ES2636671T3 - Métodos para predicción del riesgo, diagnóstico, pronóstico de trastornos pulmonares - Google Patents

Métodos para predicción del riesgo, diagnóstico, pronóstico de trastornos pulmonares Download PDF

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Abstract

Un método para determinar si un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar una afección fibrótica pulmonar, comprendiendo dicho método detectar en una muestra biológica de dicho sujeto si un genoma de dicho sujeto comprende el alelo T de rs35705950 y en donde la presencia del alelo T indica que dicho sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar una afección fibrótica pulmonar.

Description

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II. Mucinas Hay varias mucinas formadoras de gel que incluyen, pero no se limitan a, MUC6, MUC2, MUC5AC, y MUC5B. Estas proteínas son grandes filamentosas y altamente O-glicosiladas.
III. Enfermedades Pulmonares Las enfermedades pulmonares contempladas en la presente memoria pueden incluir cualquier trastorno pulmonar, enfermedad de fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar intersticial, neumonía intersticial idiopática (NII), fibrosis pulmonar idiopática, neumonía intersticial familiar (NIF), síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), enfermedad pulmonar de esclerodermia, Sarcoidosis, Enfermedad de Berilio, trastorno pulmonar asociado a artritis reumatoide, trastorno pulmonar asociado a vascular de colágeno, trastorno pulmonar asociado a humo de cigarrillo, síndrome de Sjögren, enfermedad mixta del tejido conectivo, neumonía intersticial no específica (NINE), etc.
Las condiciones fibróticas pulmonares, por ejemplo, enfermedades pulmonares intersticiales (ILD) se caracterizan por dificultad para respirar, tos crónica, fatiga y debilidad, pérdida de apetito y rápida pérdida de peso. La fibrosis pulmonar esta comúnmente vinculada a enfermedades pulmonares intersticiales (por ejemplo, trastornos autoinmunes, infecciones virales u otras lesiones microscópicas), pero puede ser idiopática. La fibrosis implica el intercambio de tejido pulmonar normal con tejido fibrótico (tejido cicatricial) que conduce a capacidad de oxígeno reducida.
Las neumonías intersticiales idiopáticas (NII) son un subconjunto de enfermedades pulmonares intersticiales difusas de etiología desconocida (el término “idiopático” indica origen desconocido). Las NII se caracterizan por la expansión del compartimento intersticial (i.e., aquella porción del parénquima pulmonar intercalado entre las membranas basales epitelial y endotelial) con un infiltrado de células inflamatorias. El infiltrado inflamatorio está algunas veces acompañado por fibrosis, ya sea en forma de deposición de colágeno anormal o proliferación de fibroblastos capaces de la síntesis de colágeno.
La Fibrosis Pulmonar Idiopática (FPI) ocurre en miles de personas en todo el mundo con una duplicación de prevalencia durante los últimos 10 años. La aparición de FPI ocurre alrededor de los 50 a 70 años de edad y comienza con progresiva dificultad para respirar e hipoxemia. La supervivencia media de FPI es de alrededor de 3-5 años y es hasta la fecha intratable. La etiología y patogénesis de la afección no se entiende bien. Aproximadamente el 5-20 por ciento de todos los casos de FPI tienen antecedentes familiares y la herencia parece ser autosómica dominante.
Las enfermedades pulmonares fibróticas adicionales incluyen neumonía intersticial aguda (AIP), Bronquiolitis Respiratoria asociada a Enfermedad Intersticial Pulmonar (RBILD), Neumonía Intersticial Descamativa (NID), Neumonía Intersticial No Específica (NINE), Bronquiolitis obliterante, con Neumonía Organizativa (BONO).
La AIP es una forma rápidamente progresiva e histológicamente distinta de neumonía intersticial. El patrón patológico es una forma de organización de daño alveolar difuso (DAD) que también se encuentra en el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y otras neumonías intersticiales agudas de causas conocidas (véase Clinical Atlas of Interstitial Lung Disease (2006 ed.) pp61-63).
La RBILD se caracteriza por lesiones inflamatorias de los bronquiolos respiratorios en fumadores de cigarrillos. El aspecto histológico de RBILD se caracteriza por la acumulación de macrófagos pigmentados dentro de los bronquiolos respiratorios y los espacios aéreos circundantes, variablemente, engrosamiento septal alveolar fibrótico peribronquial, e inflamación mural asociada mínima (véase Wells et al. (2003) Sem Respir. Crit. Care Med. vol. 24).
La NID es una enfermedad pulmonar intersticial rara caracterizada por la acumulación de macrófagos en grandes cantidades en los espacios alveolares asociados con inflamación intersticial y/o fibrosis. Los macrófagos frecuentemente contienen pigmento de color marrón claro. Los nódulos linfoides son comunes, así como un infiltrado de eosinófilos disperso pero distinto. La NID es más común en fumadores (véase Tazelaar et al. (Sep. 21, 2010) Histopathology).
La NINE se caracteriza patológicamente por la inflamación intersticial uniforme y la fibrosis que aparecen durante un corto periodo de tiempo. La NINE difiere de otras enfermedades pulmonares intersticiales en que tiene un pronóstico generalmente bueno. Además, la uniformidad temporal de los cambios parenquimales observados en NINE contrasta enormemente con la heterogeneidad temporal de la neumonía intersticial usual (véase Coche et al. (2001) Brit J Radiol 74:189).
La BONO, a diferencia de la NINE, puede ser fatal en cuestión de días de los primeros síntomas agudos. Se caracteriza por la aparición rápida de síndrome de dificultad respiratoria aguda; por lo tanto, clínicamente, la BONO rápidamente progresiva puede ser indistinguible de la neumonía intersticial aguda. Las características histológicas incluyen agrupaciones de células inflamatorias mononucleares que forman tejido de granulación y taponan las vías respiratorias distales y los espacios alveolares. Estos tapones de tejido de granulación pueden formar pólipos que migran dentro de los conductos alveolares o pueden estar focalmente unidos a la pared (véase White & Ruth-Saad (2007) Crit. Care Nurse 27:53).
Detalles adicionales acerca de las características y terapias disponibles para estas enfermedades se pueden encontrar, por ejemplo, en el sitio web de la Asociación Americana del Pulmón en lungusa.org/lung-disease/pulmonary-fibrosis.
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Los indicadores de diagnóstico de trastornos pulmonares incluyen la biopsia (por ejemplo, VATS o biopsia pulmonar quirúrgica), tomografía computarizada de alta resolución (TCAR) o métricas de respiración, tal como volumen espiratorio forzado (VEF1), capacidad vital (CV), capacidad vital forzada (CVF) y VEF1/CVF.
Los trastornos adicionales asociados con la expresión de MUC5B y/o los SNP asociados con MUC5B (por ejemplo, SNP rs35705950) pueden incluir, pero no se limitan a, trastornos de secreción mucosa, cánceres (por ejemplo, de ovario, de mama, de pulmón, pancreático, etc.), enfermedad ocular, colitis y cirrosis del hígado.
IV.
Métodos de Diagnóstico y Pronóstico Los métodos para detectar e identificar ácidos nucleicos y proteínas e interacciones entre tales moléculas implican técnicas de bilogía molecular convencional, microbiología y ADN recombinante dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura (véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed., 1986).
A.
Muestras biológicas Para la detección de una variante genética utilizando ADN genómico, se puede obtener una muestra biológica de casi cualquier tejido. Un experto en la técnica entenderá que una muestra de sangre o una torunda de mejilla se espera que porte la misma información de secuencia genética que una célula pulmonar. Para la detección de un nivel de expresión dado, se utilizan típicamente muestras de tejido pulmonar y otros fluidos biológicos.
Las muestras biológicas pueden incluir una muestra de mucosa pulmonar o fluido biológico tal como sangre o componentes sanguíneos (plasma, suero), esputo, moco, orina, saliva, etc.
Una muestra de mucosa pulmonar se puede obtener utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, un cepillo epitelial bronquial o condensado de aire exhalado. Los métodos adicionales incluyen biopsia bronquial, lavado bronquial, lavado broncoalveolar, lavado pulmonar completo, biopsia transendoscópica, catéter tras laringoscópico y lavado transtraqueal. Una revisión de técnicas comúnmente utilizadas, incluyendo comparaciones y cuestiones de seguridad, se proporciona en Busse et al. (2005) Am J Respir Crit Care Med 172:807-816.
Para las técnicas de lavado, se puede insertar un broncoscopio hasta el nivel deseado de las vías respiratorias. Un volumen pequeño de fluido estéril, fisiológicamente aceptable (por ejemplo, solución salina regulada) se libera, e inmediatamente se aspira. El material de lavado contiene células de la mucosa y epitelios superiores (Riise et al. (1996) Eur Resp J 9:1665).
Para el uso de un cepillo epitelial bronquial, se puede utilizar un cepillo de citología estéril, no irritante (por ejemplo, nylon). Se pueden tomar múltiples cepillados para asegurar un muestreo representativo. El cepillo se agita entonces en fluido fisiológicamente aceptable, y las células y los desechos se separan utilizando métodos rutinarios (Riise et al. (1992) Eur Resp J 5: 382).
Los componentes celulares se pueden aislar utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, centrifugación. De manera similar, los componentes subcelulares (por ejemplo, exosomas o vesículas) se pueden aislar utilizando métodos conocidos o productos de separación comerciales (disponibles de BioCat, System Bio, Bioscientific, etc.). Un método ejemplar es descrito, por ejemplo, por Thery et al. (2006) Current Prot. Cell Biol.
B. Detección de variantes genéticas Los inventores han encontrado que las variaciones genéticas en los genes de mucina están asociadas con enfermedades pulmonares. Estas variaciones genéticas se pueden encontrar en cualquier parte del gen, por ejemplo, en las regiones reguladoras, intrones, o exones. Las variaciones genéticas relevantes también se pueden encontrar en las regiones de intergén, por ejemplo, en secuencias entre genes de mucina. Las inserciones, sustituciones y supresiones se incluyen en las variantes genéticas. Los polimorfismos de un solo nucleótido (los SNP) son variantes genéticas ejemplares.
En particular, 14 SNP independientes están asociados con trastornos pulmonares (por ejemplo, NIF o FPI). Los estudios descritos en la presente memoria demuestran que la presencia de uno o más de estos SNP asociados con MUC5B pueden conducir a la predisposición a una enfermedad pulmonar. Además, si están presentes, algunos de estos SNP están relacionados con un sitio de unión del factor de transcripción. El sitio de unión del factor de transcripción puede efectuar la modulación de la expresión de MUC5B, por ejemplo pérdida de E2F3, y la generación de HOXA9 y PAX-2.
La invención proporciona por tanto métodos para evaluar la presencia o ausencia de SNP en una muestra de un sujeto sospechoso de tener o desarrollar un trastorno pulmonar (por ejemplo, debido a antecedentes familiares). En ciertas realizaciones de la divulgación, se criban uno o más SNP en una o más muestras de un sujeto. Los SNP pueden ser asociados con uno o más genes, por ejemplo, uno o más genes MUC u otros genes asociados con la secreción mucosa. Un SNP asociado al gen MUC está asociado con MUC5B y/u otro gen MUC, tal como MUC5AC o MUC1. Los SNP contemplados para diagnóstico, tratamiento o pronóstico pueden incluir los SNP encontrados dentro de un gen MUC y/o dentro de una región reguladora o promotora asociada con un gen MUC. Por ejemplo, uno o más SNP pueden incluir, pero no se limitan a, la detección de los SNP de MUC5B mostrados en la Tabla 4 (SEC ID Nos: 20-53), por ejemplo, SNP
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Los fármacos mucolíticos son aquellos que disminuyen la viscosidad del moco, ya sea mediante despolimerización de glicoproteínas de mucina o mediante despolimerización de redes poliméricas de ADN y F-actina. El primer modo de acción puede ser de particularmente útil para tratar el exceso de MUC5B. Los mucolíticos ejemplares incluyen N-acetilcisteína, Nacistelina, erdosteína, dornasa alfa, timosina beta4, dextrano, pulmozyme, heparina y bronquiotol (manosa inhalada).
Los mucorreguladores son aquellos agentes que regulan la secreción de moco, o interfieren con la red de ADN/F-actina. Ejemplos de mucorreguladores incluyen, por ejemplo, carbocisteína, agentes anticolinérgicos, glucocorticoides y antibióticos macrólidos.
Los agentes mucocinéticos incrementan la eliminación de moco actuando sobre el revestimiento ciliar de las vías respiratorias. Los agentes mucocinéticos ejemplares incluyen, por ejemplo, broncodilatadores, surfactantes y ambroxol.
Los expectorantes son agentes que inducen la descarga de moco de las vías respiratorias o del tracto respiratorio. Algunos ejemplos incluyen solución salina hipertónica, guaifenesina, dornasa/pulmozyme y bronquiotol (manosa inhalada).
El tratamiento de enfermedad pulmonar, tal como los agentes descritos anteriormente, se puede utilizar solo, secuencialmente, o en combinación según los métodos descritos en la presente memoria. Un tratamiento de enfermedad pulmonar se puede utilizar en combinación con un inhibidor más dirigido de la expresión de MUC5B.
B. Antagonistas de MUC5B Los resultados descritos en la presente memoria indican que la expresión elevada del gen MUC5B está asociada con enfermedad pulmonar. La divulgación incluye por tanto métodos y composiciones para inhibir la expresión, secreción y/o actividad de MUC5B. Los inhibidores ejemplares incluyen ARNip y antisentido, pRNA (ARN asociado a promotor, véase, por ejemplo, Schmitz et al. (2010) Genes Dev. 24:2264-69), anticuerpos específicos de MUC5B y fragmentos de los mismos, y aptámeros específicos de MUC5B. Se puede inhibir la actividad de MUC5B o se puede incrementar la eliminación de MUC5B, por ejemplo, utilizando agentes mucolíticos, inhibidores de glicosilación, o inhibidores de secreción de proteína. Los términos “inhibidor” y “antagonista” y términos similares se utilizan de manera sinónima en la presente memoria.
Por tanto, una secuencia de nucleótidos que interfiere específicamente con la expresión del gen MUC5B en el nivel de transcripción o de traducción se puede utilizar para tratar o prevenir la enfermedad pulmonar. Este enfoque puede utilizar, por ejemplo, ARNip y/u oligonucleótidos antisentido para bloquear la transcripción o traducción de un ARNm específico (por ejemplo, un ARN de variante genética), ya sea induciendo la degradación del ARNm con un ARNip o enmascarando el ARNm con un ácido nucleico antisentido. El ARNip o constructo antisentido puede no bloquear significativamente la expresión de otros genes de mucina.
El ARNip de doble cadena que corresponde al gen MUC5B se puede utilizar para silenciar la transcripción y/o traducción induciendo la degradación de las transcripciones de ARNm de MUC5B, y por tanto tratar o prevenir la enfermedad pulmonar (por ejemplo, la enfermedad pulmonar asociada con MUC5B de variante genética). El ARNip es típicamente de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, más típicamente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, lo más típicamente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. Las moléculas de ARNip y los métodos para generarlas se describen en, por ejemplo, Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498; el documento WO 00/44895; el documento WO 01/36646; el documento WO 99/32619; el documento WO 00/01846; el documento WO 01/29058; el documento WO 99/07409; y el documento WO 00/44914. Una molécula de ADN que transcribe ARNbc o ARNip (por ejemplo, como un dúplex de horquilla) también proporciona ARNi. Las moléculas de ADN para transcribir ARNbc se describen en la patente de EE.UU. No 6.573.099, y en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Nos 2002/0160393 y 2003/0027783, y Tuschl y Borkhardt, Molecular Interventions, 2: 158 (2002). Por ejemplo, los oligonucleótidos de ARNbc que se hibridan específicamente con las secuencias de ácidos nucleicos de MUC5B descritas en la presente memoria se pueden utilizar en los métodos. Se puede utilizar una disminución en la gravedad de los síntomas de enfermedad pulmonar en comparación con los síntomas detectados en la ausencia del ARN interferente para monitorizar la eficacia del ARNip.
Los oligonucleótidos antisentido que se hibridan específicamente con secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos MUC5B se pueden utilizar también para silenciar la transcripción y/o traducción, y por tanto tratar o prevenir la enfermedad pulmonar. Por ejemplo, se pueden utilizar oligonucleótidos antisentido que se hibridan específicamente con una secuencia de polinucleótidos de MUC5B. Se puede utilizar una disminución en la gravedad de los síntomas de enfermedad pulmonar en comparación con los síntomas detectados en la ausencia de los ácidos nucleicos antisentido para monitorizar la eficacia de los ácidos nucleicos antisentido.
Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas de ADN o ARN que son complementarias a al menos una porción de una molécula de ARNm específica (véase, por ejemplo, Weintraub, Scientific American, 262:40 (1990)). Típicamente, los oligonucleótidos antisentido sintéticos son generalmente de entre 15 y 25 bases de longitud. Los ácidos nucleicos antisentido pueden comprender nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados tales como, por ejemplo, nucleótidos de cadena principal modificada con fosforotioato, metilfosfonato, y azúcar-fosfato anomérica.
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En la célula, los ácidos nucleicos antisentido se hibridan con el ARNm correspondiente, formando una molécula de doble cadena. Los ácidos nucleicos antisentido, interfieren con la traducción del ARNm, puesto que la célula no traducirá un ARNm que es de doble cadena. Se prefieren los oligómeros antisentido de aproximadamente 15 nucleótidos, puesto que son fácilmente sintetizados y es menos probable que causen problemas que las moléculas más grandes cuando se introducen en la célula productora de nucleótidos mutante objetivo. El uso de métodos antisentido para inhibir la traducción in vitro de genes es bien conocido en la técnica (Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, (1988)). De forma menos común, se pueden utilizar moléculas antisentido que se unen directamente al ADN.
El ARNip y antisentido se pueden suministrar al sujeto utilizando cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo mediante inyección, inhalación o ingestión oral. Otro sistema de suministro adecuado es un sistema de dispersión coloidal tal como, por ejemplo, complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, glóbulos, y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mezcladas y liposomas. El sistema coloidal preferido es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificial que son útiles como vehículos de suministro in vitro e in vivo. Los ácidos nucleicos, incluyendo ARN y ADN dentro de los liposomas y ser suministrados a las células en una forma biológicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Los liposomas se pueden dirigir a tipos de célula o tejidos específicos utilizando cualquier medio conocido en la técnica.
La divulgación también proporciona anticuerpos que se unen específicamente a la proteína MUC5B. Tales anticuerpos se pueden utilizar para secuestrar el MUC5B secretado, por ejemplo, para prevenir la actividad formadora de gel y la formación de exceso de moco.
Un anticuerpo que detecta específicamente MUC5B, y no otras proteínas de mucina, se puede aislar utilizando las técnicas estándar descritas en la presente memoria. Las secuencias de proteínas para MUC5B en una serie de especies, por ejemplo, humanos, primates no humanos, ratas, perros, gatos, caballos, bovinos, etc., están públicamente disponibles.
Los anticuerpos monoclonales se obtienen mediante diversas técnicas familiares para los expertos en la técnica. Brevemente, las células del bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado se inmortalizan, comúnmente mediante fusión con una célula de mieloma (véase, por ejemplo, Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)). Los métodos alternativos de inmortalización incluyen transformación con Virus de Epstein-Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos bien conocidos en la técnica. Las colonias que surgen de células inmortalizadas individuales se criban para la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas para el antígeno, y la producción de los anticuerpos monoclonales producidos por tales células se puede incrementar mediante diversas técnicas, incluyendo la inyección en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado. Alternativamente, se pueden aislar las secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo cribando una biblioteca de ADN de células B humanas según el protocolo general indicado por Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989).
Los anticuerpos monoclonales se recogen y se valoran contra el MUC5B en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Los anticuerpos monoclonales habitualmente se unirán con un Kd de al menos aproximadamente 0,1mM, y más habitualmente de al menos aproximadamente 1 µM, y se pueden diseñar a menudo para unirse con un Kd de 1 nM o menos.
Las inmunoglobulinas, incluyendo fragmentos de unión a MUC5B y derivados de los mismos, se pueden producir fácilmente mediante una variedad de técnicas de ADN recombinante, incluyendo mediante la expresión en células transfectadas (por ejemplo, células eucariotas inmortalizadas, tales como células de mieloma o de hibridoma) o en ratones, ratas, conejos, u otro vertebrado capaz de producir anticuerpos mediante métodos bien conocidos. Las células fuente adecuadas para las secuencias de ADN y las células huésped para la expresión y secreción de inmunoglobulina se pueden obtener de una serie de fuentes, tales como la American Type Culture Collection (Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, Quinta edición (1985) Rockville, Md).
El anticuerpo es un anticuerpo humanizado, i.e., un anticuerpo que conserva la reactividad de un anticuerpo no humano mientras que es menos inmunogénico en humanos. Esto se puede lograr, por ejemplo, conservando las regiones de CDR no humanas que son específicas para MUC5B, y reemplazando las partes restantes del anticuerpo con sus homólogas humanas. Véase, por ejemplo, Morrison et al., PNAS USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44: 65- 92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994). Las técnicas para humanizar anticuerpos son bien conocidas en la técnica y se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos 4.816.567; 5.530.101; 5.859.205; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.777.085; 6.180.370; 6.210.671; y 6.329.511; el documento WO 87/02671; la Solicitud de Patente Europea 0173494; Jones et al. (1986) Nature 321 :522; y Verhoyen et al. (1988) Science 239: 1534. Los anticuerpos humanizados se describen además en, por ejemplo, Winter y Milstein (1991) Nature 349:293. Por ejemplo, los polinucleótidos que comprenden una primera secuencia que codifica las regiones de estructura de inmunoglobulina humanizadas y un segundo conjunto de secuencias que codifica las regiones determinantes de complementariedad de inmunoglobulina deseadas se pueden producir sintéticamente o combinando segmentos de ADNc o de ADN genómico apropiados. Las secuencias de ADN de región constante humanas se pueden aislar de acuerdo con procedimientos bien conocidos de una variedad de células humanas.
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peptidilfosfonatos (Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)), bibliotecas de ácidos nucleicos (ee Ausubel, Berger y Sambrook, all supra), bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicos (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (véase, por ejemplo, Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) y PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (véase, por ejemplo, Liang et al., Science, 274:1520-1522 (1996) y la Patente de EE.UU 5.593.853), bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (véase, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum C&EN, Jan 18, page 33 (1993); isoprenoides, Patente de EE.UU. 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente de EE.UU 5.549.974; pirrolidinas, Patentes de EE.UU. 5.525.735 y 5.519.134, compuestos de morfolino, Patente de EE.UU. 5.506.337, benzodiazepinas, y patente de EE.UU No 5.288.514).
D. Composiciones farmacéuticas Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden administrar por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir la administración a un sujeto por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostical, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravitral, intravaginal, intarectal, tópica, intratumoral, intramuscular, intratecal, subcutánea, subconjuntiva, intravesicular, mucosal, intrapericardial, intraumbilical, intraocular, oral, local, por inhalación, por inyección, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada, a través de un catéter, mediante un lavado, en una crema, o en una composición lipídica. La administración puede ser local, por ejemplo, a la mucosa pulmonar, o sistémica.
Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sal farmacológicamente aceptable se pueden preparar en agua mezclada adecuadamente con un surfactante, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones se pueden también preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservador para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden suministrar mediante soluciones o pulverizadores intranasales o inhalables, aerosoles o inhaladores. Las soluciones nasales pueden ser soluciones acuosas diseñadas para ser administradas a los conductos nasales en gotas o pulverizadores. Las soluciones nasales se pueden preparar de modo que sean similares en muchos aspectos a las secreciones nasales. Por tanto, las soluciones nasales acuosas normalmente son isotónicas y ligeramente reguladas para mantener un pH de 5,5 a 6,5. Además, si se requiere, se pueden incluir en la formulación conservadores antimicrobianos, similares a los utilizados en preparaciones oftálmicas, y estabilizadores de fármaco apropiados. Se conocen diversas preparaciones nasales comerciales y pueden incluir, por ejemplo, antibióticos y antihistamínicos.
Las formulaciones orales pueden incluir excipientes como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos. Las composiciones farmacéuticas orales pueden comprender un diluyente inerte o portador comestible asimilable, o se pueden encerrar en cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o se pueden comprimir en comprimidos, o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta. Para administración terapéutica oral, los compuestos activos se pueden incorporar con excipientes y utilizados en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, pastillas y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos el 0,1% de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones se puede, por supuesto, variar y puede estar convenientemente entre aproximadamente el 2 a aproximadamente el 75% del peso de la unidad, o preferiblemente entre el 25-60%. La cantidad de compuestos activos en tales composiciones es tal que se puede obtener una dosificación adecuada.
Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe ser adecuadamente regulada y el diluyente líquido primero hecho isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Las soluciones acuosas, en particular, medios acuosos estériles, son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Por ejemplo, una dosificación se podría disolver en 1 ml de solución de NaCl isotónica y bien añadida a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o bien inyectada en el sitio de infusión propuesto.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando los compuestos activos o constructos en la cantidad requerida en el solvente apropiado seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico. Las técnicas de secado al vacío y secado por congelación, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional, se pueden utilizar para preparar polvos estériles para la reconstitución de soluciones inyectables estériles. La preparación de soluciones más, o altamente, concentradas para la inyección directa también se contempla. El DMSO se puede utilizar como solvente para una penetración extremadamente rápida, suministrando altas concentraciones de los agentes activos a un área pequeña.
E. Regímenes de tratamiento La divulgación proporciona métodos para tratar, prevenir y/o mejorar un trastorno pulmonar en un sujeto que lo necesite, opcionalmente en base a los métodos de diagnóstico y de predicción descritos en la presente memoria. El curso de tratamiento se determina mejor sobre una base individual dependiendo de las características particulares del sujeto y el tipo de tratamiento seleccionado. El tratamiento, tal como los descritos en la presente memoria, se puede administrar al
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sujeto diariamente, dos veces al día, quincenalmente, mensualmente, o en cualquier base aplicable que sea terapéuticamente efectiva. El tratamiento se puede administrar solo o en combinación con cualquier otro tratamiento descrito en la presente memoria o conocido en la técnica. El tratamiento adicional se puede administrar simultáneamente con el primer tratamiento, en un momento diferente, o en un programa terapéutico completamente diferente (por ejemplo, el primer tratamiento puede ser diariamente, mientras que el tratamiento adicional es semanalmente).
La administración de una composición para mejorar la enfermedad pulmonar, por ejemplo, tratando la expresión elevada del gen MUC5B, puede ser una administración sistémica o localizada. Por ejemplo, el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno pulmonar puede incluir la administración de una forma inhalable o intranasal de agente anti-MUC5B (antagonista de MUC5B) diariamente o un programa de otra manera regular. El tratamiento puede ser solamente en una base de según sea necesario, por ejemplo, tras la aparición de síntomas de enfermedad pulmonar.
VI. Equipos La divulgación proporciona equipos para la detección de marcadores de enfermedad pulmonar en un sujeto. El equipo puede ser para uso personal o proporcionado a profesionales médicos. El equipo puede ser un equipo para diagnosticar o pronosticar un trastorno pulmonar, o para monitorizar la progresión de la enfermedad o la eficacia del tratamiento.
El equipo puede incluir componentes para evaluar la expresión del gen MUC5B que comprenden, por ejemplo, un ácido nucleico capaz de detectar ARN MUC5B o un agente de enlace de proteína MUC5B, opcionalmente marcado. Un experto apreciará que la expresión del gen MUC5B se puede determinar midiendo el ARN o proteína MUC5B. El equipo puede además incluir recipientes de ensayo (tubos), soluciones reguladoras, o enzimas necesarios para llevar a cabo el ensayo de detección.
El equipo puede incluir componentes para determinar si el genoma del sujeto porta un gen MUC5B de variante genética, por ejemplo, un ácido nucleico que se hibrida específicamente con una secuencia de gen MUC5B de variante genética. Otros componentes en un equipo pueden incluir, componentes de ensayo de secuenciación de ADN, componentes de ensayo de genotipado Taqman ®, Metaanálisis, uno o más sistema(s) de detección, una o más muestras de control o una combinación de los mismos. Los equipos pueden además incluir uno o más agentes donde al menos uno de los agentes es capaz de asociarse con el SNP rs35705950.
El equipo puede incluir componentes para examinar más de un marcador de enfermedad pulmonar. Por ejemplo, el equipo puede incluir agentes de detección de marcador, tales como cebadores o sondas específicos de marcador unidos a un arreglo dirigible. Los marcadores ejemplares incluyen los SNP en los genes MUC5B, o variantes genéticas en otros genes, por ejemplo, Proteína Surfactante A2, Proteína Surfactante B, Proteína Surfactante C, TERC, TERT, IL-1RN, IL-1α, It-1β, TNF, Linfotoxina α, TNF-RII, IL-10, IL-6, IL-I2, IFNγ, TGFβ, CR1, ACE, IL-8, CXCR1 o CXCR2. El nivel de expresión de los marcadores se puede detectar en lugar de o además de la secuencia genética. En este caso, los marcadores de enfermedad pulmonar útiles con expresión aberrante incluyen: Proteína Surfactante A, Proteína Surfactante D, KL6/MUC1, CC16, CK-19, Ca 19-9, SLX, MCP-1, MIP-1a, ITAC, glutatión, péptido de procolágeno tipo III, sIL-2R, ACE, neopterina, beta-glucuronidasa, LDH, CCL-18, CCL-2, CXCL12, MMP7, y osteopontina. Los marcadores de enfermedad pulmonar adicionales pueden incluir los otros genes MUC, por ejemplo, MUC2, MUC5AC, y MUC6.
El equipo generalmente incluirá al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro medio de recipiente, en el que el agente de pruebas, se puede hacer reaccionar o dividido en alícuotas adecuadamente. Los equipos pueden también incluir componentes para comparar los resultados tal como una muestra de control adecuada, por ejemplo un control positivo y/o negativo. El equipo puede también incluir un dispositivo de recogida para recoger y/o guardar la muestra del sujeto. El dispositivo de recogida puede incluir una torunda o aguja estéril (para recoger sangre), y/o un tubo estéril (por ejemplo, para guardar la torunda o una muestra de fluido corporal).
VII. Ejemplos
Ejemplo 1: Secuenciación de mucinas pulmonares, formadoras de gel y asociación con la enfermedad Poblaciones de estudio: se identificaron y se fenotiparon sujetos con NIF o FPI. El diagnóstico de NII se estableció según criterios convencionales. Los sujetos elegibles tenían al menos 38 años de edad y tenían síntomas de NII durante al menos 3 meses. Se requirió una exploración de tomografía computarizada de alta resolución (HRCT) para mostrar la NII definida o probable según los criterios predefinidos, y se obtuvo una biopsia de pulmón quirúrgica en el 46% de los sujetos afectados. Las familias de FPI se definieron por la presencia de dos o más casos de NII definida o probable dentro de tres grados, con al menos un caso de NII establecido como FPI definido/probable. Los criterios de exclusión incluyeron la exposición significativa a agentes fibrogénicos conocidos o una etiología alternativa para ILD. Se adquirieron sujetos de control para el análisis genético (Fig. 1).
Análisis de enlace: se completó un cribado de enlace de amplio genoma en 82 familias multiplex utilizando un panel de enlace DeCode que consiste en un total de 884 marcadores con una distancia de inter-marcador promedio de 4.2 CM. El análisis de enlace no paramétrico multipunto se realizó utilizando Merlin, previamente descrito. Las puntuaciones LOD de Kong y Cos se calcularon utilizando la estadística Spares en un modelo exponencial; los intervalos de soporte se determinaron utilizando el método de una puntuación LOD hacia abajo.
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Mapeo fino del cromosoma 11: para interrogar la región enlazada en el extremo p del cromosoma 11 (8.4 Mb unido por rs702966 y rs1136966), se realizó el mapeo fino genotipando 306 SNP de etiquetado en 145 casos no relacionados de NIF, 152 casos de FPI, y 233 controles Caucásicos. Las pruebas de asociación que comparan los casos de NIF y los casos de FPI con los controles se calcularon bajo un modelo aditivo para el alelo menor.
Resecuenciación de MUC2 y MUC5AC: se diseñaron pares de cebadores para generar amplicones solapantes para la resecuenciación del promotor proximal y la mayoría de los exones de MUC2 y MUC5AC sobre secuencias enmascaradas para elementos repetitivos, los SNP, y la homología con otras regiones del genoma.
Cribado genético de mucinas formadoras de gel, expresadas en el pulmón: se realizó un estudio de asociación de control de casos en una población independiente de NIF (N=83), FPI esporádica (N=492), y sujetos de control (N=322) (Tabla 2) utilizando etiquetado y otros SNP localizados a través de los genes de mucina expresadas en el pulmón, formadoras de gel en el cromosoma 11. Se genotiparon exitosamente 175 SNP utilizando los ensayos Sequenom iPlex, y se utilizó haploview para probar los SNP para la asociación alélica con NIF y FPI. Para aquellos SNP que permanecieron significativos después de la corrección de Bonferroni, se estimaron las relaciones de probabilidad bajo un modelo aditivo para el alelo raro después del ajuste para la edad y el género mediante regresión logística. Se calcularon pruebas de bondad de ajuste Chi-cuadrada para evaluar la evidencia de las explicaciones de modelo de enfermedad para desviaciones genotípicas del Equilibrio de Hardy Weinberg (HWE) entre los casos. Para el SNP más altamente asociado, se utilizó el modelado de enlace y asociación en pedigrees para probar si, en las familias de enlace originales, el SNP se enlazaba al locus de la enfermedad, estaba en desequilibrio de enlace con el locus de la enfermedad, y podría explicar la señal de enlace.
Se produjo una fuerte evidencia para el enlace basado en las 82 familias de NIF en el cromosoma 11 donde la puntuación LOD multipunto máxima fue 3,3 (p=0.00004, D11S1318; Fig. 3). El intervalo de soporte de 1-LOD para esta región enlazada se unió mediante los marcadores D11S4046 y D11S1760, que abarcan 3,4 Mb. Puesto que D11S4046 fue el marcador telomérico más tipificado, la región de interés era inclusiva del extremo p del cromosoma 11. Dentro de la región más grande de 8,4 Mb, se seleccionaron 306 SNP de etiquetado para mapeo fino en un análisis de asociación de control de casos (145 casos de NIF, 152 casos de FPI, y 233 controles. Las pruebas de asociación alélica revelaron 7 SNP dentro del gen mucina 2 (MUC2) significativamente asociados con bien NIF o bien FPI. MUC2 está contenido en una región genómica que alberga 4 genes de mucina formadora de gel (telómero a centrómero: MUC6, MUC2, MUC5AC, y MUC5B). Aunque hay reportados puntos calientes de recombinación localizados entre MUC6 y MUC2, y dentro de la porción proximal de MUC5B, los marcadores dentro de MUC2 y MUC5AC exhiben fuerte desequilibrio de enlace (LD) 17. Por tanto, MUC2 y MUC5AC se seleccionaron para la resecuenciación utilizando los cebadores de oligonucleótidos. El análisis de resecuenciación identificó 330 variantes genéticas en MUC2 y 195 variantes genéticas en MUC5AC. Las pruebas de asociación alélica entre estas variantes genéticas y el estado de enfermedad produjeron 7 SNP independientes tanto en MUC2 como en MUC5AC significativamente asociados con el estado de enfermedad de bien NIF o bien FPI.
Los inventores diseñaron un cribado genético para la variación genética común a través de la región genómica que contiene los 3 genes de mucina formadora de gel expresados en el pulmón (MUC2, MUC5AC, y MUC5B) en una población independiente de sujetos con NII (NIF=83 y FPI=492) y controles (n=322) (Fig. 1, Tabla 2). Se observó que 19 SNP independientes estaban significativamente asociados mediante la prueba alélica con cualquiera o ambas de NIF o FPI después de la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples (Tabla 1). De estos 19 SNP, 6 ocurrieron en MUC2, uno en la región intergénica de MUC2-MUC5AC, 4 en MUC5AC, 3 en la región intergénica de MUC5AC-MUC5B, y 5 en el promotor de MUC5B putativo, dentro de 4kb del sitio 18, 19 de inicio de la transcripción de MUC5B (Tabla 1).
De importancia, se encontró que un SNP en el promotor putativo de MUC5B, 3kb aguas arriba del sitio (rs35705950) de inicio de la transcripción tiene el efecto más importante tanto sobre NIF como sobre FPI. El alelo menor de este SNP estaba presente en una frecuencia de 33,8% en los casos de NIF, 37,5% en los casos de FPI, y 9,1% entre los controles (asociación alélica; NIF P=1,2x10-15, FPI P=2,5x10-37). En particular, las frecuencias de genotipo para rs35705950 eran consistentes con HWE en los controles, pero no entre los casos de FPI (P=6,0x10-11) y casi así entre los casos de NIF (P=0,11). Comparando las frecuencias de genotipo observadas en los casos y los controles con las esperadas si rs35705950 es un locus de riesgo real, los datos demuestran que estas frecuencias de genotipo son consistentes con un efecto genotípico aditivo en el riesgo de enfermedad conferido por rs35705950 (P= 0,88 y P= 0,77, respectivamente para NIF e FPI para rechazar el efecto aditivo). Además, la frecuencia del alelo de la enfermedad y las estimaciones de penetrancia sugieren un modelo de enfermedad similar tanto para NIF como para FPI. La relación de probabilidad para la enfermedad para sujetos heterocigotos y homocigotos para el alelo raro de este SNP fue de 6,8 (IC 95% 3,9-12,0) y 20,8 (IC 95% 3,8-113,7) para NIF, and 9,0 (IC 95% 6,2-13,1) y 21,8 (IC 95% 5,1-93,5) para FPI (Tabla 1). Para asegurar que este SNP no estuviera etiquetando otro SNP en la región promotora de MUC5B, la región de 4kb se resecuenció aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción de MUC5B en 48 casos de FPI y 48 controles (Tabla 3). Se observó que 34 variantes genéticas pero ninguna tenía un valor de LD de r2 por pares con rs35705950 por encima de 0,2 (Tabla 4). Finalmente, entre las familias de enlace originales, se encontró que rs35705950 estaba tanto enlazado a (P=0,04) como en desequilibrio de enlace con (P=1,5x10-9) el locus de la enfermedad. Aunque hay alguna evidencia de otras variantes enlazadas en la región (P=0,054), estos resultados verifican la relevancia de este SNP para la enfermedad en estas familias.
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Ejemplo 2: El polimorfismo rs35705950 de un solo nucleótido da como resultado una expresión incrementada del gen MUC5B
El alelo G de tipo silvestre del SNP rs35705950 se conserva entre las especies de primates. El SNP está directamente 5’ a una región altamente conservada entre las especies de vertebrados, y está en el medio de la secuencia que se predice que esté implicada en la regulación del gen MUC5B. Un análisis bioinformático del efecto del SNP rs35705950 predice una alteración de un sitio de enlace de E2F y la creación de al menos dos nuevos sitios de enlace (por ejemplo, HOX9 y PAX2).
En base a estos análisis, se examinó el efecto de rs35705950 en la expresión del gen MUC5B. En el tejido pulmonar de 33 sujetos con FPI y 47 sujetos no afectados, la RT-PCR cuantitativa reveló que la expresión del gen MUC5B estaba sobre regulada 14,1 veces entre los sujetos con FPI en comparación con los sujetos no afectados (P=0,0001, Fig. 4A). Se observó un incremento de 37,4 veces en la expresión de MUC5B entre los sujetos no afectados que portan al menos una copia del alelo variante en comparación con los sujetos de tipo silvestre homocigotos (P=0,0003, Fig. 4B). Por el contrario, no se observó diferencia significativa en la expresión del gen MUC5B entre los sujetos con FPI con al menos un alelo variante de rs35705950 (Fig. 4C). Fumar, un factor de confusión potencial de la expresión de MUC5B, pareció tener poco efecto sobre la asociación entre el alelo variante rs35705950 y la expresión de MUC5B entre ya sea los sujetos no afectados o afectados por FPI (Figs. 4B y 4C).
La tinción inmunohistoquímica de MUC5B en el tejido pulmonar mostró tinción citoplásmica en células columnares secretoras de los bronquios y los bronquiolos proximales más grandes (>200 µm) en casos de FPI y controles (Fig. 5A). En sujetos con FPI, se observaron regiones de densa acumulación de MUC5B en áreas de apanalamiento microscópicas e implicaron la tinción parcheada del revestimiento epitelial metaplástico de los quistes de panal (Fig. 5B), así como los tapones de mucosa dentro de los quistes (Fig. 5C). No se observaron diferencias obvias en las características de tinción de MUC5B en casos de FPI con el polimorfismo del promotor de MUC5B.
Los sujetos con FPI tienen significativamente más expresión del gen pulmonar MUC5B que los controles, y la proteína MUC5B se expresa en lesiones patológicas de FPI. Los presentes resultados muestran que el riesgo de desarrollar NIF o FPI está sustancialmente correlacionado con el polimorfismo del promotor re35705950, que causa expresión de MUC5B incrementada. En conjunto, los datos muestran que la expresión de MUC5B en el pulmón desempeña un papel en la patogénesis de enfermedad pulmonar.
En base a la relación entre el SNP y la producción en exceso de MUC5B, demasiado MUC5B puede perjudicar la defensa del hospedador mucosal a la lesión pulmonar excesiva de sustancias inhaladas, y con el tiempo, conducir al desarrollo de NII. Además del SNP del promotor de MUC5B, las exposiciones comunes y los procesos biológicos básicos pueden influenciar ya sea la expresión o la eliminación de MUC5B. Por ejemplo, la expresión de MUC5B puede ser incrementada en el pulmón por el humo de cigarrillo, acroleína, estrés oxidativo, IL-6, IL-8, IL- 13, IL-17, 17β-estradiol, nucleótidos extracelulares, o cambios epigenéticos que alteran la metilación del ADN o la estructura de la cromatina. Además, la eliminación del moco pulmonar es dependiente de movimiento ciliar efectivo, la hidratación adecuada de la capa de líquido periciliar y una tos intacta. Independientemente de la causa, los presentes resultados indican que el exceso de MUC5B puede comprometer la defensa del hospedador mucosal, reducir la eliminación del pulmón de las partículas inhaladas, sustancias químicas disueltas y microorganismos. Dada la importancia de las exposiciones ambientales, tales como asbestos, sílice y otros contaminantes en el desarrollo de otras formas de enfermedad pulmonar intersticial, es lógico especular que las partículas inhaladas comunes, tales como las asociadas con el humo de cigarrillo o la contaminación del aire, podría conducir a o contribuir a la lesión intersticial exagerada en individuos quienes tienen defectos en la defensa del hospedador mucosal.
Además, el exceso de MUC5B en los bronquiolos respiratorios puede interferir con la reparación alveolar. La lesión alveolar puede conducir al colapso de las unidades broncoalveolares y esta lesión pulmonar focal es reparada a través de la re-epitelización del alveolo por las células epiteliales alveolares de tipo II. Por tanto, MUC5B puede impedir la reparación alveolar ya sea interfiriendo con la interacción entre las células epiteliales alveolares de tipo II y la matriz subyacente, o interfiriendo con las propiedades de tensión superficial del surfactante. Cualquier fallo de re-epitelizar la lámina basal del alveolo o la biología de surfactante subóptima podría incrementar el colapso en curso y la fibrosis de unidades broncoalveolares adyacentes, y finalmente dar como resultado NII.
Las lesiones de FPI son espacialmente heterogéneas, sugiriendo que FPI es multifocal, originándose en unidades broncoalveolares individuales. Puesto que el SNP rs35705950 ocurre en la región promotora de MUC5B y se predice que altera los sitios de unión del factor de transcripción, la producción ectópica de MUC5B en células o ubicaciones que causan lesión a la unidad broncoalveolar puede ser un agente causante. Las variantes genéticas no cribadas (especialmente en las regiones de mucina repetitivas inaccesibles) pueden estar en desequilibrio de enlace con el SNP del promotor de MUC5B y afectar a la función de otras mucinas pulmonares.
Las presentes observaciones proporcionan un enfoque clínico novedoso para los trastornos pulmonares tales como NII. La invocación de las mucinas de las vías respiratorias secretadas en la patogénesis de la fibrosis pulmonar sugiere que el espacio aéreo desempeña un papel en la patogénesis de NII. Aunque que el SNP (rs35705950) en el promotor de MUC5B se puede utilizar para identificar individuos en riesgo de desarrollar NII, la observación de que la biología de la mucina es

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