＡ由来の核酸サンプルは、ｍＲＮＡでもｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡでもよい。本発明の方法において使用されるＲＮＡサンプルは、乳房腫瘍の分類において有用な任意の供給源、例えば乳房組織サンプル、類繊維腫、および骨髄細胞を含む血液サンプルなど（これらに限定されないに）由来するものであってよい。好ましい実施形態では、ＲＮＡサンプルはヒトのＲＮＡサンプルである。核酸サンプルは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用に調製されたサンプルなど、ヒト細胞ＤＮＡまたはＲＮＡサンプルであることが好ましい。

本発明の第６の態様の方法の様々な好ましい実施形態では、核酸プローブは、上記に開示された組成物の様々な態様および実施形態、特に本発明の第３態様およびその好ましい実施形態から選択される。ほとんどの好ましい実施形態では、上記に開示されるように、
プローブセットのポリヌクレオチドは検出可能な標識を含んでなり、特に、異なるプローブセットは、多数の標的の遺伝子発現を分析しやすいように識別することのできる検出可能な標識を含んでなる。

様々な他の好ましい実施形態では、核酸プローブは全体として、配列番号１−１７またはそれらの相補体の３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個の異なる核酸に選択的にハイブリダイズし、配列番号１−１７またはそれらの相補体の核酸のうち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個の遺伝子発現の変化が、乳がんの分類、好ましくは再発と関連付けられる。

本発明の第６の態様のさらに好ましい実施形態では、使用される組成物は、少なくとも配列番号１７（ＣＹＰ２４）、および配列番号１０（ＰＤＣＤ６ＩＰ）、またはそれらの相補体に全体として選択的にハイブリダイズする異なるプローブセットを含んでなる。この実施形態（「ＨＲ＋組成物３」）は、ホルモン受容体陽性の乳房腫瘍の分類に特に有効であることが本明細書において実証されるが、ここで「ホルモン受容体陽性」とは、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のうちいずれか一方または両方について陽性であるとして定義される。ＨＲ＋組成物３のこの実施形態では、異なるプローブセットが、全体として、配列番号９（ＢＩＲＣ５）に選択的にハイブリダイズすることがさらに好ましい。ＨＲ＋組成物３のこれらの様々な実施形態では、プローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、前記２つまたは３つの列挙された核酸のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されることがさらに好ましい。

本発明の第６の態様のさらに好ましい実施形態では、使用される組成物は、少なくとも配列番号１５（ＮＲ１Ｄ１）および配列番号８（ＳＭＡＲＣＥ１）、またはそれらの相補体に全体として選択的にハイブリダイズする異なるプローブセットを含んでなる。この実施形態（「ＨＲ−組成物３」）は、ホルモン受容体陰性の乳房腫瘍の分類に特に有効であることが本明細書において実証されるが、ここで「ホルモン受容体陰性」とは、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のうちいずれか一方または両方について陰性であるとして定義される。ＨＲ−組成物３のこの実施形態では、異なるプローブセットが、全体として、配列番号９（ＢＩＲＣ５）に選択的にハイブリダイズすることがさらに好ましい。ＨＲ−組成物３のこれらの様々な好ましい実施形態では、プローブセットの少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、前記３つの列挙された核酸のうちの１つに選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成されることがさらに好ましい。

本発明のこの態様のそのようなプローブは、ストリンジェントな条件下で対象の核酸に選択的にハイブリダイズすることが可能な任意の長さであってよく、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチドの長さである。様々なさらなる実施形態では、この実施形態のプローブは、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００ヌクレオチドの長さである。さらなる実施形態では、本発明のこの態様のプローブは、列挙された核酸全体に相補的である。この実施形態のプローブはＲＮＡでもＤＮＡでもよく、一本鎖でも二本鎖でもよい。

この態様のほとんどの好ましい実施形態では、核酸プローブは、本発明の核酸組成物の
一本鎖アンチセンスポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成される。例えば、ｍＲＮＡの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（すなわちメッセンジャーＲＮＡを検出するＦＩＳＨ）では、アンチセンスプローブ鎖だけがＲＮＡサンプル中の一本鎖ｍＲＮＡにハイブリダイズし、かつその実施形態では、「センス」鎖オリゴヌクレオチドを陰性対照として使用することができる。

別例として、プローブ、好ましくは本発明の組成物のプローブとして、ＤＮＡプローブを使用することができる。この実施形態では、細胞質のＲＮＡへのハイブリダイゼーションと核ＤＮＡへのハイブリダイゼーションとを識別することが望ましい。この識別を行うための主な２つの基準は次のとおりである。（１）標的の種類によるコピー数の差（コピー数が何百〜何千ものＲＮＡか、２コピーのＤＮＡか）。この差は通常シグナル強度の顕著な差を生じる。および（２）細胞質（ＲＮＡ標的へのハイブリダイゼーションが起きると思われる）と核との明瞭な形態学的相違から、シグナルの位置が明白となること。したがって、二本鎖ＤＮＡプローブが使用される場合、該方法は、体液サンプル内の分析されている細胞の細胞質および核を識別する工程をさらに含むことが好ましい。そのような識別工程は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２またはＤＡＰＩのような、分析されている細胞の核ＤＮＡを描出する核染色剤の使用など、当該技術分野で周知の任意の手段によって遂行されうる。この実施形態では、核染色剤が検出可能なプローブから識別可能であることが好ましい。核膜が維持されること、すなわちＨｏｅｃｈｓｔまたはＤＡＰＩ染色剤のすべてが核の可視構造内に維持されることがさらに好ましい。

この態様の方法のハイブリダイゼーション条件および他の詳細については、コピー数の変化の分析について上述したとおりである。好ましい実施形態では、当技術分野の標準的方法を使用してＲＮＡ ＦＩＳＨが使用される。

上記の態様および実施形態の各々において、ハイブリダイゼーションの検出は一般に、上述したものなど核酸プローブ上の検出可能な標識の使用により遂行される。標識は、ポリヌクレオチドに直接組み入れてもよいし、ポリヌクレオチドにハイブリダイズまたは結合する分子に付着させてもよい。標識は、上述したように、当業者に周知の様々な手段でプローブに連結させることができる。好ましい実施形態では、上に議論されるように、本発明の組成物の異なるプローブセット上の検出可能な標識は、互いに識別可能である。標識は、上記および以下に議論されるように、分光分析法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、物理学的方法、または化学的方法（これらに限定されない）など任意の技法により検出することができる。

さらなる態様では、本発明は、本発明の組成物とその使用説明書からなる、本発明の方法に使用するためのキットを提供する。好ましい実施形態では、上記に開示されるように、プローブセットは異なるプローブセットを識別するために標識されていることが好ましい。さらに好ましい実施形態では、プローブセットは溶液状態で提供され、最も好ましくは本発明の方法で使用されるハイブリダイゼーションバッファ中に提供される。別の実施形態では、プローブセットは、上に記述されたもののような固体支持体上に提供される。さらなる実施形態では、キットは洗浄溶液および／またはプレハイブリダイゼーション溶液も備える。

現在使用されている乳がん予後診断の臨床的かつ腫瘍病理学的指標はあまり正確ではない。その結果、補助化学療法から利益を得るであろう患者よりも多くの患者が該治療を受けており、予後が悪いであろう多くの患者は、積極的な治療の初期には特定されない。ファントビア（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ）ら（２００２）は、予後に関連している遺伝子発現プロファイルを特定するという問題に取り組んだ。彼のグループによって集められたデー
タは、臨床データを備えた９７件の乳房腫瘍サンプルに関する２４４８１個の遺伝子にわたる遺伝子発現測定値で構成されるものであった。一変量の遺伝子選択メカニズム（ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を適用して、予後の予測に有用な７０個の遺伝子群が特定されている：
ファントビアの７０個の遺伝子マーカー
精度 ８０．８％
感度 ９１．２％
特異性 ７２．７％
ここでは、精度はバイオマーカーによって正確に分類されたサンプルの割合として定義される。感度は、正確に予後不良として分類された予後不良サンプルの割合を指し、特異性は、正確に予後良好として分類された予後良好なサンプルの割合を指す。

しかしながら、７０個の遺伝子マーカーの臨床上の実用性は、７０個の測定値を統合するコストおよび複雑さによって制限されている。さらに、固形腫瘍組織サンプル中の遺伝子発現の測定には、通常のやり方ではない組織の取り扱いが必要である。病院にとっては、発見された分子シグニチャについての代替的実施が好ましい。そのような１つの手法はＤＮＡ異常のＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成）測定である。ＦＩＳＨは、染色体異数性、転座および遺伝子増幅など様々な腫瘍のＤＮＡ異常を解析するために現在広く臨床的に使用されている。

分子シグニチャのマッピング
最近、ポラック（Ｐｏｌｌａｃｋ）ら（２００２）により、乳房の腫瘍については、ゲノムのかなりの割合に関して遺伝子発現が遺伝子増幅と関連していることが実証された。３７の腫瘍サンプルにわたる６０９５の遺伝子のＤＮＡコピー数およびＲＮＡ遺伝子発現の測定値から、ポラックらは、すべての遺伝子発現変化の１２％が遺伝子増幅に直接起因することを見出した。さらに、高度に増幅された領域については、これらの領域にある遺伝子の６２％が中程度または非常に高い発現を示すことを見出した。したがって、相関性の高い領域にマッピングされる分子シグニチャについては、ＦＩＳＨを用いた分析が遺伝子発現測定の代替である。そのような分子シグニチャを識別するために、このデータは上述のファントビアの遺伝子発現データと同時に分析された。

この同時分析から、本発明者らは、そのＲＮＡ遺伝子発現が無病生存率の予測となり、さらにそのＲＮＡの発現がＤＮＡのコピー数と高く相関している９つの遺伝子を特定した。

独立したデータセットにおける遺伝子の選択の検証
以前の刊行物（ソルリエ（Ｓｏｒｌｉｅ）ら、２００１）から、ＤＦＳ（無病生存率）の形式の予後データを、ポラックの乳がんＤＮＡ増幅データのサブセットについて利用することができた。この予後データは９つの遺伝子の特定においては使用されなかったので、９つの遺伝子の予後診断の精度をテストするために使用することができる。

生存率データが利用可能な２６サンプルのうち、１８サンプルは予後不良（５年未満のＤＦＳ）の患者から、８サンプルは予後が良好な（５年を越えるＤＦＳ）患者から集められた。ＤＦＳが利用可能なサンプルは少数であったので、あらかじめ発見された９つの遺伝子のうち１つおよび２つの遺伝子の組合せに分析を制限した。最も予後の予測性の高い単一の遺伝子マーカー（ＡＬ０８００５９）は、ＤＮＡ増幅データにおける予後の予測において７３％正確であることが見出された。上位９つの有益な遺伝子のうちの２つ（ＡＬ０８００５９、ＡＮＸＡ１１）の組合せにより、独立の予後データに対して次の成績：
精度 ９２．３％
感度 ９４．４％
特異性 ８７．５％
が達成された。

以下のリストに挙げるのは、乳がんにおける遺伝子発現、ＤＮＡ増幅、およびそれらの予後診断における有用性についての本発明者らの同時分析から得られた１７の遺伝子である。このリストに含まれているのは、その発現が増幅と高度に相関しており、かつ予後の予測性を有する前述の９つの遺伝子、ＤＮＡコピー数の変動が非常に大きくかつ遺伝子発現の予後の予測性を有する別の２つの遺伝子、およびＤＮＡコピー数データおよびソルリエのＤＦＳデータから直接決定したさらに６つの遺伝子である。

したがって、これらの遺伝子の各々を、乳がんに関連したゲノムＤＮＡの増幅に関するマーカーセットに使用することができる。

ファントビア、エル．ジェイ．（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ，Ｌ．Ｊ．）ら、「Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．」、Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、第４１５巻、ｐ．５３０−５３６
ポラック、ジェイ．アール．（Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｊ．Ｒ．）ら、「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｍａｊｏｒ ｄｉｒｅｃｔ ｒｏｌｅ ｏｆ ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００２年１０月１日、第９９巻第２０号、ｐ．１２９６３−８
ソルリエ、ティー．（Ｓｏｒｌｉｅ、Ｔ．）ら、「Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｔｕｍｏｒ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００１年９月１１日、第９８巻第１９号、ｐ．１０８６９−７４。

ＦＩＳＨアッセイ形式で乳がんの再発を予測するための多重ゲノムマーカーの検証
乳がん患者の再発リスクの予測には現時点では限界があり、その結果一部の女性には不必要な補助化学療法が為される可能性があり、またより積極的な治療が有益かもしれない人々を特定することが困難となっている。コピー数が乳がんの再発を予測する遺伝子マーカーのサブセットが、上記に記述されている。これらのパターンの予後の予測値を検証するために、浸潤性乳がんの女性由来の外科標本において、これらのマーカーのサブセットの組み合わせを使用して、コピー数と再発との関連付けを実施した。１７個のゲノムマーカー候補のコピー数を、初期段階の浸潤性がんであり平均８．９年の追跡調査による臨床結果が判明している２２９人の患者由来のパラフィン包埋された外科標本について、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを用いて測定した。一変量分析から、腫瘍中の１７個のゲノムマーカー候補のうちの１１個のＤＮＡコピー数が、遠隔位での再発（Ｐ＜０．００１〜＜０．０３）を予測したことが示された。本発明者らはこの１７個のゲノムマーカーの予測的サブセットの特定も実施した。

調査対象集団
１９８６年〜１９９９年にニューメキシコ大学病院で診断された７２３例の乳がんのカルテを調査し、適格な３０８例を特定した。適格性の基準として、ステージＩ、ＩＩまたはＩＩＩの浸潤性の乳腺がんと診断されていること、最初の臨床上かつ病理学的記録が入手可能であること、保管された腫瘍標本が入手可能であること、および少なくとも４年間臨床的に追跡調査されていることを含めた。追跡調査の平均は８．９年であった。再発は、乳がんからの転移または乳がん死を示す臨床上の証拠として定義された。調査対象集団は、９８例のステージＩ患者（３３％）、１１８例のステージＩＩ患者（３８％）および６１例のステージＩＩＩ患者（２０％）で構成された。治療は乳房切除術（５９％）、乳房切除術／放射線（１４％）、乳腺腫瘤摘出（４％）および乳腺腫瘤摘出／放射線（２１％）を含んでいた。（６人の患者は生検のみを受けていた。）患者は補助的なホルモン療法（２５％）、化学療法（２９％）、化学療法およびホルモン療法（１５％）を受けたか、または補助的治療なし（２２％）であった。エストロゲン受容体またはプロゲステロン受容体のいずれか（または両方）に対して陽性の場合、腫瘍をホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）として分類した。２０９例（６８％）がＨＲ＋であり、８３例（２７％）はＨＲ−であった。（１６例（５％）についてはホルモン状態が測定されなかった）。

再発の重要な予測因子であることが判明した要因には、比較的若いこと（Ｐ＝４．３×１０^−４）、病理学的ステージがｐＴ１より高いこと（Ｐ＝１．０×１０^−５）、総合的なステージがＩより高いこと（Ｐ＝６．０×１０^−６）、および結節の状態がＮ０より高いこと（Ｐ＝４．２×１０^−８）が含まれた。

ホルモン状態（Ｐ＝０．３２０８）も人種の起源（コーカサス人とその他、ヒスパニックとその他、非コーカサス人とその他、Ｐ＝＞０．７５）も、再発の重要な予測因子であるとは考えられなかった。結節陰性群の中では、年齢（Ｐ＝０．４４８５）も腫瘍サイズ（Ｐ＝０．１９９６）も、再発の予測因子であるとは考えられなかった。

病理学報告書および顕微鏡スライドを調査し、診断上の区分をＦＩＳＨ実験用の切片作成のために選択した。ＦＩＳＨデータは２６５例について収集した。ハイブリダイゼーションを連続切片について実施したが、ハイブリダイゼーションおよびシグナル収集を行なう実験者は、使用プローブおよび病歴のいずれについても盲検化した。この実験で使用されるゲノムプローブは、ヒトの「３２Ｋ」ＢＡＣ Ｒｅ−Ａｒｒａｙ（オークランド小児病院研究所（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｐａｃ．ｃｈｏｒｉ．ｏｒｇ／））から選択した。ＢＡＣクローン挿入断片をＰＣＲで確認し、染色体上の位置を有系分裂染色体へのＦＩＳＨハイブリダイゼーションによって確認した。１７のＢＡＣプローブを対にして（蛍光色素ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（商標）またはＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）で標識）ハ
イブリダイズさせたが、ハイブリダイゼーションは、サンプルの脱パラフィン処理、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための標準的プロトコルに従った。ＭｅｔａＣｙｔｅ自動ＦＩＳＨ分析用ハードウェアおよびソフトウェア（ドイツ連邦共和国アルトルスシャイム（Ａｌｔｌｕｓｓｃｈｅｉｍ）所在のＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ハイブリダイゼーションのシグナルを収集し、画像化し、保存し、分析した。概して、各プローブ対について実験者がシグナル品質の良好な２０個の４０×フィールドを選択してから、Ｍｅｔａｃｙｔｅに取り込んだ。がん細胞（例えば、間質リンパ球細胞または浸潤リンパ球細胞）を含んでいない領域については、本発明者らが「仮想顕微解剖（Ｖｉｒｔｕａｌ Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）」と称する手法を使用した詳しい分析から除外した。典型的には、少なくとも２つのフィールド（通常５−６）由来の少なくとも１００個の細胞（通常２００）からのＦＩＳＨシグナルを、各遺伝子プローブ対について分析した。わずかな標本（＞５％）から少数の分析可能な細胞が得られた。薄切片中の核の不均一な分布の影響を最小限にするために、シグナルの計数データをＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓによって設計された「タイル張り（ｔｉｌｉｎｇ）」パターンに集めた。その後、データをコンピュータ分析用のフラットファイル形式で転送した。

方法および結果−データ解析
［生データ］
生データ（１タイル当たりのＤＮＡコピー数）を、ＤＡＰＩ染色された核の断面積について観察されたＦＩＳＨシグナルを、核相当容量（ＮＥＶ）当たりの算出断面積で割ることにより、核相当容量当たりのコピー数に標準化した（パールプラッツ（Ｐａｈｌｐｌａｔｚ）ら、１９９５年）。本研究に適格な３０８例のうち、２６５の標本からＦＩＳＨデータを得た。３１例については新たな補助治療の後に収集され、５つの標本は局所的な再発に関係していた。これらの３６例については一層の研究用に確保され、ここで報告する分析からは除外され、分析用には２２９例が残った。すべての標本についての核相当容量（ＮＥＶ）当たりのＤＮＡコピー数の平均数は、以下のヒストグラムに要約されている。

［一変量分析］
１８種のプローブについて、一変量分析により、１１種が遠隔位での再発に有意に関連していることが明らかとなった（ｐ＜０．０５、ウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）検定）。個々の遺伝子についてのＰ値は、以降の表に報告されている。この結果を、コピー数と再発との間の関連がないことについて期待される偽陽性の数と比較することができる。１８種のプローブについては、平均で１つ未満のプローブがｐ＝０．０５で有意であると判定されるであろう。したがって、これらの結果は、プローブを最初に選択する際に使用した技法の正当性を確認するものである。しかしながら、本発明者らは臨床上使用するのに十分な予後の予測性を有する個別のプローブを探しているわけではない。プローブの組合せを必要としているのである。

［ＤＮＡコピー数のパターン］
遠隔位での再発に関連している１７個の固有ゲノム領域のサブセットに関するコピー数測定値のパターンを、各サブセットの予後指数の性能に関して評価した。予後指数は、予測パターンのコピー数から計算されたスコアを再発のリスクに対して割り当てる。予測パターンの探索は、各分析において無作為に選択された練習用セットで行なった。残りのサンプルは、盲検テストセットとして保留した。予後指数のスコアを、低リスク、中程度のリスク、高リスクにグループ分けし、陰性および陽性の予測価を計算した。予後のパターンを、ホルモン陽性（ＨＲ＋）およびホルモン陰性（ＨＲ−）の症例について検討した。各サブグループで最良の予後のパターンを、リンパ節陰性（ＨＲ＋、Ｎ−）であった症例サブセットについてさらにテストした。ホルモン受容体陽性マーカー（ＨＲ＋マーカー）およびホルモン受容体陰性マーカー（ＨＲ−マーカー）の遺伝子構成を、下記および表４に示す。

（３つの遺伝子の組合せ）
● ３つの遺伝子の組合せであって２つの特徴的な最良の組合せが、乳がんの再発の予測性を有していた：
○ ホルモン受容体陽性の、ステージＩ、ステージＩＩおよびステージＩＩＩの症例に関するもの（ホルモン受容体陽性とはエストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のうちいずれか一方または両方について陽性であると定義される）。遺伝子は、ＣＹＰ２４、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＢＩＲＣ５である。

このマーカーは、ホルモン陽性かつ結節陰性であるサブセットにおいても予測性を有する。
○ ホルモン陰性（エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体陰性）の症例に関するもの。遺伝子は、ＮＬＲＤ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＢＩＲＣ５である。

● 「組合せ」は、分類者に対して各遺伝子の重要性を評価する係数を含む関数によって特定される。
（２つの遺伝子の組合せ）
● ３つの遺伝子のうち２つの組合せの、ＨＲ＋およびＨＲ−のいずれの症例についても、再発の予測性を有していた。

○ ＨＲ＋について：ＣＹＰ２４、ＰＤＣＤ６ＩＰ
○ ＨＲ−について：ＮＲＬＤ１、ＳＭＡＲＣＥ１
● ２つの遺伝子については、「組合せ」は、上述の３つの遺伝子の組合せの場合のような関数によって、または２つの遺伝子のコピー数の比（線形または非線形）として、特定可能である。２つの遺伝子の増幅が相関しない（すなわち、比が数値１ではない）場合、再発のリスクが高い。

データ分析の要約
この調査について、サンプルを２つ以上のリスクグループに分類する能力に基づいて組合せを順位付けするためのアルゴリズムを開発した。該アルゴリズムは、ロジスティック回帰分析から計算された係数を用いたｌｏｇ（コピー数）の一次結合を使用する。この一次結合を予後指数と名付ける。予後指数の値から、サンプルをリスクグループに分類する。割り当てられた低リスクグループおよび高リスクグループの間の実際のリスクの差に主に基づいた目的関数が、組合せをランク付けして予測性を有する組合せを特定するための広範囲な探索に使用された。

探索過程では、データの「練習用」サブセットだけ（２５％−５０％）が使用された。残りのサンプルは再発に関して盲検化し、特定された予測的組合せのテストのために使用
した。練習用データを用いて測定された、性能が上位の組合せは、盲検化されたテストデータについても良好に機能した。

３つの遺伝子座の組合せ２種［ＮＲ１Ｄ１、ＳＭＡＲＣＥ１およびＢＩＲＣ５］ならびに［ＣＹＰ２４、ＰＤＣＤ６ＩＰおよびＢＩＲＣ５］それぞれのゲノムマーカーのＤＮＡコピー数は、それぞれホルモン受容体陰性および陽性のがんにおける再発を強力に予測した。ゲノムのマーカーの増幅パターンに基づいて、患者を、ホルモン受容体陰性の腫瘍においてはそれぞれ９％および５８％、ならびにホルモン受容体陽性のがんにおいてはそれぞれ９％および５０％の再発率の低リスクグループおよび高リスクグループに位置づけることが可能であった。ロジスティック回帰分析から導かれた方程式は
ＰＩ（予後指数）＝ａ１＊ｌｏｇ（遺伝子１コピー数）＋ａ２＊ｌｏｇ（遺伝子２コピー数）＋ａ３＊ｌｏｇ（遺伝子３コピー数）
の形である。

ホルモン陽性およびホルモン陰性のいずれの組合せについても、本発明者らは、計算された係数が、遺伝子コピー数の比が上記と同じように重要な予測値となりうるようなものであることに気付いた。特に、次の比に基づいたＰＩが本発明者らのサンプルにおける重要な予測値であることが見いだされた：
ホルモン＋：ＰＩ＝ＣＹＰ２４＊ＢＩＲＣ５／（ＰＤＣＤ６ＩＰ＾２）、
ホルモン−：ＰＩ＝ＮＲ１Ｄ１＾２／（ＢＩＲＣＳ＊ＳＭＡＲＣＥ１）
（式中、遺伝子名はその遺伝子のコピー数を表す）。

テストの実施については、比の予測値が、一次結合の予測値に対してある長所を有する。上記の比のＰＩは単位がない：遺伝子コピー数測定値における偏りも相殺される傾向を有することになる。

いずれのマーカーも再発に関係しないとすれば、平均で１未満の偽陽性率はｐ＜０．０５で期待される。１１個のマーカーがｐ＜０．０５で再発に関係していた
結論：
１．本明細書に記載のＰＧＡ ＦＩＳＨ（商標）の方法は、保管された組織サンプル中
の遺伝子コピー数を評価するための有効なアッセイである。

２．ＰＧＡ ＦＩＳＨ（商標）の方法は、間質細胞または炎症性細胞ではなくもっぱらがん細胞中のみの遺伝子コピー数の評価を可能にする。
３．１７個の遺伝子のうちの１３個について、一変量として再発を予測するか、予後を予測する多重パターンに関与するかのいずれかであることが確認された。本発明者らは、ホルモン受容体陰性（ＨＲ−）のがんである女性について再発のリスクが低い予後を予測する、３遺伝子マーカー（ＮＲ１Ｄ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＢＩＲＣ５）を練習用セットにおいて見いだした。該マーカーの「陰性」の予測値は独立したテストセットにおいて９１％であった。

４．本発明者らは、ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）のがんである女性について再発のリスクが低い予後を予測する、第２の３遺伝子マーカー（ＣＹＰ２４、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＢＩＲＣ５）を練習用セットにおいて見いだした。該マーカーの「陰性」の予測値も、独立したテストセットにおいて９１％であった。

５．ホルモン受容体陰性、リンパ節陰性（ＨＲ−、Ｎ０）のがんである女性では、第１のマーカー（ＳＭＡＲＣＥ１、ＮＲ１Ｄ１およびＢＩＲＣ５）は、テストセットにおいてＮＰＶが１００％（４人の女性のうち０人）であった。

６．ホルモン受容体陽性、リンパ節陰性（ＨＲ＋、Ｎ０）のがんである女性では、第２のマーカー（ＣＹＰ２４、ＰＤＣＤ６ＩＰおよびＢＩＲＣ５）は、テストセットにおいてＮＰＶが１００％（１５人の女性のうちの０人）であった。これらのゲノムマーカーの予後予測値は、ホルモン受容体陽性、結節陰性（ＨＲ＋、Ｎ０）ならびにホルモン受容体陰性、結節陰性（ＨＲ−、ＮＯ）のがんであるより多くの女性について研究されるだろう。

当業者には明らかなことであるが、上記症例の各々において、一変量マーカーとしては統計学的有意性を示さなかった少なくとも１つのマーカー（ｐｄｃｄ６ｉｐ（４３ｒ））が、上述の３つの多変量プローブセットそれぞれの中にある。対照的に、一変量プローブとして最も統計学的有意性が高いマーカー（７７ｒ（ｅｘｔｌ）および８２ｇ（ｂｉｒｃ５））を両方とも含む多変量セットはない。いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、本発明者らは、最も優れた再発の予測値として本明細書に開示されたマーカーの組合せが、異なる細胞内パスウェイのマーカーを提供し、したがって、それらの組合せは、一変量マーカーとしては重要性が高いが同一または類似の細胞内パスウェイについての不要な情報を提供する他のマーカーの組合せに加えて、追加情報を提供すると仮定する。このように異なる細胞内パスウェイを表すことにより、本明細書の実施例において示された組合せマーカーが、それらの個々の細胞内パスウェイとして標的化された薬の併用治療の効果を予測する有望な候補者となるかもしれない。

５つのＢＡＣ ＤＮＡ、すなわちＮＲ１Ｄ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＢＩＲＣ５、ＣＹＰ２４ＡおよびＰＤＣＤ６ＩＰのＢＡＣ ＤＮＡを選択した。該ＢＡＣは、ＣＨＯＲＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｐａｃ．ｃｈｏｒｉ．ｏｒｇ／）に維持された「３２Ｋ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ＢＡＣ Ｒｅａｒｒａｙ」から選択された。この実施例におけるＢＡＣの大きさは１５４−１７８ｋｂの範囲である。個々のＢＡＣの詳細は表６に要約されている。

ＢＡＣの反復エレメントを、ＵＣＳＣゲノムバイオインフォマティクスデータベースの「Ｍａｓｋ Ｒｅｐｅａｔ」機能の使用により識別し、反復のないＢＡＣ配列を、「Ｇｅｔ ＤＮＡ」機能

を使用して得た。

各マーカーの関連ＢＡＣクローンの配列を、印付けされた反復配列を備えたＵＣＳＣヒトゲノムブラウザからダウンロードした。プライマーを、長さ３００ｂｐ以上の固有配列の領域の両端から選択した。プライマーは、「Ｆａｓｔ ＰＣＲ」プログラムを使用して各ＢＡＣについて設計された。

ＰＣＲは以下のように実行した：
― プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＰＣＲマスターミックス（カタログ番号Ｍ７５０５）をＰＣＲに使用した。
反応バッファ：２５ユニット／ｍｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ独自の反応バッファ（ｐＨ８．５）に溶解）、２００ｕＭのｄＡＴＰ、２００ｕＭのｄＧＴＰ、２００ｕＭのｄＣＴＰ、２００ｕＭのｄＴＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２。

― サイクル反応条件：
１． ９５℃で５分；
２． ９５℃で１５秒；
３． ５６℃で３０秒；（この温度はプライマーのアニーリング温度に依存して変わる。）
４． ７２℃で２分；
５． ステップ２に続く（３０回）；
６． ７２℃で３分；
― プライマー濃度は１ｕＭとした。

― テンプレートの濃度：
初回のＰＣＲのためのＢＡＣクローン濃度は０．３〜０．５ｎｇ／ｕｌとした。２回目のＰＣＲについては、初回のＰＣＲ反応混合物の１／１００容量をテンプレートとして使用し、濃度は測定しなかった。

― ５０ｕｌの初回のＰＣＲ反応については、
０．３ｕｌのＢＡＣテンプレート（５６ｎｇ／ｕｌ）；
５ｕｌの順方向プライマー（１０ｕＭ）；
５ｕｌの逆方向プライマー（１０ｕＭ）；
２５ｕｌの２×ＰＣＲマスターミックス；
１４．７ｕｌの滅菌ｄＨ_２Ｏ
を混合する。

― そして上記のサイクル反応を実施して−２０℃に保存する。
― ５０ｕｌの２回目のＰＣＲ反応については、
０．５ｕｌの初回ＰＣＲ産物；
５ｕｌの順方向プライマー（１０ｕＭ）；
５ｕｌの逆方向プライマー（１０ｕＭ）；
２５ｕｌの２×ＰＣＲマスターミックス；
１４．５ｕｌの滅菌ｄＨ_２Ｏ
を混合する。

― そして上記のサイクル反応を実施して−２０℃に保存する。
使用したすべてのプライマーの融解温度は５７〜６０℃の範囲にあった。増幅されたＰＣＲ産物を実証するアガロースゲル分析により、反応の９８−９９％が成功したことが示された。

各ＢＡＣのプライマー対の数、ＰＣＲ産物の平均の長さ、および固有配列プローブに含まれた元のＢＡＣの範囲の全体について、表８に要約する。

固有配列プローブに含まれるＰＣＲ産物の配列は、以下の
ａ）ＳＭＡＲＣＥ１ ＵＳＰ：配列番号６６−１５９
ｂ）ＰＤＣＤ６ＩＰ ＵＳＰ：配列番号１６０−２５５
ｃ）ＣＹＰ２４ ＵＳＰ：配列番号２５６−３２７
ｄ）ＮＲ１Ｄ１ ＵＳＰ：配列番号３２８−４１５
ｅ）ＢＩＲＣ５ ＵＳＰ：配列番号４１６−５１１
のように提供される。

ＰＣＲ産物から伸長しなかったプライマーを取り除いて該産物をプールし、次に、各プール物のアリコートを、４つの蛍光色素（ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（商標）（バイシス社（Ｖｙ
ｓｉｓ））またはＤＥＡＣ（ジエチルアミノクマリン−５−ｄＵＴＰ、パーキンエルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））のうち少なくとも１つを用いて、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｉｏＰｒｉｍｅ（登録商標）ＤＮＡラベリングキットを使用して標識した。取り込まれなかった蛍光色素についてはＹＭ−３０マイクロコン（ｍｉｃｒｏｃｏｎ）カラム（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を使用して精製した。

プローブを、単独で、対として、または三つ組として（すなわち、１つ、２つまたは３つの核酸標的について；したがって１つ、２つまたは３つの異なるＵＳＰ）、中期染色体または乳がん薄切片、またはパラフィンブロックから切片を作製した組織培養細胞株切片とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションバッファは、２０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、０．９％ ＮａＣｌとした。プローブ濃度は、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、またはＤＥＡＣ Ａｑｕａで標識した場合は４０ｎｇ／μｌ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎの場合は６０ｎｇ／μｌとした。標本を、３８℃で１４−２０時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後に、スライドを０．１％のＮａＣｌで６０℃にて５分間、その後新たな０．１％ ＮａＣｌで６０℃にて３分間洗浄した。

各実施例について、元のＢＡＣおよびその誘導体であるＵＳＰを４つの蛍光色素のうちの１つで標識し、中期染色体上に同時ハイブリダイズした。二重標識プローブの各々の対において。親ＢＡＣに含まれた反復配列を抑制するために、競合ＤＮＡをこれらのハイブリダイゼーションに含めた。各々の対において、プローブは、予測される染色体領域に等しい強度で同時にハイブリダイズし、他のいかなる染色体領域へもハイブリダイズせず、かつ他のいかなる染色体領域にも特異的または非特異的なバックグラウンドまたはアーティファクトのハイブリダイゼーションを伴わない。これらの二重ハイブリダイゼーションから、標識された親ＢＡＣおよびその誘導体であるＵＳＰとの間で特異性またはシグナルの品質に損失がないことが実証される。

中期染色体上では、すべてのプローブのシグナル強度は、蛍光色素に関係なく５つすべてのプローブについて等しかった。すべての場合において、明るく強いシグナルを正しい染色体上にはっきり目に見ることができ、他の染色体上にはいかなるアーティファクトのシグナルも伴わなかった。ゲノムの全体にわたって無作為に分布したバックグラウンドのハイブリダイゼーションはなく、広範な非特異的ハイブリダイゼーションの領域もなかった。

三つ組プローブの多重ハイブリダイゼーションについても、５ｕＭのホルマリンで固定したパラフィン包埋された間期の乳腺がん細胞株の薄切片に対して試験した。これらのハイブリダイゼーションでは、明瞭な個別のハイブリダイゼーションシグナルが、使用した蛍光色素に固有の３つの色として見られ、アーティファクトのシグナルや妨げとなるバックグラウンドは伴わなかった。したがって、プローブを単独でハイブリダイズさせても三つ組としてハイブリダイズさせても、シグナルの品質または強度における損失はない。

プローブの品質およびシグナル強度は、プローブおよび蛍光色素の特定の対には依存しなかった。テストされた蛍光色素およびプローブの対を為す組合せについては、表９に要約されている。

表９は、検査を行った蛍光色素標識プローブの組合せを要約するものである。シグナル品質は、強力で明瞭であり、バックグラウンドまたはアーティファクトのシグナルを伴わず明確である場合に、＋＋＋＋と評価される。

Claims (33)

1. ２〜３５組の異なるプローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなる組成物であって、異なるプローブセットの少なくとも４０％が、３ｐ２３、８ｑ２１．１３、８ｑ２２．１、８ｑ２２．２、８ｑ２４．１１、１０ｑ２２．３、１６ｑ２４．３、１７ｑ１１．２、１７ｑ１２、１７ｑ２１．１、１７ｑ２２．２、１７ｑ２５．３、１９ｑ１３．１２および２０ｑ１３．２から成る群から選択されたゲノム領域に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなり、異なるプローブセットは全体として、前記列挙されたゲノム領域のうち少なくとも２つに選択的にハイブリダイズすることを特徴とする組成物。
2. 異なるプローブセットが全体として、前記列挙されたゲノム領域のうち少なくとも３つに選択的にハイブリダイズすることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
3. 異なるプローブセットの少なくとも５０％が、３ｐ２３、８ｑ２１．１３、８ｑ２２．１、８ｑ２２．２、８ｑ２４．１１、１０ｑ２２．３、１６ｑ２４．３、１７ｑ１１．２、１７ｑ１２、１７ｑ２１．１、１７ｑ２２．２、１７ｑ２５．３、１９ｑ１３．１２および２０ｑ１３．２から成る群から選択されたゲノム領域に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
4. 異なるプローブセットが全体として、少なくとも２０ｑ１３．２および３ｐ２３に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
5. 異なるプローブセットが全体として、前記列挙されたゲノム領域のうち少なくとも３つに選択的にハイブリダイズし、かつ異なるプローブセットが全体として、少なくとも１７ｑ２５．３に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
6. 異なるプローブセットが全体として、少なくとも１７ｑ２１．２および１７ｑ２１．１に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
7. 異なるプローブセットが全体として、前記列挙されたゲノム領域のうち少なくとも３つに選択的にハイブリダイズし、かつ異なるプローブセットが全体として、少なくとも１７ｑ２５．３に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
8. ２〜４２組の異なるプローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなる組成物であって、異なるプローブセットの少なくとも４０％が、式１、すなわち
   Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
   （式中、Ｘ２は配列番号１８−６５またはそれらの相補体から成る群から選択され、Ｘ１およびＸ３は独立にヒトゲノム中でＸ２に隣接する０−５００ｋＢのヒトゲノム核酸である）
   の核酸またはその相補体に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなり、かつ、
   異なるポリヌクレオチドプローブセットは全体として、少なくとも２つの重なり合わない式１の核酸に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする組成物。
9. 異なるポリヌクレオチドプローブセットは全体として、少なくとも３つの重なり合わない式１の核酸に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
10. 異なるプローブセットの少なくとも５０％が、式１の核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
11. 異なるプローブセットは全体として、少なくとも
    （ａ）配列番号６２−６５またはそれらの相補体のうち１または複数、および
    （ｂ）配列番号４４−４６またはそれらの相補体のうち１または複数
    に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
12. 異なるプローブセットは全体として、前記列挙されたゲノム領域のうち少なくとも３つに選択的にハイブリダイズし、かつ異なるプローブセットは全体として、少なくとも３つの重なり合わない式１の核酸にも選択的にハイブリダイズし、かつ異なるプローブセットは全体として、配列番号４１−４３またはそれらの相補体のうち少なくとも１または複数にも選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
13. 異なるプローブセットは全体として、少なくとも
    （ｃ）配列番号２５６−３２７またはそれらの相補体のうち１または複数、および
    （ｄ）配列番号１６０−２５５またはそれらの相補体のうち１または複数
    に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
14. 異なるプローブセットは全体として、配列番号４１６−５１１またはそれらの相補体のうち少なくとも１または複数にも選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
15. 異なるプローブセットは全体として、少なくとも
    （ａ）配列番号５７−５９またはそれらの相補体のうち１または複数、および
    （ｂ）配列番号４０またはその相補体
    に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
16. 異なるプローブセットは全体として、前記列挙されたゲノム領域のうち少なくとも３つに選択的にハイブリダイズし、かつ異なるプローブセットは全体として、少なくとも３つの重なり合わない式１の核酸にも選択的にハイブリダイズし、かつ異なるプローブセットは全体として、配列番号４１−４３またはそれらの相補体のうち少なくとも１または複数にも選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
17. 異なるプローブセットは全体として、少なくとも
    （ｃ）配列番号３２８−４１５またはそれらの相補体、および
    （ｄ）配列番号６６−１５９またはそれらの相補体
    に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
18. 異なるプローブセットは全体として、配列番号４１６−５１１またはそれらの相補体のうち少なくとも１または複数にも選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
19. ２〜４２組の異なるプローブセットで構成される乳がんバイオマーカーを含んでなる組成物であって、異なるプローブセットの少なくとも４０％が、配列番号１−１７またはそれらの相補体のうちの１つの核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなるかまたは該ポリヌクレオチドで構成され、かつ異なるプローブセットは全体として配列番号１−１７またはそれらの相補体の前記核酸のうち少なくとも２つに選択的にハイブリダイズすることを特徴とする組成物。
20. 異なるポリヌクレオチドプローブセットは全体として、配列番号１−１７またはそれらの相補体の前記核酸のうち少なくとも３つに選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
21. 異なるプローブセットの少なくとも５０％が、配列番号１−１７またはそれらの相補体のうちの１つの核酸に選択的にハイブリダイズする１または複数の単離ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１９に記載の組成物。
22. 異なるプローブセットは全体として、少なくとも
    （ａ）配列番号１７またはその相補体、および
    （ｂ）配列番号１０またはその相補体
    に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
23. 異なるプローブセットは全体として、配列番号１−１７またはそれらの相補体の前記核酸のうち少なくとも３つに選択的にハイブリダイズし、かつ異なるプローブセットは全体として、少なくとも配列番号９またはその相補体にも選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項２２に記載の組成物。
24. 異なるプローブセットは全体として、少なくとも
    （ａ）配列番号１５またはその相補体、および
    （ｂ）配列番号８またはその相補体
    に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
25. 異なるプローブセット全体は全体として、配列番号１−１７またはそれらの相補体の前記核酸のうち少なくとも３つに選択的にハイブリダイズし、かつ異なるプローブセットは全体として、少なくとも配列番号９またはその相補体にも選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
26. 乳房の腫瘍を分類する方法であって、
    （ａ）乳房の腫瘍を有する対象から得られた核酸サンプルを、３ｐ２３、８ｑ２１．１３、８ｑ２２．１、８ｑ２２．２、８ｑ２４．１１、１０ｑ２２．３、１６ｑ２４．３、１７ｑ１１．２、１７ｑ１２、１７ｑ２１．１、１７ｑ２２．２、１７ｑ２５．３、１９ｑ１３．１２、および２０ｑ１３．２から成る群から選択された２つ以上のゲノム領域に全体として選択的にハイブリダイズする本発明の乳がんバイオマーカーを含んでなる組成物と接触させる工程であって、プローブセットのポリヌクレオチドが２つ以上のゲノム領域に選択的にハイブリダイズするのを促進する条件下で接触が行われることを特徴とする工程と、
    （ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程と、
    （ｃ）検出されたハイブリダイゼーション複合体から、１または複数のゲノム領域が、コピー数が変化した状態で核酸サンプル中に存在するかどうかを判定する工程と、
    （ｄ）２つ以上のゲノム領域のコピー数の変化を、乳がんの再発リスクの増大と関連付ける工程と
    からなる方法。
27. 乳房の腫瘍を分類する方法であって、
    （ａ）乳房の腫瘍を有する対象から得られた核酸サンプルを、請求項８の組成物と接触させる工程であって、プローブセットのポリヌクレオチドが核酸サンプル中の標的に選択的にハイブリダイズするのを促進する条件下で接触が行われることを特徴とする工程と、
    （ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する工程と、
    （ｃ）検出されたハイブリダイゼーション複合体から、配列番号１８−６５またはそれらの相補体から成る群から選択された２つ以上のマーカーが、コピー数が変化した状態で核酸サンプル中に存在するかどうかを判定する工程と、
    （ｄ）配列番号１８−６５またはそれらの相補体から成る群から選択された２つ以上のマーカーのコピー数の変化を、乳がんの再発リスクの増大と関連付ける工程と
    からなる方法。
28. 判定工程は、検出されたハイブリダイゼーション複合体から、配列番号１８−６５またはそれらの相補体から成る群から選択された３つ以上のマーカーが、コピー数が変化した状態で核酸サンプル中に存在するかどうかを判定することからなり、かつ、関連付け工程は、配列番号１８−６５またはそれらの相補体から成る群から選択された３つ以上のマーカーのコピー数の変化を、乳がんの再発リスクの増大と関連付けることからなる、請求項２７に記載の方法。
29. 異なるプローブセットは全体として、少なくとも
    （ｅ）配列番号６２−６５またはそれらの相補体のうち１または複数、および
    （ｆ）配列番号４４−４６またはそれらの相補体のうち１または複数
    に選択的にハイブリダイズすることを特徴とし、かつ、
    判定工程は、検出されたハイブリダイゼーション複合体から、（ｅ）および（ｆ）に記載された核酸またはそれらの相補体が、コピー数が変化した状態で核酸サンプル中に存在するかどうかを判定することからなり、かつ、関連付け工程は、（ｅ）および（ｆ）に記載された核酸またはそれらの相補体のコピー数の増加を、ホルモン受容体が陽性の対象における乳がんの再発リスクの増大と関連付けることからなる、請求項２７に記載の方法。
30. 異なるプローブセットは全体として、少なくとも
    （ｅ）配列番号６２−６５またはそれらの相補体のうち１または複数、
    （ｆ）配列番号４４−４６またはそれらの相補体のうち１または複数、および
    （ｇ）配列番号４１−４３またはそれらの相補体のうち１または複数
    に選択的にハイブリダイズすることを特徴とし、かつ、
    判定工程は、検出されたハイブリダイゼーション複合体から、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）に記載された核酸またはそれらの相補体が、コピー数が増加した状態で核酸サンプル中に存在するかどうかを判定することからなり、かつ、関連付け工程は、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）に記載された核酸またはそれらの相補体のコピー数の増加を、ホルモン受容体が陽性の対象における高い乳がん再発リスクと関連付けることからなる、請求項２７に記載の方法。
31. 異なるプローブセットは全体として、少なくとも
    （ｅ）配列番号５７−５９またはそれらの相補体のうち１または複数、および
    （ｆ）配列番号４０またはその相補体のうち１または複数
    に選択的にハイブリダイズすることを特徴とし、かつ、
    判定工程は、検出されたハイブリダイゼーション複合体から、（ｅ）および（ｆ）に記載された核酸またはそれらの相補体が、コピー数が増加した状態で核酸サンプル中に存在するかどうかを判定することからなり、かつ、関連付け工程は、（ｅ）および（ｆ）に記載された核酸またはそれらの相補体のコピー数の増加を、ホルモン受容体が陰性の対象における高い乳がん再発リスクと関連付けることからなる、請求項２７に記載の方法。
32. 異なるプローブセットは全体として、少なくとも
    （ｅ）配列番号５７−５９またはそれらの相補体のうち１または複数、
    （ｆ）配列番号４０またはその相補体のうち１または複数、および
    （ｇ）配列番号４１−４３またはそれらの相補体のうち１または複数
    に選択的にハイブリダイズすることを特徴とし、かつ、
    判定工程は、検出されたハイブリダイゼーション複合体から、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）に記載された核酸またはそれらの相補体が、コピー数が増加した状態で核酸サンプル中に存在するかどうかを判定することからなり、かつ、関連付け工程は、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）に記載された核酸またはそれらの相補体のコピー数の増加を、ホルモン受容体が陰性の対象における高い乳がん再発リスクと関連付けることからなる、請求項２７に記載の方法。
33. 乳がん患者の治療について決定を下す方法であって、請求項２６に記載の乳房の腫瘍を分類する方法を実行することと、その後、その結果を、対象における乳がんの再発リスクに基づいた治療のコースを決定する際に検討することからなる方法。