DE60223276T2 - Verfahren zur Blockierung von unspezifischen Hybridisierungen von Nukleinsäuresequenzen - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Mikroarrays, spezieller Verfahren zur Blockierung unspezifischer Wechselwirkungen bei der Hybridisierung von Nukleinsäuresequenz-Proben mit einem Mikroarray.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Änderungen der Genexpressionsmuster oder in einer DNA-Sequenz können tiefgreifende Auswirkungen auf biologische Funktionen haben. Derartige Variationen der Genexpression können geänderte physiologische und pathologische Prozesse zur Folge haben. Sich entwicklelnde DNA-Techniken liefern rasche und kostengünstige Verfahren zur Identifikation der Genexpression und von genetischen Variationen im großen Maßstab.
  • Eine Hochgeschwindigkeitstechnik, die für die DNA-Analyse nützlich ist, ist das DNA-Mikroarray, das eine Vielzahl unterschiedlicher DNA- oder Gensonden (d. h. Polynukleotide) einschließt, die räumlich verteilt und stabil mit einem im Wesentlichen ebenen Substrat, wie einer Platte aus Glas, Silicium oder einer Nylon-Membran, verbunden sind. Derartige Mikroarrays werden in einem Bereich von Anwendungen, wie der Analyse einer Probe auf die Anwesenheit von Genvariationen oder -mutationen (d. h. Genotypisierung) oder auf Muster der Genexpression, verwendet, wobei ein Äquivalent von Tausenden von individuellen "Reagenzglas"-Experimenten in einer kurzen Zeitspanne durchgeführt wird.
  • Alle Mikroarrays arbeiten mit einem ähnlichen Prinzip: ein im Wesentlichen ebenes Substrat, wie ein Deckglas, wird mit einem Gitter von winzigen Flecken mit einem Durchmesser von etwa 20 bis 100 Mikrometern beschichtet; jeder Flecken (d. h. jedes Merkmal) enthält Millionen von Kopien einer kurzen DNA-Sequenz oder von Nukleotiden; und ein Computer verfolgt jede Sequenz bei einem vorbestimmten Merkmal. Um eine Analyse zu machen, wird Boten-RNA (mRNA) aus einer Zellprobe extrahiert. Unter Verwendung von Enzymen werden Millionen von Kopien der mRNA-Moleküle reproduziert. Kopien von komplementärer DNA (cDNA) werden durch reverse Transkription aus der mRNA erzeugt. Die cDNA-Kopien werden mit einer Markierung oder einem Marker, wie einer Fluoreszenzmarkierung, markiert und in kurze Fragmente zerbrochen. Die markierten Fragmente werden über das Mikroarray gewaschen und über Nacht belassen, um zu ermöglichen, dass die markierten Fragmente mit der DNA hybridisieren, die an dem Mikroarray angebracht ist.
  • Nach der Hybridisierung emittieren die Merkmale auf dem Mikroarray, die sich mit der fluoreszierenden cDNA gepaart haben, ein Fluoreszenzsignal, das mit einem Mikroskop betrachtet oder mittels eines Computers detektiert werden kann. Auf diese Weise kann man erfahren, welche Sequenzen auf dem Mikroarray mit der cDNA der Testprobe zusammenpassen. Obwohl es gelegentliche Fehlpaarungen gibt, stellt die Verwendung von Millionen von Sonden in jedem Fleck oder Merkmal sicher, dass Fluoreszenz nur dann detektiert wird, wenn die komplementäre cDNA vorliegt. Je intensiver das Fluoreszenzsignal ist (d. h. je heller der Fleck ist), desto mehr zusammenpassend cDNA war in der Zelle anwesend.
  • Ein Gebiet, auf dem die Mikroarrays nützlich sind, ist die Genexpressions-Analyse. Bei der Genexpressions-Analyse, die Mikroarrays verwendet, wird ein Array von "Sonden"-Oligonukleotiden mit einer interessierenden Nukleinsäure-Probe, d. h. einem Target, in Kontakt gebracht, wie einer cDNA, die aus einer aus einem speziellen Gewebetyp extrahierten mRNA erzeugt wurde. Der Kontakt wird unter Hybridisierungsbedingungen durchgeführt und ungebundene Nukleinsäure wird dann entfernt. Das resultierende Muster von hybridisierter Nukleinsäure liefert Information bezüglich des genetischen Profils der getesteten Probe. Genetisches Profil soll Information hinsichtlich der Typen von in der Probe vorliegenden Nukleinsäuren (z. B. den Typen von Genen, zu denen sie komplementär sind, sowie der Kopienzahl jeder speziellen Nukleinsäure in der Probe) einschließen. Die Genexpressionsanalyse kann in einer Vielfalt von Anwendungen verwendet werden, einschließlich beispielsweise der Identifikation einer neuen Expression von Genen, der Korrelation der Genexpression mit einem speziellen Phänotyp, der Durchmusterung auf Krankheitsprädisposition und der Identifikation der Wirkung eines speziellen Mittels auf die zelluläre Genexpression, wie in Toxizitätstests.
  • Unter Verwendung bekannter Verfahren wird eine Vielzahl von Gensonden auf der Oberfläche eines Mikroarrays befestigt oder darauf gedruckt, wie durch Roboter- oder Laserlithographie-Verfahren. Markierte Target-Moleküle werden anschließend auf diese Sonden aufgebracht und das Array wird gewaschen, um Target-Moleküle zu entfernen, die nicht hybridisiert haben.
  • Zum Beispiel kann eine Probe zur Verwendung auf einem Mikroarray unter Verwendung von Boten-RNA (mRNA) oder Gesamt-RNA, die aus einer Zellprobe extrahiert wurde, hergestellt werden. Die mRNA, die als Matrize dient, wird revers transkribiert, was die komplementäre DNA (cDNA)-Target-Moleküle liefert. Ein(e) oder mehrere Marker oder Markierungen, wie Fluoreszenz, werden den Kopien der cDNA beim reversen Transkriptionsprozess direkt einverleibt (wobei die Markierung durchgeführt wird, um eine anschließende Detektion dieser cDNA-Moleküle durch Abtasten bezüglich ihres Fluoreszenzsignals durchzuführen). Die markierten cDNA-Kopien werden zu kurzen Fragmenten zerbrochen und über den Mikroarray gewaschen. Unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren oder kuppeln die markierten Fragmente mit komplementären Nukleinsäuresequenzen (d. h. Gensonden), die an den Merkmalen des Mikroarrays angebracht sind, für einen leichten Nachweis derselben. Dieses Markierungsverfahren wird üblicherweise als "direkte Einverleibung" bezeichnet.
  • In einem alternativen Verfahren (wie in 1 gezeigt) wird die komplementäre DNA (cDNA) aus einer mRNA-Probe hergestellt, die Gesamt-RNA oder Poly(A)+ RNA zusammen mit einer großen Menge an Nukleotid-Basen (Desoxynukleotidtriphosphat, DNTP), Enzymen und reverse Transkriptions (RT)-Primer-Oligonukleotiden mit daran angehängten Einfang-Sequenzabschnitten umfasst. Alternativ können auch andere Verfahren zur Synthese von komplementärer Desoxyribonukleinsäure (cDNA) aus Ribonukleinsäure (RNA) verwendet werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der Verfahren von Von Gelder, Von Zastrow, Barchas und Eberwine, die in den U.S. Patenten Nr. 5,716,787 und 5,891,636 offenbart sind.
  • Die neu gebildete cDNA wird dann aus der mRNA-Probe isoliert und mit Ethanol gefällt. Die cDNA wird dann für die Hybridisierung der cDNA mit dem Mikroarray mit den komplementären Gensonden in einem cDNA-Hybridisierungspuffer suspendiert und über Nacht inkubiert. Nach der Hybridisierung der cDNA mit dem präparierten Mikroarray wird das Mikroarray gewaschen, um jegliches überschüssige RT-Primer-Oligonukleotid zu entfernen. Die cDNAs werden unter Verwendung von Molekülen (z. B. Dendrimeren) markiert, die sowohl eine Markierung als auch eine Sequenz aufweisen, die komplementär zur Einfangsequenz ist.
  • Unabhängig davon, ob die cDNA unter Verwendung von direkter Einverleibung oder einer Einfangsequenz hergestellt wird, wird nach Hybridisierung der cDNA mit dem Mikroarray bei einem positiven Ergebnis ein nachweisbares Signal (z. B. Fluoreszenz) von jedem Merkmal emittiert, das ein cDNA-Fragment enthält, welches mit einer daran angebrachten komplementären Gensonde hybridisiert ist. Das nachweisbare Signal ist sichtbar für eine geeignete Sensorvorrichtung oder Mikroskop und kann dann vom Computer oder Benutzer detektiert werden, um ein Hybridisierungsmuster zu erzeugen. Da die Nukleinsäuresequenz jedes Merkmals bekannt ist, zeigt jegliches positive Ergebnis (d. h. eine Signalerzeugung) eines speziellen Merkmals die Anwesenheit der komplementären cDNA-Sequenz in der Probenzelle an. Obwohl es gelegentliche Fehlpaarungen gibt, stellt die Anbringung von Millionen von Gensonden an jedem Fleck oder Merkmal sicher, dass das nachweisbare Signal nur dann stark emittiert wird, wenn die komplementäre cDNA der Testprobe vorhanden ist.
  • Die WO 01/66555A lehrt ein Verfahren für einen Assay und Nachweis von Nukleinsäuren, das eine verringerte Zahl von Schritten verwendet, um die Zeit und Mühe zu verringern, die typisch für das Testen einer Probe auf einem Mikroarray erforderlich sind. Die WO 01/66555 A lehrt jedoch nicht die Verwendung eines LNA-Reagens, um unspezifische Hybridisierung auf einem Mikroarray zu blockieren.
  • Die WO 02/33125 A1 lehrt ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Einverleibung komplementär markierter Dendrimer-Moleküle in ein Target oder einen Sonden-Nukleinsäurestrang. Die WO 02/33125 A1 lehrt jedoch nicht die Verwendung eines LNA-Reagens, um unspezifische Hybridisierung auf einem Mikroarray zu blockieren.
  • Die WO 00/56920 lehrt ein Verfahren zur Verwendung von LNA, die im Wesentlichen komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäure ist, für eine Hybridisierung der LNA an die Ziel-Nukleinsäure. Die WO 00/56920 lehrt jedoch nicht die Verwendung eines LNA-Reagens, um unspezifische Hybridisierung auf einem Mikroarray zu blockieren.
  • In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung sind dendritische Nukleinsäure-Moleküle wegen ihrer Nachweisfähigkeiten besonders bevorzugt (obwohl alle Arten von markierten Molekülen mit der hierin offenbarten Erfindung verendet werden können). Dendritische Nukleinsäure-Moleküle oder Dendrimere sind komplexe hoch verzweigte Moleküle, die eine Mehrzahl von verbundenen natürlichen oder synthetischen Monomer-Einheiten von doppelsträngiger DNA umfassen. Dendrimere sind in größerer Einzelheit in Nilsen et al., Dendritic Nucleic Acid Structures, J. Theor. Biol., 187, 273–284 (1997); in Stears et al., A Novel, Sensitive Detection System for High-Density Microarrays Using Dendrimer Technology, Physiol. Genomics, 3: 93–99 (2000); und in verschiedenen US-Patenten, wie den U.S. Patenten Nr. 5,175,270 ; 5,484,904 ; 5,487,973 ; 6,072,043 ; 6,110,687 und 6,117,631 beschrieben.
  • Dendrimere umfassen zwei Arten von einzelsträngigen Hybridisierungs"armen" auf der Oberfläche, die verendet werden, um zwei Schlüssel-Funktionalitäten anzubringen. Ein einziges Dendrimer-Molekül kann mindestens hundert Arme jedes Typs auf der Oberfläche aufweisen. Ein Armtyp wird für die Anbringung eines speziellen Targeting-Moleküls verwendet, um eine Target-Spezifität zu erreichen, und das andere wird für eine Anbringung eines Markers oder einer Markierung verwendet. Die Moleküle, welche die Target- und Markierungs-Spezifitäten des Dendrimers festlegen, sind entweder als Oligonukleotide oder als Oligonukleotid-Konjugate angebracht. Unter Verwendung einfacher DNA-Markierungs-, -Hybridisierungs- und -Ligierungsreaktionen kann ein Dendrimer-Molekül so konfiguriert werden, dass es als hoch markierte, Target-spezifische Sonde wirkt.
  • Die hergestellte Mischung wird in Anwesenheit eines geeigneten Puffers formuliert, was eine Dendrimer-Hybridisierungsmischung liefert, die Dendrimere enthält, bei denen Fluoreszenzmarker an einer Art "Arm" angebracht sind und bei denen Oligonukleotide, welche komplementär zu den Einfangsequenzen der an RT-Primer gebundenen cDNA-Fragmente sind, an einer anderen Art "Arm" angebracht sind. Ein Oligonukleotid, das so entworfen ist, dass es unspezifische Wechselwirkungen der cDNA oder des Dendrimers mit der Nukleinsäure blockiert, die auf die Arrayoberfläche getüpfelt ist, wird zu diesem Zeitpunkt ebenfalls dazugegeben; Blockierungs-Oligonukleotide, welche ein Vielfaches der gleichen Nukleinbase enthalten, können zum Blockieren von langen Abschnitten der gleichen komplementären Base verwendet werden, die auf der aus der RNA-Probe abgeleiteten cDNA und den Nukleinsäuresonden auf der Mikroarray-Oberfläche gefunden werden. In der vorliegenden Erfindung, die nachstehend offenbart ist, wurde gefunden, dass Blockierungs-Oligonukleotide, die ein modifiziertes Nukleotid aufweisen, das eine Änderung des Schmelzpunkts (Tm) zur Folge hat, früheren Blockierungsmolekülen überlegen sind.
  • Die Dendrimer-Hybridisierungsmischung, welche die Dendrimer-Moleküle enthält, wird dann zu dem Mikroarray gegeben und über Nacht inkubiert, um ein Hybridisierungsmuster zu erzeugen. Nach der Dendrimer-cDNA-Hybridisierung wird das Mikroarray gewaschen, um alle nicht hybridisierten Dendrimere wegzuspülen. Das Mikroarray wird abgetastet, um das Signal zu detektieren, das von dem Marker erzeugt wird, um eine Genexpressionsanalyse des Hybridisierungsmusters zu ermöglichen. Ein Nachteil der Verwendung dieses Verfahrens schließt die übermäßige Zeit und Arbeit ein, die erforderlich sind, um die Probe zu präparieren und den Assay einschließlich der Hybridisierungs- und Waschschritte durchzuführen.
  • Es wäre hoch wünschenswert, die Menge an Zeit und Arbeit, die bei der Herstellung der Probe und der Durchführung des Assays investiert wird, signifikant zu verringern, ohne wünschenswert Eigenschaften, wie Empfindlichkeit, niedriges Hintergrund"rauschen" und minimale "falsch Positive" zu opfern. Es wäre ein signifikanter Fortschritt auf dem Gebiet der Genexpressionsnachweis-Mikroarrays, weiter ein Verfahren bereitzustellen, das signifikant die Komplexität der Schritte, die für die Herstellung der Genproben erforderlich sind, und des Assays für die Genexpressionsanalyse verringert und das unter Verwendung herkömmlicher Laborreagenzien-Ausrüstung und -Techniken durchgeführt werden kann. Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, derartige Ziele unter Verwendung von Verfahren zu erreichen, die unspezifische Hybridisierungen auf dem Array blockieren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zum Blockieren unspezifischer Hybridisierung zwischen Nukleinsäuresequenzen. Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, welches die Schritte umfasst: Verwenden eines Blockierungsreagens, um unspezifische Wechselwirkungen bei der Hybridisierung von Nukleinsäure-Molekülen zu minimieren oder zu eliminieren, wobei das Blockierungsreagens mindestens ein modifiziertes Nukleotid enthält. Dieses modifizierte Nukleotid ist ein Nukleotid, das eine modifizierte Version eines Standard-DNA- oder RNA-Nukleotids ist, während es immer noch den Watson-Crick-Basenpaarungsregeln gehorcht. So weisen modifizierte Nukleotide eine Affinität zum komplementären Standard-DNA- und -RNA-Nukleotid auf, aber diese Affinität ist von jener von Standard-DNA-Nukleotiden bezüglich ihrer Komplemente verschieden. Als Ergebnis weisen die Nukleinsäuresequenzen, welche sie enthalten, einen höheren oder niedrigeren Schmelzpunkt (Tm) auf als eine Standard-Doppelstrang-Sequenz, die nur Standard-DNA- oder RNA-Nukleotide enthält. Zum Beispiel kann eine modifizierte Nukleotid-Adenin-Base (A') mit einer Affinität zu einer Standard-Thymin-Base (T) bereitgestellt werden, welche größer ist als die Affinität einer Standard-Adenin-Base (A) zu der gleichen Standard-Thymin-Base (T) und so weiter. Als Ergebnis und weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ermöglicht das Blockierungsreagens eine angewandte Stringens, d. h. die Fähigkeit, die Unterscheidung zwischen spezifischen und unspezifischen Bindungswechselwirkungen durch Variation eines physikalischen Parameters.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in einem Bereich von Anwendungen verwendet werden und ist besonders bei der Verwendung in Verbindung mit Mikroarrays vorteilhaft. Zum Beispiel kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um eine signifikante Verringerung der Menge an unspezifischer Hybridisierung und des resultierenden Signals aus der Hybridisierung von cDNA und anderen Nukleinsäure-Proben mit komplementären Sonden auf der Mikroarray-Oberfläche zu liefern. So hat sie einen Mikroarray-Assay mit ausgezeichneter Empfindlichkeit und geringem Hintergrund"rauschen" und minimalen "falsch Positiven" zum Ergebnis. Die Parameter des Assays können so eingestellt werden, dass der gewünschte Grad an Effizienz und Spezifität für die gewünschte Hybridisierung des markierten Zielmoleküls mit Sondenmolekülen auf dem Array die Folge ist, indem die physikalischen Parameter der Reaktionsbedingungen, wie der Reaktionstemperatur oder der Zahl der modifizierten Nukleotide in dem Blockierungsreagens, eingestellt werden.
  • Das Blockierungsreagens selbst ist ein Molekül, das sich an eine Nukleinsäuresequenz bindet, um zu verhindern, dass andere Nukleinsäure sich daran bindet, insbesondere Sequenzen, die unspezifisch binden würden. Es ist vorzugsweise ein Molekül, das in seiner Gesamtheit eine Nukleinsäuresequenz ist, es kann aber alternativ ein Molekül sein, welches die Nukleinsäuresequenz enthält.
  • Der gewöhnliche Fachmann kann die Sequenz des Blockierungsreagens auf der Grundlage der erwarteten Nukleotidsequenzen in der Anwendung, die unspezifische Bindung zur Folge haben können, wählen oder konstruieren und kann gleichermaßen wählen, welche Arten von modifizierten Nukleotiden auf der Grundlage der erwarteten Bedingungen verwendet werden.
  • Beispielsweise wird im Fall eines Mikroarrays das Blockierungsmittel verwendet, um Sondensequenzen zu binden, von denen bekannt ist, dass sie unspezifische Bindung durch markierte Target-Moleküle verursachen, wobei gewisse derartige Sondensequenzen in der Technik wohlbekannt sind. Zum Beispiel haben Verfahren, die üblicherweise für die Erzeugung von Arrays verwendet werden, Nukleotidsequenzen an jedem Fleck zur Folge, die Abschnitte von Poly-A auf dem Array aufweisen. Gewöhnlich würde potentiell der Poly-T-Schwanz eines markierten cDNA-Target-Moleküls mit diesen Poly-A-Sequenzen hybridisieren, was ein unspezifisches Signal zur Folge hätte, anstelle der Hybridisierung der cDNA-Sequenz mit irgendwelchen komplementären Genen von Sondenmolekülen auf dem Array. Als Ergebnis konstruiert man, um in diesem Fall unspezifisches Signal zu eliminieren, ein Reagens, um die unspezifische Hybridisierung mit den Poly-T-Sequenzen zu blockieren, indem man ein Blockierungsreagens in Form eines Poly-A-Oligonukleotids verwendet, das modifizierte Nukleotide enthält. Diese Poly-A-Oligonukleotide binden fest an die Poly-T-Sequenzen, was jegliche Bindung der cDNA-Poly-T-Sequenzen an das Array verhindert, die ein unspezifisches Signal zur Folge hätte. Auf analoge Weise können unter Verwendung eines Poly-A-Blockierungsreagens Abschnitte von Poly-T auf dem Array blockiert werden, so dass sie nicht an das Poly-A eines Target-RNA-Moleküls binden. Demgemäß besteht in den üblichsten Anwendungen der vorliegenden Erfindung das Blockierungsreagens aus einer Poly-T- oder Poly-A-Sequenz. Obwohl Poly-A- und Poly-T-Hybridisierungen die üblichste Form unspezifischer Bindung sind, ist jedoch die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung bei diesen Sequenzen beschränkt. Vielmehr kann das Blockierungsreagens mit einer komplementären Sequenz zu jeder Sonden- oder Target-Sequenz versehen werden, welche unerwünschte unspezifische Bindungswechselwirkungen zur Folge haben könnten.
  • In der vorliegenden Erfindung sind das bzw. die modifizierte(n) Nukleotid(e) des Blockierungsreagens Locked Nucleic Acid-Nukleotide ("LNA" – modifizierte bicyclische monomere Einheiten mit einer 2'-O-4'-C-Methylen-Brücke). Derartige LNA-Nukleotide besitzen eine stärkere Affinität zu den Sonden-Nukleotiden als DNA- oder RNA-Nukleotide, so dass die Hybridisierung des Blockierungsreagens eine Struktur zum Ergebnis hat, die einen höheren Schmelzpunkt aufweist als eine herkömmliche doppelsträngige DNA-Sequenz. Alternativ oder zusätzlich schließt das Blockierungsreagens Peptid-Nukleinsäuren ("PNA") ein (d. h. modifizierte Nukleotidbasen mit einem Peptid-Rückgrat). Jedoch können im Einklang mit der Erfindung auch andere modifizierte Nukleotide verwendet werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die folgenden Zeichnungen, in denen gleiche Bezugszeichen gleiche Teile anzeigen, veranschaulichen Ausführungsformen der Erfindung und sollten nicht als Beschränkung der Erfindung angesehen werden, wie sie von den Ansprüchen umfasst wird, die Teil der Anmeldung bilden.
  • 1 ist eine schematische Darstellung eines der Verfahren des Standes der Technik zur Herstellung eines Mikroarrays für den Nachweis und Assay einer Nukleinsäuresequenz-Probe;
  • 2 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Mikroarrays für den Nachweis und Assay einer Nukleinsäuresequenz-Probe in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
  • 3 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Mikroarrays für den Nachweis und Assay einer Nukleinsäuresequenz-Probe in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung; und
  • 4 zeigt die Struktur von LNA im Vergleich zu DNA und RNA.
  • 5 zeigt die Struktur von PNA im Vergleich zu DNA.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen
  • Bevor die vorliegende Erfindung weiter beschrieben wird, sollte verstanden werden, dass die Erfindung nicht auf die hierin beschriebenen speziellen Ausführungsformen der Erfindung beschränkt ist, da Abwandlungen der speziellen Ausführungsformen vorgenommen werden können und immer noch in den Bereich der Erfindung oder der beigefügten Ansprüche fallen. Es sollte auch verstanden werden, dass die verwendete Terminologie dem Zweck der Beschreibung spezieller Ausführungsformen dient und nicht beschränkend sein soll.
  • Die vorliegende Erfindung ist allgemein auf ein Verfahren zum Nachweis und Assay auf einem Mikroarray in einer Weise gerichtet, die eine signifikante Verringerung von unspezifischem Signal liefert. Wie es in der Technik bekannt ist, steht unspezifisches Signal mit einer Bindung der Probe an Moleküle auf der Array-Oberfläche in Beziehung, die keine nützliche oder relevante Information bezüglich der Identität der Probe (des Targets) bereitstellt. Wenn beispielsweise die Target-Moleküle cDNA sind, die aus einer Probe mit mRNA mit einem Poly-A-Schwanz hergestellt ist, ist ein Poly-T-Schwanz anwesend, der aus dem Vorliegen der Erzeugung der cDNA abstammt und der eine Target-Sonden-Bindung zur Folge haben kann, die keine nützliche oder relevante Information bezüglich der Sequenz der mRNA liefert, von der die cDNA abgeleitet wurde.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung liefert den Vorteil von niedrigem Hintergrund"rauschen", und minimalen "falsch Positiven", die für das Labor und die klinische Verwendung erforderlich sind. Die kostengünstige und wirksame Weise, mit der die Nukleinsäuresequenz-Proben hergestellt werden und mit der das Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung herkömmlicher Labortechniken, Ausrüstung und Reagenzien implementiert werden kann, macht sie für die Forschung und klinische Verwendung besonders geeignet.
  • Um diese Ziele zu erreichen, verwendet die vorliegende Erfindung Blockierungsreagenzien, die unspezifische Hybridisierung von Nukleinsäure- Molekülen an andere Nukleinsäuresequenzen verringern. Diese Blockierungsreagenzien sind Reagenzien mit Nukleinsäuresequenz-Reagenzien, die modifizierte Nukleotide enthalten. In der Erfindung besitzen die Blockierungsreagenzien einen oder mehrere LNA (Locked Nucleic Acid)-Reste als modifizierte(s) Nukleotid(e) in der Nukleinsäuresequenz. In alternativen Ausführungsformen können ein oder mehrere PNA-Reste oder andere modifizierte Nukleotide verwendet werden.
  • LNA-Moleküle sind neue DNA-Analoga, die den Watson-Crick-Basenpaarregeln unterliegen und DNA- oder RNA-Heteroduplexe mit hoher thermischer Stabilität bilden. In der Vergangenheit wurde beispielsweise gezeigt, dass sie eine ausgezeichnete Fähigkeit besitzen, zwischen zusammenpassenden und nicht zusammenpassenden Zielsequenzen beim Einzelnukleotid-Polymorphismus-Nachweis zu unterscheiden.
  • Wie in 4 gezeigt, ist in diesen Molekülen durch die Verwendung eines Methylen-Linkers, der die 2'-O-Position mit der 4'-C-Position verbindet, die normale Konformationsfreiheit des Furanoserings eingeschränkt. Bevorzugt werden die LNA-Moleküle von Proligo, LLC, Boulder, Colorado (www.proligo.com) oder von Exiqon A/S, Vedbaek, Dänemark (www.exiqon.com) erhalten. Alternativ können sie unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie unter Verwendung von DNA-Synthetisierern synthetisiert werden. (Siehe auch Sanjay Singh et al., "LNA (Locked Nucleic Acids): Synthesis and High Affinity Nucleic Acid Recognition", Chemical Communications, Royal Society of Chemistry, GB, Nr. 4, 21. Feb. 1998, was hierin vollständig durch Bezugnahme aufgenommen wird.) Als Alternative zu der in 4 gezeigten Struktur können auch andere Analoga verwendet werden, bei denen das 2'-Sauerstoffatom entweder durch Stickstoff oder durch Schwefel ersetzt ist. In weiteren alternativen Ausführungsformen kann die a-L-Ribo-Diastereoisomerform von LNA verwendet werden.
  • Mit Bezug auf PNA ist das PNA-Monomer ein 2-Aminoethylglycin, das durch eine Methylencarbonyl-Verknüpfung an eine der vier Basen (Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin), die in DNA gefunden werden, geknüpft ist. Anders als Standard- Nukleotide fehlen PNAs Pentosezuckerphosphat-Gruppen. Die allgemeine Struktur von PNA ist in 5 gezeigt.
  • Wie Aminosäuren besitzen PNA-Monomere Amino- und Carboxyl-Termini. Die PNA-Monomere sind durch Peptidbindungen zu einem Einzelketten-Oligomer verknüpft. Durch Übereinkunft für das PNA-Oligomer wird ein Peptid mit seinem N-Terminus an der ersten Position dargestellt (2). Dieses Ende entspricht dem 3'-Ende eines DNA- oder RNA-Strangs, wobei der N-Terminus einer PNA mit dem 5'-Ende von komplementärer einzelsträngiger DNA hybridisiert. Demgemäß werden, anders als die 5'-nach-3'-Übereinkunft beim Schreiben von Nukleinsäuresequenzen, PNA-Sequenzen gewöhnlich von 3' nach 5' geschrieben. Weitere Einzelheiten bezüglich derselben werden in B. Hyrup und P. E. Nielsen, Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic and Medicinal Chemistry, Bd. 4, Nr. 1, S. 5–23 (Elsevier Science Ltd., Großbritannien, 1996) bereitgestellt.
  • Während PNA-Monomere im Einklang mit der Erfindung verwendet werden können, können sie aufgrund solcher Faktoren wie der Tatsache, dass sie derzeit nur zu Oligomeren mit einer Länge von 20 Basen synthetisiert werden können, in einigen Anwendungen gewisse Nachteile aufweisen. Gleichermaßen zeigt ihr Schmelzpunkt die Tendenz, bei einem gewissen maximalen Niveau stehen zu bleiben, im Gegensatz zu LNA, die keine dieser Beschränkungen aufweist. Als Ergebnis wird LNA im Allgemeinen als das modifizierte Nukleotid der Wahl für die vorliegenden Blocker bevorzugt.
  • In den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Array von DNA- oder Gensonden, das auf der Oberfläche eines im Wesentlichen ebenen Substrats fixiert oder stabil damit verbunden ist, mit einer Probe von Target-Nukleinsäuren unter ausreichenden Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht, um ein Hybridisierungsmuster von komplementären Sonde/Target-Komplexen zu erzeugen. Eine Vielfalt von verschiedenen Mikroarrays, die verwendet werden können, ist in der Technik bekannt. Die hybridisierten Proben von Nukleinsäuren werden dann durch markierte Sonden angesteuert und damit hybridisiert, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen, das einem speziellen Hybridisierungsmuster entspricht. Die einzelnen markierten Sonden, die mit den Target-Nukleinsäuren hybridisiert sind, sind alle in der Lage, das gleiche Signal bekannter Intensität zu erzeugen. So kann jedes positive Signal in den Mikroarrays "gezählt" werden, um eine quantitative Information über das genetische Profil der Target-Nukleinsäureprobe zu erhalten.
  • Die DNA- oder Gensnden der Mikroarrays, die zur sequenzspezifischen Hybridisierung mit Target-Nukleinsäure in der Lage sind, können Polynukleotide oder hybridisierende Analoga oder Mimetika derselben sein, einschließlich, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Nukleinsäuren, in denen die Phosphodiester-Verknüpfung durch eine Ersatz-Verknüpfungsgruppe ersetzt worden ist, wie Phosphorothioat, Methylimino, Methylphosphonat, Phosphoramidat, Guanidin und dergleichen, Nukleinsäuren, in denen die Ribose-Untereinheit ersetzt worden ist, z. B. Hexosephosphodiester; Peptidnukleinsäuren und dergleichen. Die Länge dieser Sonden liegt im Allgemeinen im Bereich von 10 bis 1000 Nukleotiden. In einigen Ausführungsformen der Erfindung sind die Sonden Oligonukleotide mit 15 bis 150 Nukleotiden und gewöhnlicher 15 bis 100 Nukleotiden. In anderen Ausführungsformen sind die Sonden länger, gewöhnlich im Bereich einer Länge von 150 bis 1000 Nukleotiden, wobei die Polynukleotid-Sonden einzel- oder doppelsträngig, gewöhnlich einzelsträngig, sein können und PCR-Fragmente sein können, die aus cDNA amplifiziert wurden. Die DNA- oder Gensonden auf der Oberfläche der Substrate entsprechen bevorzugt bekannten Genen der physiologischen Quelle, die analysiert wird, und sind an bekannten Orten auf dem Mikroarray angeordnet, so dass positive Hybridisierungsereignisse mit der Expression eines speziellen Gens in der physiologischen Quelle, aus der die Target-Nukleinsäureprobe abgeleitet ist, korreliert werden können. Aufgrund der Weise, in der die Target-Nukleinsäureprobe erzeugt wird, wie nachstehend beschrieben, weisen die Mikroarrays der Gensonden im Allgemeinen Sequenzen auf, die komplementär sind zu den Nicht-Matrizen-Strängen des Gens, dem sie entsprechen.
  • Die Substrate, mit denen die Gensonden stabil assoziiert sind, können aus einer Vielfalt von Materialien bestehen, einschließlich Kunststoff, Keramik, Metall, Gel, Membran, Glas und dergleichen. Die Mikroarrays können gemäß jedem zweckmäßigen und herkömmlichen Verfahren erzeugt werden, wie Vorbilden der Gensonden und dann stabile Assoziierung derselben mit der Oberfläche des Trägers oder das Wachsenlassen der Gensonden direkt auf dem Träger. Eine Anzahl von verschiedenen Mikroarray-Konfigurationen und Verfahren zu deren Herstellung sind dem Fachmann bekannt, von denen eine in Science, 283,83, 1999 beschrieben ist.
  • Der Ausdruck "Marker" wird hierin verwendet, um Agenzien zu bezeichnen, die ein nachweisbares Signal entweder direkt oder durch Wechselwirkung mit einem oder mehreren zusätzlichen Mitgliedern eines signalerzeugenden Systems liefern können. Marker, die direkt nachweisbar sind und in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können, umfassen Fluoreszenzmarker, wie Fluorescein, Rhodamin, BODIPY, Cyanin-Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoff-Phosphoramidite und dergleichen; und radioaktive Isotope, wie 32S, 32P, 3H usw.; und dergleichen. Beispiele für Marker, die ein nachweisbares Signal durch Wechselwirkung mit einem oder mehreren zusätzlichen Mitgliedern eines signalerzeugenden Systems liefern, umfassen Einfangeinheiten, die speziell an komplementäre Bindungspaarmitglieder binden, wobei das komplementäre Bindungspaarmitglied eine direkt nachweisbare Markereinheit umfasst, wie eine fluoreszierende Einheit, wie oben beschrieben. Der Marker liefert bevorzugt kein variables Signal, sondern liefert stattdessen ein konstantes und reproduzierbares Signal über eine gegebene Zeitspanne.
  • Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein gewünschter Mikroarray bereitgestellt, an dem die Sonden-Nukleinsäuresequenzen stabil fixiert sind. Zusätzlich wird eine Probe bereitgestellt, welche die für die Untersuchung interessierenden Target-Moleküle aufweist. Die Target-Moleküle werden durch irgendein gewünschtes Verfahren markiert, sei es durch direkte Einverleibung von Markermolekülen oder andere Verfahren wie die Hybridisierung des Targets mit einem geeigneten Markermolekül, wie einem Dendrimer, wie nachstehend vollständiger erörtert. Die Target-Moleküle können vor oder nach dem Auftragen des Targets auf das Array markiert werden, obwohl eine vorherige Markierung im Allgemeinen bevorzugt wird.
  • So wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren bereitgestellt, welches in geeigneter Reihenfolge die Schritte umfasst: Verwendung eines Mikroarrays, wobei der Mikroarray eine Vielzahl von Merkmalen umfasst, wobei jedes der Merkmale eine Sonden-Nukleotidsequenz aufweist; Aufbringen einer Probe auf das Mikroarray, wobei die Probe Target-Moleküle zum Binden an irgendeine der Sonden-Nukleotidsequenzen auf dem Mikroarray umfasst, welche komplementär zu den Target-Molekülen sind; und Verwendung eines Blockierungsreagens, um unspezifische Bindung zwischen den Target- und den Sonden-Molekülen zu verringern, wobei das Blockierungsreagens eine Sequenz von Nukleinsäuren umfasst, die mindestens ein modifiziertes Nukleotid umfasst, wobei das modifizierte Nukleotid frei von einem Peptid-Rückgrat ist; wobei das Blockierungsreagens, welches das modifizierte Nukleotid umfasst, einen höheren Schmelzpunkt (Tm) im Vergleich zu einem Reagens mit der gleichen Sequenz von Nukleinsäuren, aber einer Standard-Nukleotidbase anstelle des modifizierten Nukleotids, aufweist.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, welches in irgendeiner geeigneten Reihenfolge die Schritte umfasst: Verwenden eines Mikroarrays, wobei das Mikroarray eine Vielzahl von Merkmalen darauf aufweist, wobei jedes der Merkmale eine Sonden-Nukleotidsequenz aufweist; Auftragen einer Probe auf das Mikroarray, wobei die Probe Target-Moleküle zum Binden an jegliche komplementären Sonden-Sequenzen auf dem Mikroarray enthält; und Verwenden eines LNA-Reagens als Blockierungsreagens, um unspezifische Bindung zwischen den Target- und Sonden-Molekülen zu verringern, wobei das LNA-Reagens ein DNA-Oligonukleotid ist, das Reste von Locked Nucleic Acid enthält, wobei die Locked Nucleic Acid-Reste modifizierte bicyclische Monomer-Einheiten mit einer 2'-O-4'-C-Methylen-Brücke sind.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besitzen die Target-Moleküle eine(n) direkt oder indirekt enthaltene(n) Marker oder Markierung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Target-Moleküle ein cDNA-Reagens, das aus mRNA einer Target-Probe erhalten wurde, obwohl in Übereinstimmung mit der Erfindung irgendwelche Target-Moleküle verwendet werden können.
  • So wird das Blockierungsreagens verwendet, um Nukleinsäuresequenzen zu binden, die eine unspezifische Bindung zwischen den Target-Molekülen und den Sonden-Molekülen zur Folge haben könnten. Gewöhnlich wird das Blockierungsreagens auf das Mikroarray aufgebracht, um Nukleinsäuresequenzen der Sonden zu binden, wobei sie die Sondensequenz "blockieren", so dass sie nicht an das Target binden. Jedoch kann in einer alternativen Ausführungsform das Blockierungsreagens auf die Probe angewandt werden, um die Nukleinsäuresequenzen des Targets zu blockieren. Bei beiden Ausführungsformen kann im Einklang mit der Erfindung das Blockierungsreagens vor oder gleichzeitig mit dem Auftragen der Probe auf dem Array aufgetragen werden.
  • In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden dendritische Nukleinsäure-Moleküle oder Dendrimere als Marker verwendet. Dendrimere sind komplexe, hoch verzweigte Moleküle, die eine Mehrzahl von verbundenen natürlichen oder synthetischen monomeren Untereinheiten von doppelsträngiger DNA umfassen. Dendrimere sind in Nilsen et al., Dendritic Nucleic Acid Structures, J. Theor. Biol., 187, 273–284 (1997) beschrieben. Weitere Information bezüglich der Struktur und Erzeugung von Dendrimeren ist in den U.S. Patenten Nr. 5,175,270 , 5,484,904 und 5,487,973 offenbart.
  • Dendrimere umfassen zwei Arten von einzelsträngigen Hybridisierungs"armen" auf der Oberfläche, welche verwendet werden, um zwei Schlüssel-Funktionalitäten anzubringen. Ein einziges Dendrimer-Molekül kann mindestens 100 Arme jeder Arm aufweisen. Eine Art Arm wird zum Anbringen von Targeting-Molekülen (z. B. eine Einfangsequenz) verwendet, um eine Target-Spezifität bereitzustellen, und der andere wird zum Anbringen einer Markierung oder eines Markers verwendet Die Moleküle, welche die Target- und Markierungsspezifitäten des Dendrimers festlegen, sind entweder als Oligonukleotide oder als Oligonukleotid-Konjugate angebracht. Unter Verwendung von einfachen DNA-Markierungs-, -Hybridisierungs- und -Ligierungsreaktionen können die Dendrimer-Sonden so konfiguriert werden, dass sie als hoch markiertes Target-spezifisches Reagens wirken.
  • Um fluoreszenzmarkiertes Dendrimer herzustellen, werden die Sequenzen, die zu der Einfangsequenz auf dem Cy3® RT-Primer und dem Cy5® RT-Primer komplementär sind, getrennt an gereinigtes dendritisches Kernmaterial ligiert, das durch die früher beschriebenen Verfahren hergestellt wird (siehe Nilsen et al., oben, und U. S. Patente Nr. '270, '904 und '973 oben). Oligonukleotide mit einer Länge von dreißig Nukleotiden, die zu den äußeren Armen eines Vierlagen-Dendrimers mit einem 5'-Cy3® oder Cy5® komplementär sind, werden dann synthetisiert. (Oligos usw., Inc., Wilsonville, OR). Die Cy3®- und Cy5®-Oligonukleotide werden dann jeweils mit der äußeren Oberfläche der entsprechenden Dendrimere hybridisiert und kovalent vernetzt. Überschüssige Einfang- und fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide werden dann durch Techniken wie Größenausschlusschromatographie entfernt.
  • Die Dendrimer-Konzentration wird bestimmt, indem man mit einem UV/Vis-Spektrometer die optische Dichte des gereinigten Materials bei 260 nm misst. Die Fluoreszenz wird bei optimalen Signal/Rausch-Wellenlängen unter Verwendung eines Fluorometers (FluoroMax, SPEX Industries) gemessen. Cy3 ist bei 542 nm anregbar und die Emission wird bei 570 nm gemessen. Cy5 ist bei 641 nm anregbar und die Emission wird bei 676 nm gemessen.
  • In früheren Erfindungen verringert die Verwendung von Dendrimer-Sonden signifikant die Menge an Proben-RNA, die benötigt wird, um einen Assay zu erzeugen, während die Empfindlichkeit aufgrund der überlegenen Signalamplifikationsfähigkeit der Dendrimere erhöht wird. Durch Verringern der Menge an RNA, die für einen Assay erforderlich ist, kann die Menge RT-Primer für eine verbesserte Signalerzeugung ebenfalls verringert werden, wie nachstehend erörtert. Die verringerte RT-Primer-Menge verringert auch die Zahl der Waschschritte, die während der Assaypräparation benötigt werden.
  • Für den Assay selbst kann, falls gewünscht, eine Strategie verwendet werden (ein "Zweistufen-Verfahren"), welches aufeinanderfolgende Hybridisierungsschritte verwendet, bei denen die revers transkribierte cDNA über Nacht in Anwesenheit oder nach Verwendung des LNA-Blockers mit dem Array hybridisiert wird. Die Hybridisierung der cDNA-Moleküle mit immobilisierten Target-Sonden folgt sofort ein Waschverfahren, bei dem ungebundene cDNA und ungebundener LNA-Blocker von dem Array entfernt werden. Das fluoreszierend markierte Dendrimer-Molekül (oder ein anderes Molekül, das die der cDNA einverleibte Einfangsequenz binden kann) wird zu dem gewaschenen Array gegeben und bei dieser zweiten Hybridisierung mit der geeigneten Target-cDNA hybridisiert, die mit der Einfangsequenz assoziiert ist, was typisch für 15–180 Minuten durchgeführt wird. Überschüssiges Dendrimer wird bei einem zweiten Waschverfahren weggewaschen und die Arrays werden abgetastet, wie vorstehend erörtert.
  • Alternativ kann gemäß früheren Erfindungen das Hybridisierungsverfahren zu einem einzigen Schritt ("Einstufen"-Verfahren) zur Erhöhung der Empfindlichkeit und Leichtigkeit der Verwendung und zu einer signifikant verringerten Verarbeitungszeit reduziert werden. Die Hybridisierungsgeschwindigkeit und -effizient wird in großem Maße erhöht, indem man vor der Hybridisierung der cDNA mit dem Mikroarray zuerst die cDNA mit den Dendrimer-Sonden hybridisiert. Dieses Einstufen-Hybridisierungsverfahren verringert auch die Zahl der Hybridisierungspuffer auf einen, indem man die Verwendung eines cDNA-Hybridisierungspuffers (50% Formamid, 10% Dextransulfat, 1 x Denhardt-Lösung, 0,2% N-Lauroylsarcosin, 250 Mikrogramm/Milliliter gescherte Lachssperma-DNA, 2X SSC, 20 mM Tris, pH 7,5 und doppelt destilliertes Wasser) ausschaltet. Weitere Einzelheiten bezüglich des Zweistufen- und Einstufen-Verfahrens werden in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US01/07477, eingereicht am 8. März 2001, bereitgestellt.
  • Falls gewünscht, kann in weiteren bevorzugten Ausführungsformen ein Temperaturcycling verwendet werden, um selektiv die Hybridisierung zwischen der Target-Nukleinsäure und dem Mikroarray und die Hybridisierung zwischen dem Einfangreagens und dem Mikroarray (bevorzugt cDNA-Mikroarray-Hybridisierung bzw. cDNA-Dendrimer-Hybridisierung) zu steuern. Unter Verwendung eines derartigen Cyclings kann die Hybridisierung sorgfältig gesteuert werden, so dass die cDNA anfänglich nur mit dem Mikroarray hybridisiert, mit einer anschließenden Hybridisierung von cDNA mit dem Dendrimer. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Hybridisierungskinetik jeder der zwei Komponenten, d. h. Target-Nukleinsäure mit Sonde und Einfangreagens mit Target-Nukleinsäure, zu verbessern. Weitere Einzelheiten bezüglich der Verwendung eines derartigen Temperaturcyclings sind in der U.S. Provisional Application No. 60/261,231 , eingereicht am 13. Januar 2001 ( US 2002 09 4538 ) und veröffentlichten Protokollen von den gegenwärtigen Erfindern und von Genisphere, Inc., Montvale, New Jersey, bereitgestellt.
  • Die Target-Nukleinsäure ist im Allgemeinen DNA, die revers aus RNA transkribiert worden ist, welche von einer natürlich vorkommenden Quelle abstammt, wobei die RNA ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus Gesamt-RNA, Poly(A)+mRNA, amplifizierter RNA und dergleichen. Die anfängliche mRNA-Quelle kann in einer Vielfalt von verschiedenen Proben vorliegen, wobei die Probe typisch aus einer physiologischen Quelle abstammt. Die physiologische Quelle kann aus einer Vielfalt von eukaryotischen Quellen abstammen, wobei interessierende physiologische Quellen Quellen einschließen, die von einzelligen Organismen, wie Hefe, und mehrzelligen Organismen, einschließlich Pflanzen und Tieren, insbesondere Säugern, stammen, wobei die physiologischen Quellen aus mehrzelligen Organismen aus speziellen Organen oder Geweben des mehrzelligen Organismus oder aus isolierten Zellen, die davon abstammen, stammen können. Beim Erhalt der zu analysierenden Proben-RNAs aus der physiologischen Quelle, von der sie stammt, kann die physiologische Quelle eine Anzahl von verschiedenen Verarbeitungsschritten unterzogen werden, wobei derartige bekannte Verarbeitungsschritte Gewebehomogenisierung, Zellenisolierung und zytoplasmatische Extraktion, Nukleinsäureextraktion und dergleichen einschließen können. Verfahren zur Isolierung von RNA aus Zellen, Geweben, Organen oder ganzen Organismen sind dem gewöhnlichen Fachmann bekannt und sind zum Beispiel in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989, und in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1998, beschrieben.
  • Die Proben-mRNA wird revers in eine Target-Nukleinsäure in Form einer cDNA durch Hybridisierung eines Oligo(dT)-Primers oder RT-Primers mit der mRNA unter ausreichenden Bedingungen für eine enzymatische Verlängerung des hybridisierten Primers transkribiert. Der Primer ist ausreichend lang, um für eine effiziente Hybridisierung mit dem mRNA-Schwanz zu sorgen, wobei die Region typisch in einem Längenbereich von 10 bis 25 Nukleotiden, gewöhnlich 10 bis 20 Nukleotiden und gewöhnlicher 12 bis 18 Nukleotiden liegt.
  • Wegen der Erkenntnis, dass Anwendungen typisch die Verwendung von sequenzspezifischen Primern erfordern, umfassen die Standard-Primer, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, weiter "Einfangsequenz"-Nukleotid-Abschnitte. Die bevorzugten Einfangsequenzen, auf die hierin Bezug genommen wird, sind Cy3® RT-Primer-Einfangsequenzen (Oligos etc., Inc., Wilsonville, OR) oder Cy5® RT-Primer-Einfangsequenzen (Oligos etc., Inc., Wilsonville, OR) und sind nachstehend dargestellt.
    Figure 00210001
    bei maßgeschneiderten Primer sollten die obigen Einfangsequenzen am 5'-Ende des entsprechenden maßgeschneiderten Oligonukleotid-Primers angebracht sein. Auf diese Weise ersetzt der maßgeschneiderte Primer den Standard-RT-Primer. Da die vorliegende Erfindung zur Verwendung mit dem Standard-RT-Primer gedacht ist, können einigen Abwandlungen erforderlich sein, wenn ein maßgeschneiderter Primer eingesetzt wird. Derartige Abwandlungen sind dem Fachmann bekannt und können die Einstellung der Menge und Mischung von Primern auf der Grundlage der Menge und der Art der verwendeten RNA-Probe einschließen. Der Primer trägt eine Einfangsequenz, die eine spezifische Sequenz von Nukleotiden umfasst, wie oben beschrieben. Die Einfangsequenz ist komplementär zu den Oligonukleotiden, die an den Armen der Dendrimer-Sonden angebracht sind, welche weiter mindestens einen Marker tragen. Derartige komplementäre Oligonukleotide können im Handel erworben werden und können auch als markierte Einheiten erworben werden. Der Marker kann an einem oder mehreren der Oligonukleotide angebracht sein, die an den Armen der Dendrimer-Sonde angebracht sind, entweder direkt oder durch eine Verknüpfungsgruppe, wie es in der Technik bekannt ist. In der bevorzugten Ausführungsform sind die Dendrimer-Sonden durch Hybridisierung und Vernetzung von Cy3®- oder Cy5®-markierten Oligonukleotiden mit den Dendrimer-Armen markiert. Die Cy3®- oder Cy5®-markierten Oligonukleotide sind komplementär zu der Cy3®- bzw. Cy5®-RT-Primer-Einfangsequenz.
  • Bei der Erzeugung der Target-Nukleinsäure-Probe wird der Primer mit der mRNA in Anwesenheit eines Reverse-Transkriptase-Enzyms und anderen für die Primerverlängerung erforderlichen Reagenzien unter ausreichenden Bedingungen für die Induzierung einer Erststrang-cDNA-Synthese in Kontakt gebracht, wobei zusätzliche Reagenzien umfassen: dNTPs; Puffermittel, z. B. Tris.Cl; kationische Quellen, sowohl einwertige als auch zweiwertige, z. B. KCl, MgCl2; RNAase-Inhibitor und Sulfhydril-Reagens, z. B. Dithiothreit; und dergleichen. Eine Vielfalt von Enzymen, gewöhnlich DNA-Polymerasen, die Reverse-Transkriptase-Aktivität besitzen, können für den Erststrang-cDNA-Syntheseschritt verwendet werden. Beispiele für geeignete DNA-Polymerasen umfassen die DNA-Polymerasen, die aus Organismen abstammen, weclhe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus thermophilen Bakterien und Archaebacteria, Retroviren, Hefen, Neurosporas, Drosophilas, Primaten und Nagern. Geeignete DNA-Polymerasen, die Reverse-Transkriptase-Aktivität besitzen, können aus einem Organismus, der im Handel erhalten wird oder aus Zellen erhalten wird, die hohe Niveaus an klonierten Genen exprimieren, welche die Polymerasen codieren, durch den Fachmann bekannte Verfahren erhalten werden, wobei die spezielle Weise des Erhalts der Polymerase hauptsächlich aufgrund von Faktoren wie Zweckmäßigkeit, Kosten, Verfügbarkeit und dergleichen gewählt wird. Die Reihenfolge, in der die Reagenzien vereinigt werden, kann abgewandelt werden, wie gewünscht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das cDNA-Syntheseprotokoll die Vereinigung von 0,25 bis 1 Mikrogramm Gesamt-RNA oder etwa 12,5 bis 50 Nanogramm Poly(A)+mRNA mit etwa 0,2 Pikomol RT-Primer (0,2 pMol) und RNase-freiem Wasser auf ein Endvolumen von etwa 10 Mikrolitern, was eine RNA-RT-Primermischung liefert. Die RNA-RT-Primermischung wird dann gemischt und mikrozentrifugiert, um den Inhalt am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. Die RNA-RT-Primermischung wird dann zehn Minuten auf 80°C erwärmt und sofort auf Eis überführt. In einem getrennten Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis mische man etwa 4 Mikroliter 5X RT-Puffer, 1 Mikroliter dNTP-Mischung, 4 Mikroliter RNase-freies Wasser und 1 Mikroliter von 200 Einheiten Reverse-Transkriptase-Enzym zusammen. Man mische sanft und mikrozentrifugiere kurz, um den Inhalt am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln, was eine Reaktionsmischung liefert. Man mische die RNA-RT-Primer-Mischung mit der Reaktionsmischung und inkubiere dann bei etwa 42°C über eine ausreichende Zeitspanne für die Bildung des Erststrang-cDNA-Primerverlängerungsprodukts, was gewöhnlich etwa 2 Stunden dauert.
  • Die Mischung, welche die cDNA- oder Target-Nukleinsäure nach der Bildung umfasst, kann weiter gereinigt werden, um jegliche überschüssigen RT-Primer zu entfernen, die nach Beendigung des Reverse-Transkriptions-Prozesses noch verbleiben könnten. Der überschüssige RT-Primer würde an die Dendrimer-Sonden binden, was eine verringerte Signalstärke und -intensität und demgemäß eine verringerte Assayempfindlichkeit zur Folge hätte. Obwohl dieser Schritt fakultativ ist, tendiert die Reinigung der cDNA-Mischung dazu, die Signalstärke im Mikroarray zu verbessern, was eine verbesserte Signalerzeugung des Hybridisierungsmusters zur Folge hat. Die Menge an RT-Primer beeinflusst die Qualität des Assays, da überschüssiger RT-Primer die Signalstärke und -auflösung verringern kann. Die überschüssige RT-Primer können durch jedes geeignete Mittel, einschließlich der Verwendung einer Spinsäulenanordnung, des QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA) und dergleichen, aus der cDNA-Mischung entfernt werden. Spinsäulenanordnungen sind bekannte Vorrichtungen, die verwendet werden, um eine oder mehrere Komponenten mittels Zentrifugieren aus einer Mischung abzutrennen.
  • Bevorzugt können die überschüssigen RT-Primer über eine herkömmliche Spinsäulenanordnung entfernt werden. Das Spinsäulenmedium ist aus einem Größenausschlussharz-Kern zusammengesetzt, der eine Vielzahl von Harzporen umfasst, die überall darin verteilt sind. Die Harzporen sind ausreichend groß, um den überschüssigen RT-Primer einzufangen und erlauben, dass cDNA, in das Leervolumen tritt. Um überschüssigen RT-Primer zu entfernen, wird die cDNA-haltige Mischung in ein Halteröhrchen an einem Ende der Spinsäule gegeben, wobei die Spinsäule und die Mischung über eine Zeitspanne einer hohen Zentrifugalkraft ausgesetzt werden. Die Mischung diffundiert durch die Säule und tritt am entgegengesetzten Ende in ein Sammelgefäß aus. Das in dem Gefäß gesammelte resultierende Eluat umfasst die gereinigte cDNA-Sonde.
  • Bei der Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Menge einer markierten Dendrimer-Sonde zusammen mit einem Hybridisierungspuffer unter Temperaturbedingungen zu dem gereinigten cDNA-Sondeneluat gegeben, die eine Hybridisierung zwischen der Dendrimer-Sonde und der Target-cDNA induzieren. Speziell wird die Mischung bei einer ersten Vorhybridisierungstemperatur und über eine ausreichende Zeitspanne inkubiert, um zu ermöglichen, dass die Dendrimer-Sonden an der cDNA angebracht werden. Der bevorzugte Bereich für die erste Vorhybridisierungstemperatur beträgt, wenn ein Formamidfreier Hybridisierungspuffer verwendet wird, etwa 45 bis 60°C und bevorzugt etwa 55°C. Wenn ein Formamid-haltiger Hybridisierungspuffer verwendet wird, hängt der bevorzugte Bereich der Vorhybridisierungstemperatur von dem prozentualen Gehalt an Formamid ab, wobei die Temperatur für jede 2% vorhandenes Formamid um 1 Grad Celsius bezüglich des Formamid-freien Standard-Puffertemperaturbereichs verringert wird. Die Mischung wird vorzugsweise etwa 15 bis 20 Minuten inkubiert, um zu ermöglichen, dass die cDNA mit den Dendrimer-Sonden hybridisiert, um eine Vorhybridisierungsmatrix zu liefern.
  • Das Blockierungs-LNA-Oligonukleotid wird bevorzugt während des vorangehenden Schritts oder unmittelbar vor der Zugabe der Dendrimer-cDNA-Mischung zu dem Mikroarray zugesetzt. Alternativ kann der LNA-Blocker auf dem Array vorhybridisiert werden, d. h. vor der Auftragung der Target-Moleküle auf das Array direkt zum Array gegeben werden. Das Blockierungs-LNA-Oligonukleotid enthält sowohl normale als auch modifizierte LNA-Basenreste (LNA = Locked Nucleic Acid, modifizierte bicyclische monomere Einheiten mit einer 2'-O-4'-C-Methylenbrücke), welche den funktionalen Schmelzpunkt (Tm) des Blockierungs-LNA-Oligonukleotids erhöhen (Tm-Schmelzpunkte von mehr als 100°C sind möglich). Dies ermöglicht, dass das Blockierungs-LNA-Oligonukleotid vorzugsweise und irreversibel mit komplementären Sequenzen auf dem Mikroarray hybridisiert, welche mit durch RT erzeugten cDNA-Proben konkurrieren oder durch RT erzeugte cDNA-Proben, die über diese sich wiederholenden Sequenzen hybridisiert haben können, ersetzen. (Alternativ kann der LNA-Blocker verwendet werden, um mit komplementären Sequenzen des Targets zu hybridisieren, bevorzugt vor Auftragung des Targets auf das Array).
  • Typisch werden Blockierungs-LNA-Oligonukleotide, die 20–50 normale Basen von Poly-T oder Poly-A und 2–20 Basen von LNA-Poly-T oder -Poly-A enthalten, auf der Grundlage von Schmelzpunkt und funktionellen Eigenschaften gewählt; die Anordnung der LNA-Reste innerhalb der Oligonukleotidsequenz können die Funktionalität des Moleküls ändern; deshalb ist die Konstruktion des korrekten Oligonukleotids von kritischer Bedeutung, damit das Blockierungs-LNA-Oligonukleotid geeignet funktioniert. Nützliche und bevorzugte Sequenzkonstruktionen haben die folgenden eingeschlossen:
    Figure 00250001
    Figure 00260001
  • Diese Blockierungs-Oligos werden so konstruiert, dass sie die Bindung von langen Verlängerungen von Poly-T- oder Poly-A-Sequenzen, die bei mRNA gefunden werden, und anderen üblicherweise für Mikroarray-Tests verwendeten Sequenzen blockieren. Diese Sequenzen verursachen typisch falsch positive Ergebnisse und ein unspezifisches Signal, wenn die Hybridisierung zwischen diesen Sequenzen und komplementären Sequenzen stattfindet, die auf de Oberfläche des Mikroarrays gefunden werden. Typisch enthält ein Mikroarray mit cDNAs Flecken, die aus PCR-Reaktionen erzeugt worden sind, mit Wahrscheinlichkeit lange Poly-A und Poly-T-Sequenzen, die mit der cDNA hybridisieren können, die bei der oben beschriebenen Reverse-Transkriptase-Reaktion erzeugt wurden. (Mikroarrays, die Oligonukleotide als Sonden enthalten, enthalten mit weniger Wahrscheinlichkeit lange Abschnitte monomerer Basen, obwohl dies nicht unbekannt ist.)
  • Jedoch können die gewünschten Blockierungs-LNA-Oligomere ähnlich verwendet werden, um irgendwelche anderen Sequenzen zu blockieren, die unspezifische Bindungswechselwirkungen verursachen könnten, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, repetitiver Sequenzen, die im ganzen Genom (human oder sonstig) verteilt sind. Zum Beispiel könnten sie verwendet werden, um Tandem-wiederholte DNA oder eingestreute repetitive DNA zu kopieren, unabhängig davon, ob es sich um Short Interdispersed Nuclear Elements ("SINES"), Long Interspersed Nuclear Elements ("LINES") und so weiter handelt. So könnte in einer Ausführungsform ein Blocker verwendet werden, um Alu-Sequenzen oder jede andere Sequenz, die derzeit bekannt ist oder später entdeckt wird, zu blockieren. Im Allgemeinen werden eine oder mehrere Basensequenzen, die eine unspezifische Bindung an markierte Target-Moleküle zur Folge haben könnten, innerhalb der Sonde oder Target-Nukleotide identifiziert. Ein LNA-Blockierungsreagens kann dann bereitgestellt werden, das eine Sequenz aufweist, die komplementär zu jenen Basensequenzen ist, um an sie zu binden und dadurch unerwünschte unspezifische Sonden-Target-Bindungswechselwirkungen zu minimieren oder auszuschalten.
  • Die Vorhybridisierungsmischung wird dann zu dem Mikroarray gegeben und bei einer zweiten Hybridisierungstemperatur und über eine ausreichende Zeitspanne inkubiert, um zu ermöglichen, dass die cDNA an das Mikroarray bindet. Der bevorzugte Bereich für die zweite Hybridisierungstemperatur beträgt, wenn ein Formamid-freier Hybridisierungspuffer verwendet wird, etwa 42 bis 60°C. Wenn ein Formamid-haltiger Hybridisierungspuffer verwendet wird, hängt der bevorzugte Bereich der Vorhybridisierungstemperatur von dem prozentualen Formamidgehalt ab, wobei die Temperatur für jede vorhandene 2% Formamid um 1°C bezüglich des Formamid-freien Standard-Puffer-Temperaturbereichs verringert wird. Vorzugsweise werden die Vorhybridisierungsmischung und das Mikroarray über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei der zweiten Temperatur inkubiert.
  • Unter derartigen Anfangsbedingungen ist die Einfangsequenz der cDNA in der Lage, mit dem Komplement vorzuhybridisieren, das an der Dendrimer-Sonde angebracht ist, bevor die cDNA an die Gensonde auf dem Mikroarray bindet. Die Target-cDNA, die an der Dendrimer-Sonde angebracht ist, wird dann mit dem Mikroarray unter ausreichenden Bedingungen in Kontakt gebracht, um eine Hybridisierung der Target-cDNA mit der DNA- oder Gen-Sonde auf dem Mikroarray zu ermöglichen. Die resultierende Mischung wird für eine vollständige Hybridisierung über Nacht inkubiert. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann geläufig und in Maniatis et al., oben, beschrieben, wobei die Bedingungen abgeändert werden können, um eine gewünschte Spezifität bei der Hybridisierung zu erzielen. Es wird angemerkt, dass alle geeigneten Hybridisierungspuffer in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. In einer bevorzugten Form kann die Hybridisierungs-Pufferzusammensetzung 0,25 M NaPO4, 4,5% SDS, 1 mM EDTA und 1X SSC umfassen. In einer weiteren bevorzugten Form kann die Hybridisierungs-Pufferzusammensetzung 40% Formamid, 4X SSC und 1% SDS umfassen.
  • Nach dem Hybridisierungsschritt wird, wenn die unhybridisierten Dendrimer-Sonde-cDNA-Komplexe während des Nachweisschrittes ein Signal emittieren können, ein Waschschritt verwendet, wobei die unhybridisierten Komplexe von dem Mikroarray weggespült werden, was so ein sichtbares diskretes Muster von hybridisierten cDNA-Dendrimer-Sonden zurücklassen, die an das Mikroarray gebunden sind. Eine Vielfalt von Waschlösungen und Protokollen für deren Verwendung sind dem Fachmann geläufig und können verwendet werden. Die speziellen verwendeten Waschbedingungen hängen notwendigerweise von der speziellen Natur des Signal-erzeugenden Systems ab, das verwendet wird, und sind dem Fachmann bekannt, dem das verwendete spezielle Signal-erzeugende System geläufig ist.
  • Das resultierende Hybridisierungsmuster von markierten cDNA-Fragmenten kann auf vielfältige Weise sichtbar gemacht oder nachgewiesen werden, wobei die spezielle Weise des Nachweises auf der Grundlage des speziellen Markers der cDNA gewählt wird, wobei repräsentative Nachweismittel Szintillationszählung, Autoradiographie, Fluoreszenzmessung, kalorimetrische Messung, Lichtemissionsmessung und dergleichen einschließen.
  • Nach der Hybridisierung und jeglichem bzw. jeglichen Waschschritt(en) und/oder nachfolgenden Behandlungen, wie oben beschrieben, wird das resultierende Hybridisierungsmuster nachgewiesen. Bei dem Nachweis oder der Sichtbarmachung des Hybridisierungsmusters wird die Intensität des Signalwertes des Markers nicht nur nachgewiesen, sondern quantitativ bestimmt, womit gemeint ist, dass das Signal aus jedem Flecken der Hybridisierung gemessen wird.
  • Nach Nachweis oder Visualisierung kann das Hybridisierungsmuster verwendet werden, um eine quantitative und qualitative Information über das genetische Profil der markierten Target-Nukleinsäure-Probe, die mit dem Mikroarray in Kontakt gebracht wurde, um das Hybridisierungsmuster zu erzeugen, sowie die physiologische Quelle, aus der die markierte Target-Nukleinsäure-Probe abstammt, zu bestimmen. Aus diesen Daten kann man auch Informationen über die physiologische Quelle, aus der die Target-Nukleinsäure-Probe stammt, wie die Arten von Genen, die in Gewebe oder der Zelle exprimiert wird, welche(s) die physiologische Quelle ist, sowie die Niveaus der Expression jedes Gens ableiten, insbesondere auf quantitative Weise. Wenn man die vorliegenden Verfahren beim Vergleich von Target-Nukleinsäuren aus zwei oder mehr physiologischen Quellen verwendet, können die Hybridisierungsmuster verglichen werden, um Unterschiede zwischen den Mustern zu identifizieren. Wenn Mikroarrays, in denen jede der verschiedenen Sonden einem bekannten Gen entspricht, verwendet werden, können alle Unterschiede mit einer unterschiedlichen Expression eines speziellen Gens in den physiologischen Quellen verglichen werden. So finden die vorliegenden Verfahren in differentiellen Genexpressions-Assays Verwendung, bei denen man die vorliegenden Verfahren bei der differentiellen Expressionsanalyse von: erkranktem oder normalem Gewebe, z. B. neoplastischem und normalem Gewebe, verschiedenen Gewebe- oder Subgewebe-Typen und dergleichen verwenden kann.
  • Viele andere Abwandlungen der obigen Verfahren können im Einklang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann anstelle der Verwendung von RNA, die aus einer Probe extrahiert wurde und vor der Hybridisierung in cDNA überführt wurde, die vorliegende Erfindung direkt mit der RNA-Probe verwendet werden. In einer derartigen Ausführungsform kann eine geeignete Einfangsequenz unter Verwendung bekannter Verfahren des RNA-Spleißens, wie durch enzymatische Mittel, an die RNA ligiert werden. Oder es kann, falls die RNA ein spezielles Oligonukleotid einschließt, das als Einfangsequenz nützlich ist, ein komplementäres Oligonukleotid an dem Dendrimer angebracht werden, um das RNA-Molekül zu markieren. Weitere Einzelheiten bezüglich der Verfahren zur direkten Verwendung von RNA ohne das Erfordernis für eine Reverse Transkription werden in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US01/22818, eingereicht am 19. Juli 2001, bereitgestellt.
  • Weitere Beispiele für Ausführungsformen der Erfindung werden wie folgt bereitgestellt:
  • BEISPIEL 1
  • Mit Bezug auf 2 wird nachstehend ein Verfahren zum Nachweis und Assay auf einem Mikroarray beschrieben.
  • Mikroarray-Herstellung
  • Ein Mikroarray wurde wie vom Hersteller angegeben oder durch ein maßgeschneidertes Verfahrensprotokoll hergestellt. Die Nukleinsäuresequenzen, die DNA- oder Gensonden umfassten, wurden unter Verwendung bekannter Techniken mit der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert, dann auf Glasobjektträger aufgetüpfelt und gemäß herkömmlichen Verfahren verarbeitet.
  • Herstellung und Konzentration von Ziel-Nukleinsäuresequenzen-Probe oder cDNA
  • Die Ziel-Nukleinsäuresequenzen oder cDNA wurden aus Gesamt-RNA oder Poly(A)+RNA hergestellt, die aus Zellproben extrahiert worden war. Es wird angemerkt, dass bei Proben, die etwa 10 bis 20 Mikrogramm Gesamt-RNA oder 500–1000 Nanogramm Poly(A)+RNA enthalten, eine Ethanolfällung nicht erforderlich ist und übergangen werden kann, da die cDNA ausreichend konzentriert ist, um die Mikroarray-Hybridisierung durchzuführen. In einem Mikrozentrifugenröhrchen werden 0,25 bis 5 Mikrogramm Gesamt-RNA oder 2,5 bis 500 Nanogramm Poly(A)+RNA mit 3 Mikrolitern Cy3®- oder Cy5®-RT-Primer (0,2 pMol) und RNase-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10 μl versetzt, was eine RNA-RT-Primermischung liefert. Die resultierende Mischung wurde gemischt und kurz mikrozentrifugiert, um den Inhalt im Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. Der gesammelte Inhalt wurde dann etwa zehn (10) Minuten auf 80°C erwärmt und sofort auf Eis überführt. In einem getrennten Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis wurden 4 Mikroliter 5X RT-Puffer, 1 Mikroliter dNTP-Mischung, 4 Mikroliter RNase-freies Wasser und 1 Mikroliter Reverse-Transkriptase-Enzym (200 Einheiten) vereinigt, was eine Reaktionsmischung lieferte. Die Reaktionsmischung wurde sanft gemischt und kurz mikrozentrifugiert, um den Inhalt im Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. 10 Mikroliter der RNA-RT-Primermischung und 10 Mikroliter der Reaktionsmischung wurden kurz gemischt und 2 Stunden bei 42°C inkubiert. Die Reaktion wurde beendet, indem man 3,5 Mikroliter 0,5 M NaOH/50 mM EDTA zu der Mischung gab. Die Mischung wurde zehn (10) Minuten bei 65°C inkubiert, um die DNA/RNA-Hybride zu denaturieren, und die Reaktion wurde mit 5 Mikrolitern 1 M Tris-HCl, pH 7,5, neutralisiert. 38,5 Mikroliter 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA wurden dann zu der neutralisierten Reaktionsmischung gegeben. (Die obigen Schritte können wiederholt werden, indem man die 3 Mikroliter Cy3®-RT-Primer (0,2 pMol) mit 3 Mikrolitern Cy5®-RT-Primer (0,2 pMol) für die Herstellung von Dualkanal-Expressionsassays ersetzt, wobei die hergestellte Cy3®- und Cy5®-cDNA-Mischung mit 10 Mikrolitern 10 Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA zusammengemischt wird, um eine Reaktionsmischung für die Verarbeitung in den folgenden Schritten zu liefern.)
  • 2 Mikroliter einer Träger-Nukleinsäure (10 mg/ml lineares Acrylamid) wurden vor der Ethanolfällung zu der neutralisierten Reaktionsmischung gegeben. 175 Mikroliter 3 M Ammoniumacetat wurden zu der Mischung gegeben und dann gemischt. Dann wurden 625 Mikroliter 100%-iges Ethanol zu der resultierenden Mischung gegeben. Die resultierende Mischung wurde dreißig (30) Minuten bei –20°C inkubiert. Die Probe wurde mit einer Beschleunigungsgeschwindigkeit von mehr als 10.000 g fünfzehn (15) Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und dann wurden 330 Mikroliter 70%-iges Ethanol zu dem Überstand oder dem cDNA-Pellet gegeben. Das cDNA-Pellet wurde dann mit einer Beschleunigungsgeschwindigkeit von mehr als 10.000 g 5 Minuten lang zentrifugiert und wurde dann entfernt. Das cDNA-Pellet wurde getrocknet (d. h. 20–30 Minuten bei 65°C).
  • Hybridisierung von cDNA/Dendrimer-Sondenmischung mit Mikroarray
  • Der DNA-Hybridisierungspuffer wurde aufgetaut und durch Erwärmen auf 65°C für zehn (10) Minuten resuspendiert. Der Hybridisierungspuffer umfasste 40% Formamid. Der Puffer wurde durch Auf-den-Kopf-Stellen gemischt, um sicherzustellen, dass die Komponenten gleichmäßig resuspendiert waren. Das Erwärmen und Mischen wurde wiederholt, bis alles Material resuspendiert war. Eine Menge von Konkurrenz-DNA wurde dazugegeben, wie erforderlich (z. B. COT-1-DNA und PolydA). Die cDNA wurde in 5,0 Mikrolitern sterilem Wasser resuspendiert.
  • In einer ersten Ausführungsform, einer Einkanal-Analyse, wurden 2,5 Mikroliter einer Art von 3DNA®-Reagens (Genisphere, Inc., Montvale, NJ) (Cy3 oder Cy5) zusammen mit 12,5 Mikrolitern eines DNA-Hybridisierungspuffers (der 40% Formamid enthielt) und 1 Mikroliter des Blockierungs-LNA-Oligonukleotids Oligo dT36-LNA13 zu der resuspendierten cDNA gegeben.
  • In einer alternativen Ausführungsform für eine Dualkanal-Analyse wurden 2,5 Mikroliter von zwei Arten von 3DNA®-Reagenzien, mit Cy3 und Cy5 spezifisch markierte Dendrimere, zusammen mit 10 Mikrolitern eines DNA-Hybridisierungspuffers und 1 Mikroliter des Blockierungs-LNA-Oligonukleotids Oligo dT36-LNA13 zu der resuspendierten cDNA gegeben. In einer weiteren Ausführungsform der Mehrkanal-Analyse (mit drei oder mehr Kanälen) wurden 2,5 Mikroliter von drei oder mehr Arten von 3DNA®-Reagenzien, Cy3, Cy5 und ein oder mehrere, die unter Verwendung einer anderen Markereinheit hergestellt waren, zusammen mit 10 Mikrolitern eines DNA-Hybridisierungspuffers und 1 Mikroliter des Blockierungs-LNA-Oligonukleotids Oligo dT36-LNA13 zu der resuspendierten cDNA gegeben.
  • Bei größeren Hybridisierungspuffervolumina kann zusätzlicher DNA-Hybridisierungspuffer auf das erforderliche Endvolumen dazugegeben werden. Es wird angemerkt, dass Hybridisierungspuffervolumina von mehr als 35 Mikrolitern auf zusätzliche 3DNA®-Reagenzien erfordern können.
  • Die DNA-Hybridisierungspuffermischung wurde etwa 15 bis 20 Minuten bei etwa 50°C inkubiert, um eine Vorhybridisierung der cDNA mit den 3DNA®-Reagenzien zu ermöglichen. Die Vorhybridisierungsmischung wurde dann zu dem Mikroarray gegeben und dann über Nacht bei 55°C inkubiert. In diesem Stadium wurde die cDNA mit den Gensonden hybridisiert.
  • Nachhybridisierungswaschung
  • Das Mikroarray wurde kurz gewaschen, um alle überschüssigen Dendrimer-Sonden zu entfernen. Zuerst wurde das Mikroarray 10 Minuten bei 55°C mit 2X SSC-Puffer, 0,2% SDS gewaschen. Dann wurde das Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 2X SSC-Puffer gewaschen. Schließlich wurde das Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,2X SSC-Puffer gewaschen.
  • Signaldetektion
  • Das Mikroarray wurde wie vom Hersteller empfohlen für den Nachweis, die Analyse und den Assay des Hybridisierungsmusters dann abgetastet.
  • BEISPIEL 2
  • Mit Bezug auf 3 wird nachstehend ein Verfahren zum Nachweis und Assay auf einem Mikroarray beschrieben. Dieses Verfahren umfasst die Verwendung einer Spinsäulenanordnung zur Verringerung der Protokollzeit und Zahl der Schritte und zur Erhöhung der Signalstärke.
  • Mikroarray-Herstellung
  • Ein Mikroarray wurde wie vom Hersteller empfohlen oder durch maßgeschneiderte Protokollverfahren hergestellt. Die Nukleinsäuresequenzen, welche die DNA- oder Gensonden umfassten, wurden unter Verwendung bekannter Techniken mit der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert, dann auf Glasobjektträger aufgetüpfelt und gemäß herkömmlichen Verfahren verarbeitet.
  • Herstellung und Konzentration von Target-Nukleinsäuresequenzen oder cDNA
  • Die Target-Nukleinsäuresequenzen oder cDNA wurden aus Gesamt-RNA oder Poly(A)+RNA hergestellt, welche aus einer Probe von Zellen extrahiert war. In einem Mikrozentrifugenröhrchen wurden 0,25 bis 5 Mikrogramm Gesamt-RNA oder 12,5 bis 500 ng Poly(A)+RNA mit 1 Mikroliter Cy3®- oder Cy5®-RT-Primer (5 pMol) und RNase-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern versetzt, was eine RNA-RT-Primermischung lieferte. Die resultierende Mischung wurde gemischt und kurz mikrozentrifugiert, um Inhalt im Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. Der gesammelte Inhalt wurde dann etwa zehn (10) Minuten auf 80°C erwärmt und sofort auf Eis überführt. In einem getrennten Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis wurden 4 Mikroliter 5X RT-Puffer, 1 Mikroliter dNTP-Mischung, 4 Mikroliter RNase-freies Wasser und 1 Mikroliter Reverse-Transkriptase-Enzym (200 Einheiten) vereinigt, was eine Reaktionsmischung lieferte. Die Reaktion wurde beendet, indem man 3,5 Mikroliter 0,5 M NaOH/50 mM EDTA dazugab. Die Mischung wurde zehn (10) Minuten bei 65°C inkubiert, um die DNA/RNA-Hybride zu denaturieren. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 Mikrolitern 1 M Tris-HCl, pH 7,5, zu der Mischung neutralisiert. 71 Mikroliter 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA wurden zu der neutralisierten Reaktionsmischung gegeben. (Die obigen Schritte können wiederholt werden, indem man den 1 Mikroliter Cy3®-RT-Primer (5 pMol) mit 1 Mikroliter Cy5®-RT-Primer (5 pMol) zur Herstellung von Dualkanal-Expressionsassays ersetzte, wobei die hergestellte Cy3®- und Cy5®-cDNA-Mischung mit 42 Mikrolitern 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA zusammenmischte, was eine Reaktionsmischung für die Verarbeitung in den folgenden Schritten lieferte.)
  • cDNA-Reinigung: Entfernung von überschüssigem RT-Primer über eine SC-Spinsäulen-Anordnung
  • Die Spinsäule wurde mehrere Male auf den Kopf gestellt, um das Medium zu resuspendieren und eine gleichmäßige Aufschlämmung in der Säule zu schaffen.
  • Die obere und untere Kappe wurden von der Spinsäule entfernt. Ein Mikrozentrifugenröhrchen wurde erhalten und die untere Spitze des Mikrozentrifugenröhrchens wurde abgeschnitten oder durchstoßen. Ein Ende der Spinsäule wurde in das durchstoßene Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, dann wurde das zerstoßene Mikrozentrifugenröhrchen in ein zweites, intaktes Mikrozentrifugenröhrchen oder ein Sammelröhrchen gegeben. Die zusammengebaute Spinsäule wurde dann in ein 15 ml-Zentrifugenrohr mit dem Mikrozentrifugenröhrchenende zuerst gegeben. Die Spinsäule wurde etwa 3,5 Minuten nach Erreichen der vollen Beschleunigung bei etwa 1000 g zentrifugiert. Die Spinsäule wurde überprüft, um sicherzustellen, dass die Säule nach der Zentrifugation vollständig abgelaufen war und dass das Ende der Spinsäule über dem Flüssigkeitsmeniskus im Sammelröhrchen lag. Das Sammelröhrchen enthielt etwa 2 bis 2,5 ml klaren Puffer, der aus der Spinsäule entleert worden war. Das Harz erschien im Säulenrohr nahezu trocken und gut gepackt, ohne Verzerrungen oder Risse. Wenn das Ende der Spinsäule in den flüssigen Teil eingetaucht gewesen wäre, wäre die Spinsäule verworfen und die obigen Schritte mit einer frischen Spinsäule wiederholt worden. Die Spinsäule war zu diesem Zeitpunkt präpariert, um den überschüssigen RT-Primer in der neutralisierten Reaktionsmischung zu entfernen.
  • Die abgelaufene Spinsäule wurde entfernt und ein neues 1,0 ml-Sammelröhrchen wurde oben auf die Puffer-Sammelröhrchen gegeben, die sich bereits in dem 15 ml-Zentrifugenrohr befanden. Der entleerte Puffer wurde verworfen. Die abgelaufene Spinsäule wurde in das neue Sammelröhrchen gegeben. 100 Mikroliter der neutralisierten Reaktionsmischung, welche die cDNA enthielt, wurden direkt in das Zentrum des Spinsäulenmediums geladen. Die Spinsäulen-Anordnung wurde etwa 2,5 Minuten nach Erreichen der vollen Beschleunigung bei 10.000 × g zentrifugiert. Das Eluat, das in dem neuen Sammelröhrchen gesammelt war, wurde dann gewonnen. Etwa 10% der ursprünglichen Reaktionsmischung wurden zurückgewonnen. Das Eluat umfasste die cDNA-Sonde.
  • 2 Mikroliter einer Träger-Nukleinsäure (10 mg/ml lineares Acrylamid) wurden für eine Ethanolfällung zu dem Eluat gegeben. 250 Mikroliter 2 M Ammoniumacetat wurden zu der Mischung gegeben und gemischt. Dann wurden 875 Mikroliter 100%-iges Ethanol zu der Mischung gegeben. Die resultierende Mischung wurde dreißig (30) Minuten bei –20°C inkubiert. Die Probe wurde bei einer Beschleunigungsgeschwindigkeit von mehr als 10.000 × g fünfzehn (15) Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und 300 Mikroliter 70%-iges Ethanol wurden zu dem Überstand oder dem cDNA-Pellet gegeben. Das cDNA-Pellet wurde dann mit einer Beschleunigungsgeschwindigkeit von mehr als 10.000 × g 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde dann entfernt. Das cDNA-Pellet wurde getrocknet (d. h. 20–30 Minuten bei 65°C).
  • Hybridisierung von cDNA/Dendrimersonden-Mischung mit Mikroarray
  • Der DNA-Hybridisierungspuffer wurde aufgetaut und durch Erwärmen auf 65°C resuspendiert und zehn (10) Minuten bei 65°C gehalten. Der Hybridisierungspuffer umfasste 40% Formamid. Der Puffer wurde durch Auf-den-Kopf-Stellen gemischt, um sicherzustellen, dass die Komponenten gleichmäßig resuspendiert waren. Das Erwärmen und Mischen wurde wiederholt, bis alles Material resuspendiert war. Eine Menge von Konkurrenz-DNA (z. B. COT-1-DNA und PolydA) kann zugesetzt werden, falls erforderlich. Die cDNA wurde in 5,0 Mikrolitern sterilem Wasser resuspendiert.
  • In einer ersten Ausführungsform, einer Einkanal-Analyse, wurden 2,5 Mikroliter einer Art von 3DNA®-Reagens (Genisphere, Inc., Montavale, NJ) (Cy3 oder Cy5) zusammen mit 12,5 Mikrolitern eines DNA-Hybridisierungspuffers (der 40% Formamid enthielt) und 1 Mikroliter des Blockierungs-LNA-Oligonukleotids Oligo dT36-LNA13 zu der resuspendierten cDNA gegeben. In einer alternativen Ausführungsform für eine Dualkanal-Analyse wurden 2,5 Mikroliter von zwei Arten von 3DNA®-Reagenzien, mit Cy3 und Cy5 spezifisch markierte Dendrimere, zusammen mit 10 Mikrolitern eines DNA-Hybridisierungspuffers und 1 Mikroliter des Blockierungs-LNA-Oligonukleotids Oligo dT36-LNA13 zu der resuspendierten cDNA gegeben. In einer weiteren Ausführungsform einer Mehrkanal-Analyse (mit drei oder mehr Kanälen) wurden 2,5 Mikroliter von drei oder mehr Arten von 3DNA®-Reagenzien, Cy3, Cy5 und einem oder mehreren, die unter Verwendung einer anderen Markereinheit hergestellt waren, zusammen mit 10 Mikrolitern eines DNA-Hybridisierungspuffers und 1 Mikroliter des Blockierungs-LNA-Oligonukleotids Oligo dT36-LNA13 zu der resuspendierten cDNA gegeben.
  • Bei größeren Hybridisierungspuffervolumina können zusätzliche Mengen des DNA-Hybridisierungspuffers zugesetzt werden, um das erforderliche Endvolumen zu erreichen. Es wird auch angemerkt, dass Hybridisierungspuffervolumina von mehr als 35 Mikrolitern auch zusätzliche 3DNA®-Reagenzien erfordern können. Die DNA-Hybridisierungspuffermischung wurde etwa 15 bis 20 Minuten bei einer Temperatur von etwa 50°C inkubiert, um die Vorhybridisierung der cDNA mit den 3DNA®-Reagenzien oder Dendrimer-Sonden zu ermöglichen. In diesem Stadium hybridisierten die Dendrimer-Sonden des 3DNA®-Reagens mit der Einfangsequenz auf der cDNA. Nach 20 Minuten wurde dann der DNA-Hybridisierungspuffer auf das Mikroarray gegeben. Das Mikroarray und der DNA-Hybridisierungspuffer wurden bedeckt und über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei einer Temperatur von etwa 55°C inkubiert. In diesem Stadium wurde die cDNA mit den Gensonden hybridisiert.
  • Nachhybridisierungswaschung
  • Das Mikroarray wurde kurz gewaschen, um alle überschüssigen Dendrimer-Sonden zu entfernen. Zuerst wurde das Mikroarray 10 Minuten bei 55°C mit 2X SSC-Puffer gewaschen, der 0,2% SDS enthielt. Dann wurde das Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 2X SSC-Puffer gewaschen. Schließlich wurde das Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,2X SSC-Puffer gewaschen.
  • Signaldetektion
  • Das Mikroarray wurde dann für den Nachweis, die Analyse und den Assay des Hybridisierungsmusters abgetastet, wie vom Hersteller des Scanners empfohlen.
  • BEISPIEL 3
  • Ein alternatives Verfahren zum Nachweis und Assay auf einem Mikroarray
  • Mikroarray-Herstellung
  • Ein Mikroarray wurde wie vom Hersteller empfohlen oder durch maßgeschneiderte Protokollverfahren hergestellt. Die Nukleinsäuresequenzen, welche die DNA- oder Gensonden umfassten, wurden unter Verwendung bekannter Techniken mit der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert, dann auf Glasobjektträger aufgetüpfelt und gemäß herkömmlichen Verfahren verarbeitet.
  • Herstellung und Konzentration von Target-Nukleinsäuresequenzen oder cDNA
  • Die Target-Nukleinsäuresequenzen oder cDNA wurden aus Gesamt-RNA oder Poly(A)+RNA hergestellt, die aus einer Probe von Zellen extrahiert war. In einem Mikrozentrifugenröhrchen wurden 0,25 bis 10 Mikrogramm Gesamt-RNA oder 250 bis 500 ng Poly(A)+RNA mit 1 Mikroliter Cy3®- oder Cy5®-RT-Primer (5 pMol) und RNase-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern versetzt, was eine RNA-RT-Primermischung lieferte. Die resultierende Mischung wurde gemisch t und kurz mikrozentrifugiert, um Inhalt im Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. Der gesammelte Inhalt wurde dann etwa zehn (10) Minuten erwärmt und sofort auf Eis überführt. In einem getrennten Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis wurden 4 Mikroliter 5X RT-Puffer, 1 Mikroliter dNTP-Mischung, 4 Mikroliter RNAse-freies Wasser und 1 Mikroliter Reverse-Transkriptase-Enzym (200 Einheiten) vereinigt, was eine Reaktionsmischung lieferte. Die Reaktionsmischung wurde sanft gemischt und kurz mikrozentrifugiert, um Inhalt im Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu sammeln. 10 Mikroliter der RNA-RT-Primermischung und 10 Mikroliter der Reaktionsmischung wurden zusammengemischt und 2 Stunden bei 42°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3,5 Mikrolitern 0,5 M NaOH/50 mM EDTA beendet. Die Mischung wurde zehn (10) Minuten bei 65°C inkubiert, um die DNA/RNA-Hybride zu denaturieren. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 Mikrolitern 1 M Tris-HCl, pH 7,5, zu der Mischung neutralisiert. 71 Mikroliter 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA wurden zu der neutralisierten Reaktionsmischung gegeben.
  • cDNA-Reiniqung: Entfernung von überschüssigem RT-Primer über eine SC-Spinsäulen-Anordnung
  • Die Spinsäule wurde mehrere Male umgekehrt, um das Medium zu resuspendieren und eine gleichmäßige Aufschlämmung in der Säule zu schaffen. Die obere und untere Kappe wurden von der Spinsäule entfernt. Ein Mikrozentrifugenröhrchen wurde erhalten und die untere Spitze des Mikrozentrifugenröhrchens wurde abgeschnitten oder durchstoßen. Ein Ende der Spinsäule wurde in das durchstoßene Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, dann wurde das durchstoßene Mikrozentrifugenröhrchen in ein zweites, intaktes Mikrozentrifugenröhrchen oder Sammelröhrchen gegeben. Die zusammengebaute Spinsäule wurde dann in ein 15 ml-Zentrifugenrohr mit dem Mikrozentrifugenröhrchenende zuerst gegeben. Die Spinsäule wurde etwa 3,5 Minuten nach Erreichen der vollen Beschleunigung bei etwa 1000 g zentrifugiert. Die Spinsäule wurde überprüft, um sicherzustellen, dass die Säule vollständig nach der Zentrifugation abgelaufen war und dass das Ende der Spinsäule über dem Flüssigkeitsmeniskus im Sammelröhrchen lag. Das Sammelröhrchen enthielt 2 bis 2,5 ml klaren Puffer, der aus der Spinsäule entleert worden war. Das Harz im Säulenzylinder erschien nahezu trocken und gut gepackt ohne Verzerrungen oder Risse. Wenn das Ende der Spinsäule in den flüssigen Teil eingetaucht gewesen wäre, wäre die Spinsäule verworfen worden und die obigen Schritte mit einer frischen Spinsäule wiederholt worden. Die Spinsäule wurde hergestellt, um den überschüssigen RT-Primer in der neutralisierten Reaktionsmischung zu entfernen.
  • Die abgelaufene Spinsäule wurde entfernt und ein neues 1,0 ml-Sammelröhrchen wurde oben auf die Puffer-Sammelröhrchen gegeben, die bereits in dem 15 ml-Zentrifugenrohr waren. Der entleerte Puffer wurde verworfen. Die abgelaufene Spinsäule wurde in das neue Sammelröhrchen gegeben. 100 Mikroliter der neutralisierten Reaktionsmischung, welche die cDNA enthielt, wurden direkt in das Zentrum des Spinsäulenmediums geladen. Die Spinsäulenanordnung wurde etwa 2,5 Minuten nach Erreichen der vollen Beschleunigung bei 10.000 × g zentrifugiert. Das Eluat, das in dem neuen Sammelröhrchen gesammelt war, wurde dann gewonnen. Etwa 10% der ursprünglichen Reaktionsmischung wurden zurückgewonnen. Das Eluat umfasste die cDNA-Sonde.
  • Hybridisierung von cDNA/Dendrimersonden-Mischung mit Mikroarray
  • Der DNA-Hybridisierungspuffer wurde aufgetaut und durch Erwärmen auf 65°C resuspendiert und zehn (10) Minuten bei 65°C gehalten. Der Hybridisierungspuffer umfasste 40% Formamid. Der Puffer wurde durch Auf-den-Kopf-Stellen gemischt, um sicherzustellen, dass die Komponenten gleichmäßig resuspendiert waren. Das Erwärmen und Mischen wurde wiederholt, bis das ganze Material resuspendiert war. Eine Menge von Konkurrenz-DNA (z. B. COT-1-DNA und PolydA) kann dazugegeben werden, falls erforderlich. Die cDNA wurde in 5,0 Mikrolitern sterilem Wasser resuspendiert. In einer ersten Ausführungsform, einer Einkanal-Analyse, wurden 2,5 Mikroliter einer Art 3DNA®-Reagens (Genisphere, Inc., Montvale, NJ) (Cy3 oder Cy5) zusammen mit 12,5 Mikrolitern eines DNA-Hybridisierungspuffers (der 40% Formamid enthielt) und 1 Mikroliter des Blockierungs-LNA-Oligonukleotids Oligo dT36-LNA13 zu der resuspendierten cDNA gegeben. In einer alternativen Ausführungsform für eine Dualkanal-Analyse wurden 2,5 Mikroliter von zwei Arten von 3DNA®-Reagenzien, mit Cy3 und Cy5 spezifisch markierte Dendrimere, zusammen mit 10 Mikrolitern eines DNA-Hybridisierungspuffers und 1 Mikroliter des Blockierungs-LNA-Oligonukleotids Oligo dT36-LNA13 zu der resuspendierten cDNA gegeben. In einer weiteren Ausführungsform einer Mehrkanal-Analyse (mit drei oder mehr Kanälen) wurden 2,5 Mikroliter von drei oder mehr Arten von 3DNA®-Reagenzien, Cy3, Cy5 und einem oder mehrerem, die unter Verwendung einer anderen Markereinheit hergestellt waren, zusammen mit 10 Mikrolitern eines DNA-Hybridisierungspuffers und 1 Mikroliter des Blockierungs-LNA-Oligonukleotids Oligo dT36-LNA13 zu der resuspendierten cDNA gegeben.
  • Bei größeren Hybridisierungspuffervolumina können zusätzliche Mengen des DNA-Hybridisierungspuffers zugesetzt werden, um das erforderliche Endvolumen zu erreichen. Es wird auch angemerkt, dass Hybridisierungspuffervolumina von mehr als 35 Mikrolitern auch zusätzliche 3DNA®-Reagenzien erfordern können. Die DNA-Hybridisierungspuffermischung wurde etwa 15 bis 20 Minuten bei einer Temperatur von 50°C inkubiert, um die Vorhybridisierung der cDNA mit dem 3DNA®-Reagenzien oder Dendrimer-Sonden zu ermöglichen. In diesem Stadium hybridisierten die Dendrimer-Sonden des 3DNA®-Reagens mit der Einfangsequenz auf der cDNA. Nach 20 Minuten wurde dann der DNA-Hybridisierungspuffer zu dem Mikroarray gegeben. Das Mikroarray und der DNA-Hybridisierungspuffer wurden bedeckt und über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei einer Temperatur von etwa 55°C inkubiert. In diesem Stadium wurde die cDNA an die Gensonden hybridisiert.
  • Nachhybridisierungswaschung
  • Das Mikroarray wurde kurz gewaschen, um alle überschüssigen Dendrimer-Sonden zu entfernen. Zuerst wurde das Mikroarray 10 Minuten bei 55°C mit 0,2% SDS enthaltendem 2X SSC-Puffer gewaschen. Dann wurde das Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 2X SSC-Puffer gewaschen. Schließlich wurde das Mikroarray 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,2X SSC-Puffer gewaschen.
  • Signaldetektion
  • Das Mikroarray wurde dann für den Nachweis, die Analyse und den Assay des Hybridisierungsmusters abgetastet, wie vom Hersteller des Scanners empfohlen.
  • BEISPIEL 4
  • Verfahren zum Nachweis und Assay auf einem Mikroarray unter Verwendung eines Nachweiskits für cDNA-Arrays
  • Kitinhalt:
    Fläschchen 1 Cy3®3DNA®-Reagens (Genisphere, Montvale, NJ). Man verwendet 2,5 Mikroliter pro 20 Mikroliter Assay.
    Fläschchen 2 Hybridisierungspuffer – 0,25 M NaPO4, 4,5% SDS, 1 mM EDTA und 1X SSC. (Aufbewahrt bei –20°C im Dunkeln.)
    Fläschchen 3 Oligo dT36 LNA-13-Blockierungsreagens, 75–125 ng/μl.
  • Mikroarray-Herstellung:
  • Ein Mikroarray wurde wie vom Hersteller empfohlen oder durch maßgeschneiderte Protokollverfahren hergestellt. Die Nukleinsäuresequenzen, welche die DNA- oder Gensonden umfassten, wurden unter Verwendung bekannter Techniken mit der Polymeraseketten-Reaktion amplifiziert, dann auf Glasobjektträger getüpfelt und gemäß herkömmlichen Verfahren verarbeitet.
  • 3DNA®-Hybridisierung:
  • Der Hybridisierungspuffer von Fläschchen 2 wurde aufgetaut und durch Erwärmen auf 65°C über 10 Minuten resuspendiert. Der Puffer wurde durch Auf-den-Kopf-Stellen gemischt, um sicherzustellen, dass die Komponenten gleichmäßig resuspendiert waren. Falls erforderlich, wurde das Erwärmen und Mischen wiederholt, bis alle Komponenten resuspendiert waren. 2,5 Mikroliter des 3DNA®-Reagens von Fläschchen 1 wurden zu 17,5 Mikrolitern Hybridisierungspuffer gegeben, was eine Hybridisierungsmischung lieferte. 1 Mikroliter des Blockierungs-LNA-Oligonukleotids Oligo dT36-LNA13 wird ebenfalls zu der Hybridisierungsmischung gegeben. Die Hybridisierungsmischung wurde zu dem Mikroarray gegeben. Der Mikroarray wurde bedeckt und bei einer Temperatur von etwa 37 bis 42°C etwa 6 Stunden bis über Nacht in einer befeuchteten Kammer inkubiert.
  • Nachhybridisierungswaschung:
  • Das Mikroarray wurde 10 Minuten bei 42°C mit 0,2% SDS enthaltendem 2X SSC-Puffer gewaschen. Das Mikroarray wurde dann 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 2X SSC-Puffer gewaschen. Das Mikroarray wurde dann bei Raumtemperatur mit 0,2X SSC-Puffer gewaschen.
  • Signaldetektion:
  • Das Mikroarray wurde dann zum Nachweis, zur Analyse und zum Assay des Hybridisierungsmusters abgetastet, wie vom Hersteller des Scanners empfohlen.
  • BEISPIEL 5
  • Verfahren zum Nachweis und Assay auf einem Mikroarray unter Verwendung von LNA-Blockern und direkter Einverleibung von Marker
  • In einem Mikrozentrifugenröhrchen wurden 500 ng Oligo(dT)-Primer mit 20 μg Gesamt-RNA (Maushirn oder Mausleber) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vereinigt. Das Volumen wurde mit Nuklease-freiem Wasser auf 21 μl eingestellt. Die Probe wurde 10 Minuten bei 75–80°C inkubiert, dann sofort 1–2 Minuten auf Eis gegeben. Reverse-Transkriptionsreaktions-Komponenten wurden zu der Gesamt-RNA und dem Primer, wie nachstehend aufgeführt, auf ein Gesamtreaktionsvolumen von 40 μl gegeben:
    8 μl 5X Erststrangpuffer (Invitrogen, mit dem Enzym geliefert)
    4 μl 0,1 M DTT (Invitrogen, mit dem Enzym geliefert)
    2 μl dNTP-Mischung (10 mM dATP, dTTP, dGTP und 2 mM dCTP)
    2 μl von mit Cy3 oder Cy5 modifiziertem dCTP (Amersham)
    1 μl Superase-In (Ambion)
    2 μl Superscript II-RT-Enzym (Invitrogen)
  • Das Röhrchen wurde sanft gemischt und mikrozentrifugiert, um den Inhalt zum Boden des Röhrchens hinunter zu zentrifugieren. Die Reaktion wurde 90 Minuten bei 42°C inkubiert. Die Reaktion stoppte durch Zugabe von 7 μl 0,5 M NaOH/50 mM EDTA und 10-minütiges Inkubieren der Probe bei 65°C. 10 Mikroliter 1 M Tris-HCl wurden zu der neutralisierten Mischung gegeben. Die resultierende cDNA wurde unter Verwendung des Qiagen QIAquick PCR-Reinigungskits gereinigt, wie vom Hersteller empfohlen, und durch Ethanolfällung konzentriert. Das getrocknete cDNA-Pellet wurde in 19,5 μl Wasser resuspendiert. 2 Mikroliter LNATMdt-Blocker (25 ng/μl), 1 μl Human-COT-1-DNA (1 μg/μl), und 22,5 μl Hybridisierungspuffer auf 2X SDS-Basis wurden auf ein Gesamtvolumen von 45 μl dazugegeben. Die Probe wurde gründlich gemischt und 15 Minuten bei 80°C unter gelegentlichem Mischen inkubiert. Die Probe wurde auf ein vorerwärmtes Mikroarray pipettiert und ein 24 × 60 mm Abdeckglas wurde auf die Oberfläche gegeben. Das Array wurde über Nacht bei 65°C in einer befeuchteten Hybridisierungskammer inkubiert.
  • Das Array wurde aus der Hybridisierungskammer entfernt und in 2X SSC, 0,2% SDS eingetaucht, um zu ermöglichen, dass das Deckglas von der Array-Oberfläche wegschwamm. Das Array wurden wie nachstehend angegeben gewaschen, wobei das Array von einem Puffer zum nächsten überführt wurde.
    2X SSC, 0,2% SDS für 15 Minuten bei 65°C,
    2X SSC für 10 Minuten bei Raumtemperatur,
    0,2X SSC für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
  • Das Array wurde in ein trockenes 50 ml-Zentrifugenrohr überführt und 2 Minuten bei 800–1000 U/min zentrifugiert, um die Scheibe zu trocknen. Das Array wurde aus dem Zentrifugenrohr entfernt und abgetastet, um die Daten zu erzeugen.
  • Obwohl die vorliegende Anmeldung mehrere bevorzugte Ausführungsformen erörtert hat, können weitere Ausführungsformen verwendet werden, die vollständig in Einklang mit der Erfindung stehen. Zum Beispiel kann, wie oben erörtert, in verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung LNA als Blockierungsmittel allgemein in Mikroarray-Anwendungen mit oder ohne Verwendung von Dendrimeren verwendet werden. In noch weiteren Ausführungsformen kann LNA als Blockierungsmittel auch in Nicht-Mikroarray-Anwendungen verwendet werden. Mit anderen Worten können LNA-Reagenzien im Einklang mit der Erfindung in jeder gewünschten Anwendung verwendet werden, um unspezifische Hybridisierung während der Hybridisierung von cDNA und anderen Nukleinsäuren mit komplementären Sonden zu verringern.
  • Weiter werden in den bevorzugten Ausführungsformen Locked Nucleic Acid-Nukleotide dem Oligonukleotid einverleibt, um eine größere thermische Stabilität zu verleihen, wie durch Tm quantitativ gemessen, und so die Nützlichkeit des Reagens als Blocker zu verbessern. Typisch erhöht die Hinzufügung jedes LNA-Nukleotids den Tm des Oligonukleotids um etwa 3–5°C, abhängig von dem substituierten Nukleotid oder der Position der Anordnung. Jedoch sollte, obwohl es wünschenswert ist, ein LNA als Nukleotid der Wahl zu verwenden, um den Tm zu erhöhen, verstanden werden, dass alternative Nukleotide in dem Oligonukleotid substituiert werden können, um ähnliche Vorteile zu liefern. Zum Beispiel können andere Nukleotide, bei denen die Standard-Nukleotidstruktur modifiziert worden ist (d. h. "modifizierte Nukleotide"), verwendet werden. Es wird bevorzugt, dass jegliche anderen gewählten derartigen Substitutionsnukleotide oder modifizierten Nukleotide Nukleotide sind, die gleichermaßen den Tm des Oligonukleotids gegenüber der gleichen Nukleotidsequenz mit "unmodifizierten Nukleotiden" (d. h. mit Standard-DNA- oder RNA-Basen) erhöhen, wobei die Tm-Erhöhung bevorzugt mindestens 3–5°C beträgt. Zusätzlich zu jeglichen Nukleotiden, die derzeit in der Technik erhältlich sind, werden weitere derartige Nukleotide in Zukunft erhältlich, wenn die organische chemische Synthese weiter fortschreitet. Der Einsatz dieser Nukleotide anstelle der hierin verwendeten LNA kann im Einklang mit der vorliegenden Erfindung für eine ähnliche vorteilhafte Blockierungswirkung verwendet werden.
  • Die vorangehende Erörterung offenbart und beschreibt deshalb lediglich beispielhafte und bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Der Fachmann erkennt aus dieser Erörterung und aus den begleitenden Zeichnungen, Ansprüchen und Beispielen leicht, dass vielfältige Änderungen, Modifikationen und Abwandlungen vorgenommen werden können.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00470001
  • Figure 00480001

Claims (14)

  1. Verfahren, umfassend: 1) Auftragen einer Probe auf ein Mikroarray, wobei das Mikroarray eine Mehrzahl von Merkmalen umfasst, wobei die Merkmale Sonden-Nucleotidsequenzen umfassen, wobei die Probe Ziel-Moleküle zum Binden an irgendeine der Sonden-Nucleotidsequenzen auf dem Mikroarray umfasst, die komplementär zu den Ziel-Molekülen sind; und 2) Zugabe eines LNA-Reagens als Blockierungsmittel, um nicht-spezifische Bindung zwischen den Ziel- und Sondenmolekülen zu verringern, wobei das LNA-Reagens ein Oligonucleotid ist, das mindestens einen Locked Nucleic Acid-Rest enthält, wobei die Locked Nucleic Acid-Reste modifizierte bicyclische monomere Einheiten mit einer 2'-O-4'-C-Methylenbrücke sind, wobei das LNA-Reagens eine Sequenz einschließt, die komplementär zu einer Sonden- oder Zielsequenz ist, welche unerwünschte nicht-spezifische Bindungswechselwirkungen zur Folge haben könnte.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem Ziel-Moleküle einen Marker zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals umfassen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in dem die Ziel-Moleküle cDNA-Moleküle sind, und das weiter die folgenden Schritte in der folgenden Reihenfolge umfasst: (a) Auftragen der cDNA-Moleküle auf das Mikroarray; (b) Waschen des Mikroarrays, um jene cDNA-Moleküle zu entfernen, die nicht mit dem Mikroarray hybridisiert haben; und (c) Auftragen von Dendrimer-Molekülen auf das Mikroarray zur Hybridisierung jener cDNA-Moleküle, die mit den Sonden-Nucleotidsequenzen hybridisiert haben.
  4. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche 1–3, in dem das LNA-Reagens vor dem Auftragen der Ziel-Moleküle auf das Mikroarray mit dem Mikroarray hybridisiert wird.
  5. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche 1–3, in dem die Ziel-Moleküle mit dem LNA-Reagens hybridisiert werden und in dem die Ziel-Moleküle, die an das LNA-Reagens hybridisiert sind, anschließend auf das Mikroarray aufgetragen werden.
  6. Verfahren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: 1) In-Kontakt-Bringen eines Mikroarrays, das eine Mehrzahl von Merkmalen umfasst, wobei die Merkmale einen ersten Satz von Nucleotidsequenzen umfassen, mit einer Mischung, welche umfasst: a) eine erste Komponente, die ein cDNA-Reagens umfasst, das aus mRNA einer Ziel-Probe erhalten wurde, wobei die cDNA eine Einfangsequenz hat; b) eine zweite Komponente, die ein Dendrimer mit mindestens einem ersten Arm, der einen Marker zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals enthält, und mindestens einem zweiten Arm mit einer zweiten Nucleotidsequenz umfasst, die komplementär zu der Einfangsequenz ist; und c) eine dritte Komponente, die ein synthetisches DNA-Oligonucleotid umfasst, das Reste von LNA (Locked Nucleic Acid – modifizierte bicyclische monomere Einheiten mit einer 2'-O-4'-C-Methylenbrücke) enthält, zur Verwendung als Blockierungsreagens auf dem Mikroarray, wobei das LNA-Reagens eine Sequenz einschließt, die komplementär zu einer Sonden- oder Zielsequenz ist, welche unerwünschte nicht-spezifische Bindungswechselwirkungen zur Folge haben könnte.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, weiter umfassend den Schritt des Mischens der ersten Komponente und der zweiten Komponente bei einer Temperatur und über eine ausreichende Zeit, um zu ermöglichen, dass die erste Komponente an die zweite Komponente bindet.
  8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, weiter umfassend den Schritt des Inkubierens der Mischung mit dem Mikroarray, um zu ermöglichen, dass die erste Nucleotidsequenz an die erste Komponente bindet, wobei eine derartige Bindung das Merkmal zum Ergebnis hat, das das nachweisbare Signal emittiert.
  9. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche 6–8, weiter umfassend den Schritt der Bildung der ersten Komponente, welche das cDNA-Reagens umfasst, durch In-Kontakt-Bringen der Ziel-Proben-mRNA mit einer Menge eines RT-Primers mit der Einfangsequenz, einer reversiblen Transkriptase und von Nucleotid unter ausreichenden Bedingungen, um die reverse Transkription der mRNA in das cDNA-Reagens zu initiieren.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, weiter umfassend den Schritt der Reinigung von überschüssigem, nicht-hybridisiertem RT-Primer aus der ersten Komponente vor Inkubieren der Mischung.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, in dem der Reinigungsschritt weiter den Schritt des Durchleitens der ersten Komponente durch ein Spinsäulen-Medium umfasst.
  12. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche 6 bis 11, weiter umfassend das Scannen des Mikroarrays zum Nachweisen eines Signals aus dem Marker.
  13. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche 6–12, weiter umfassend den Schritt des Waschens des Mikroarrays, um Dendrimere abzuspülen, die nach der Inkubation des Mikroarrays und der Mischung nicht an dem Mikroarray angebracht sind.
  14. Verfahren für einen Nachweis und Assay auf einem Mikroarray, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: 1) Inkubieren einer Mischung, welche einschließt: a) eine erste Komponente, die ein cDNA-Reagens umfasst, das aus mRNA aus einer Ziel-Probe erhalten wurde, wobei die cDNA eine Einfangsequenz aufweist; und b) eine zweite Komponente, die ein Dendrimer mit mindestens einem ersten Arm, der einen Marker zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals enthält, und mindestens einem zweiten Arm mit einer zweiten Nucleotidsequenz aufweist, welche komplementär zu der Einfangsequenz ist, wobei die Mischung bei einer ersten Temperatur und über eine ausreichende Zeit inkubiert wird, um zu induzieren, dass die erste Komponente an die zweite Komponente bindet und einen vorhybridisierten cDNA-Dendrimer-Komplex bildet; 2) In-Kontakt-Bringen eines Mikroarrays mit der Mischung, wobei das Mikroarray eine Mehrzahl von Merkmalen umfasst, wobei die Merkmale einen ersten Satz von Nucleotidsequenzen umfassen, 3) In-Kontakt-Bringen des Mikroarrays mit einem Reagens, das Locked Nucleic Acid (LNA) umfasst, um nicht-spezifische Bindung des cDNA-Reagens an die Merkmale des Mikroarrays zu verringern; und 4) Inkubieren des Mikroarrays und des vorhybridisierten cDNA-Dendrimer-Komplexes bei einer zweiten Temperatur und über eine ausreichende Zeit, um zu induzieren, dass der vorhybridisierte cDNA-Dendrimer-Komplex irgendeinen Teil des Satzes von ersten Nucleotidsequenzen bindet, welche komplementär zu irgendwelchen Sequenzen des cDNA-Reagens sind, wobei eine derartige Bindung zur Folge hat, dass das Merkmal das nachweisbare Signal emittiert, so dass ein Hybridisierungsmuster auf dem Mikroarray erzeugt wird, wobei das LNA-Reagens eine Sequenz einschließt, die komplementär zu einer Proben- oder einer Ziel-Sequenz ist, welche unerwünschte nicht-spezifische Bindungswechselwirkungen zur Folge haben könnte.
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