DE102007018833A1

DE102007018833A1 - Verbesserte molekularbiologische Prozessanlage

Info

Publication number: DE102007018833A1
Application number: DE102007018833A
Authority: DE
Inventors: Peer STÄHLER; Cord STÄHLER; Markus Dr. Beier; Daniel Dr. Summerer; Mark Dr. Matzas; Sonja Dr. Vorwerk
Original assignee: Febit Holding GmbH
Current assignee: Febit Holding GmbH
Priority date: 2007-04-20
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2008-10-23

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine verbesserte molekularbiologische Prozessanlage sowie ein verbessertes Verfahren zur Prozessierung biologischer Proben. Die Erfindung kombiniert die Bereitstellung biologisch funktionaler Moleküle wie Nukleinsäuren und Peptide sowie von Derivaten oder Analoga dieser beiden Molekülklassen in miniaturisierten Flusszellen mit der seriellen Zugabe von Reagenzien oder Fluiden und dient der Bearbeitung von biologischen Proben, wie Proteinen, Nukleinsäuren, biogener kleiner Moleküle wie z. B. Metaboliten, Viren oder Zellen, die dazu in die miniaturisierten Flusszellen eingebracht werden. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf Verfahren und auf die Verwendung der erfindungsgemäßen molekularbiologischen Prozessanlage zum Nachweis oder/und zur Isolierung von Nukleinsäuren; zur Sequenzierung; zur Punktmutationsanalyse; zur Analyse von Genomen und/oder Chromosomen; zur Herstellung synthetischer Nukleinsäuren; zur Herstellung von Arrays von Primern, Sonden und/oder Antisense-Molekülen sowie weiterer analytischer und synthetischer Verfahren.

Description

1 Einleitung
Für ein umfassendes Verständnis der Molekularbiologie des Menschen und anderer Lebewesen ist die Kenntnis der Zahl, Art und der Interaktionen aller seiner Gene und Genprodukte untereinander sowie mit der Umwelt notwendig. Hierzu bedarf es Analysemethoden, die Informationen über die lokale Konzentration von Genen sowie ihrer kodierten funktionalen Biomoleküle (RNA, Proteine) aber auch anderer Stoffklassen, die aus der Aktivität von Genen resultieren (z. B. Produkte enzymatischer Reaktionen wie bestimmte Metabolite) zu einem gegebenen Zeitpunkt in einem Organismus unter bestimmten Bedingungen liefern. Die gesamte Information für die Funktionsweise eines Lebewesens ist in seiner DNA kodiert. Diese kodiert wiederum für RNA, welche für Proteine kodieren kann. DNA und RNA lassen sich durch ihre Stabilität und Paarungseigenschaften relativ leicht untersuchen, weshalb gegenwärtige Analysemethoden insbesondere auf diese beiden Molekülklassen abzielen. Hierbei liegt der Fokus auf der Untersuchung der DNA-Sequenz verschiedener Organismen sowie verschiedener Individuen einer Spezies und ihr Vergleich untereinander (z. B. Genomsequenzierungen, Gentypisierungen durch Analyse von Orten hoher genetischer Variabilität wie „single nucleotide polymorphisms", Evolutionsbiologie, Taxonomie). Eine weitere wichtige Analysemethode ist die Charakterisierung der Art und Konzentration von mRNA (Expression Profiling) um Aussagen über die Aktivität von Genen unter bestimmten Bedingungen treffen zu können. Solche Methoden haben in den letzten Jahren zu einer Fülle neuer Erkenntnisse geführt.
So gilt nach aktuellem Stand der Forschung das menschliche Genom sowie die Genome einiger weiterer komplexer Lebewesen wie der Maus und einer Vielzahl an kleinen Organismen, Viren, Bakterien etc. als von der Sequenz her aufgeklärt. Die Aufklärung der Funktion unseres und aller anderen Genome steht jedoch noch ganz am Anfang. Bei der Sequenzierung hat sich herausgestellt, dass der Mensch viel weniger Gene besitzt als zunächst angenommen, und der Vergleich der sequenzierten Organismen hat gezeigt, dass die Anzahl der Gene und damit die Anzahl der Proteine nicht mit der Komplexität eines Organismus korreliert. Und auch die Unterschiede in den Genen sind minimal. So liegen die Unterschiede zwischen den Genen von zwei Menschen im Promillebereich und der Unterschied zwischen Mensch und Affe gerade mal im unteren, einstelligen Prozentbereich. Ein sehr kleiner genotypischer Unterschied im Vergleich zum offensichtlich großen Unterschied beim Phänotyp.
Im März 2005 Heft des „Spektrum der Wissenschaft" beschreibt der Autor John S. Mattick von der Universität in Queensland, Australien, in seinem Beitrag „Das verkannte Genom-Programm" ein alternatives bzw. erweitertes Modell für die Funktionsweise der DNA. Die gängige Lehrmeinung sieht in der DNA nur die Bauanleitung für Proteine, und per Definition kodiert ein Gen für jeweils ein Protein. Für primitive Organismen ist das auch so noch weitgehend gültig, aber für komplexe Organismen, allen voran der Mensch, hat sich beim Sequenzieren herausgestellt, das nur 1,5% der menschlichen DNA für Proteine kodiert und diese Abschnitte, die so genannten Exons, nicht zusammenhängend auf der DNA angeordnet sind. Zwischen den Exons liegen die Introns, welche zusammen mit den Exons etwa 60% der menschlichen DNA ausmachen. Heute wird deshalb als menschliches Gen ein Bereich auf der DNA zwischen einem Start- und einem Stopp-Kodon definiert, innerhalb dessen mehrere Exons liegen, welche für ein oder mehrere ähnliche Proteine kodieren. Daraus geht hervor, dass die menschlichen Gene in gewisser Weise jeweils einen Modulbaukasten für verschiedene, aber verwandte Proteine darstellen. Damit kann der Mensch mit etwa 25.000 Genen etwa 100.000 Proteine erzeugen.
Die Introns sowie die restliche, nicht-kodierende DNA werden nach diesem Modell als Junk-DNA oder genetischer Abfall angesehen. Insgesamt hätten so 98,5% des Genoms des Menschen keine oder keine wesentliche Bedeutung, und die große Menge wird mit der langen Dauer der Evolution erklärt. Genau hier setzt Mattick an und postuliert, dass zumindest die Introns, ggf. die gesamte nicht für Proteine kodierende DNA, die Information zur Nutzung der Gene enthält. Introns kodieren demnach für eine große Vielzahl an unterschiedlich langen RNAs. Tatsächlich sind mittlerweile eine Vielzahl an regulatorischen RNAs entdeckt worden (z. B. microRNAs), die außerhalb der Exons kodiert werden.
In ebenfalls großem Maße werden momentan Erkenntnisse über die komplexen regulatorischen Netzwerke von Genen auf Proteinebene gewonnen. Hierbei stehen insbesondere Mechanismen im Vordergrund, die auf unterschiedlichen posttranslationalen Proteinmodifikationen beruhen, die auf Nukleinsäureebene nicht nachweisbar sind.
All diese Erkenntnisse eröffnen eine Vielzahl neuer Forschungsfelder und erfordern neue flexible Analysemethoden, die dem hohen Durchsatz und dem rapiden Wandel an Erkenntnissen auf diesen Gebieten Rechnung tragen. Hierbei kann es insbesondere auch von großem Nutzen sein, Methoden zu entwickeln, die es erlauben, eine große Zahl von Biomolekülen parallel zu erzeugen und auf bestimmte Eigenschaften im Hochdurchsatz zu untersuchen.
2 Stand der Technik
Methoden zur Untersuchung von biologischen Proben beruhen häufig auf chemischen oder biochemischen Manipulationen der Probe gekoppelt mit physikalischen Methoden zur Analyse. Dem Fachmann sind z. B. folgende Verfahren bekannt:
2.1 Kapillarelektrophorese (CE)
Die vorherrschende Methode zur Sequenzerkennung ist die Kapillarelektrophorese (engl.: capillary electrophoresis, CE). An mit speziellem Gel gefüllte Kapillaren wird Strom angelegt, wodurch geladene Moleküle zur Bewegung angeregt werden. Kleinere Moleküle kommen schneller als große durch das Netz des Gels. Gibt man einen Cocktail an unterschiedlich großen Molekülen in eine CE, so verlassen diese die Kapillare nach ihrer Größe sortiert. Für die Sequenzierung der geladenen DNA wird dieses Verfahren in Zusammenhang mit einem enzymatischen Assay verwendet. Dieser Probenvorbereitungsassay erzeugt ausgehend von einem Ende der zu sequenzierenden DNA die jeweilige Abschrift durch eine Primerverlängerung. Dabei wird an jeder kopierten Nukleotidposition ein kleiner Anteil von Nukleotidanaloga eingebaut, die Kettenabbruch verursachen und ein jeweils nukleotidspezifisches Fluorophor enthalten. Je nachdem, mit welcher der 4 Basen der jeweilige Abschnitt endet, ist dadurch durch Länge und Farbe des entstandenen Moleküls die Identität einer Base an einer Position analysiert. Die Farben werden bei Austritt aus der Kapillare optisch erfasst und die Signale per Computer verarbeitet und zu einer Sequenz zusammengesetzt.
Dieses Verfahren ist weitgehend automatisiert. Die größten Geräte vom Marktführer Applied Biosystems aus den USA haben bis zu 96 parallele Kapillaren mit einer Leseleistung von 650 Basen pro Messung und Kapillare und damit bis zu 1,5 Mio. Basen pro Gerät und Tag (24 h). Die maximale Länge, die auf einmal pro Kapillare gelesen werden kann, liegt allerdings bei etwa 400 Basen, was den Durchsatz pro Tag auf etwa 1 Mio. Basen pro Gerät reduziert.
Das Verfahren ist ausgereift und breit etabliert. Die hohen Kosten machen einen Einsatz aber nur bei der erstmaligen Sequenzierung und zur Kontrolle einer moderaten Anzahl an Proben im Re-Sequencing und Genotyping wirtschaftlich sinnvoll. Um weniger wichtige Organismen oder größere Gruppen oder gar individuelle Patienten sequenzieren zu können, bedarf es einer erheblichen Kostenreduktion.
2.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die PCR und verwandte Verfahren nutzen besonders temperaturstabile Enzyme, welche der Natur entnommen wurden, um die DNA oder auch RNA vergleichbar den Prozessen in einer Zelle zu vermehren. Dies ist notwendig, da in den meisten Fällen die DNA/RNA in der zu messenden Probe in so niedriger Konzentration vorliegt, dass die meisten Messmethoden diese nicht detektieren können. Das PCR-Verfahren ist eine „one potreaction", bei der zyklisch die Temperatur variiert wird: Vom Denaturierungsschritt bis nahe an 100°C, Anlagerungsschritten bei ca. 50°C bis 65°C bis zu enzymatischen Schritten mit ca. 72°C. Das Ergebnis ist je nach Assay eine lineare oder auch exponentielle Vervielfältigung der Sequenz zwischen zwei geeignet gewählten Primern, Oligonukleotiden mit der Komplementärsequenz zum Bereich, an welchem sie sich anlagern, und die die Enzymreaktion damit ermöglichen. Durch die Auswahl der Primersequenzen lässt sich der Bereich festlegen, welcher vervielfältigt, sprich amplifiziert, wird. Dies wird neben der Probenvorbereitung für andere Detektionsverfahren, wie z. B. DNA-Arrays, aber auch direkt für die Detektion verwendet. Bei der Nutzung der PCR als Analysemethode (direkte Detektion) wird das Produkt einer Amplifikation eingefärbt und detektiert. Alleine das Vorhandensein einer oder mehrerer erfolgreicher Amplifikationen in einem bestimmten Ausgangsmaterial erlaubt eine Erkennung. Das Verfahren ist weit etabliert und anerkannt und liefert insbesondere in kalibrierter Form als quantitative PCR zuverlässige Ergebnisse. Das PCR-Verfahren hat jedoch zwei wesentliche Schwachpunkte. Der eine sind die relativ hohen Kosten für ein Primerpaar. Dieser Nachteil reduziert sich, wenn man ein Primerset für mehrere Reaktionen nutzt. Eine Faustformel sind hier 100 Reaktionen mit einem Set. Der zweite Nachteil, insbesondere bei weniger gut verstandenen oder komplexen Analysen liegt darin, dass man keinerlei Information über die Sequenz zwischen den beiden Primern erhält. Somit kann auch eine beliebige andere Sequenz vervielfältigt worden sein, welche die beiden Primersequenzen enthält und die nahe genug beieinander liegen, so dass eine Überlappung stattfinden konnte. Dieser Nachteil wird bei der Verwendung der PCR als Analyseverfahren durch mehrere Primersets adressiert. Die Wahrscheinlichkeit, dass gleich mehrere sehr unterschiedliche Primer in unbekanntem Material erfolgreich amplifizieren ist statistisch gesehen entsprechend niedriger.
Wenn man die Signale einer PCR-Amplifikation in Echtzeit Zyklus für Zyklus erfasst (RT-PCR), so kann man die Messung durch Eichkurven kalibrieren und damit quantitative Ergebnisse erzielen (qPCR bzw. qRT-PCR). Dieses Verfahren ist mittlerweile sehr ausgereift und ein Referenzstandard für andere Messmethoden wie DNA-Arrays. Mittels quantitativer RT-PCR lassen sich auch sehr präzise Expressionsprofile erstellen. Die Kosten und der Durchsatz limitieren jedoch die Anzahl an Analysen. Die Firma Applied Biosystems ist auch hier Marktführer mit einem System, welches 384 parallele qRT-PCR Reaktionen in 3 Stunden durchführt, welche für das „Genotyping" oder auch das „Expression Profiling" verwendet werden können. Die Limitation in Verfügbarkeit und Kosten für alle PCR-Anwendungen sind die Oligonukleotide, welche als Primer verwendet werden.
2.3 Hochparallele „Sequencing by Synthesis" Methoden
Es existieren verschiedene Methoden für die Sequenzaufklärung kurzer Nukleinsäureabschnitte mit sehr hohen Durchsätzen. Diese Methoden wurden in der Regel als kostengünstige Alternativen für die Sanger-Sequenzierung entwickelt, um schnellen Zugang zu neuen Genomsequenzen zu erhalten. Grundprinzip ist die Erzeugung und Immobilisierung einer sehr hohen Zahl von Primer/Templat-Komplexen, die anschließend von einer DNA-Polymerase prozessiert werden. Die Immobilisierung kann dabei auf flachen Chips oder Beads erfolgen. Anschließend wird durch schrittweisen Einbau von dNTPs (Desoxynukleosidtriphosphaten) und die Erzeugung eines vom Einbau abhängigen optischen Signals die Sequenz der einzelnen Template in Bereichen von einigen Nukleotiden aufgeklärt. Die einzelnen Sequenzen werden dann durch computergestützte Auswertung assembliert und es wird so versucht, längere, zusammenhängende Sequenzbereiche aufzuklären. Der Prozess kann unter vorhergehender Amplifikation der zu untersuchenden Genabschnitte erfolgen, wie z. B. in von 454 Life Sciences oder Solexa entwickelten Testsystemen (Gennett S. T., Barnes C., Cox A., Davies L., Brown C., Pharmacogenomics 2005 Jun; 6(4): 373–82. Warren R. L., Sutton G. G., Jones S. J., Holt R. A., Bioinformatics 2006 Dec 8; [Epub ahead of print]. Bentley D. R. Curr Opin Genet Dev, 2006 Dec; 16(6): 545–52. Gennett S., Pharmacogenomics 2004 Jun; 5(4): 433–8. Margulies, M. Eghold, M. et al. Nature 2005 Sep 15; 437(7057): 326–7. Patrick Ng, Jack J. S. Tan, Hong Sain Ooi, Yen Ling Lee, Kuo Ping Chiu, Melissa J. Fullwood, Kandhadayar G. Srinivasan, Clotilde Perbost, Lei Du, Wing-Kin Sung, Chia-Lin Wei and Yijun Ruan, Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 12. Robert Pinard, Alex de Winter, Gary J Sarkis, Mark B Gerstein, Karrie R Tartaro, Ramona N Plant, Michael Egholm, Jonathan M Rothberg, and John H Leamon, BMC Genomics 2006, 7: 216. John H. Leamon, Michael S. Braverman and Jonathan M. Rothberg, Gene Therapy and Regulation, Vol. 3, No. 1 (2007) 15–31).
Alternativ wurden Methoden entwickelt, die auf eine Einzelmolekülanalyse ohne vorherige Amplifikation abzielen (Helicos Biosciences). Generell kann die Erzeugung des Signals durch Lumineszenz in Abhängigkeit von Pyrophosphatbildung während des Einbaus erfolgen (454 Life Sciences), analog der bekannten Pyrosequencing-Technologie. Alternativ können fluoreszenzmarkierte dNTPs verwendet werden, die eine 3'-OH-Schutzgruppe enthalten, die eine weitere Verlängerung nach einem Einzeleinbau verhindert. Nach Einbau eines dNTPs wird die am Primer/Templat-Komplex vorhandene Fluoreszenz detektiert und anschließend die 3'-OH-Schutzgruppe sowie das Fluorophor abgespalten, so dass ein neuer Zyklus aus Einbau, Detektion und Abspaltung erfolgen kann. Es können dabei alle vier dNTPs mit unterschiedlichen Fluorophoren parallel angeboten werden oder sequentiell jeweils ein einzelnes; in diesem Falle ist nur eine Einfarbendetektion notwendig.
2.4 DNA-Microarrays
Die am meisten verbreitete Methode für das Expression Profiling sind DNA-Arrays. Auf diesen Arrays werden in Zeilen und Spalten kurze DNA- oder RNA-Abschnitte ortsaufgelöst gebunden oder vor Ort synthetisiert. Für jedes Gen, dessen Expression analysiert werden soll, werden ein oder mehrere Oligos verwendet. Wie bei der PCR erhöhen mehrere Oligos die statistische Sicherheit des Verfahrens. Weitere Parameter für die Qualität der Arraymessung sind die Oligoqualität, -länge, -sequenzauswahl und die Durchführung der Hybridisierungsreaktion. Es gibt diese Arrays für alle bekannten Gene des menschlichen Genoms sowie für einige andere wichtige Modellorganismen. Daneben gibt es noch verschiedene Themen-Arrays, auf denen sich Oligos befinden, welche für Gene kodieren, welche einer Funktion oder einem Krankheitsbild zugeordnet werden.
In der Regel muss das mit einem Array zu untersuchende Probengut mittels PCR amplifiziert werden. Hierzu wird eine generische PCR verwendet, bei der alle in der Probe exprimierten Gene vom universellen 3'-Ende ausgehend amplifiziert werden. Dieses Gesamtverfahren ermöglicht es, eine Vielzahl an Genen mit nur einer PCR-Reaktion zu vermehren und dann genspezifisch mit dem DNA-Array zu detektieren.
Bei der Verwendung von Arrays für das Genotyping liegt das Hauptproblem in der Probenamplifikation. Da die zu untersuchenden Positionen in unterschiedlichen Bereichen eines Genoms liegen, kann man mit einer PCR-Reaktion nur ein oder wenige Messpunkte amplifizieren. Da die Kosten für ein Primerset erheblich sind, limitiert dies erheblich die Anwendung von Arrays im Bereich Genotyping, da sehr schnell die Kosten für die vorgeschalteten PCR-Reaktionen die Kosten für die Analyse mittels Array überschreiten. Applied Biosystems adressiert diese Segmente deshalb auch mit einem parallelen PCR-System. Die Firmen Roche und Affymetrix haben im Jahr 2004 ein erstes Genotyping-Produkt auf den Markt gebracht, das für die Diagnostik zugelassen wurde. Im Amplichip werden je PCR möglichst viele SNPs mittels DNA-Array gemessen, um das Produkt noch wirtschaftlich einsetzbar zu machen. Ein breiter Einsatz dieses Vorgehens scheint aber technisch-wirtschaftlich eher unwahrscheinlich. Es bleibt als Engpass die Verfügbarkeit der individuellen Oligos als Primer.
Dem Fachmann ist die Herstellung von Mikroarrays durch die in-situ-Synthese (Array-Anordnung in einer Matrix) bekannt. Am weitesten verbreitet ist die in-situ-Synthese in einer Array-Anordnung von synthetischen Nukleinsäuren resp. Oligonukleotiden. Diese wird auf einem Substrat durchgeführt, das durch die Synthese mit einer Vielzahl unterschiedlicher Polymere beladen wird. Der große Vorteil der in-situ-Syntheseverfahren für Mikroarrays ist die Bereitstellung einer Vielzahl von Molekülen unterschiedlicher und definierter Sequenz an adressierbaren Lokationen auf einem gemeinsamen Träger. Die Synthese greift dabei auf ein überschaubares Set aus Einsatzstoffen zurück (bei DNA-Mikroarrays in der Regel die 4 Basen A, G, T und C) und baut aus diesen beliebige Sequenzen der Nukleinsäurepolymere auf.
Die Abgrenzung der einzelnen Molekülspezies kann zum einen durch getrennte fluidische Kompartimente bei der Zugabe der Syntheseeinsatzstoffe erfolgen, wie es z. B. in der so genannten in-situ-Spotting-Methode oder Piezoelektrischen Techniken der Fall ist, die auf der Tintenstrahldrucktechnik beruhen (A. Blanchard, in Genetic Engineering, Principles and Methods, Vol. 20, Ed. J. Sedlow, S. 111–124, Plenum Press; A. P. Blanchard, R. J. Kaiser, L. E. Hood, High-Density Oligonucleotide Arrays, Biosens. & Bioelectronics 11, S. 687, 1996).
Eine alternative Methode ist die ortsaufgelöste Aktivierung von Syntheseplätzen, was z. B. durch selektive Belichtung oder selektive Zugabe von Aktivierungsreagenzien (Entschützungsreagenzien) möglich ist. Die Menge synthetisierter Moleküle einer Spezies ist bei den bisher bekannten Methoden verhältnismäßig gering, da in einem Mikroarray definitionsgemäß nur jeweils kleine Reaktionsbereiche für jeweils eine Sequenz vorgesehen werden, um möglichst viele Sequenzen im Array und damit für den funktionellen Einsatz abbilden zu können.
Beispiele für die bisher bekannten Verfahren sind die photolithographische lichtgestützte Synthese [McGall, G. et al; J. Amer. Chem. Soc. 119; 5081–5090; 1997], die projektorbasierte lichtgestützte Synthese [ PCT/EP99/06317 ], die fluidische Synthese mittels Trennung der Reaktionsräume, die indirekte projektorbasierte lichtgesteuerte Synthese mittels Photosäuren und geeigneter Reaktionskammern in einem mikrofluidischen Reaktionsträger, die elektronisch induzierte Synthese mittels ortsaufgelöster Entschützung an einzelnen Elektroden auf dem Träger und die fluidische Synthese mittels ortsaufgelöster Deposition der aktivierten Synthese-Monomere.
2.5 Micro RNAs
MicroRNAs (miRNAs) sind RNA-Moleküle einer Länge von ca. 22 Nukleotiden und stellen die größte Gruppe von kleinen RNAs in Pflanzen und Tieren.
Es sind momentan ca. 250 miRNAs im Humangenom bekannt, bioinformatische Methoden sagen jedoch eine deutlich größere Zahl voraus. Nach unterschiedlichen Berechnungen regulieren miRNAs vermutlich über 30% aller humanen Gene und dementsprechend vielfältig ist ihre Beteiligung an verschiedensten Prozessen wie der Entstehung von Krebs über die Steuerung von Transposonrelokationen, Stammzellbiologie oder Muskel- und Gehirnentwicklung.
miRNAs werden aus Primärtranskripten (pri-miRNAs) durch zwei Schritte von Endoribonuklease-III-Prozessierungen herausgeschnitten, erst durch Drosha, das hairpinförmige pre-miRNA produziert, dann durch Dicer, das siRNA-artige Doppelstrangkomplexe erzeugt. Reife miRNAs können dann durch unterschiedliche Mechanismen in die Genregulation eingreifen, etwa durch die Steuerung von mRNA-Verdau oder Bindung an die UTR-Regionen.
Verschiedene Verfahren zum Nachweis von kleinen RNAs wie miRNAs sind dem Fachmann bekannt. Ein einfaches Verfahren ist zum Beispiel klassische Northern Blot Hybridisierung, die neben der Sequenz auch Aussagen über die Länge einer RNA erlaubt, aber arbeitsintensiv ist und nur mit geringem Durchsatz durchgeführt werden kann. Eine weitere gelbasierte Methode mit den entsprechenden Nachteilen ist der „RNAse protection assay" (RPA).
Zum Nachweis kann auch eine Primer-Extension-Reaktion herangezogen werden. Hierbei wird ein gelabelter Primer an die miRNA hybridisiert, mit einer Polymerase verlängert und die Reaktionsmischung gelelektrophoretisch aufgetrennt und analysiert.
Weit schnellere und für einen quantitativen Nachweis besser geeignete Verfahren beruhen auf PCR. Reverse Trancription/PCR kann verwendet werden, wenn Primer mit einem Loop eingesetzt werden, die eine universelle Sequenz einführen. Diese Universalsequenz wird dann für die PCR herangezogen.
Ein weiterer Ansatz für den Nachweis und die Quantifizierung von miRNAs ist die Anwendung von Mikroarrays. Besondere Herausforderungen entstehen dabei aus der geringen Länge der miRNAs sowohl für das Sondendesign als auch für Labelingprotokolle. Verschiedenste Methoden für das Labeling sind dem Fachmann bekannt, sowohl durch direktes Labeling mit Biotin oder Fluorophoren oder indirekt während der cDNA-Synthese oder der Amplifikation. Sowohl chemische als auch enzymatische Verfahren sind hierfür bekannt, z. B. basierend auf cis-Platin-Verbindungen, Periodat-Hydrazin-Labeling, T4 RNA-Ligase, Poly-A-Polymerase oder Kopplung an aminomodifizierte RNAs. Bezüglich des Sondendesigns entstehen besondere Herausforderungen aus der geringen Länge von miRNAs vor allem im Hinblick auf die Signalstärke wegen geringer Duplex-Schmelztemperaturen. Hierfür können modifizierte Nukleotide oder die Verwendung von Tandem-Sonden bzw. Sonden mit mehr als 2 Bindungsstellen für miRNAs herangezogen werden.
2.6 PCR auf Oberflächen
Für verschiedene dem Fachmann bekannte Methoden der Nukleinsäureanalytik wie z. B. Sequencing-by-Synthesis-Methoden für Whole-Genome-Sequenzierungen oder Sequenzierungen großer Sequenzabschnitte aber auch für viele weitere Methoden ist es notwendig, PCR-Produkte auf Oberflächen zu generieren. Hierzu kommen insbesondere Bead-Systeme (z. B. 454 Life sciences Sequenzierer) oder Arrayoberflächen (Illumina-Solexa) zum Einsatz. Da es gegenwärtig kaum möglich ist, experimentbezogen und gezielt eine große Anzahl von Primersequenzen zu einem wirtschaftlichen Preis herzustellen, sind diese Methoden auf universelle Primersequenzen beschränkt, die in die zu untersuchenden Nukleinsäureabschnitte eingeführt werden müssen. Daraus resultiert, dass die einzelnen Sequenzen in einem Sequenzgemisch nicht gezielt ausgewählt werden können. Eine Aufgabenstellung wie die gezielte Sequenzierung einzelner Abschnitte eines Genoms ist daher nur möglich, wenn vorher spezifische Oligonukleotide generiert werden, die z. B. als Primer Einsatz finden.
Für die Parallele Amplifikation einer großen Zahl unterschiedlicher Sequenzen müssen außerdem besondere Voraussetzungen geschaffen werden, die ein Kreuzreagieren während der PCR verhindern. Dies kann zum Beispiel durch Einschluss einzelner Beads, die nur eine Targetsequenz tragen, in Tröpfchen einer Wasser-in-Öl-Emulsion geschehen, oder durch räumliche Isolierung auf Chipoberflächen.
Es besteht beim gegenwärtigen Stand der Technik ein großer Bedarf an Methoden zur Generierung einer Vielzahl von Oligonukleotidsequenzen und ihrer gleichzeitigen Nutzung unter räumlicher Isolierung einzelner PCRs innerhalb eines komplexen Probengemisches an Templatmolekülen.
2.7 Pathogene
Die Molekulare Diagnostik in Bezug auf die Detektion, Quantifizierung und Gentypisierung von Mikroorganismen und Viren hat in den letzten Jahren enorme Fortschritte gemacht.
Intensive Forschung an Genomen pathogener Organismen hat die Nutzung ihrer DNA/RNA als analytische Zielmoleküle vorangetrieben und den Anteil phänotypischer Assays in diesem Feld reduziert.
Als Gentyp-basierte Methoden werden momentan verschiedene Methoden verwendet. Direkte Hybridisierungen mit markierten Oligonukleotiden werden für Kulturanalysen verwendet.
Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist eine attraktive Methode für die Detektion und Identifizierung von Mikroorganismen direkt von Abstrichen. Diese Methoden sind allerdings unsensitiv und daher auf sehr häufige Nukleinsäuremoleküle beschränkt, wie z. B. ribosomale RNAs.
Array-basierte Methoden können für die Analyse einer großen Zahl von Zielmolekülen herangezogen werden, jedoch ist hierfür in der Regel eine Amplifikation und Markierung der Zielmoleküle notwendig.
Die Einführung von homogenen Nachweisverfahren, die Markierung und Amplifikation integrieren, hat stark zur Akzeptanz von molekulardiagnostischen Methoden beigetragen. Insbesondere quantitative Real-time-PCR ist mittlerweile eine weit verbreitete Methode. Als signalgebende Verfahren haben sich dabei verschiedene Methoden durchgesetzt, wie z. B. Taqman Sonden, Molecular Beacons, Scorpion Primer, Sunrise Primers, DNA-Intercalatoren oder Minor Groove Binder. Diese Methoden erlauben insbesondere den Nachweis seltener Nukleinsäuren in Probengemischen, etwa zur Detektion von geringen Viruskonzentrationen.
Sequenzierbasierte Methoden werden ebenfalls eingesetzt, sind aber meist beschränkt auf häufige Nukleinsäuren wie ribosomale RNA.
Neben der Detektion und Identifizierung von Mikroorganismen bzgl. ihres Genus oder ihrer Spezies ist eine genauere Genotypisierung notwendig um Pathogene effizient zu bekämpfen, Populationen zu monitoren und epidemiologische Gefahren abzuschätzen.
Die verbreitetsten Methoden in dieser Richtung sind Makro-Restriktionsanalysen von totaler genomischer DNA oder PCR-basierte Methoden für die Genomtypisierung. Bekannte Beispiele sind auch Pulse-field-Gelelektrophorese (PFGE) und Ribotyping.
3 Gegenstand der Erfindung und damit gelöste Aufgabe
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die molekularbiologische Prozessierung eines Gemisches von biologischen Proben, wie Proteinen und Nukleinsäuren, zu vereinfachen und mehr als einen molekularbiologischen Arbeitsschritt durchführen zu können, ohne dass die Proben aufwendig gereinigt und von einem Reaktionsgefäß in das nächste transferiert werden müssen.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine verbesserte molekularbiologische Prozessanlage.
Gegenstand der Erfindung ist daher eine verbesserte molekularbiologische Prozessanlage sowie ein verbessertes Verfahren zur Prozessierung biologischer Proben. Diese Erfindung kombiniert die Bereitstellung biologisch funktionaler Molekülen wie Nukleinsäuren und Peptiden sowie von Derivaten oder Analoga dieser beiden Molekülklassen in miniaturisierten Flusszellen mit der seriellen Zugabe von Reagenzien oder Fluiden und dient der Bearbeitung biologischer Proben, wie Proteinen, Nukleinsäuren, biogener kleiner Moleküle wie z. B. Metaboliten, Viren oder Zellen, die dazu in die miniaturisierten Flusszellen eingebracht werden. Das zu bearbeitende Material wird durch mehrere Prozessschritte hindurch in einem im wesentlichen unveränderten Reaktionsraum gebunden gehalten, dessen vorgeschaltete Anpassung an spezifische Proben durch eine orts- oder/und zeitaufgelöste Immobilisierung biologisch funktionaler Moleküle wie Nukleinsäuren, Peptiden und ihren Derivaten oder Analoga in den miniaturisierten Flusszellen in einer Anordnung als Mikroarray erfolgt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ermöglicht die erfindungsgemäße molekularbiologische Prozessanlage ein Verfahren zur verbesserten Analyse von Sequenz, chemischer oder biochemischer Modifikation und Quantität von Nukleotidsequenzen. Dies wird erreicht durch Kombination von selektiver räumlich aufgelöster Bindung der Analyten an einen in den miniaturisierten Flusszellen synthetisierten Array aus hybridisierfähigen Sonden und optionaler sequenzunspezifischer oder sequenzspezifischer Amplifikation, insbesondere DNA-Amplifikation. Dabei verwendet das Verfahren ein bis mehrere Wasch-Trenn-Schritte sowie Amplifikations-Schritte. Die in der miniaturisierten Flusszelle synthetisierten, hybridisierfähigen Sonden können zu diesem Zweck chemisch oder biochemisch verändert werden. Alle Schritte des Verfahrens können in einer bevorzugten Ausführungsform optional optisch überwacht werden, z. B. durch einen flächigen und damit zum Array parallelen oder im Wesentlichen parallelen Detektor. Während die Reaktionszyklen durchlaufen werden oder danach kann ein optisch detektierbares Ergebnis, z. B. die Lokalisation und die Quantität optischer Marker wie z. B. Fluoreszenzmarker, erfasst werden.
Die erfindungsgemäße Prozessanlage verfügt vorzugsweise über ein oder mehrere Heizelemente, die die Temperatur in einer oder mehreren Flusszellen erhöhen können, und vorzugsweise über ein oder mehrere Kühlelemente, die die Temperatur in einer oder mehreren Flusszellen herabsetzen können.
In der erfindungsgemäßen Anlage können die verschiedenen zyklischen Schritte automatisiert oder teilweise automatisiert werden. Damit bietet sie wesentliche Verbesserungen gegenüber dem Stand der Technik. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ermöglicht die erfindungsgemäße molekularbiologische Prozessanlage Verfahren zur verbesserten Analyse von sequenzspezifischen Bindungs- und/oder Modifikationsereignissen zwischen Proteinen und den in der miniaturisierten Flusszelle synthetisierten, hybridisierfähigen Sonden. Die in der miniaturisierten Flusszelle synthetisierten, hybridisierfähigen Sonden können zu diesem Zweck chemisch oder biochemisch verändert werden. Dabei verwendet das Verfahren ein bis mehrere Wasch-Trenn-Schritte. Alle Schritte des Verfahrens können in einer bevorzugten Ausführungsform optional optisch überwacht werden, z. B. durch einen flächigen und damit im Wesentlichen parallelen Detektor. Während die Zyklen laufen oder danach kann ein optisch detektierbares Ergebnis, z. B. die Lokalisation und Quantität von optischen Markern wie z. B. Fluoreszenzmarkern, erfasst werden.
4 Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt eine Ausführungsform der Erfindung, bei welcher auf dem Reaktionsträger Sondenmoleküle 1 synthetisiert wurden, an die zu analysierende Moleküle 2b binden. Ausgehend vom Sondenmolekül 1 synthetisiert eine Polymerase 4b die jeweiligen Komplementärstränge der zu analysierenden Moleküle.
2 zeigt eine Ausführungsform der Erfindung, bei welcher auf dem Reaktionsträger Sondenmoleküle 1 synthetisiert wurden, an die ein Molekül 6 angeknüpft wurde. An das Molekül 6 wurde ein Adaptermolekül 7b angeknüpft. Ausgehend von einem Primer 8b, der an Molekül 6 gebunden hat, synthetisiert eine Polymerase 4 aus Bausteinen 9a den zu Molekül 6 komplementären Strang. Bausteine 9a tragen eine signalgebende Gruppe, die während des Einbaus oder danach entfernt werden kann, so dass der gebildete Strang verknüpfte Bausteine 9b mit signalgebender Gruppe oder verknüpfte Bausteine 9c mit entfernter signalgebender Gruppe enthält.
3 zeigt eine tabellarische Aufstellung von Polymerasen, deren Eignung für die Verwendung in der erfindungsgemäßen Prozessanlage und den erfindungsgemäßen Verfahren untersucht wurde.
4 zeigt ein Fluoreszenzbild eines Reaktionsträgers, auf dem DNA-Sondenmoleküle synthetisiert wurden, die über das 5'-Ende an die Oberfläche geknüpft sind und ein freies 3'-OH-Ende aufweisen. Das Bild wurde aufgenommen nach Hybridisierung des Reaktionsträgers mit einem PCR-Produkt und Inkubation mit unterschiedlichen Polymerasen, dNTPs und dNTPs mit signalgebenden Gruppen in geeignetem Reaktionspuffer. Verwendete Polymerasen von links nach rechts: T7 DNA-Polymerase, Sequenase, Phi29, T4 DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, Klenow-Fragment exo- und Bst DNA-Polymerase.
5 zeigt ein Fluoreszenzbild eines Reaktionsträgers, auf dem DNA-Sondenmoleküle synthetisiert wurden, die über das 5'-Ende an die Oberfläche geknüpft sind und ein freies 3'-OH-Ende aufweisen. Das Bild wurde aufgenommen nach Hybridisierung des Reaktionsträgers mit einem PCR-Produkt und Inkubation mit unterschiedlichen Polymerasen, dNTPs und dNTPs mit signalgebenden Gruppen in geeignetem Reaktionspuffer. Verwendete Polymerasen von links nach rechts: Taq DNA-Polymerase, 9°N, Vent DNA-Polymerase, Vent-DNA-Polymerase, Pfu DNA-Polymerase, Therminator, Phusion Hotstart.
6A bis 6F zeigen Fluoreszenzwerte (willkürliche Einheiten) eines Reaktionsträgers mit auf der Oberfläche synthetisierten selbstkomplementären Hairpin-Sonden nach Verlängerung durch verschiedene Polymerasen unter Einbau signalgebender Gruppen und anschließender Fluoreszenzdetektion. Hierzu wurden inverse Sonden (5'-3'-Synthese) mit einer Länge zwischen 27 und 30 Nukleotiden entworfen, die über einen T-Tetraloop mit sich selbst paaren (siehe 6G). Die verwendeten DNA-Polymerasen sind: 6A Vent; 6B Vent-; 6C, Pfu; 6D Therminator, 6E Phusion Hotstart, 6F Klenow Fragment E. coli DNA-Polymerase I. Es wurden verschiedene Sequenzen für den Paarungsbereich (Stem) getestet und die Länge des Stems zwischen 4 und 7 Nukleotiden variiert (4stem–7stem). Es wurden außerdem unterschiedliche Einzelstrangtemplatsequenzen getestet, die von der jeweiligen DNA Polymerase kopiert werden sollten. In dieser Templatsequenz wurde durch Anwesenheit von 1–3 Adenosinnukleotiden für den Einbau von 1–3 biotinmarkierten dUTP kodiert, um die Abhängigkeit der Fluoreszenz von der Anzahl der eingebauten Biotine zu testen (siehe 6F, 1 Bio–3 Bio). 6F zeigt exemplarisch Daten für Reaktionen mit dem 3'–5'-exonukleasedefizienten Klenow Fragment der E. coli DNA Polymerase I(KF–). Es ist eine Zunahme der Verlängerungseffizienz mit zunehmender Stemlänge erkennbar. Die Zunahme der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Anzahl der kodierten Biotinmarker verläuft dabei annähernd linear.
7 zeigt ein Fluoreszenzbild eines Reaktionsträgers, auf dem DNA-Sondenmoleküle synthetisiert wurden, die über das 3'-Ende an die Oberfläche geknüpft sind und an die Primer hybridisiert wurden. Die Primer binden dabei an dem Ende des Sondenmoleküls, das der Reaktionsträgeroberfläche näher ist (d. h. proximales Ende). Das Bild wurde aufgenommen nach Inkubation mit unterschiedlichen Polymerasen, dNTPs und dNTPs mit signaltragenden Gruppen in geeignetem Reaktionspuffer. Verwendete Polymerasen von links nach rechts: T7 DNA-Polymerase, Sequenase, Phi29, T4 DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, Klenow-Fragment exo- und Bst DNA-Polymerase. Der dunkel schattierte Pfeil gibt die Richtung der Anknüpfung von Bausteinen durch die Polymerase an.
8 zeigt den Reaktionsträger aus 7 nach Waschen mit Wasser.
9 zeigt den Reaktionsträger aus 8 nach erneuter Hybridisierung von Primern an die DNA-Sondenmoleküle und Inkubation mit unterschiedlichen Polymerasen, dNTPs und dNTPs mit signaltragenden Gruppen in geeignetem Reaktionspuffer. Die in diesem zweiten Abschreibevorgang verwendeten Polymerasen sind von links nach rechts: Taq DNA-Polymerase, 9°N, Vent DNA-Polymerase, Vent- DNA-Polymerase, Pfu DNA-Polymerase, Therminator, Phusion Hotstart.
10 zeigt zwei Varianten der bevorzugten Ausführungsform „on-chip-Ligation". Bei dieser bevorzugten Ausführungsform findet in Abhängigkeit eines zu analysierenden Probenmoleküls eine Verknüpfung zweier Sondenmoleküle statt. Der dunkel schattierte Pfeil gibt den Ort der Verknüpfung, d. h. Ligation, an. Die Ligation kann z. B. enzymatisch oder chemisch erfolgen.
11A und 11B zeigen zwei Varianten der bevorzugten Ausführungsform „PCR-on-chip". Beiden Varianten gemein ist die Verwendung einer locusspezifischen (und allelspezifischen) Sonde, die auf dem Reaktionsträger synthetisiert wurde und mit dem zu analysierenden Sequenzbereich des Probenmoleküls hybridisiert. In der in 11A gezeigten Variante wird an das zu analysierende und/oder zu amplifizierende Probenmolekül ein so genannter „Universal Tag" kovalent angefügt. Weiterhin wird ein „Universal Primer" verwendet, der zu diesem „Universal Tag" komplementär ist. Die Amplifikation erfolgt zwischen dem Universal-Primer und der locusspezifischen (und allelspezifischen) Sonde. In Variante 11B wird kein „Universal Tag" verwendet. Der hier verwendete Universal-Primer ist ein Gemisch aus so genannten Random-Primern, die an unterschiedlichen Stellen des zu analysierenden und/oder zu amplifizierenden Probenmoleküls binden. Die Amplifikation erfolgt zwischen der jeweiligen Bindungsstelle des Universal-Primers und der locusspezifischen (und allelspezifischen) Sonde.
12 zeigt eine Ausführungsform, bei der reverse Transkription und PCR kombiniert werden. Die Amplifikation erfolgt dabei schließlich zwischen der polyA-Region der gebildeten cDNA und einer lokusspezifischen Sonde, die auf dem Reaktionsträger synthetisiert worden ist.
13 zeigt die bevorzugte Ausführungsform „microRNA capture-signal amplification". Bei dieser wird microRNA durch Sondenmoleküle gebunden. MicroRNA kann daraufhin oder auch vorher mit einer universellen Sequenz markiert werden, z. B. einem Adeninstrang (PolyA-Schwanz). Diese Sequenz kann als Primer genutzt werden, um eine circuläre DNA mit einer an den Primer bindenden Sequenz in einer Reaktion zu kopieren, die dem Fachmann als „Rolling circle Amplification" bekannt ist. Die dabei entstehende DNA kann auf unterschiedliche Weise für eine Detektion markiert werden.
14 zeigt Daten von Experimenten bezüglich einer Ausführungsform der Erfindung zur Analyse von mikroRNAs (miRNA). Rechts im Bild sind Scatter-Plots gezeigt, die die Reproduzierbarkeit der Signalintensitäten der einzelnen Spots auf verwendeten Mikroarrays zweier Hybridisierungen von miRNAs aus einer humanen Herzprobe zeigen (oben), bzw. die Unterschiede in den Signalintensitäten zwischen zwei Hybridisierungen, wenn Proben aus unterschiedlichen Geweben verglichen werden (Herz und Gehirn, unten). Links in der Abbildung sind zwei Säulendiagramme gezeigt, die die Signalintensitäten verschiedener Mikroarray Sonden nach Hybridisierung mit einer miRNA Probe aus dem humanen Hirn zeigen, die für die Detektion einer bestimmten miRNA entworfen wurden. Die Sonden sind entweder vollständig komplementär zur miRNA (PM) oder tragen einen, zwei oder drei Mismatches (MM, single, double, triele). Zusätzlich sind Intensitäten von analogen Sonden gezeigt, die zwei aufeinanderfolgende Komplementärsequenzen der miRNA aufweisen, die entweder direkt aufeinanderfolgen oder durch einen Spacer getrennt sind Tandem oder Tandem mit Spacer). Das untere linke Säulendiagramm zeigt analoge Daten für eine weitere miRNA. Diese ist in Hirn- und Herzgewebe unterschiedlich exprimiert, Signalintensitäten für die Hybridisierungen der Proben aus den jeweiligen Geweben sind vergleichend gezeigt.
15 zeigt ein Fluoreszenzbild eines Mikroarrays von Hybridisierungen von miRNAs aus verschiedenen Geweben (Herz und Hirn) die unter verschiedenen Bedingungen hybridisiert wurden, wie in der Tabelle unten angegeben.
16 zeigt ein Fluoreszenzbild eines Mikroarrays nach Hybridisierung mit miRNAs und Markierung mit Biotin/Streptavidin-Phycoerythrin (vor Signalverstärkung; Aufnahmedauer: 2780 ms).
17 zeigt ein Fluoreszenzbild eines Mikroarrays nach Hybridisierung mit miRNAs und Markierung mit Biotin/Streptavidin-Phycoerythrin (SAPE) und darauf folgender Signalverstärkung mittels eines Antikörpers, der seinerseits biotinmarkiert ist und erneuter Markierung mit Streptavidin-Phycoerythrin (Aufnahmedauer: 1500 ms)
18 zeigt Daten zur Abhängigkeit der Signalintensität der Fluoreszenzsignale von Arraybildern nach Hybridisierung mit RNA-Proben aus humanem Hirn, die entweder ohne vorherige Aufreinigung oder nach selektiver Anreicherung der miRNAs erfolgte. (Ausgangsmaterial: 5 μg Hirn-RNA; markiert mit mirVANA Labeling Kit (Ambion); die Daten wurden gegenüber den Hintergrundsignale korrigiert und sind ohne „gespikete" Kontrollen aber mit Original- und Tandemsondensequenzen; Normalisierung wurde nicht durchgeführt.)
19 zeigt Daten und ein Schema zum Themenkomplex „Analyse von Einzelnukleotidsubstitutionen für das SNP-Genotyping, Resequencing oder die Methylierungsanalyse". Rechts oben ist ein Schema gezeigt, das das Assayprinzip verdeutlicht. In Abhängigkeit des Nukleotids des Probenmoleküls an einer bestimmten Position findet eine mehr oder weniger effiziente Primer Extension durch eine DNA Polymerase an unterschiedlichen an der Oberfläche befindlichen Primermolekülen statt. Links ist ein Fluoreszenzbild eines Mikroarrays nach einer Primer Extension wie beschrieben gezeigt. Während der Extension wurde Biotin eingebaut, welches anschließend mit Streptavidin-Phycoerythrin markiert wurde. In der Vergrößerung sind die Signalunterschiede für verschiedene Nukleotidpaare im Primer deutlich zu erkennen. Unten rechts ist ein Säulendiagramm gezeigt, das quantitativ die Fluoreszenzsignale eines entsprechenden Arrays zeigt. (PM = perfect match des Nukleotidpaares im Primer, MM = mismatch).
20 zeigt Daten zum Themenkomplex „PCR-on-Chip". Es wurden PCR-Reaktionen im Reaktionsträgers entsprechend den beiden Schemata mit einem PCR-Produkt des GFP-Gens als Templat durchgeführt, wobei jeweils einer der Primer auf der Oberfläche immobilisiert ist. Während der Reaktion wurde Biotin eingebaut und über SAPE markiert. Fluoreszenzbilder der Arrays sind jeweils rechts des jeweiligen Schemas gezeigt. Die Datenpunkte, die mit PCR bezeichnet sind, gehen aus einer PCR-Reaktion hervor, die mit PEX betitelten Bilder wurden den gleichen Inkubationen bei den gleichen Temperaturen ausgesetzt, allerdings nicht in zyklischer Weise.
21 zeigt Daten zum Themenkomplex PCR-on-Chip. Es wurden PCR-Reaktionen im Reaktionsträger entsprechend dem Schema links mit einem PCR-Produkt des GFP-Gens als Templat durchgeführt, wobei innerhalb eines Reaktionsträgers beide Primer (GFPforw01 und GFPrev01) getrennt auf der Oberfläche immobilisiert sind. Es wurden dabei verschiedene Primerlängen zwischen 10 und 30 Nukleotiden verwendet. Während der Reaktion wurde Biotin eingebaut und über SAPE markiert. Fluoreszenzbilder der Arrays sind jeweils rechts des Schemas gezeigt. Es wurde in zwei identischen Reaktionsträgern identische PCR-Reaktionen verwendet, wobei in einem als löslicher Primer ausschließlich GFPforw01 und im anderen ausschließlich GFPrev01 zugegeben wurde. Nur an den Positionen, an denen ein PCR-fähiges, gegenläufiges Primerpaar zustande kommt, wird eine effiziente Signalerzeugung durch die Amplifikation beobachtet.
22 zeigt Daten zum Themenkomplex „PCR-on-Chip". Es wurden PCR-Reaktionen im Reaktionsträgers mit einem PCR-Produkt des GFP-Gens als Templat durchgeführt, wobei innerhalb eines Reaktionsträgers verschiedenste Primer auf der Oberfläche immobilisiert vorlagen und jeweils ein Primer (GFPforw01 und GFPrev01) zugegeben wurde. Wie unten im Bild gezeigt, wurden dabei je 30 verschiedene immobilisierte Primer in sense- und antisense-Richtung verwendet. Es entstehen dadurch in jedem Array 30 unterschiedliche PCR-Produkte verschiedener Länge. Je nachdem, welcher Primer in löslicher Form zugegeben wird, wird nur für die sense- oder antisense-Primer Produktbildung beobachtet.
23 zeigt Daten bzgl. „on-chip Primer Extension" für das Abkopieren von im Reaktionsträger synthetisierten, immobilisierten Oligonukleotiden. Entsprechend dem Schema im Bild unten werden Primer an die Oligonukleotide hybridisiert und durch eine Polymerase verlängert. Die entstandenen, nichtkovalent gebundenen Einzelstränge können dann durch Waschen aus dem Reaktionsträger entfernt werden und als Templat in einer PCR dienen, die zu ihrer Vermehrung eingesetzt werden kann.
24 zeigt ein Schema, das eine sogenannte „Strand Displacement Amplification" im Reaktionsträger zeigt. Es wird eine Hairpin-Sonde mit einem freien 3'-Nukleotid im Reaktionsträger synthetisiert, die im Doppelstrangbereich eine Erkennungssequenz für eine weiter entfernt schneidende Nicking Endonuklease enthält. Nach Primerverlängerung durch eine Polymerase wird der neu entstandene Strang durch die Nicking Endonuklease geschnitten und steht für eine erneute Primer Extension zur Verfügung. Es können beide Enzyme, Polymerase und Nuklease gleichzeitig in der Lösung vorliegen und eine isotherme, lineare Amplifikation bewirken.
25 zeigt ein Schema, das eine sogenannte „Strand Displacement Amplification" im Reaktionsträger zeigt. Es wird eine im Reaktionsträger synthetisierte Sonde mit einem Primer hybridisiert, so dass im Doppelstrangbereich eine Erkennungssequenz für eine weiter entfernt schneidende Nicking Endonuklease entsteht. Der Primer kann dabei optional mit der im Reaktionsträger synthetisierten Sonde chemisch verknüpft werden. Nach Primerverlängerung durch eine Polymerase wird der neu entstandene Strang durch die Nicking Endonuklease geschnitten und steht für eine erneute Primer Extension zur Verfügung. Es können beide Enzyme, Polymerase und Nuklease gleichzeitig in der Lösung vorliegen und eine isotherme, lineare Amplifikation bewirken.
26 zeigt ein Schema, in dem eine Amplifikation auf der Oberfläche des Reaktionsträgers stattfindet. Zwei benachbarte Sondenmoleküle mit unterschiedlicher Sequenz (Primer A und Primer B) können von einer Polymerase nicht templatabhängig verlängert werden, da diese zu weit voneinander entfernt sind, um aneinander zu binden (keine Bildung von dem Fachmann bekannten Primer Homo- oder Hetero-Dimeren). Werden lösliche, nicht mit der Oberfläche des Reaktionsträgers verknüpfte Moleküle hinzugegeben, können die Primer selektiv an gewünschte Moleküle aus einem komplexen Molekülgemisch (z. B. DNA-Fragmente aus genomischer DNA) binden und werden von der Polymerase verlängert. Sie erreichen dann eine Länge, die eine Bindung eines benachbarten Primers erlaubt, so dass dieser auch von der Polymerase verlängert werden kann. Nach einem anfänglichen Verlängerungsschritt wird der Reaktionsträger stringent gewaschen, so dass alle nicht kovalent an die Oberfläche des Reaktionsträgers gebundenen Moleküle und Ionen aus dem Reaktionsträger entfernt werden. Nach erneuter Zugabe von Reagenzien, die für eine dem Fachmann bekannte PCR-Reaktion notwendig sind, wird der Reaktionsträger einem Temperatur-Zeit-Profil unterworfen, das eine PCR-Reaktion ermöglicht.
27 zeigt ein Schema in dem eine Amplifikation auf der Oberfläche des Reaktionsträgers stattfindet. Zwei benachbarte Sondenmoleküle mit unterschiedlicher Sequenz (Primer A und Primer B) können von einer Polymerase nicht templatabhängig verlängert werden, da diese zu weit voneinander entfernt sind, um aneinander zu binden (keine Bildung von dem Fachmann bekannten Primer Homo- oder Hetero-Dimeren). Werden lösliche, nicht mit der Oberfläche des Reaktionsträgers verknüpfte Moleküle hinzugegeben, können die Primer binden. Es wird nun eine Hybridisierung und ein Waschprofil durchgeführt, das die selektive Bindung gewünschter Moleküle aus komplexen Probengemischen erlaubt (z. B. Fragmente aus genomischer DNA). Ungewünschte Moleküle werden durch Waschen aus dem Reaktionsträger entfernt. Die Primer, die Moleküle gebunden haben, werden nach Zugabe von für eine PCR notwendigen Reagenzien von der Polymerase verlängert. Sie erreichen dann eine Länge, die eine Bindung eines benachbarten Primers erlaubt, so dass dieser auch von der Polymerase verlängert werden kann. Nach einem anfänglichen Verlängerungsschritt wird der Reaktionsträger optional stringent gewaschen, so dass alle nicht kovalent an die Oberfläche des Reaktionsträgers gebundenen Moleküle und Ionen aus dem Reaktionsträger entfernt werden. Nach erneuter Zugabe von Reagenzien, die für eine dem Fachmann bekannte PCR-Reaktion notwendig sind, wird der Reaktionsträger einem Temperatur-Zeit-Profil unterworfen, das eine PCR-Reaktion ermöglicht.
28 zeigt ein Prinzip zur Detektion von microRNAs. Diese binden selektiv an im Reaktionsträger synthetisierte Sondenmoleküle und können durch dem Fachmann bekannte Hybridisierungs- und Waschschritte selektiv aus einem komplexen Probengemisch heraus im Reaktionsträger zurückgehalten werden. Ungewünschte Moleküle werden durch Waschen entfernt. Es wird nun optional eine einzelstrangspezifische (ssDNA) Nuklease zugegeben, die alle nicht gebundenen, einzelsträngigen Sondenmoleküle prozessiert. Die an microRNAs gebundenen Sondenmoleküle werden nicht prozessiert. Die gebundenen microRNAs fungieren nun als Primer und werden von einer Polymerase verlängert, wobei Bausteine mit signalgebenden Gruppen oder Haptenen eingebaut werden. Nach Waschen können diese direkt oder nach Bindung eines haptenspezifischen Liganden detektiert werden, der seinerseits eine oder mehrere signalgebende Gruppen enthält.
29 zeigt ein Prinzip zur Detektion von microRNAs. Diese binden selektiv an im Reaktionsträger synthetisierte Sondenmoleküle und können durch dem Fachmann bekannte Hybridisierungs- und Waschschritte selektiv aus einem komplexen Probengemisch heraus im Reaktionsträger zurückgehalten werden. Ungewünschte Moleküle werden durch Waschen entfernt. Die microRNAs sind vorher mit einer oder mehren signalgebenden Gruppen oder Haptenen markiert worden. Nach Waschen können diese direkt oder nach Bindung eines haptenspezifischen Liganden detektiert werden, der seinerseits eine oder mehrere signalgebende Gruppen enthält.
30 zeigt ein Prinzip zur Detektion von microRNAs. Diese binden selektiv an im Reaktionsträger synthetisierte Sondenmoleküle und können durch dem Fachmann bekannte Hybridisierungs- und Waschschritte selektiv aus einem komplexen Probengemisch heraus im Reaktionsträger zurückgehalten werden. Ungewünschte Moleküle werden durch Waschen entfernt. Die microRNAs sind vorher mit einer oder mehren signalgebenden Gruppen oder Haptenen markiert worden. Nach Waschen können diese direkt oder nach Bindung eines haptenspezifischen Liganden detektiert werden, der seinerseits eine oder mehrere signalgebende Gruppen enthält.
31 zeigt ein Prinzip zur Detektion von microRNAs. Diese binden selektiv an im Reaktionsträger synthetisierte Sondenmoleküle und können durch dem Fachmann bekannte Hybridisierungs- und Waschschritte selektiv aus einem komplexen Probengemisch heraus im Reaktionsträger zurückgehalten werden. Die Sondenmoleküle enthalten dabei mehrere Stellen für die Bindung einer microRNA, vorzugsweise zwei, drei, vier oder fünf. Ungewünschte Moleküle werden durch Waschen entfernt. Die microRNAs sind vorher mit einer oder mehreren signalgebenden Gruppen oder Haptenen markiert worden. Nach Waschen können diese direkt oder nach Bindung eines haptenspezifischen Liganden detektiert werden, der seinerseits eine oder mehrere signalgebende Gruppen enthält.
32 zeigt ein Prinzip zur Detektion von microRNAs. Diese binden selektiv an im Reaktionsträger synthetisierte Sondenmoleküle und können durch dem Fachmann bekannte Hybridisierungs- und Waschschritte selektiv aus einem komplexen Probengemisch heraus im Reaktionsträger zurückgehalten werden. Die Sondenmoleküle enthalten dabei mehrere Stellen für die Bindung einer microRNA, vorzugsweise zwei, drei, vier oder fünf. Ungewünschte Moleküle werden durch Waschen entfernt. Die microRNAs sind vorher mit einer oder mehreren signalgebenden Gruppen oder haptenen markiert worden. Nach Waschen können diese direkt oder nach Bindung eines haptenspezifischen Liganden detektiert werden, der seinerseits eine oder mehrere signalgebende Gruppen enthält.
33 zeigt ein Prinzip zur Detektion von microRNAs. Diese binden selektiv an im Reaktionsträger synthetisierte Sondenmoleküle und können durch dem Fachmann bekannte Hybridisierungs- und Waschschritte selektiv aus einem komplexen Probengemisch heraus im Reaktionsträger zurückgehalten werden. Ungewünschte Moleküle werden durch Waschen entfernt. Die microRNAs werden dann durch ein oder mehrere Enzyme, vorzugsweise Polymerasen und/oder Ligasen mit einer oder mehreren signalgebenden Gruppen oder Haptenen markiert. Nach Waschen können diese direkt detektiert werden oder nach Bindung eines haptenspezifischen Liganden, der seinerseits eine oder mehrere signalgebende Gruppen enthält.
34 zeigt ein Prinzip zur Detektion von microRNAs. Diese binden selektiv an im Reaktionsträger synthetisierte Sondenmoleküle und können durch dem Fachmann bekannte Hybridisierungs- und Waschschritte selektiv aus einem komplexen Probengemisch heraus im Reaktionsträger zurückgehalten werden. Ungewünschte Moleküle werden durch Waschen entfernt. Die microRNAs werden dann durch ein oder mehrere Enzyme, vorzugsweise Polymerasen und/oder Ligasen mit einer oder mehreren signalgebenden Gruppen oder Haptenen markiert. Nach Waschen können diese direkt detektiert werden oder nach Bindung eines haptenspezifischen Liganden, der seinerseits eine oder mehrere signalgebende Gruppen enthält.
35 zeigt ein Prinzip zur Detektion von microRNAs. Diese binden selektiv an im Reaktionsträger synthetisierte Sondenmoleküle und können durch dem Fachmann bekannte Hybridisierungs- und Waschschritte selektiv aus einem komplexen Probengemisch heraus im Reaktionsträger zurückgehalten werden. Die Sondenmoleküle enthalten dabei mehrere Stellen für die Bindung einer microRNA, vorzugsweise zwei, drei, vier oder fünf. Ungewünschte Moleküle werden durch Waschen entfernt. Die microRNAs werden dann durch ein oder mehrere Enzyme, vorzugsweise Polymerasen und/oder Ligasen mit einer oder mehreren signalgebenden Gruppen oder Haptenen markiert. Nach Waschen können diese direkt detektiert werden oder nach Bindung eines haptenspezifischen Liganden, der seinerseits eine oder mehrere signalgebende Gruppen enthält.
36 zeigt ein Prinzip zur Detektion von microRNAs. Diese binden selektiv an im Reaktionsträger synthetisierte Sondenmoleküle und können durch dem Fachmann bekannte Hybridisierungs- und Waschschritte selektiv aus einem komplexen Probengemisch heraus im Reaktionsträger zurückgehalten werden. Die Sondenmoleküle enthalten dabei mehrere Stellen für die Bindung einer microRNA, vorzugsweise zwei, drei, vier oder fünf. Ungewünschte Moleküle werden durch Waschen entfernt. Die microRNAs werden dann durch ein oder mehrere Enzyme, vorzugsweise Polymerasen und/oder Ligasen mit einer oder mehreren signalgebenden Gruppen oder Haptenen markiert. Nach Waschen können diese direkt detektiert werden oder nach Bindung eines haptenspezifischen Liganden, der seinerseits eine oder mehrere signalgebende Gruppen enthält.
37 zeigt ein Arbeitsflussschema für die Detektion und Typisierung von Viren und anderen Pathogenen. Nach quantitativer real-time-PCR wird im Falle eines positiven Test das entstandene PCR-Produkt direkt, ohne erneute PCR für eine Hybridisierung im Reaktionsträger verwendet. Diese dient der Typisierung des detektierten Virus oder der Entdeckung neuer Mutanten, Stämme oder Typen eines Virus.
38 zeigt eine Ausführungsform, bei der ein im Reaktionsträger der erfindungsgemäßen Prozessanlage synthetisiertes Sondenmolekül eine Hairpinstruktur ausbildet. Es gibt vorzugsweise zwei mögliche Erkennungssequenzen im Stamm der Hairpinstruktur: eine Oberflächen-nahe (d. h. proximale) und eine Oberflächen-ferne (d. h. distale).
39 zeigt eine Ausführungsform, bei der ein Sondenmolekül, das eine Hairpinstruktur ausbildet und zwei Sequenzen A und A* aufweist, die durch einen Linker verbunden sind, verwendet wird, um eine Sequenz A (Abbildung A) oder A* (Abbildung B) zu binden. Dadurch wird eine Änderung der Sekundärstruktur des Sondenmoleküls verursacht, die nachgewiesen werden kann.
40 zeigt eine Ausführungsform wie in 39 mit dem Unterschied, dass an Sequenz A (Abbildung A) und A* (Abbildung B) jeweils eine Sequenz X und Z angefügt ist, wobei diese nicht miteinander paaren und besondere im folgenden näher erläuterte Eigenschaften aufweisen.
41 zeigt eine Ausführungsform wie in 38 mit dem Unterschied, dass an Sequenz A und A* jeweils ein Fluorophor (Abbildung A) oder ein Quenchermolekül (Abbildung B) angefügt ist, die eine Detektion der Änderung der Sekundärstruktur im Sondenmolekül vereinfachen.
42 zeigt eine Ausführungsform wie in 39, die verwendet wird, um beide Stränge eines doppelsträngigen Probenmoleküls (Target) zu binden.
43 zeigt eine Ausführungsform, bei der ein im Reaktionsträger der erfindungsgemäßen Prozessanlage synthetisiertes Sondenmolekül eine Hairpinstruktur ausbildet. Es sind zwei mögliche Erkennungssequenzen vorhanden, und das Sondenmolekül ist nicht terminal, sondern intern mit der Oberfläche des Reaktionsträgers verknüpft. Bei Typ A ist die oder sind die Erkennungssequenzen im Loop und bei Typ B ist die oder sind die Erkennungssequenzen im Stem. Die Erkennungssequenz ist jeweils dunkel schraffiert dargestellt.
5 Grundzüge des Lösungsweges
5.1 Definitionen
Bevor die vorliegende Erfindung unten im Detail beschrieben werden wird, wird darauf hingewiesen, dass die Erfindung nicht auf die besonderen, hierin beschriebenen bevorzugten Verfahren, Versuchsvorschriften und Reagenzien beschränkt ist, da diese variieren können. Es ist auch selbstverständlich, dass die hierin verwendete Terminologie nur dem Zweck der Beschreibung besonderer Ausführungsformen dient und nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung begrenzen soll, der nur durch die angehängten Patentansprüche begrenzt werden wird. Sofern hierin nichts anderes angegeben ist, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleichen Bedeutungen wie sie üblicherweise von einem gewöhnlichen Fachmann des Fachgebiets verstanden werden.
Vorzugsweise haben die hierin verwendeten Begriffe die Bedeutung, die ihnen in "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H. G. W, Nagel, B. and Kölbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland) zugeschrieben werden.
In der gesamten Beschreibung und den nachfolgenden Patentansprüchen beinhaltet das Wort „umfassen" und Variationen wie „umfasst" und „umfassend", sofern der Kontext nichts anderes verlangt, den Einschluss einer angegebenen ganzen Zahl oder eines Schritts oder einer Gruppe ganzer Zahlen oder Schritte, aber nicht den Ausschluss irgendeiner anderen ganzen Zahl oder eines Schrittes oder einer Gruppe ganzer Zahlen oder Schritte.
Zahlreiche Dokumente werden im gesamten Text dieser Beschreibung zitiert. Jedes der hierin zitierten Dokumente (einschließlich aller Patentschriften, Patentanmeldungen, wissenschaftlicher Veröffentlichungen, Herstellerangaben, Anleitungen, Sequenzhinterlegungen bei GenBank unter einer Zugangsnummer (Accession Number) etc.), gleich ob im vorangegangen oder im nachfolgenden zitiert, ist hiermit in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen. Nichts in dieser Beschreibung soll als Eingeständnis ausgelegt werden, dass die vorliegende Erfindung nicht berechtigt ist, solch einer Offenbarung kraft früherer Erfindung vorauszugehen.
Ein „Rezeptor" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist jedes Molekül, das einen Analyten binden kann. Vorzugsweise ist die Bindung zum Analyten spezifisch und selektiv. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist der „Rezeptor" immobilisiert, vorzugsweise auf einem Trägerkörper oder kurz Träger. Bevorzugte Rezeptoren der Erfindung umfassen Oligopeptide oder Polypeptide, im folgenden auch kurz mit dem Begriff „Peptid" zusammengefasst. Diese Oligopeptide oder Polypeptide können aus den bekannten natürlich vorkommenden 20 Aminosäuren zusammengesetzt, sie können aber auch natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäurenanaloga und/oder -derivate enthalten. Diese Aminosäuren, Aminosäureanaloga und/oder -derivate können optional Markierungen, wie z. B. Farbstoffe tragen. Oligopeptide bestehen typischerweise aus bis zu 30 Aminosäuren, Aminosäureanaloga und/oder -derivaten, während Polypeptide aus mehr als 30 Aminosäuren, Aminosäureanaloga und/oder -derivaten bestehen, wobei keine scharfe Abgrenzung zwischen Oligopeptiden oder Polypeptiden besteht. Oligopeptide oder Polypeptide, die als Rezeptor im Sinne der Erfindung verwendet werden, umfassen vorzugsweise mindestens 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 oder 60 Aminosäuren, Aminosäureanaloga und/oder -derivate.
Besonders bevorzugte „Rezeptoren" der Erfindung umfassen Oligonukleotide oder Polynukleotide, im Folgenden auch zusammenfassend als Nukleinsäuren bezeichnet. Diese Oligonukleotide oder Polynukleotide können aus Desoxyribonukleotiden oder aus Ribonukleotiden oder aus Mischungen davon bestehen und können einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Diese Oligonukleotide können darüber hinaus zusätzlich oder ausschließlich Nukleinsäureanaloga und/oder -derivate enthalten, wie z. B. Peptid-Nukleinsäuren (PNA), Locked-Nukleinsäuren (LNA), etc. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Nukleobasen dieser Desoxyribonukleotide, Ribonukleotide, Nukleotidanaloga und Nukleotidderivate ausgewählt aus Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G), Thymin (T) und Uracil (U), wobei Desoxyribonukleotide typischerweise die Nukleobasen A, C, G oder T enthalten und Ribonukleotide typischerweise die Nukleobasen A, C, G oder U enthalten. Außer den genannten Nukleobasen können die Rezeptoren der Erfindung auch Varianten und Derivate dieser Nukleobasen enthalten, beispielsweise methylierte Nukleobasen oder solche, die kovalent gebundene Markierungen, wie zum Beispiel Farbstoffe oder Haptene tragen. Oligonukleotide bestehen typischerweise aus bis zu 30 Nukleotiden, Nukleotidanaloga oder -derivaten, während Polynukleotide aus mehr als 30 Nukleotiden, Nukleotidanaloga oder -derivaten bestehen, wobei keine scharfe Abgrenzung zwischen Oligonukleotiden und Polynukleotiden besteht. Vorzugsweise umfassen Oligonukleotide oder Polynukleotide, die als Rezeptor im Sinne der Erfindung verwendet werden, mindestens 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 oder 60 Nukleotide, Nukleotidanaloga oder -derivate.
Der Begriff „asymmetrische Rezeptoren", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet Rezeptoren, die aus mindestens 2 unterschiedlichen Arten von Rezeptorbausteinen bestehen, d. h. mehr als 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, oder 8 unterschiedliche Arten von Rezeptorbausteinen enthalten. Eine „Art von Rezeptorbausteinen" oder auch ein „Satz von Rezeptorbausteinen" umfasst jeweils eine Gruppe von Rezeptorbausteinen, die ein gemeinsames strukturelles Merkmal haben, sich aber in einem anderen strukturellen Merkmal unterscheiden. Falls der Rezeptor aus Nukleinsäuren, Nukleinsäureanaloga und/oder Nukleinsäurederivaten besteht, so umfasst zum Beispiel ein „Satz von Rezeptorbausteinen" alle Desoxyribonukleotide unabhängig davon, welche Nukleobase das Desoxyribonukleotid trägt. Ein zweiter „Satz von Rezeptorbausteinen" umfasst beispielsweise alle Locked-Nukleinsäuren, d. h. alle LNA-Nukleotide, unabhängig davon, welche Nukleobase das jeweilige LNA-Nukleotide trägt. Das heißt also, dass ein „asymmetrischer Rezeptor", der aus Nukleinsäuren besteht, mindestens zwei verschiedenen Nukleotidarten, beispielsweise DNA + LNA oder DNA + PNA oder DNA + RNA, umfasst.
Die Rezeptoren der Erfindung können eine oder mehrere „Sekundärstrukturen" ausbilden. Ein Rezeptor der Erfindung kann in seiner Gesamtheit oder auch nur in Teilbereichen eine oder mehrere Sekundärstrukturen aufweisen. Für den Fall, dass die Rezeptoren der Erfindung Oligopeptide oder Polypeptide sind, so können diese unter anderem die dem Fachmann bekannten Sekundärstrukturen α-Helix, β-Faltblatt und β-Turn ausbilden. Diese Sekundärstrukturen setzen eine Mindestlänge des betreffenden Oligo- oder Polypeptids voraus, zum Beispiel im Fall von α-Helices mindestens 4 Aminosäuren, im Falle von β-Faltblättern mindestens 4 Aminosäuren. Diese Sekundärstrukturen umfassen vorzugsweise mindestens 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 oder 30 Aminosäuren. Für den Fall, dass die Rezeptoren der Erfindung Oligo- oder Polynukleotide sind, können sie Sekundärstrukturen wie z. B. Haarnadelstrukturen (engl. hairpin structure), interne Schlaufen (internal loops), so genannte „Bulges" (engl. bulge = Ausbuchtung) und/oder so genannte Pseudoknoten aufweisen. Es ist besonders bevorzugt, dass der Rezeptor ein einzelsträngiges Oligo- oder Polynukleotid ist und dass die Sekundärstruktur eine Haarnadelstruktur ist. Die Haarnadelstruktur ist gekennzeichnet durch eine Stammregion (engl. stem), die aus einer selbstkomplementären Helix besteht, und eine Schlaufenregion (engl loop), die aus einem einzelsträngigen, ungepaarten Bereich besteht. Vorzugsweise weist die Schlaufenregion eine Länge von mindestens 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder mehr Nukleotiden auf. Weiterhin ist es bevorzugt, dass die Schlaufenregion eine Länge von höchstens 100, 90, 80, 70, 60, 50, Nukleotiden aufweist. Die Stammregion weist vorzugsweise eine Länge von 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr Basenpaaren auf. Weiterhin ist bevorzugt, dass die Stammregion eine Länge von höchstens 40, 35, 30, oder 25 Basenpaaren aufweist. Die Gesamtlänge des Rezeptors, der eine Haarnadelstruktur ausbildet, beträgt vorzugsweise mindestens 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 40, 45, 50, 60, 80, 100 oder mehr Nukleotide. Es versteht sich von selbst, dass ein Oligo- oder Polynukleotid nur dann eine Haarnadelstruktur ausbilden kann, wenn es über selbstkomplementäre Bereiche verfügt. Dem Fachmann sind Verfahren, Algorithmen und Computerprogramme zur Ermittlung solcher selbstkomplementären Bereiche und zur Konstruktion von Oligo- bzw. Polynukleotiden, die Haarnadelstrukturen oder andere Sekundärstrukturen aufweisen, bekannt. Dem Fachmann sind weiterhin experimentelle oder rechnerische Verfahren, Algorithmen oder Computerprogramme zur Bestimmung physikalischer Eigenschaften solcher Haarnadelstrukturen bekannt; insbesondere kennt der Fachmann experimentelle oder rechnerische Verfahren zu Bestimmung der Schmelztemperatur solcher Haarnadelstrukturen, genauer gesagt der Stammregion der Haarnadel. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die Schmelztemperatur der Haarnadelstruktur niedriger als die Schmelztemperatur des Hybridisierungsprodukts aus Rezeptor und spezifisch bindefähigem Analyten. In anderen Worten: in Gegenwart eines spezifisch bindefähigen Analyten löst sich die Haarnadelstruktur auf, und der Rezeptor und der spezifisch bindefähige Analyt hybridisieren miteinander.
Eine „Lichtquellenmatrix" im Sinne dieser Erfindung ist vorzugsweise eine programmierbare Lichtquellenmatrix, z. B. ausgewählt aus einer Lichtventilmatrix, einem Spiegelarray, einem UV-Laserarray und einem UV-LED-(Dioden)-Array. Die programmierbare Lichtquellenmatrix bzw. Belichtungsmatrix kann eine Reflexionsmatrix, eine Lichtventilmatrix, z. B. eine LCD-Matrix, oder eine selbstemittierende Belichtungsmatrix sein. In bevorzugten Ausführungsformen kann die Lichtventilmatrix eine Strahlungsquelle steuern, die vorzugsweise vorbestimmte Positionen ansteuern kann. Derartige Lichtmatrices sind z. B. in WO 00/13018 offenbart. Vorzugsweise ist die Lichtventilmatrix ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DLP, LCoS-Panels, und LCD-Panels und die Strahlungsquelle, welche vorbestimmte Positionen ansteuern kann, ist ausgewählt aus einem LED-Array und einem OLED-Array.
Eine „miniaturisierte Flusszelle" im Sinne dieser Erfindung ist eine dreidimensionale Mikrokavität, die jeweils über mindestens einen Eingang und einen Ausgang verfügt. Vorzugsweise ist der Innenraum so gestaltet, dass er wie ein einziger langer Kanal von einem oder mehreren Eingängen zu einem oder mehreren Ausgängen führt und somit eine schnelle druckgetriebene Befüllung (Über- und/oder Unterdruck) mit Reagenzien und sonstigen Medien erlaubt. Dieser Kanal hat vorzugsweise einen Durchmesser im Bereich von 10 bis 10.000 μm, besonders bevorzugt von 50 bis 250 μm und kann grundsätzlich in beliebiger Form ausgestaltet sein, z. B. mit rundem, ovalem, quadratischem oder rechteckigem Querschnitt. Die Länge einer Flusszelle kann zwischen 10 μm und 10 cm variieren. Bei Flusszellenlängen, die die Breite bzw. Länge des Trägers überschreiten, kann diese auch mäanderförmig angebracht werden.
Eine "Primerverlängerungsreaktion" im Sinne der Erfindung bezeichnet jede Reaktion, bei der ein Primermolekül, welches an ein Templat hybridisiert ist, in Abhängigkeit von der Sequenz des Templats verlängert wird. Das Templat kann eine Nukleinsäure, d. h. DNA oder RNA, oder ein Nukleinsäureanalogon sein. Falls es sich bei dem Templat um DNA handelt, kann die Primerverlängerungsreaktion durch jede geeignete, dem Fachmann bekannte DNA-abhängige Polymerase erreicht werden. Vorzugsweise ist die DNA-abhängige Polymerase eine DNA-Polymerase, jedoch können auch geeignete DNA-abhängige RNA-Polymerasen in den „Primerverlängerungsreaktionen" der Erfindung Verwendung finden. Falls es sich bei dem Templat um RNA handelt, kann die Primerverlangerungsreaktion durch jede geeignete, dem Fachmann bekannte RNA-abhängige Polymerase erreicht werden. Vorzugsweise ist die RNA-abhängige Polymerase eine RNA-abhängige DNA-Polymerase Solche RNA-abhängigen DNA-Polymerasen sind auch als „Reverse Transkriptasen" bekannt.
Ein „Amplifikation" einer Nukleinsäure im Sinne dieser Erfindung bezeichnet jede Erzeugung eines neuen Nukleinsäurestrangs ausgehend von einem vorhandenen Nukleinsäurestrang. Der Begriff „Amplifikation" schließt somit auch die Synthese eines einzelnen komplementären Strangs in einer Primerverlängerungsreaktion ein. Der Begriff „Amplifikation" umfasst aber auch die Verdoppelung oder weitere Vervielfältigung von Nukleinsäuresträngen in Verfahren wie Polymerasekettenreaktion oder Multiple Displacement Amplification.
5.2 Kurzfassung der Erfindung
In einem ersten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine molekularbiologische Prozessanlage umfassend (a) ein Gerät für die in-situ-Synthese von Arrays von Rezeptoren, (b) ein oder mehrere Elemente für die Abarbeitung fluidischer Schritte, wie der Probenzugabe, Reagenzien-Zugabe, Waschschritte oder/und Probenableitung, (c) eine Detektionseinheit für die Erfassung eines optischen oder elektrischen Signals, (d) eine speicherprogrammierbare Einheit für die Steuerung der Synthese, und (e) eine speicherprogrammierbare Einheit für die Steuerung der Fluidik, der Detektion und der Speicherung und Verwaltung der Messdaten.
In bevorzugten Ausführungsformen dieses ersten Aspekts ist die molekularbiologische Prozessanlage dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere miniaturisierte Flusszellen aufweist und dass ein fluidischer Schritt in dieser einen oder diesen mehreren miniaturisierten Flusszellen 1 min oder weniger, mehr bevorzugt 30 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt 10 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt 1 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,1 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,01 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,001 sec oder weniger und am meisten bevorzugt 0,0001 sec oder weniger dauert. In bevorzugten Ausführungsformen dieses ersten Aspekts ist die molekularbiologische Prozessanlage dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere miniaturisierte Flusszellen aufweist und dass das Fluidvolumen in dieser einen oder diesen mehreren miniaturisierten Flusszellen 40% oder weniger, mehr bevorzugt 25% oder weniger, noch mehr bevorzugt 10% oder weniger, noch mehr bevorzugt 5% oder weniger, noch mehr bevorzugt 1% oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,5% oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,1% oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,01% oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,001% oder weniger und am meisten bevorzugt 0,0001% oder weniger des Volumens der Zuleitung zum Fluidreservoir beträgt. In bevorzugten Ausführungsformen dieses ersten Aspekts ist die molekularbiologische Prozessanlage dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere miniaturisierte Flusszellen aufweist und dass bei der Abarbeitung der fluidischen Schritte mindestens 2, mehr bevorzugt mindestens 5, noch mehr bevorzugt mindestens 10, noch mehr bevorzugt mindestens 100, noch mehr bevorzugt mindestens 500 und am meisten bevorzugt mindestens 1000 unterschiedliche Reagenzien in diese eine oder diese mehreren miniaturisierten Flusszellen eingebracht werden. In besonders bevorzugten Ausführungsformen werden bei der Abarbeitung der fluidischen Schritte diese unterschiedlichen Reagenzien in 10 min oder weniger, vorzugsweise in 1 min oder weniger, mehr bevorzugt in 30 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt in 10 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt in 1 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt in 0,1 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt in 0,01 sec oder weniger und am meisten bevorzugt in 0,001 sec oder weniger in eine oder mehrere miniaturisierte Flusszellen eingebracht.
In einem zweiten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Analyse der Nukleinsäuresequenz eines Nukleinsäureanalyten umfassend die Schritte: (a) in-situ-Synthese wenigstens einer Oligonukleotidsonde in wenigstens einem Synthesebereich in einer miniaturisierten Flusszelle; (b) Zugabe wenigstens eines einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäureanalyten zu den miniaturisierten Flusszellen; (c) Ligation oder sequenzspezifische Hybridisierung des Nukleinsäureanalyten an die Oligonukleotidsonde; und (d) wenigstens ein templat-abhängiger Nukleinsäuresyntheseschritt, der mit einer Änderung in einem optischen oder elektrischen Signal einhergeht.
In bevorzugten Ausführungsformen dieses zweiten Aspekts beträgt das Innenvolumen der Flusszelle aus Schritt (a) vorzugsweise 40% oder weniger, mehr bevorzugt 25% oder weniger, noch mehr bevorzugt 10% oder weniger, noch mehr bevorzugt 5% oder weniger, noch mehr bevorzugt 1% oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,5% oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,1% oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,01% oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,001% oder weniger und am meisten bevorzugt 0,0001% oder weniger des Volumens der Zuleitung zum Fluidreservoir. In bevorzugten Ausführungsformen dieses zweiten Aspekts ist die Flusszelle aus Schritt (a) dadurch gekennzeichnet, dass ein fluidischer Schritt vorzugsweise 1 min oder weniger, mehr bevorzugt 30 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt 10 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt 1 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,1 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,01 sec oder weniger, noch mehr bevorzugt 0,001 sec oder weniger und am meisten bevorzugt 0,0001 sec oder weniger dauert.
In einem dritten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure umfassend die Schritte: (a) in-situ-Synthese wenigstens einer Oligonukleotidsonde in wenigstens einem Synthesebereich in einer miniaturisierten Flusszelle; (b) Zugabe wenigstens eines einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäureanalyten zu den miniaturisierten Flusszellen; (c) Ligation oder sequenzspezifische Hybridisierung des Nukleinsäureanalyten an die Oligonukleotidsonde; und (d) wenigstens eine Runde Nukleinsäureamplifikation.
In bevorzugten Ausführungsformen dieses dritten Aspekts umfasst Schritt (d) den Schritt einer Templat-abhängigen Nukleinsäuresynthese und/oder das Ligieren eines Oligonukleotidprimer oder eines Adapternukleotids an den Nukleinsäureanalyten und/oder den Schritt des Verdaus mit einer Restriktionsendonuklease. In bevorzugten Ausführungsformen dieses dritten Aspekts geht einer oder mehrere der Schritte (a) bis (d) mit einer Änderung in optischen oder elektrischen Eigenschaften einher. Vorzugsweise ist diese Änderung einer optischen Eigenschaft eine Änderung der Lokalisation, der Emission, der Absorption, oder der Menge eines optischen Markers. In bevorzugten Ausführungsformen dieses dritten Aspekts umfasst das Verfahren zusätzlich den Schritt einer in-situ-Synthese wenigstens eines Oligonukleotidprimers in der miniaturisierten Flusszelle, der in seinem Synthesebereich ablösbar befestigt ist. In bevorzugten Ausführungsformen dieses dritten Aspekts umfasst das Verfahren zusätzlich das Freisetzen zweier oder mehr Oligonukleotidprimer und deren Hybridisierung zur Ausbildung eines doppelsträngigen Adapteroligonukleotids. Es ist außerdem bevorzugt, dass das Amplifikationsverfahren ausgewählt ist aus Strand-displacement-Amplifikation, PCR und Rolling-circle-Amplifikation. In bevorzugten Ausführungsformen dieses dritten Aspekts wird das Amplifikationsprodukt von der Oberfläche des der miniaturisierten Flusszelle freigesetzt. Es ist außerdem bevorzugt, dass das Amplifikationsprodukt einem oder mehreren weiteren Verarbeitungs- und/oder Analyseschritten unterzogen wird, die ausgewählt sind aus PCR, Gelelektrophorese, Ligation, Restriktionsverdau, Phosphatase-Behandlung, Kinase-Behandlung, in-vitro-Proteintranslation und in-vivo-Proteintranslation.
In einem vierten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers für die Bestimmung von Nukleinsäure-Analyten durch Hybridisierung, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägerkörpers und (b) schrittweises Aufbauen eines Arrays von mehreren verschiedenen Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga auf dem Träger durch orts- oder/und zeitspezifisches Immobilisieren von Rezeptorbausteinen an jeweils vorbestimmten Positionen auf dem oder im Trägerkörper, wobei man für die Synthese der Rezeptoren mehrere unterschiedliche Sätze von Synthesebausteinen verwendet, um asymmetrische, d. h. aus mehreren unterschiedlichen Arten von Rezeptorbausteinen bestehende Rezeptoren zu erhalten.
In einem fünften Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers für die Bestimmung von Nukleinsäure-Analyten durch Hybridisierung, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägerkörpers und (b) schrittweises Aufbauen eines Arrays von mehreren verschiedenen Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga auf dem Träger durch orts- oder/und zeitspezifisches Immobilisieren von Rezeptorbausteinen an jeweils vorbestimmten Positionen auf dem oder im Trägerkörper, wobei in einer oder mehreren der vorbestimmten Positionen die Nukleotidsequenzen der Rezeptoren derart ausgewählt sind, dass die Rezeptoren in Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen.
In einem sechsten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten Bereiche die Rezeptoren aus mehreren unterschiedlichen Arten von Rezeptorbausteinen bestehen, (b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe und (c) Bestimmen der Analyten über deren Bindung an die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren, wobei die Bindung eines Analyten an einem damit spezifisch bindefähigen Rezeptor zu einer detektierbaren Signaländerung führt.
In einem siebten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten Bereiche die Rezeptoren in Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen, (b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe und (c) Bestimmen der Analyten über deren Bindung an die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren, wobei die Bindung eines Analyten an einem damit spezifisch bindefähigen Rezeptor den Nachweis der Auflösung der in Abwesenheit des Analyten vorliegenden Sekundärstruktur umfasst.
In einem achten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure umfassend die Schritte: (a) in-situ-Synthese wenigstens einer Oligonukleotidsonde in wenigstens einem Synthesebereich in einer miniaturisierten Flusszelle; wobei die Oligonukleotidsonde intramolekulare Hybridisierungsbereiche aufweist; wobei einer der intramolekularen Hybridisierungsbereiche am 3'-Ende der Oligonukleotidsonde positioniert ist; und wobei eine Erkennungssequenz für eine Nicking- Endonuklease (I) in dem Hybridisierungsbereich am 3'-Ende der Oligonukleotidsonde vorhanden ist, oder (II) durch eine sequenzabhängige Verlängerung des Hybridisierungsbereich am 3'-Ende der Oligonukleotidsonde generiert werden kann, oder (III) in dem Hybridisierungsbereich am 3'-Ende der Oligonukleotidsonde partiell vorhanden ist und durch eine sequenzabhängige Verlängerung des Hybridisierungsbereichs am 3'-Ende der Oligonukleotidsonde vervollständigt werden kann; (b) sequenzspezifische Hybridisierung der intramolekularen Hybridisierungsbereiche der Oligonukleotidsonde miteinander; (c) Zugabe einer DNA-Polymerase; (d) sequenzabhängige Synthese eines komplementären DNA-Strangs durch die DNA-Polymerase ausgehend vom 3'-Ende der Oligonukleotidsonde; (e) Zugabe einer Nicking-Endonuclease; (f) Erzeugung eines erkennungssequenzspezifischen Einzelstrangbruchs durch die Nicking-Endonuclease; (g) sequenzabhängige Synthese eines neuen komplementären DNA-Strangs durch die DNA-Polymerase ausgehend vom in (f) erzeugten Einzelstrangbruch unter Verdrängung des zuvor synthetisierten komplementären DNA-Strangs; und (h) optional einmalige oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (f) und (g); wobei Schritt (c) vor, während oder nach Schritt (b) erfolgend kann; und wobei Schritt (e) vor, während oder nach einem der Schritte (b), (c) oder (d) erfolgen kann.
In einem neunten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure umfassend die Schritte: (a) in-situ-Synthese wenigstens einer Oligonukleotidsonde in wenigstens einem Synthesebereich in einer miniaturisierten Flusszelle; (b) Zugabe eines Primermoleküls; wobei der Primer so gestaltet ist, dass er zumindest an seinem 3'-Ende einen zur Oligonukleotidsonde komplementären Bereich aufweist; und wobei eine Erkennungssequenz für eine Nicking-Endonuklease (I) in dem zur Oligonukleotidsonde komplementären Bereich des Primers vorhanden ist, oder (II) durch eine sequenzabhängige Verlängerung des zur Oligonukleotidsonde komplementären Bereichs generiert werden kann, oder (III) in dem zur Oligonukleotidsonde komplementären Bereich des Primers partiell vorhanden ist und durch eine sequenzabhängige Verlängerung des zur Oligonukleotidsonde komplementären Bereichs des Primers vervollständigt werden kann; (c) sequenzspezifische Hybridisierung des Primermoleküls an die Oligonukleotidsonde; (d) Zugabe einer DNA-Polymerase; (e) sequenzabhängige Synthese eines komplementären DNA-Strangs durch die DNA-Polymerase ausgehend vom 3'-Ende des Primermoleküls; (f) Zugabe einer Nicking-Endonuclease; (g) Erzeugung eines erkennungssequenzspezifischen Einzelstrangbruchs durch die Nicking-Endonuclease; (h) sequenzabhängige Synthese eines neuen komplementären DNA-Strangs durch die DNA-Polymerase ausgehend vom in (g) erzeugten Einzelstrangbruch unter Verdrängung des zuvor synthetisierten komplementären DNA-Strangs; und (i) optional einmalige oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (g) und (h); wobei Schritt (d) vor, während oder nach einem der Schritt (b) oder (c) erfolgen kann; und wobei Schritt (f) vor, während oder nach einem der Schritte (b), (c), (d) oder (e) erfolgen kann.
In einem zehnten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure umfassend die Schritte: (a) in-situ-Synthese einer Vielzahl wenigstens einer ersten Oligonukleotidsonde in wenigstens einem Synthesebereich in einer miniaturisierten Flusszelle; (b) in-situ-Synthese einer Vielzahl wenigstens einer zweiten Oligonukleotidsonde in wenigstens einem Synthesebereich in einer miniaturisierten Flusszelle; wobei der Abstand zwischen zwei beliebigen Oligonukleotidsonden jeweils so gewählt ist, dass sie nicht aneinander binden können; wobei jeweils zugehörige erste und zweite Oligonukleotidsonden im selben Synthesebereich synthetisiert werden; (c) Zugabe wenigstens eines einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäureanalyten zu den miniaturisierten Flusszellen; (d) Ligation oder sequenzspezifische Hybridisierung des Nukleinsäureanalyten an eine erste Oligonukleotidsonde; (e) Zugabe einer DNA-Polymerase; (f) sequenzabhängige Synthese eines komplementären DNA-Strangs durch die DNA-Polymerase ausgehend vom 3'-Ende der ersten Oligonukleotidsonde; (g) Ligation oder sequenzspezifische Hybridisierung des in (f) neu synthetisierten DNA-Strangs an eine zweite Oligonukleotidsonde; (h) sequenzabhängige Synthese eines komplementären DNA-Strangs durch die DNA-Polymerase ausgehend vom 3'-Ende der zweiten Oligonukleotidsonde; (i) optional Ligation oder sequenzspezifische Hybridisierung des in (h) neu synthetisierten DNA-Strangs an eine erste Oligonukleotidsonde; und (j) optional einmalige oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (f) bis (i); wobei Schritt (e) vor, während oder nach einem der Schritte (b), (c) oder (d) erfolgen kann.
In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure enthalten die Verfahren einen oder mehrere stringente Waschschritte, vorzugsweise einen stringenten Waschschritt nach Schritt (d) und/oder nach Schritt (f) des zehnten Aspekts.
In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure wird die Menge der neu synthetisierten Nukleinsäuren in Echtzeit bestimmt.
In einem elften Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind; wobei jeder einzelne Rezeptor mindestens einen Hybridisierungsbereich umfasst, an den ein Analyt spezifisch hybridisieren kann; (b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe; (c) Durchführen einer Primerverlängerungsreaktion; wobei der Analyt als Primer fungiert; wobei in der Primerverlängerungsreaktion Bausteine eingebaut werden, die eine oder mehrere signalgebende Gruppen und/oder ein oder mehrere Haptene tragen; und (d) Bestimmung des Analyten über den Einbau signalgruppenhaltiger oder haptenhaltiger Bausteine.
In einem zwölften Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind; wobei jeder einzelne Rezeptor mindestens einen Hybridisierungsbereich umfasst, an den ein Analyt spezifisch hybridisieren kann; (b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe; wobei die Analyten in der Probe vor, während oder nach dem Inkontaktbringen mit einer oder mehreren signalgebenden Gruppen und/oder mit einem oder mehreren Haptenen verknüpft worden sind; (c) Bestimmung des Analyten über die Detektion der signalgebenden Gruppe(n) oder des Haptens/der Haptene im Analyten.
In einem dreizehnten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Amplifikation von Analyten, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind; wobei jeder einzelne Rezeptor an seinem 3'-Ende einen Hybridisierungsbereich aufweist, an den ein Analyt spezifisch hybridisieren kann; (b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe; und (c) Durchführen einer Primerverlängerungsreaktion; wobei die unterschiedlichen Rezeptoren als Primer fungieren, wodurch eine doppelsträngige Nukleinsäure erhalten wird, die aus Analyt und verlängertem Rezeptor besteht.
In bevorzugten Ausführungsformen dieses dreizehnten Aspekts enthält das Verfahren zusätzlich folgende Verfahrenschritte, die sich an Schritt (c) anschließen: (d) Thermische Denaturierung der in Schritt (c) erhaltenen doppelsträngigen Nukleinsäure; (e) Einstellung von Reaktionsbedingungen, die eine Hybridisierung von Analyt und nicht-verlängerten Rezeptoren erlauben; (f) Durchführen einer Primerverlängerungsreaktion, wobei die unterschiedlichen nicht-verlängerten Rezeptoren als Primer fungieren; und (g) optional Wiederholung der Schritte (d) bis (f).
In bevorzugten Ausführungsformen werden in der Primerverlängerungsreaktion (c) und/oder in der Primerverlängerungsreaktion (f) Bausteine eingebaut werden, die eine oder mehrere signalgebende Gruppen und/oder ein oder mehrere Haptene tragen.
In weiter bevorzugten Ausführungsformen enthält das Verfahren zusätzlich folgenden Verfahrensschritt, der während eines der Schritte (c) bis (g) oder nach einem der Schritte (c) bis (g) durchgeführt wird: Bestimmung des Analyten über den Einbau der signalgruppenhaltigen und/oder haptenhaltigen Bausteine.
In bevorzugten Ausführungsformen des dreizehnten Aspekts ist der Analyt eine RNA; wobei die unterschiedlichen Rezeptoren zusätzlich einen Bereich mit einer Primersequenz 1 aufweisen, die 5' zum Hybridisierungsbereich positioniert ist, und wobei das Verfahren zusätzlich folgende Verfahrenschritte aufweist, die sich an Schritt (c) anschließen: (d) Ligation einer Nukleinsäurekassette, die einen Bereich mit einer Primersequenz 2 aufweist, an die in Schritt (c) erhaltene doppelsträngige Nukleinsäure; (e) Durchführen einer Zweitstrangsynthese; (f) Durchführen mindestens eines Zyklus einer Amplifikationsreaktion unter Zugabe eines Primers mit der Primersequenz 1 und eines Primers mit der Primersequenz 2.
In bevorzugten Ausführungsformen werden in Schritt (e) und/oder in Schritt (f) Bausteine eingebaut werden, die eine oder mehrere signalgebende Gruppen und/oder ein oder mehrere Haptene tragen.
In weiter bevorzugten Ausführungsformen enthält das Verfahren zusätzlich folgenden Verfahrensschritt, der während eines der Schritte (e) bis (f) oder nach einem der Schritte (e) bis (f) durchgeführt wird: Bestimmung des Analyten über den Einbau der signalgruppenhaltigen und/oder haptenhaltigen Bausteine.
In einem vierzehnten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers für die Nukleinsäureanalytik und/oder -synthese, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägerkörpers und (b) schrittweises Aufbauen eines Arrays von mehreren verschiedenen Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga auf dem Träger durch orts- oder/und zeitspezifisches Immobilisieren von Rezeptorbausteinen an jeweils vorbestimmten Positionen auf dem oder im Trägerkörper, wobei in mindestens einem Synthesebereich durch orthogonale chemische Verfahren mindestens 2 unterschiedliche Rezeptoren synthetisiert werden.
In einem fünfzehnten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Reagenzienkit, umfassend einen Trägerkörper und mindestens zwei unterschiedliche Sätze von Bausteinen für die Synthese von Rezeptoren auf dem Trägerkörper.
In einem sechzehnten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der molekularbiologische Prozessanlage gemäß dem ersten Aspekt zum Nachweis oder/und zur Isolierung von Nukleinsäuren; zur Sequenzierung; zur Punktmutationsanalyse; zur Analyse von Genomen, Genomvariationen, Genominstabilitäten und/oder Chromosomen; zur Typisierung von Pathogenen; zur Genexpressions- oder Transkriptomanalyse; zur Analyse von cDNA-Bibliotheken; zur Herstellung substratgebundener cDNA-Bibliotheken oder cRNA-Bibliotheken; zur Erzeugung von Arrays für die Herstellung synthetischer Nukleinsäuren, Nukleinsäuredoppelstränge und/oder synthetischer Gene; zur Herstellung von Arrays von Primern, Sonden für homogene Assays, Molecular Beacons und/oder Haarnadel-Sonden; zur Erzeugung von Arrays für die Herstellung, Optimierung und/oder Entwicklung von Antisense-Molekülen; zur weiteren Prozessierung der Analyten oder Zielmoleküle für die logisch nachgeordnete Analyse auf dem Mikroarray, in einem Sequenzierverfahren, in einem Amplifikationsverfahren oder für die Analyse in einer Gelelektrophorese; zur Herstellung von prozessierten RNA-Bibliotheken für nachfolgende Schritte, ausgewählt aus: Translation in vitro oder in vivo oder Modulation der Genexpression durch iRNA oder RNAi; zur Herstellung von Sequenzen, die anschließend mittels Vektoren oder in Plasmiden oder direkt kloniert werden; und/oder zur Ligation von Nukleinsäuren in Vektoren oder Plasmide.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorgenannten Verfahren und Verwendungen ist der Analyt oder Nukleinsäureanalyt oder die nachzuweisende und/oder zu isolierende Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: eine microRNA, eine zu einer microRNA korrespondierende cDNA, eine pathogen wirkende Nukleinsäure, und eine aus einem Pathogen stammende Nukleinsäure.
Im Folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform für den spezifischen Nachweis von Nukleinsäuren resp. Poly-Nukleotiden beschrieben. In dieser Ausführungsform wird die Spezifität der Hybridisierung mit der Parallelität eines Mikroarrays und der Amplifikation wie in einer konventionellen PCR Amplifikation in dem erfindungsgemäßen Verfahren integriert.
Als miniaturisierter Reaktionsträger wird eine Mikrostruktur mit dreidimensionalen Mikrokavitäten eingesetzt, die jeweils über mindestens einen Eingang und einen Ausgang verfügen. Vorzugsweise ist der Innenraum so gestaltet, dass er wie ein einziger langer Kanal von einem Eingang zu einem Ausgang führt und somit eine schnelle druckgetriebene Befüllung mit Reagenzien und sonstigen Medien erlaubt.
Dieser Reaktionsträger wird zunächst durch eine in-situ-Synthese z. B. mit Oligonukleotiden, Oligonukleotidderivaten oder Oligonukleotidanaloga bestückt, die in Reihen und Spalten separater Reaktionsfelder angeordnet sind. Die einzelnen Reaktionsfelder haben vorzugsweise Ausmaße von kleiner als 100 × 100 μm.
Damit stehen in dem Reaktionsträger funktionelle biologische Moleküle zur Verfügung, die über eine spezifische Hybridisierung nun selektiv Nukleinsäuren binden können, die in einer zugegebenen Probe enthalten sind. Diese Zielmoleküle werden demnach in Abhängigkeit der Sequenzen gebunden, die zuvor während der in-situ-Synthese erzeugt wurden. Im nächsten Schritt werden alle nicht in gewünschtem Maße gebundenen Nukleinsäuren weggewaschen. Es bleiben nur die spezifisch gebundenen Nukleinsäuren zurück. Allerdings kann die Menge dieser gebundenen Nukleinsäuren unterhalb der Nachweisgrenze eines dem Stand der Technik entsprechenden konfokalen, z. B. auf einem scannenden Laser basierenden, oder parallelen, z. B. auf CCD Chips basierenden, optischen Detektors liegen.
Nun erfolgt mit dem gebundenen Material eine unspezifische oder spezifische enzymatische Amplifikation, die nicht auf zusätzliche spezifische Primer angewiesen ist. Dazu sind dem Fachmann zahlreiche Verfahren bekannt. Für eine Amplifikation über PCR kann an die gebundenen Nukleinsäuren eine Kassette ligiert werden, die die notwendigen Primersequenzen enthält. Dazu kann es hilfreich sein, die Probe zunächst mit einer oder mehreren Restriktionsnukleasen zu behandeln, so dass die dem Fachmann bekannten spezifischen Sequenzen an den Schnittstellen entstehen. Alternativ kann auf kommerzielle Kits, wie z. B. den „GenomePlex Whole Genome Amplifikation WGA Kit", erhältlich von Rubicon Genomics, USA, resp. von Sigma-Aldrich, USA, zurückgegriffen werden.
Nach dem Amplifikations-Schritt lässt man das Nukleinsäure-Material erneut mit den Oligonukleotiden des Arrays hybridisieren. Eventuell ist es hilfreich, noch weitere Zwischenschritte, wie einen Heizschritt zur Trennung der Stränge, durchzuführen. Wichtig ist in allen Schritten, dass jeweils vor einem Wasch-Schritt bzw. nach einem Prozessierungsschritt die Gelegenheit besteht, dass diejenigen Zielmoleküle, die weiter bearbeitet werden sollen, an der Matrix aus funktionalen biologischen Molekülen, also in dieser Ausführungsform an dem Mikroarray aus Oligonukleotiden, binden können. Nach dem Hybridisier-Schritt wird erneut gewaschen und damit alles unspezifische Material ganz oder teilweise entfernt.
Jetzt kann die Detektion durchgeführt werden, die wie oben beschrieben mit verschiedenen dem Fachmann für die Anwendung von Mikroarrays bekannten Verfahren und Vorrichtungen erfolgen kann. Beispiele hierfür sind Mikroskope, optische Scanner, Laser-Scanner, konfokale Scanner, oder parallele, z. B. auf CCD-Chips basierende, optische Detektoren, die mehr als eine Messstelle auf einmal aufnehmen, oder sogar den ganzen Reaktionsträger im Ganzen aufnehmen können, und Mischformen der oben beschriebenen Vorrichtungen, wie z. B. Scanner mit CCD-Zeilen. Beispiele für Signale, die bei der Analyse der Reaktionsergebnisse auf dem Reaktionsträger bzw. Array genutzt werden können, sind unter anderem die folgenden in der Fachwelt gut bekannten Signale:

– Optische Signale
– Fluoreszenz (organische und anorganische Fluorophore, fluoreszente Biomoleküle),
– Lichtstreuung (z. B. Goldpartikel in nm-Dimensionen),
– Chemilumineszenz,
– Biolumineszenz;
– Elektrische Signale
– Stromfluss,
– Redoxreaktionen.

Alternativ zur Detektion kann zunächst durch Wiederholen der Wasch-Trenn-Schritte eine weitere Anreicherung des Ergebnis-relevanten Materials erreicht werden, außerdem kann das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert werden.
Ein wichtiges technisches Merkmal der dafür notwendigen Anlage ist ein geeigneter Fluid- resp. Reagenzienwechsel. Insbesondere Anlagen mit der Möglichkeit zum schnellen und automatisierbaren Wechsel der Fluide resp. Reagenzien sind daher Gegenstand dieser Erfindung. Solche Anlagen sind in WO 00/13017 und in WO 00/13018 beschrieben, auf die hier als Referenz verwiesen wird.
6 Bevorzugte Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung wird jetzt weiter genauer beschrieben. In den folgenden Absätzen werden unterschiedliche Aspekte, Merkmale und Ausführungsformen der Erfindung in größerem Detail beschrieben. Jeder so definierte Aspekt, jedes Merkmal, jede Ausführungsform kann mit jedem anderen Aspekt, jedem anderen Merkmal oder jeder anderen Ausführungsform kombiniert werden, sofern nicht ausdrücklich Gegenteiliges angegeben ist. Dies schließt auch multiple Kombinationen von Aspekten, Merkmalen oder Ausführungsformen ein. Insbesondere kann jedes bevorzugte Merkmal oder jede bevorzugte Ausführungsform mit einer oder mehreren bevorzugten Merkmalen oder bevorzugten Ausführungsformen kombiniert werden.
6.1 Primer in DNA-Processor
Es werden Oligonukleotide, Oligonukleotidderivate oder Oligonukleotidanaloga im Reaktionsträger in der Weise synthetisiert, dass ihr 3'-OH-Ende für eine Polymerase verlängerbar ist. Dies kann z. B. durch Verknüpfung des 5'-Endes an den Reaktionsträger mit frei bleibendem 3'-OH-Ende realisiert werden. An die angeknüpften Moleküle werden durch eine Polymerase kopierbare, zu analysierende Nukleinsäuren hybridisiert und das 3'-OH Ende der Sonden durch die Polymerase durch Verknüpfung von Nukleotiden oder Nukleotidanaloga verlängert. Während der Verlängerung kann, muss aber nicht, eine Kopie des hybridisierten Moleküls erstellt werden. Insbesondere kann der neugebildete Strang einer anderen Verbindungsklasse angehören als der hybridisierte Strang, so können zum Beispiel Nukleinsäurederivate und -analoga in den Strang eingebaut werden oder angeknüpft werden. Der Reaktionsverlauf kann optional optisch verfolgt werden, z. B. durch Einbau modifizierter Nukleotide oder Anwesenheit zusätzlicher signalgebender Substanzen, die z. B. mit DNA Wechselwirken. Alternativ kann auch das hybridisierte, nicht im Reaktionsträger hergestellte Molekül als Primer fungieren und verlängert werden. Auch hier kann, muss aber nicht, eine Kopie des im Reaktionsträger hergestellten Moleküls erstellt werden. Ein Beispiel für eine Verlängerung des als Primer fungierenden Moleküls, bei dem keine Kopie des hybridisierten Stranges erstellt wird, sind templatunabhängige Verlängerungsreaktionen wie sie dem Fachmann bekannt sind. Dies kann z. B. die Herstellung von Poly-A-schwänzen sein, die durch bestimmte Polymerasen gebildet werden.
6.2 Integrierte Probenvorbereitung
Methoden zur Aufbereitung oder Vorbereitung einer analytischen Methode können auch direkt im Reaktionsträger durchgeführt werden. Hierzu gehören zum Beispiel die Entfernung oder Umwandlung störender Begleitstoffe (etwa durch enzymatische Prozessierung), Anknüpfung von signalgebenden Gruppen oder ihren Vorläuferstufen und Anknüpfung bestimmter Gruppen zur Bindung von Liganden wie Proteinen, Nukleinsäuren, signalgebenden Molekülen oder ihren Vorläuferstufen. Diese Anknüpfungen können durch dem Fachmann bekannte chemische oder z. B. auch enzymatische Methoden erfolgen. Der Reaktionsträger kann weiterhin zur Aufreinigung von Probenmolekülen verwendet werden, die auf der Affinität der gewünschten Probenmoleküle aus dem biologischen Probengemisch zu auf der Oberfläche des Reaktionsträgers befindlichen Sondenmolekülen beruht. Diese der Affinitätschromatographie ähnliche Methode beruht auf der Bindung der Probenmoleküle an die genannten Sondenmoleküle und einem oder mehreren Waschschritten, bei denen auch die Temperatur variiert werden kann.
6.3 Verfahren zur Erzeugung von Volllängen-cDNA-Bibliotheken an fester Phase
Hierzu werden „capture oligos" im Reaktionsträger so synthetisiert, dass sie mit ihrer Sequenz für alle oder eine Auswahl von Genen für einen Bereich ,downstream' vom poly-A Schwanz spezifisch sind. Dabei kann es vorteilhaft sein, diesen Bereich in der Nähe des 5'-Endes zu wählen. Damit werden aus einer mRNA-Präparation oder einer bereits weiter prozessierten mRNA-Population (z. B. einer cDNA-Bibliothek) entsprechende Transkripte spezifisch festphasengestützt extrahiert.
Als nächsten Schritt können bei Synthese von capture oligos mit distalem 3'-Ende komplementäre Stränge zu dem isolierten Strang synthetisiert werden. Dies erfolgt unter Zugabe entsprechender dem Fachmann bekannter Enzyme und sonstiger Einsatzstoffe.
In einem weiteren Schritt können nun Abschriften des kovalent mit der Festphase verknüpften Stranges gemacht werden. Alle Volllängen-Sequenzen (ab der Bindungsstelle der capture oligos) haben definitionsgemäß einen poly-T-Abschnitt am distalen Ende des Stranges. Dieser kann für eine lineare Amplifikation mit entsprechenden poly-A-Primern genutzt werden. Ein Vorteil einer solchen linearen Amplifikation ist die geringe Verzerrung der Konzentrationsverhältnisse einzelner Transkripte zueinander. Alternativ können im capture oligo auch proximal zum Träger konservative Primer-Sequenzen eingefügt werden, die eine exponentielle Amplifikation der isolierten Stränge erlauben.
6.4 Kombination von cDNA-Bibliotheken an fester Phase mit Analyse auf einem Array
In einer weiteren Ausführungsform werden die Isolation und Amplifikation von Transkripten oder von genomischen oder sonstigen Sequenzen, wie sie oben beschrieben sind, mit der Analyse auf einem in situ synthetisierten Polymersonden-Array so kombiniert, dass entweder beide Arten von Oligo (capture oligo und Analyse-Oligo) in einem gemeinsamen Träger untergebracht sind oder in automatisch miteinander verbundenen Kompartimenten des Trägers.
In einem Beispiel können mit 35mer capture oligos bei relativ hoher Stringenz oder Temperatur Zielmoleküle isoliert und wie oben beschrieben amplifiziert werden. Im selben Reaktionsträger wurden zuvor ebenfalls deutlich kürzere Analyse-Oligos von z. B. 20 Nukleotiden Länge synthetisiert. Dem Fachmann ist ersichtlich wie durch die unterschied liche Länge der Oligos anhand von Stringenz oder Temperatur eine serielle Abarbeitung der Prozessschritte Isolation, Amplifikation und Analyse durchgeführt werden können.
Kompartimente, die einzelne Prozessschritte seriell beinhalten, können durch hydrophobe Barrieren, Ventile, getrennte Reaktionskammern oder ähnliche technische Details des Reaktionsträgers, die aus der Mikroreaktortechnik bekannt sind, geschaffen werden.
6.5 „Sequencing by synthesis" in der erfindungsgemäßen Prozessanlage
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer weiteren Ausführungsform dazu verwendet werden, ein „sequencing by synthesis" durchzuführen. Dabei wird zunächst im Reaktionsträger ein Mikroarray aus Oligonukleotiden, Oligonukleotidderivaten oder Oligonukleotidanaloga (Sonden) hergestellt und mit einer zu analysierenden Nukleinsäureprobe hybridisiert. Die im Mikroarray hergestellten Moleküle enthalten freie 3'-OH-Enden, so dass – wie dem Fachmann bekannt – eine Verlängerung der Enden durch eine Polymerase möglich wird. Es sind mehrere Verfahren bekannt, die eine Anlagerung nur eines Nukleotids und die Verbindung des Phosphat-Rückgrates erlauben, da die Nukleotide noch eine blockierende Gruppe enthalten. Diese blockierende Gruppe kann innerhalb des miniaturisierten Reaktionsträgers abgespalten werden, so dass ein durch eine Polymerase verlängerbares Nukleotid entsteht. Zur Detektion kann das Nukleotid z. B. signalgebende Gruppen oder deren Precursor enthalten, die ebenfalls innerhalb des miniaturisierten Reaktionsträgers abgespalten werden können (etwa Fluorophore). Alternativ kann die abspaltbare blockierende Gruppe von einem mit einer signalgebenden Gruppe oder ihrem Precursor verknüpften Liganden (z. B. fluoreszenzmarkierter Antikörper) gebunden werden. Durch Zyklen aus Nukleotidaddition, optional Ligandbindung, Detektion, Abspaltung der blockierenden Gruppe (und optional der signalgebenden Gruppe) und neuerlicher Nukleotidaddition können so Sequenzen gebundener zu analysierender Nukleinsäuremoleküle aufgeklärt werden.
Die erfindungsgemäße Prozessanlange bietet für diese Technologie erhebliche Vorteile im Vergleich zu dem Fachmann bekannten Testformaten.
In z. B. den von 454 Life Sciences, Helicos oder Solexa entwickelten Testsystemen die unter 2.3 genauer beschrieben wurden (Gennett ST, Barnes C, Cox A, Davies L, Brown C. Pharmacogenomics. 2005 Jun; 6(4): 373–82. Warren RL, Sutton GG, Jones SJ, Holt RA. Bioinformatics. 2006 Dec 8; [Epub ahead of print]. Bentley DR. Curr Opin Genet Dev. 2006 Dec; 16(6): 545–52. Gennett S. Pharmacogenomics. 2004 Jun; 5(4): 433–8. Margulies, M. Eghold, M. et al. Nature. 2005 Sep 15; 437(7057): 326–7. Patrick Ng, Jack J. S. Tan, Hong Sain Ooi, Yen Ling Lee, Kuo Ping Chiu, Melissa J. Fullwood, Kandhadayar G. Srinivasan, Clotilde Perbost, Lei Du, Wing-Kin Sung, Chia-Lin Wei and Yijun Ruan Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 12. Robert Pinard, Alex de Winter, Gary J Sarkis, Mark B Gerstein, Karrie R Tartaro, Ramona N Plant, Michael Egholm, Jonathan M Rothberg, and John H Leamon BMC Genomics 2006, 7: 216. John H. Leamon, Michael S. Braverman and Jonathan M. Rothberg, Gene Therapy and Regulation, Vol. 3, No. 1 (2007) 15–31) werden die zu untersuchenden Genabschnitte ohne Information über ihre Identität auf Oberflächen immoblisiert um sie anschließend nach der beschriebenen Methode zu sequenzieren. Die Information über längere Genabschnitte wird dann durch Assemblierung der kleinen Einzelinformation bioinformatisch erhalten. Dies hat zur Folge, dass immer das gesamte Genom analysiert werden muss und die Zahl und Länge der einzelnen sequenzierten Bereiche eine kritische Größe überschreiten müssen, um eine Assemblierung durch genug Überlappung der Abschnitte überhaupt zu ermöglichen. In vielen Fällen besteht jedoch nur für die Sequenz eines Teiles des Genoms Interesse. In der erfindungsgemäßen Prozessanlage ist es möglich, gewünschte Genabschnitte durch sequenzspezifische Immobilisierung (Hybridisierung des gewünschten Abschnittes an eine dafür spezifische, im Reaktionsträger der erfindungsgemäßen Prozessanlage synthetisierte Sonde) gezielt für die Sequenzierung auszuwählen. So können durch Wahl der Anzahl und Sequenz der im Reaktionsträger der erfindungsgemäßen Prozessanlage synthetisierten und bereitgestellten Sonden die Zahl und Identität der gewünschten Genabschnitte der Probe festgelegt werden. Es existiert dabei keine Limitierung in Bezug auf die Zahl, Art oder Mindestlänge der sequenzierten Abschnitte, da keine anschließende bioinformatische Assemblierung erfolgen muss.
In dieser bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Prozessanlage insbesondere für eine mehrschrittige Bearbeitung und Analyse von Probenmaterial in folgender Weise verwendet werden: Durch die Bereitstellung von Sonden im Reaktionsträger der erfindungsgemäßen Prozessanlage, die für zu analysierende Genabschnitte spezifisch sind, können zunächst gewünschte Genabschnitte durch Bindung an die Sonden ausgewählt werden. Es kann optional ein Waschschritt erfolgen, um unerwünschtes Probenmaterial aus dem Reaktionsträger zu entfernen. Es kann dann eine Amplifikation des Probenmateriales erfolgen, die bereits Information über die Sequenz der gebundenen liefern kann. Dem Fachmann sind dafür zahlreiche Methoden bekannt. Es kann dann optional eine Sequenzierung der gebundenen und optional amplifizierten Probenmoleküle nach der beschriebenen Methode erfolgen. Eine solche sequenzielle Bearbeitung und Analyse von Probenmaterial wird durch die Bauart des Reaktionsträgers als Mikrofluidikeinheit erheblich vereinfacht und bietet damit eine wesentliche Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik.
6.6 Amplifikation des Signals statt des Zielmoleküls in einem der Schritte nach der ersten initialen Bindung
Beispiele für solche Signalamplifikation sind dem Fachmann bekannt, dazu zählen u. a. Rolling Circle Amplification, Tyramid-vermittelte Amplifikation, Chemilumineszenz und Biolumineszenz, Phosphatase-induzierte Amplifikation oder die Dekoration der gebundenen Zielmoleküle durch ein oder mehrere weitere Oligonukleotide, die ihrerseits bereits markiert sind, wie z. B. bei Verwendung von „branched DNA" oder „bDNA" der Firma Genospectra, USA (Collins M. L. et al.; Nucleic Acids Res. 25(15); 2979–2984; 1997). Bevorzugt können Konjugate aus Streptavidin und einem über das 5'-Ende daran geknüpften Oligonukleotid verwendet werden. Diese können an zuvor an das Probenmolekül oder an das Probenmolekül bindende Sondenmoleküle angebrachte Biotineinheiten binden. Anschließend kann nach Zugabe einer zirkulären Nukleinsäure unter Verwendung der an das Streptavidin gebundenen Oligonukleotide eine dem Fachmann bekannte Rolling-circle-Amplifikation stattfinden. Die Verwendung eines Verfahrensschrittes (nach der letzten ausreichend erachteten Bindung oder zwischendurch), der eine Amplifikation des Messsignals anstelle einer weiteren Amplifikation des Zielmoleküles ermöglicht, kann sich günstig auf die Kosten des Assays auswirken. Ein weiterer Vorteil kann in einer möglichst niedrigen Verzerrung des Verhältnisses der Zielmoleküle in der Probe liegen.
6.7 Reaktionsträger
Für die meisten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren und molekularbiologischen Prozessanlagen sind mehrere Reaktionsträger verwendbar. Wichtig ist die gezielte Zuführung von Reagenzien resp. Fluiden sowie die entsprechende Bestückung mit funktionalen biologischen Molekülen durch orts- oder/und zeitaufgelöste Immobilisierung. Die Reaktionsträger können prinzipiell flache Glasplättchen sein, wie man sie als Mikroskop-Objektträger und für Mikroarrays kennt, wobei die Oberflächen mit einer der zahlreichen dem Fachmann bekannten Konfigurationen für die Bindung von Molekülen vorbereitet sein können, wie z. B. durch reaktive oder aktivierbare funktionale Gruppen (Epoxygruppen, Aminogruppen etc.). Alternativ kann auf den Reaktionsträgern eine weitere Schicht wie z. B. ein Gel, ein Polyacrylamid oder eine poröse Beschichtung aufgebracht sein, die auch die Beladungskapazität der Reaktionsträger erhöhen kann.
Die Reaktionsträger können die Form von dreidimensionalen Mikrostrukturen haben, wie sie z. B. in WO 00/13018 , in WO 02/46091 und in WO 01/08799 beschrieben sind. Demnach können die Reaktionsträger eine Vielzahl von kleinen Löchern oder Poren enthalten, die parallel oder orthogonal zu Zu- und Ableitungen angeordnet sein können. Alternativ kann es sinnvoll sein, einen Träger zu verwenden, der physikalisch, elektrostatisch, fluidisch oder chemisch ein Set an Beads, Mikrosphären oder Mikropartikeln immobilisiert, wie z. B. in WO 02/32567 beschrieben oder von der Firma Illumina, USA, bekannt.
Außer Glas sind für die Reaktionsträger viele andere organische und anorganische Materialien wie z. B. Silizium, Plastik, Kunststoff, Polypropylen, Harze, Polycarbonat, cylische Olefin-Copolymere oder Mischungen dieser Materialien bekannt.
Dreidimensionale Strukturen können mit geeigneten Anschlusstechniken direkt in die erfindungsgemäße Anlage integriert werden. Flache oder nicht-geschlossene Reaktionsträger werden entsprechend in einer Flusszelle oder einem anderen dreidimensionalen Reaktionsraum eingebracht, so dass der notwendige Reagenzien- oder Fluidwechsel erfolgen kann. Diese Konstrukte können permanent sein, so dass für den normalen Betrieb kein Wechsel der eigentlichen flachen oder nicht geschlossenen Reaktionsträger vorgesehen ist. Dies kann durch Kleben, Verschrauben, indirekte Halterung, Klemmen oder Einspannen erfolgen. Ebenso kann es vorgesehen sein, dass die Reaktionsträger reversibel in den dreidimensionalen Reaktionsraum eingebracht werden. Dem Fachmann sind Methoden zur Halterung von Reaktionsträgern in Flusszellen und Messeinrichtungen bekannt.
Die dreidimensionalen Reaktionsräume oder geschlossenen Strukturen werden dann mit entsprechenden Anschlüssen für die Versorgung mit Fluiden und Reagenzien versehen.
6.8 Oligos werden enzymatisch abgeschrieben
Die im Reaktionsträger hergestellten Moleküle können als Templat fungieren und werden abgeschrieben. Dies kann nicht nur zur Analyse des Reaktionsträgers verwendet werden, wenn signalgebende Bausteine beim Abschreiben eingebaut werden, sondern kann genutzt werden, um eine Kopie des Reaktionsträgers in Form eines Gemisches löslicher Abschriften der im Reaktionsträger synthetisierten Moleküle zu erzeugen. Der Reaktionsträger kann danach z. B. für eine neue Abschrift wieder verwendet werden. Ein Beispiel für einen solchen Prozess ist die Abschrift von DNA Molekülen im Reaktionsträger durch eine Primer-Extension-Reaktion durch eine Polymerase. Hierbei kann durch Verwendung einer thermostabilen Polymerase auch eine Amplifikation erfolgen, wenn zum Beispiel durch einen Überschuss an Primer und geeignete Veränderungen der Temperatur während der Reaktion ein wiederholtes Binden und Verlängern der Primer durchgeführt wird. Die entstandenen Abschriften können dann durch Waschen aus dem Reaktionsträger isoliert werden. Eine Primer-Extension-Reaktion kann auch ohne Waschen genutzt werden, um z. B. im Reaktionsträger synthetisierte DNA-Einzelstränge in Doppelstränge umzuwandeln. Diese können zur Analyse z. B. von Proteinen dienen, die doppelsträngige DNA binden oder modifizieren.
Während des Abschreibevorgangs der Moleküle des Reaktionsträgers kann auch eine andere Molekülart entstehen. So kann z. B. im Reaktionsträger synthetisierte DNA in RNA umgeschrieben werden. Dies kann zum Beispiel durch die beschriebene vorherige Umwandlung der im Reaktionsträger synthetisierten DNA-Einzelstränge in Doppelstränge und anschließende Transkription erfolgen. Dem Fachmann sind hierfür zahlreiche Methoden bekannt. Es können außerdem Nukleinsäureanaloga oder -derivate eingebaut oder angeknüpft werden, die keine natürlichen DNA- oder RNA-Bausteine sind.
23 illustriert die beschriebene Ausführungsform und zeigt Daten von Experimenten, die ein erfolgreiches Kopieren von auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Sondenmolekülen nach Art einer Primer Extension beweisen. Die erstellten Kopien können dann durch Waschen aus dem Reaktionsträger herausgelöst werden und erfolgreich als Templat in einer PCR-Reaktion verwendet werden, wobei sie vermehrt werden.
6.9 Konfigurationen der im Reaktionsträger synthetisierten Moleküle
Die im Reaktionsträger synthetisierten Moleküle können verschiedenen Verbindungsklassen zugehörig sein. Es können z. B. DNA- oder RNA-Moleküle aber auch Peptide im Reaktionsträger synthetisiert werden. Es ist weiterhin möglich, verschiedene Derivate und/oder Analoga dieser Verbindungsklassen im Reaktionsträger zu synthetisieren. Hierzu gehören Peptidnukleinsäuren (PNA) Locked-Nukleinsäuren (LNA), verschiedene nukleobasenmodifizierte Nukleinsäurederivate und -analoga, wie z. B. Nukleinsäuren mit verändertem Hybridisierungsverhalten oder angeknüpften funktionalen Gruppen wie Haptene, Fluoreszenfarbstoffe, lumineszenzfähige Gruppen oder deren Precursor, photoreaktive Gruppen, anorganische Partikel, photoisomerisierbare Gruppen oder Gruppen mit einem gewünschten bestimmten Bindungs- oder Reaktionsverhalten oder einem gewünschten optischen Verhalten. Hierzu gehören unter anderem aber nicht ausschließlich Goldnanopartikel, Stilbene, Azobenzene, Nitrobenzylverbindungen, Biotin, Digoxigenin, Quantenpunkte, Phosphat, Phosphorthioate, Gruppen, die die Stabilität des Moleküls z. B. gegenüber Enzymen erhöhen, Gruppen, die Substrate für Enzyme darstellen usw.
Es können ebenfalls Gemische aus Molekülen im Reaktionsträger hergestellt werden. Die Moleküle können auch Verzweigungen oder dendritische Strukturen beinhalten. Es ist weiterhin möglich, Moleküle im Reaktionsträger zu synthetisieren, die mehreren Verbindungsklassen zugehörig sind oder aus verschiedenen, verknüpften Teilen bestehen, die jeweils unterschiedlichen Verbindungsklassen zugehörig sind. Die Verknüpfung kann direkt oder über bestimmte Linkergruppen erfolgen. So können zum Beispiel Nukleinsäuren mit Peptiden und/oder Proteinen verknüpft sein. Allgemein können zur Erzeugung und Veränderung der gewünschten Moleküle nicht nur z. B. organisch-chemische Methoden verwendet werden, sondern auch z. B. enzymatische Methoden.
6.10 Herstellung von unterschiedlichen Reagenzien für das neue molekularbiologische Verfahren im gleichen Reaktionsträger (spezifische Primer oder sonstige funktionale Oligonukleotidsonden)
Die spezifischen Primer, Aptamere, Ribozyme, Aptazyme oder sonstigen Oligonukleotidsonden oder funktionalen Oligonukleotide oder Polynukleotide können im gleichen Reaktionsträger und in manchen Ausführungsformen auch auf dem gleichen Array hergestellt und in einem der Prozessschritte in Lösung gebracht werden. Dazu können sie entweder mit geeigneten labilen Linker ausgestattet sein oder als Kopien von auf dem Reaktionsträger erzeugten Oligonukleotidsonden hergestellt werden. Durch Einsatz bekannter Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays aus Nukleinsäurepolymeren, z. B. in Form eines so genannten Mikroarrays, können sehr viele (typischerweise mehr als 10) unterschiedliche Nukleinsäurepolymere von mindestens mehr als 2, typischerweise mehr als 10 Basen Länge, erzeugt werden.
In einer Ausführungsform wird ein Teil des Mikroarray resp. der Nukleinsäuren, die dort immobilisiert wurden, als kopierfähige Matrizen für die enzymbasierte Synthese mittels Kopiervorgang vorgesehen. Sie stehen nach ihrer eigentlichen Synthese in kopierfähigem Zustand zur Verfügung und können in einem enzymbasierten Verfahren unter Zugabe entsprechender Reagenzien und Hilfsstoffe, wie Nukleotiden, vervielfältigt werden.
Der nächste Schritt im erfindungsgemäßen Verfahren besteht nun darin, die an der festen Phase synthetisierten Moleküle mit Hilfe entsprechender Enzyme zu kopieren. Dazu sind zahlreiche Enzym-Systeme bekannt und kommerziell erhältlich. Beispiele hierfür sind DNA-Polymerasen, thermostabile DNA-Polymerasen, Reverse Transkriptasen und RNA-Polymerasen.
Die Reaktionsprodukte zeichnen sich durch große Vielfalt der Sequenz aus, die indirekt über die Matrizen-Moleküle während des vorgeschalteten Synthesevorgangs frei wählbar programmiert werden kann. Ein Mikroarray aus dem Geniom-Instrument kann in einem Mikro-Kanal als Reaktionsraum 6.000 frei wählbare Oligonukleotide mit einer Sequenz von bis zu 30 Nukleotiden in einer Mikroarray-Anordnung synthetisieren. Nach dem Kopierschritt liegen entsprechend bis zu 6.000 frei programmierbare DNA-30mere oder RNA-30mere in Lösung vor und können als Reaktanden für einen nächsten Verfahrensschritt zur Verfügung gestellt werden.
Für den Start des Kopierschritts wird es dabei in einigen Ausführungsformen notwendig sein, so genannte Primer-Moleküle zuzugeben, die als Initiationspunkt für Polymerasen dienen. Diese Primer können aus DNA, RNA, einem Hybrid der beiden oder aus modifizierten Basen bestehen. Auch der Einsatz von Nukleinsäure-Analoga, wie PNA- oder LNA-Molekülen als Beispiel, ist in bestimmten Ausführungsformen vorgesehen. Zur Schaffung einer Erkennungsstelle für den Primer kann es zweckmäßig sein, am Ende eines jeden Nukleinsäurepolymeres auf dem Träger eine einheitliche Sequenz hinzuzufügen, entweder als Teil der Synthese oder in einem zusätzlichen Schritt mittels einer enzymatischen Reaktion, wie einer Ligation einer vorgefertigten Nukleinsäure-Kassette. In einer Variante ist das distale Ende der am Träger synthetisierten Sequenz selbstkomplementär und kann so einen hybriden Doppelstrang ausbilden, der von den Polymerasen als Initiationspunkt erkannt wird.
Beispiele für erfindungsgemäße Ausführungsformen des Verfahrens und von Prozessschritten mit Verwendung solcher frei in Lösung vorliegenden Nukleinsäurepolymere sind:

– die Herstellung von Primer für Primer-Extension-Methoden, Strand-Displacement-Amplifikation, Polymerase Chain Reaction, Site Directed Mutagenesis oder Rolling Circle Amplifikation,
– Weitere Prozessierung der Analyten oder Zielmoleküle für die logisch nachgeordnete Analyse auf dem Mikroarray, in einem Sequenzierverfahren, in einem Amplifikationsverfahren (Strand Displacement Amplifikation, Polymerase Chain Reaction oder Rolling Circle Amplifikation) oder für die Analyse in einer Gelelektrophorese,
– Herstellung von prozessierten RNA-Bibliotheken für nachfolgende Schritte, wie die Translation in vitro oder in vivo oder die Modulation der Genexpression durch iRNA oder RNAi,
– Herstellung von Sequenzen, die anschließend mittels Vektoren oder in Plasmiden oder direkt kloniert werden,
– Ligation der Nukleinsäuren in Vektoren oder Plasmide.

Allen diesen Verfahren ist die Nutzung von Nukleinsäuren als hybridisierfähigem Reagenz gemeinsam. Darüber hinaus gibt es auch noch Verfahren, die Nukleinsäurepolymere nicht oder nicht ausschließlich über eine Hybridisierungsreaktion nutzen. Hierzu gehören Aptamere, Ribozyme und Aptazyme.
Die Herstellung der Nukleinsäurepolymere für das erfindungsgemäße Verfahren über eine Kopierreaktion bietet als zusätzlichen Vorteil an mehreren Stellen des Verfahrens die Möglichkeit, mit bekannten Methoden in die Reaktionsprodukte Modifikationen oder Markierungen einzuführen. Hierzu zählen markierte Nukleotide, die z. B. mit Haptenen oder optischen Markern, wie Fluorophoren und Lumineszenz-Markern, modifiziert sind, markierte Primer oder Nukleinsäure-Analoga mit besonderen Eigenschaften, wie z. B. besondere Schmelztemperatur oder Zugänglichkeit für Enzyme.
Die Initiation an den Matrizen-Nukleinsäuren kann prinzipiell mit allen Methoden erfolgen, die dem Fachmann für die Initiation eines enzymatischen Kopiervorgangs von Nukleinsäuren bekannt sind, also z. B. aus den Anwendungen Polymerase Chain Reaction, Strand Displacement und Strand Displacement Amplification, in-vitro-Replikation, Transkription, Reverse Transkription oder virale Transkription (Vertreter hiervon sind T7, T3 und SP6).
In einer Ausführungsform wird ein T7-, T3- oder ein SP6-Promoter in einen Teil oder alle Nukleinsäurepolymere am Reaktionsträger eingefügt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden im Reaktionsträger Nukleinsäuremoleküle synthetisiert, die zur Bindung von microRNAs dienen. Die Nukleinsäuremoleküle können aus DNA bestehen, aber auch aus Nukleinsäureanaloga, die ein verändertes Hybridisierungsverhalten aufweisen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Nukleinsäuren, die an die im Reaktionsträger synthetisierten Moleküle gebunden sind, durch enzymatische Methoden mit einer universellen Gruppe verknüpft. Dies kann durch Verlängerung durch templatunabhängige Polymerasen erfolgen wie z. B. Poly-A-Polymerase oder Telomerase.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Primer-Extension-Reaktion verwendet, um aus im Reaktionträger synthetisierten einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen Doppelstränge zu generieren. Diese können zur Analyse von Bindungs- oder Modifikationsereignissen durch z. B. Proteine dienen, die an den Doppelstrang binden. Hierzu kann es zweckmäßig sein, generelle Sequenzabschnitte in die im Reaktionsträger synthetisierten Moleküle einzubauen, die zum Beispiel als Bindungsstelle für einen oder mehrere Primer dienen. Es können außerdem chemische Gruppen eingefügt werden, die eine kovalente Verknüpfung der beiden Stränge ermöglichen. Dem Fachmann sind hierfür zahlreiche Beispiele bekannt, z. B. die Anwendung von Psoralen.
In einer anderen Ausführungsform dient der Anteil des Arrays aus Nukleinsäuren, der für diese Reaktionsprodukte vorgesehen ist, der Initiation einer isothermalen Kopierreaktion. Ein Vertreter dieser Verfahren ist die Strand-Displacement-Reaktion. Hiervon sind dem Fachmann zahlreiche Varianten bekannt. Dazu wird z. B. ein Primer gewählt, der an die Matrizen-Polymere an deren distalem Ende bindet und dann dort in 3'-Richtung verlängert werden kann. Alle oder ein bestimmter Teil der Nukleinsäurepolymere auf dem Träger enthalten distal diese Primer-Sequenz. Als nächstes wird ein Enzym zugegeben, für das der Primer eine Erkennungsstelle enthält, so dass ein Einzelstrangbruch induziert wird. Die übliche Vorgehensweise sieht dazu die Verwendung einer Restriktionsnuklease vor, z. B. N.BstNB I (erhältlich z. B. von Fa. New England Biolabs), das von Natur aus nur Einzelstrangbrüche (so genannte Nicks) einführt, da es keine Dimere bilden kann.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden doppelsträngige, ringförmige Nukleinsäurefragmente bereitgestellt, wobei ein Strang an der Oberfläche des Trägers verankert wird und der andere Strang ein selbstprimendes 3'-Ende umfasst, so dass eine Elongation des 3'-Endes erfolgen kann. Die enzymatische Synthese umfasst bei dieser Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Replikation analog des für die Replikation von Bakteriophagen bekannten Rolling-Circle-Mechanismus, wobei ein Strang der ringförmigen Nukleinsäurefragmente an der Oberfläche des Trägers verankert ist und mehrfach kopiert werden kann. Wenn zunächst ein doppelsträngiges geschlossenes Nukleinsäure-Fragment vorliegt, kann der zweite Strang zunächst durch einen Einzelstrangbruch geöffnet werden, wobei ein 3'-Ende gebildet wird, von welchem ausgehend die Elongation stattfindet. Die Abspaltung des elongierten Strangs kann z. B. enzymatisch erfolgen. Durch Zugabe von Nukleotidbausteinen und eines geeigneten Enzyms erfolgt dann eine Synthese der jeweils zu den Basensequenzen der an der Oberfläche des Trägers verankerten Nukleinsäurestränge komplementären Teilsequenzen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden einzelsträngige, ringförmige DNA-Moleküle verwendet, um in einer Rolling-Circle-Amplification kopiert zu werden. Als Primer können hierbei in dem Reaktionsträger synthetisierte Nukleinsäuremoleküle verwendet werden oder Nukleinsäuremoleküle, die mit den im Reaktionsträger synthetisierten Molekülen hybridisieren. Bevorzugt können auch Oligonukleotide als Primer verwendet werden, die mit Streptavidin verknüpft sind. Das Streptavidin-Biotin-Konjugat kann zuvor an Biotineinheiten gebunden haben, die zuvor an Hybride von Sondenmolekülen und Probenmolekülen angeknüpft wurden. Diese mit den im Reaktionsträger synthetisierten Molekülen hybridisierenden Nukleinsäuremoleküle können eine universelle Gruppe enthalten, etwa einen Poly-A-schwan. Es kann für diese Methode zweckmäßig sein, universelle Bindungsstellen im ringförmigen DNA-Molekül für die Bindung des Primers zu nutzen. Es entstehen dabei lange Concatemere, in die signalgebende Moleküle eingebaut werden und zur Analyse herangezogen werden können.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform können die entstehenden Concatemere als Templat für weitere verlängerbare Moleküle dienen. Diese hybridisieren am durch die Rolling-Circle-Amplification gebildeten Strang und werden durch eine Polymerase verlängert. Da hierbei mehrere Moleküle hintereinander binden können, kann ein Molekül durch seine Verlängerung eine Länge erreichen, bei der es an das Ende eines am gleichen Strang gebundenen Moleküls angrenzt. Hier kann die Verlängerung weiter erfolgen, wenn die Hybridisierung des zweiten Moleküls durch die voranschreitende Verlängerung gelöst wird („strand displacement") und der Hybridisierungsbereich des zweiten Moleküls nochmals durch die Verlängerung des ersten Moleküls kopiert wird. Durch die Auflösung der Hybridisierung eines Moleküls entstehen wiederum Einzelstrangbereiche, die für ein verlängerbares Molekül als Templat dienen können. Dabei entstehen komplexe, verzweigte dendritische Strukturen. Während der Verlängerung der gebundenen Moleküle können insbesondere auch signalgebende Gruppen oder deren Vorläuferstufen oder Haptene in den wachsenden Strang eingebaut werden. Moleküle, die an die verlängerten Stränge binden, können ebenfalls signalgebende Gruppen oder deren Vorläuferstufen oder Haptene enthalten. Ebenso können die gebildeten Strukturen von Substanzen gebunden werden, die durch die Bindung an die durch die Verlängerung gebildeten Strukturen eine Änderung einer oder mehrerer ihrer optischen Eigenschaften erfahren.
Die Produkte des Kopiervorgangs können auf verschiedenen Wegen Label, Bindungsstellen oder Marker erhalten, die für eine weitere Prozessierung oder den Einsatz in weiteren Assays oder Verfahren erwünscht sind.
Dazu gehören Marker und Label, die eine direkte Detektion der Kopien erlauben und dem Fachmann aus anderen Verfahren zur Kopie von Nukleinsäuren bekannt sind. Beispiel hierfür sind Fluorophore. Des Weiteren können Bindestellen für indirekte Nachweisverfahren oder Reinigungsverfahren vorgesehen werden. Dazu zählen als Beispiele Haptene, wie Biotin oder Digoxigenin.
Die Label, Bindungsstellen oder Marker können in einer Variante durch modifizierte Nukleotide eingeführt werden. Ein weiterer Weg eröffnet sich bei Verwendung von Primern für die Initiation des Kopiervorgangs. Die Primer können bereits mit Label, Bindungsstellen oder Marker in die Reaktion eingebracht werden.
Nachträglich können Label, Bindungsstellen oder Marker eingebracht werden, indem die Reaktionsprodukte einer nachfolgenden Markierungsreaktion mit generischen, mit den Nukleinsäuren reagierenden Agenzien behandelt werden. Ein Beispiel hierfür sind Cis-Platin-Reagenzien oder Nanogold-Partikel, wie sie z. B. von der Firma Aurogen, USA, angeboten werden. Alternativ hierzu lassen sich Label, Bindungsstellen oder Marker auch durch eine weitere enzymatische Reaktion einführen, wie z. B. durch eine terminale Transferase katalysiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Kopien der Matrizen-Nukleinsäuren ihrerseits zur Reaktion mit den gebundenen Ziel-Nukleinsäuren verwendet. Die Initiation ihrer Synthese als Kopierprodukte von Nukleinsäure-Sonden kann während oder nach der spezifischen Bindung der Zielmoleküle erfolgen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird zunächst das unspezifisch gebundene oder ungebundene Probenmaterial weggewaschen. Die Sequenzen der zu kopierenden Nukleinsäure-Sonden werden so gewählt, dass die später in einer Hybridisierreaktion zu analysierende Sequenz erst bei erfolgreicher Verlängerung der einzelnen kopierten in Lösung befindlichen Nukleinsäurepolymere entsteht. Diese Abschnitte können dann ihrerseits mittels eines anderen Bereiches des Arrays detektiert werden.
In einer Variante zur Erzeugung des Signals kann es vorgesehen sein, dass die Primer zur Initiation des Kopiervorgangs bereits eine Modifikation tragen, die die Erzeugung des Signals unterstützt. Ein Beispiel für eine solche Modifikation ist ein Primer, der in seinem 5'-Abschnitt in einem Bereich, der nicht für die Hybridisierung mit der Matrize notwendig ist, eine branched-DNA-Struktur trägt (zu bDNA siehe oben).
Eine andere Variante sieht vor, dass für jede Zielsequenz, also z. B. ein einzelnes Gen oder Exon, zwei Primer mit gegenläufiger Spezifität bereitgestellt werden, so dass in einer PCR oder isothermalen Amplifikation eine effiziente exponentielle Vervielfältigung erfolgt.
Bei gleichzeitiger Reaktion von Kopiervorgang, Amplifikation und Hybridisierung an die analytischen Sonden kann in einem sehr kompakten und simplifizierten Format die komplette Analyse eines Gemisches an Ziel-Nukleinsäuren durchgeführt werden. Solch eine komplette Analyse kann z. B. die Detektion aller exprimierten Gene aufklären – ohne vorherige Proben-Amplifikation und mit sehr einfacher Probenvorbereitung.
Eine dazu gehörige Vorrichtung als bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anlage besteht aus

a) einem Gerät für die in-situ-Synthese der Arrays von Matrizen-Polymeren und analytischen Nukleinsäure-Sonden,
b) Elementen für die Abarbeitung fluidischer Schritte, wie der Probenzugabe, Reagenzien-Zugabe, Waschschritte oder/und Probenableitung
c) einer Detektionseinheit für die Erfassung eines optischen oder elektrischen Signals,
d) einer speicherprogrammierbaren Einheit für die Steuerung der Synthese,
e) einer speicherprogrammierbaren Einheit für die Steuerung der Fluidik, der Detektion und der Speicherung und Verwaltung der Messdaten.

In einer weiteren Ausführungsform werden die verlängerten Polymere mit analytischen Nukleinsäure-Sonden in Kontakt gebracht, die wiederum für eine Verlängerung in Form einer Primer Extension nutzbar sind. Die Anordnung eines Primer-Extension-Experiments ist aus der Fachliteratur bekannt. Das Signal der Primer-Extension an diese Analyse-Sonden wird dann zur Bestimmung des Analyse-Ergebnisses ausgewertet. Eine solche Analyse kann z. B. die Bestimmung von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) in genomischer DNA sein. Dazu werden erst verlängerbare Primer an Matrizen-Nukleinsäuren abkopiert. Die Sequenz ist so gewählt, dass im 3'-Bereich nach der Primer-Sequenz auf der Ziel-Nukleinsäure die zu untersuchenden SNPs lokalisiert sind. Im nächsten Schritt werden diese Primer über die Sequenz der zu detektierenden SNPs hinweg verlängert. Anschließend werden die Reaktionsprodukte dieser Verlängerung durch Primer-Extension oder direkt durch Hybridisierung untersucht und die Ergebnisse für die Bestimmung der in der Analyse abgefragten SNPs registriert. In der speicherprogrammierbaren Vorrichtung werden für den Nutzer der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Daten so aufbereitet, dass er z. B. direkt einen Report mit den Basen-Positionen und den gefundenen Basen erhält.
Der große Vorteil der Erfindung liegt dabei darin, dass für solche Genotypisierungs- oder SNP-Analyse-Assays nur noch eine universelle, generische Probenvorbereitung notwendig ist. Primer und Reagenzien, die für einzelne Genotypen oder SNPs spezifisch sind, werden nicht benötigt, da alle Sequenz-Spezifität aus der in-situ-Synthese des zugrunde liegenden Matrizen-Arrays und dem Analyse-Array stammt. In der Ausführungsform mit der Kombination dieser beiden in einem Reaktionsträger wird die Gentypisierung und SNP-Analyse damit maximal vereinfacht.
6.11 Herstellung synthetischer Gene und anderer synthetischer Nukleinsäure-Doppelstränge unter Nutzung des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Prozessieren von Nukleinsäuren, die außerhalb des Reaktionsträgers hergestellt wurden
Hierzu werden qualitativ hochwertige und in der Sequenz frei programmierbare Nukleinsäuren in Form von Oligonukleotiden bereitgestellt, um synthetische kodierende doppelsträngige DNA (synthetische Gene) herzustellen. Dazu wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt.
Die Oligonukleotide, die als Bausteine des synthetischen Genes dienen, werden durch Synthese im Reaktionsträger hergestellt. Die Nutzung von trägergebundenen Bibliotheken aus Nukleinsäuresonden ist für die Synthese von synthetischen Genen in PCT/EP00/01356 beschrieben. Die Synthese von Oligonukleotiden durch Kopieren von trägergebundenen Nukleinsäuren z. B. für die Gensynthese oder zur Herstellung von Reagenzien wie siRNAs oder Aptameren ist in DE 103 53 887.9 beschrieben. In beiden Verfahren werden Oligonukleotide mit frei wählbarer Sequenz in einem Bereich von 10–100, ggf. auch bis zu 500 Nukleotiden, für die nachfolgenden Verfahren, wie den Aufbau von synthetischen Genen, bereit gestellt. Es können außerdem Oligonukleotide, die außerhalb des Reaktionsträgers hergestellt wurden, durch dem Fachmann bekannte Verfahren an die im Reaktionsträger synthetisierten Oligonukleotide angeknüpft werden.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden weitere Prozessschritte, die die Nutzung, Aufreinigung, Modifikation oder Veredlung der Oligonukleotide oder den teilweisen oder kompletten Aufbau der Zielsequenz, also ggf. des fertigen synthetischen Genes, umfassen, gemäß dem Verfahren in einem entsprechenden Reaktionsträger durchgeführt.
6.12 Herstellung von synthetischen Genen und anderen synthetischen Nukleinsäure-Doppelsträngen unter Nutzung des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Prozessieren von Nukleinsäuren, die direkt im Reaktionsträger resp. im Mikroarray hergestellt wurden

a. Synthese und Ablösen durch labilen Linker
b. Synthese via Kopie von Nukleinsäuresonden

In einer Ausführungsform werden qualitativ hochwertige und in der Sequenz frei programmierbare Nukleinsäuren in Form von Oligonukleotiden bereitgestellt, um synthetische kodierende doppelsträngige DNA (synthetische Gene) herzustellen. Dazu wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt.
Die Oligonukleotide, die als Bausteine des synthetischen Genes dienen, werden durch Synthese und Ablösen mittels eines labilen Linkers oder durch Synthese via Kopie von Nukleinsäuresonden hergestellt. Die Nutzung von trägergebundenen Bibliotheken aus Nukleinsäuresonden ist für die Synthese von synthetischen Genen in PCT/EP00/01356 beschrieben. Die Synthese von Oligonukleotiden durch Kopieren von trägergebundenen Nukleinsäuren z. B. für die Gensynthese oder zur Herstellung von Reagenzien wie siRNAs oder Aptameren ist in DE 103 53 887.9 beschrieben. In beiden Verfahren werden Oligonukleotide mit frei wählbarer Sequenz in einem Bereich von 10–100, ggf. auch bis zu 500 Nukleotiden, für die nachfolgenden Verfahren, wie den Aufbau von synthetischen Genen, bereit gestellt.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden weitere Prozessschritte, die die Nutzung, Aufreinigung, Modifikation oder Veredlung der Oligonukleotide oder den teilweisen oder kompletten Aufbau der Zielsequenz, also ggf. des fertigen synthetischen Genes, umfassen, gemäß dem Verfahren in einem entsprechenden Reaktionsträger durchgeführt.
6.13 Ligation vermittelt durch Sonden aus Array
In einer Ausführungsform werden zwei Stränge verknüpft, von denen einer ein im Reaktionsträger synthetisiertes Sondenmolekül ist. Die Verknüpfung wird dabei durch einen Templatstrang ermöglich, der die beiden zu verknüpfenden Stränge in räumliche Nähe bringt. Alternativ kann das im Reaktionsträger synthetisierte Sondenmolekül als Templat dienen, das zwei weitere Stränge in räumliche Nähe bringt und so eine Verknüpfung ermöglicht. Die Ligation kann dabei z. B. durch eine Ligase katalysiert werden, aber auch durch dem Fachmann bekannte chemische Kopplungsreaktionen erfolgen. In allen genannten Fällen kann das im Reaktionsträger synthetisierte Sondenmolekül entweder auf der Oberfläche des Reaktionsträgers immobilisiert sein oder vor der Verknüpfung abgelöst worden sein. Alternativ kann auch eine Abschrift der Moleküle des Reaktionsträgers vor der Verknüpfung erfolgen und die Verknüpfung mit den Molekülen, die die Kopie darstellen, erfolgen. Für das Kopieren kann auf dem Fachmann bekannte Verfahren zurückgegriffen werden, etwa einer Primer-Extension-Reaktion.
6.14 Lab an a Chip
Die besondere Bauweise des Reaktionsträgers als Mikrofluidiksystem in Kombination mit Pumpsystemen ist ideal geeignet, um sequentiell Modifikationen von auf dem Reaktionsträger hergestellten Molekülen oder an die auf dem Reaktionsträger hergestellten Moleküle bindenden Moleküle vorzunehmen. Da die zu modifizierenden Moleküle auf dem Reaktionsträger immobilisiert sind oder an diesen binden, werden Waschschritte zwischen den verschiedenen Modifikationsereignissen gegenüber gängigen Methoden erheblich vereinfacht. Eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten molekularbiologischen Prozessen beinhalten mehrere aufeinanderfolgende Einzelschritte von bestimmten Modifikationen, zwischen denen ein Reinigungsschritt erfolgt. Dies sind z. B. enzymatische Modifikationen wie Amplifikation, Primer Extension, Ligation, Phosphorylierungen oder Dephosphorylierungen, Nukleasebehandlungen etc.. Die Reinigungsschritte sind zum Beispiel Bindung und Waschen der Probe mithilfe von Affinitätssäulen, Fällungsschritte, gelelektrophoretische Verfahren etc.
In einer Ausführungsform wird die Erfindung genutzt, um aufeinander folgende Modifikationsereignisse von Molekülen durchzuführen. Dabei kann durch die Bauweise des Reaktionsträgers, dessen Mikrofluidikkanäle von Lösungen und Mischungen durchspült werden können, eine erhebliche Vereinfachung solcher Prozesse im Vergleich zu Methoden des Standes der Technik erreicht werden. Optional kann nach den einzelnen Modifikationsschritten jeweils ein Waschschritt erfolgen, um z. B. Substanzen eines Modifikationsschrittes zu entfernen, die einen darauf folgenden Schritt stören könnten.
6.15 Verbesserte Polymersondenarrays
In einer Ausführungsform finden für die Polymersonden insbesondere asymmetrische Polymersonden Anwendung. Diese ermöglichen die Ausführung der Erfindung in einer Variante, bei der solche Sonden, die Volllängenprodukte darstellen, durch weitere Faktoren thermodynamisch bevorzugt sind als alleine durch die Tatsache, dass sie Volllängenprodukte sind. Dies wird erreicht, indem die Sonden einzelne Bausteine mit einem besonders starken Bindungsverhalten enthalten. Diese besonderen Bausteine werden asymmetrisch oder in einem späteren Schritt während der Polymersynthese eingefügt. Damit entsteht eine Asymmetrie, die den Sonden thermodynamische Eigenschaften gibt, die das Bindungsverhalten beeinflusst.
Im Fall von Nukleinsäuren finden Analoga Verwendung, die zu einer stärkeren Bindung an die komplementären Basen beitragen. Alternativ werden distal an den Sondenmolekülen solche Bausteine eingefügt, die das Bindungsverhalten beeinflussen und zu stärkerer Bindung dieser Sonden beitragen. Ein Beispiel hierfür sind Peptid-Derivate. Bekannt sind dem Fachmann zum Beispiel „Minor Groove Binders", die auch in der Polymerase- Kettenreaktion eingesetzt werden.
Für die in-situ-Synthese von Polymersonden-Arrays auf einem Träger stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Sie haben das gemeinsame Ziel, einen eleganten Weg zur Herstellung dieser Arrays zu eröffnen, der ressourcenschonend und ökonomisch ist und meist ein besonders gut definiertes Substrat für die nachfolgenden Analysen liefert. Außerdem können durch in-situ-Verfahren Arrays mit einer besonders hohen Zahl an unterschiedlichen Rezeptorsonden auf einem Reaktionsträger erzeugt werden.
Ein wesentlicher Nachteil solcher Verfahren ist aber, dass bei einem in-situ-Synthese-Prozess das Produkt der Synthese nicht anschließend aufgereinigt werden kann. Zur Vermeidung dieses Nachteils werden bei sogenannten "off chip"-Synthesen der Polymersonden die entsprechenden DNA-Moleküle mit konventionellen Methoden hergestellt und anschließend dergestalt gereinigt, dass nahezu ausschließlich das Volllängenprodukt der Synthese vorliegt. Nur diese Molekülpopulation wird anschließend auf dem Substrat als Array angeordnet. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, dass die Anordnung der fertigen Polymersonden auf dem Array sehr aufwendig ist.
Die mangelnde Aufreinigung kann im Zusammenspiel mit der spezifischen Ausbeute der in-situ-Synthese zu deutlichen Einbussen bei der Analysequalität führen, wenn der Anteil an Volllängenprodukt vergleichsweise niedrig ist. Dies spielt insbesondere bei DNA-Mikroarrays eine wesentliche Rolle, da die Länge eines immobilisierten DNA-Sondenmoleküls über die Spezifität der potentiellen Hybridisierungsreaktion mit einem Probenmolekül entscheidet. Diese Spezifität ist wiederum ein entscheidender Parameter für das analytische Potential eines DNA-Mikroarrays.
Bisher bekannte Verfahren zur in-situ-Herstellung von Polymersonden-Arrays beinhalten, dass alle aufeinanderfolgenden Additionsschritte mit einzelnen Bausteinen dieser Sonden durchgeführt werden. Keiner dieser Schritte weist eine Kopplungsrate von 100% auf. Für den Fachmann ist klar, dass eine chemische serielle Kondensation wie im Fall einer in-situ-Synthese von Polymersonden nicht zu 100% Volllängenprodukt führen kann. In der DNA-Synthese sind die Kopplungsraten für die konventionelle Säulenmethodik nach vielen Jahren der Optimierung und unter Verwendung der effizientesten bekannten chemischen Methode (Phosphoramidit-Methode nach Caruthers) immer noch unter 100%.
Mit vergleichsweise niedrigen Ausbeuten bei der seriellen Ankopplung von Synthesebausteinen kann der Anteil des Volllängenprodukts nach einer bestimmten Zahl von Synthesezyklen unter einen kritischen Wert fallen, so dass das Analyseergebnis gar nicht von diesem Volllängenprodukt geprägt wird. Bei der photolithographischen in-situ-Synthese von DNA mit MeNPOC-Schutzgruppen ist z. B. beschrieben, dass die Kopplungsrate der einzelnen Additionsschritte unter 95% liegt (Beier, M., Hoheisel, J. D., Production by quantitative photolitogaphic synthesis of individually quality checked DNA microarrays, Vol. 28, No. 4, S. 1–6, 2000). Mit solchen Verfahren lassen sich sinnvollerweise nur DNA-Polymersonden bis zu einer Länge von 25 Basen erzeugen. Auf solch einem Array stehen nur noch ca. 27% Volllängenprodukte, sofern die Rate tatsächlich 95% beträgt. Mit einer Kopplungsrate von 90% je Additionsschritt ergibt sich nur noch ein Wert von 7%.
Bislang kann nur die Synthese von Polymersonden vor der Anordnung auf dem Array unter Verwendung eines geeigneten Reinigungsschrittes mit dann nachgeschaltet erfolgender Aufbringung auf dem Reaktionsträger für nahezu 100% Volllängen-Sonden sorgen. Diese Vorgehensweise ist jedoch mit anderen Nachteilen behaftet, vor allem logistischem Aufwand und dem Vorlauf der Produktion einschließlich der Investition in die Polymersonden eines bestimmten ausgewählten Designs.
Vor diesem Hintergrund ist es in einer Ausführungsform mit asymmetrischen Sonden das Ziel, die geschilderten Nachteile zu vermeiden, die sich aus einer Population von unterschiedlich langen Molekülen auf den einzelnen Positionen eines Mikroarrays ergeben können, ohne die Nachteile einer "off chip" Synthese in Kauf nehmen zu müssen.
Diese Ausführungsform der Erfindung mit asymmetrischen Sonden beschreibt also ein Verfahren zur Verbesserung der Nutzung von in-situ-Syntheseverfahren in der Herstellung von Polymersonden-Arrays für das erfindungsgemäße Verfahren, indem der Beitrag von Volllängenprodukten aus dem Syntheseprozess zum Analyseergebnis erhöht wird. Dies wird durch eine asymmetrische Konfiguration der Polymersonden erreicht. Insbesondere in den letzten Syntheseschritten werden hierzu modifizierte Bausteine verwendet, die sich in bestimmten thermodynamischen Eigenschaften, wie z. B. der Bindungsstabilität, von den vorher verwendeten Bausteinen unterscheiden. Alternativ oder zusätzlich kann der gleiche Effekt durch eine geeignete Modifikation des distalen Endes der Polymersonden, z. B. mit einem Hybridisierungsverstärker, erzielt werden. Ein solches Molekül ist z. B. ein sogenannter "Minor Groove Binder" (Epoch Biosciences 2000 Annual Report, Seiten 4–5), der die Stabilität der Bindung an die letzten 4–5 Basen der Polymersonde deutlich erhöht. Beispiele für solche "Minor Groove Binders" sind einige natürliche Antibiotika mit einer Gestalt, die eine Faltung in die kleine Furche ("minor groove") einer DNA-Helix erlaubt. Damit wird die bei in-situ-Synthesen fehlende Aufreinigung der Polymersonden vor der Aufbringung in einem Polymersonden-Array substituiert. Der Qualitätsnachteil von in-situ-Syntheseverfahren wird auf diese Weise teilweise oder ganz ausgeglichen.
Durch das beschriebene Verfahren als Ausführungsform der Erfindung wird die Nutzbarkeit von in situ synthetisierten Polymersonden-Arrays in Bezug auf die Qualität und Aussagekraft der Analyse verbessert.
Insbesondere für die Anwendung in Analysen und Prozessen, die mit sehr genauem Analyseergebnis oder sehr präziser Unterscheidung von sehr ähnlichem Untersuchungsgut arbeiten müssen, wird damit die Methode nochmals verbessert.
Verfahren und Moleküle für die Synthese von Polymersonden mit modifizierten thermodynamischen Eigenschaften unter Verwendung von modifizierten Nukleotidbausteinen sind aus der Patentschrift US 6,156,501 A bekannt. Darüber hinaus sind in der Literatur Modifikationen an der fertigen Polymersonde bekannt, die die Bindungseigenschaften der Polymersonden verändern, z. B. eine Einlagerung von "Minor Groove Binders" (MGB). Modifizierte Synthesebausteine sind beispielsweise Ribonukleosidanaloga, wie LNAs („locked nucleic acids"), modifizierte Purin- bzw. Pyrimidinbasen, wie superstabilisierende Adenosinanaloga (z. B. 2,4-Diaminoadenosin), Pyrazolopyrimidine (z. B. PPG) sowie Phosphatrückgratanaloga, wie z. B. Methylphosphonate, Phosphorthionate, Phosphoramidate etc.
Weitere verwendbare Duplexstabilisatoren sind Bausteine, die zu einer Tripelhelixbildung durch einen dritten Nukleinsäure- oder Peptidstrang führen können, sowie stabilisierende Moleküle, wie z. B. Interkalatoren, die sich zwischen die Basenstapelung eines DNA-Doppelstranges einlagern.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Kombination des asymmetrischen Sondendesigns mit in-situ-Reinigungsmethoden, bei denen die Abbruchprodukte der Sondensynthese in situ entfernt werden. Die postsynthetische Array-Optimierung wird in dieser Ausführungsform durch die modifizierten Bausteine am Ende der bis zuletzt verlängerten Polymersonden ermöglicht. Kürzere Sonden tragen überwiegend keine solchen modifizierten Bausteine und lassen sich mit geeigneten Verfahren, wie z. B. einem chemischen oder/und enzymatischen Verdau, entfernen.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers für die Bestimmung von Nukleinsäure-Analyten durch Hybridisierung, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägerkörpers und (b) schrittweises Aufbauen eines Arrays von mehreren verschiedenen Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga auf dem Träger durch orts- oder/und zeitspezifisches Immobilisieren von Rezeptorbausteinen an jeweils vorbestimmten Positionen auf dem oder im Trägerkörper, wobei man für die Synthese der Rezeptoren mehrere unterschiedliche Sätze von Synthesebausteinen verwendet, um asymmetrische, d. h. aus mehreren unterschiedlichen Arten von Rezeptorbausteinen bestehende Rezeptoren zu erhalten.
Die unterschiedlichen Sätze von Bausteinen werden dabei so ausgewählt, dass die einzelnen Bausteine in Bezug auf die Spezifität für komplementäre Nukleinsäurebausteine aus dem Analyten gleich sind, aber eine unterschiedliche Affinität für komplementäre Nukleinsäurebausteine aus dem Analyten aufweisen, so dass die Bevorzugung von Volllängenprodukten eines in situ synthetisierten Polymersonden-Arrays durch eine gezielte Verteilung unterschiedlicher Arten von Bausteinen entlang der Polymersonden während der Synthese erreicht wird.
Vorzugsweise wird die Bevorzugung von Volllängenprodukten eines in situ synthetisierten Polymersonden-Arrays durch eine gezielte Verteilung unterschiedlicher Arten von Bausteinen entlang der Polymersonden während der Synthese erreicht. Dazu werden für das erfindungsgemäße Verfahren Sätze von Synthesebausteinen verwendet, die sich in Bezug auf bestimmte Parameter gleich verhalten, aber in bestimmten, z. B. thermodynamischen, Eigenschaften voneinander abweichen. Die Verteilung der Bausteine entlang des wachsenden Polymers während der in-situ-Synthese wird dabei so gewählt, dass die Volllängenprodukte mit der Bausteinzahl n oder aber zumindest die Syntheseprodukte aus den letzten Additionsschritten der Polymerverlängerung modifizierte Bausteine enthalten. Die Bausteinanzahl n kann dabei 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, oder 70 betragen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zumindest für den letzten Schritt oder die letzten Schritte, z. B. die letzten zwei, drei oder vier Schritte, beim Aufbau der Rezeptoren ein Satz von Synthesebausteinen verwendet, der eine höhere Affinität für komplementäre Nukleinsäurebausteine aus dem Analyten aufweist als die vorher verwendeten.
Weiterhin ist es in einer Ausführungsform möglich, dass der für den oder die letzten Schritte beim Aufbau der Rezeptoren verwendete Satz von Synthesebausteinen zusätzlich eine höhere Beständigkeit gegenüber Abbaureagenzien, z. B. Enzymen, wie Nukleasen oder/und chemischen Reagenzien, wie Säuren oder Basen, im Vergleich zu dem für die ersten Schritte des Aufbaus der Rezeptoren verwendeten Satz von Synthesebausteinen aufweist. In diesem Fall kann z. B. nach Beendigung der Rezeptorsynthese ein gezielter Abbauschritt durchgeführt werden, mit dem der Anteil von Nicht-Volllängenprodukten gegenüber dem Anteil der Volllängenprodukte verringert wird. Der Einbau von "abbaubeständigen" Bausteinen und ein nachfolgender Abbauschritt können im Übrigen auch ein- oder mehrmals während früherer Schritte der Rezeptorsynthese erfolgen.
Eine alternative oder ergänzende Vorgehensweise sieht die Erzeugung unterschiedlicher Hybridisierungsaffinitäten für einzelne Sätze von Bausteinen durch Verwendung von Modifikationen der Rezeptoren, z. B. mittels Hybridisierungsverstärkern, vor, wodurch ihre Eigenschaften in der gewünschten Art zugunsten der Volllängenprodukte verändert werden. Der Einbau von Hybridisierungsverstärkern erfolgt ortsspezifisch, d. h. es wird eine erhöhte Hybridisierungsaffinität für komplementäre Nukleotidbausteine aus dem Analyten für eine vorbestimmte Anzahl (d. h. einen Satz) einzelner Bausteine aus dem Rezeptor vorgesehen. Vorzugsweise wird der Hybridisierungsverstärker an das distale Ende des Rezeptors angefügt, wobei z. B. die letzten 3–5 Basen des Rezeptors bezüglich der Hybridisierungsaffinität modifiziert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Nukleinsäure-Array, ausgewählt aus DNA- oder RNA-Arrays, insbesondere ein DNA-Array, aufgebaut, wobei ein erster Satz von Synthesebausteinen, bestehend aus unmodifizierte DNA- oder RNA-Synthesebausteinen, die zweckmäßigerweise in Form geeigneter Derivate mit Phosphoramidite, H-Phosphonate etc. vorliegen, verwendet wird. Als zweiter Satz für den oder die letzten Schritte des Rezeptoraufbaus wird dann ein Satz von Synthesebausteinen, ausgewählt aus N3'-P5'-Phosphoramidat-(NP)-Bausteinen, Locked-Nukleinsäure-(LNA)-Bausteinen, Morpholinophosphordiamidat-(MF)-Bausteinen, 2'-O-Methoxyethyl-(MOE)-Bausteinen, 2'-Fluor-arabino-Nukleinsäure-(FANA)-Bausteinen, Phosphorthioat-(PS)-Bausteinen, 2'-O-Methyl-(OMe)-Bausteinen oder Peptidnukleinsäure-(PNA)-Bausteinen verwendet. Selbstverständlich ist das erfindungsgemäße Verfahren jedoch auch für den Aufbau von modifizierten Nukleinsäure-Arrays geeignet, wobei als erster Satz von Bausteinen ein erster modifizierter Bausteinsatz und als zweiter Satz ein zweiter modifizierter Bausteinsatz verwendet wird, wobei sich die beiden Bausteinsätze, wie zuvor beschrieben, hinsichtlich der Affinität für komplementäre Nukleinsäurebausteine des Analyten und gegebenenfalls zusätzlich hinsichtlich der Beständigkeit gegenüber Abbaureagenzien unterscheiden.
Diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens umgeht die Reinigungsproblematik für in-situ-Polymersonden durch eine asymmetrische Konfiguration der Sonden, die bei Nukleinsäuren zu einem erhöhten Beitrag der Volllängenprodukte zur Bindungsenergie im Doppelstrang bei einer späteren Anwendung auf dem Biochip führt.
Diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet sich neben den anderen in dieser Offenbarung beschriebenen Anwendungen besonders zum Nachweis oder/und zur Isolierung von Nukleinsäuren, z. B. zur Durchführung von De-novo-Sequenzierungen, Re-Sequenzierungen und Punktmutationsanalysen, z. B. SNP-Analysen und den Nachweis neuer SNPs. Weiterhin kann das Verfahren für die Analyse von Genomen, Genomvariationen, Genominstabilitäten und Chromosomen sowie zur Genexpressions- bzw. Transkriptomanalyse oder zur Analyse von cDNA-Bibliotheken eingesetzt werden. Das Verfahren eignet sich auch für die Herstellung von substratgebundenen cDNA-Bibliotheken oder cRNA-Bibliotheken. Außerdem können Arrays für die Herstellung synthetischer Nukleinsäuren, Nukleinsäuredoppelstränge und synthetischer Gene erzeugt werden.
Des Weiteren können auch Arrays von PCR-Primern, Sonden für homogene Assays, Molecular Beacons und Haarnadel-Sonden hergestellt werden.
Schließlich können auch Arrays für die Herstellung, Optimierung oder Entwicklung von Antisense-Molekülen erzeugt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders für die Herstellung von Trägerkörpern mit Kanälen, z. B. mit geschlossenen Kanälen. Die Kanäle sind in einer Ausführungsform Mikrokanäle mit einem Querschnitt von z. B. 10–1000 μm. Beispiele für geeignete Trägerkörper mit Kanälen sind in WO 00/13018 beschrieben. Vorzugsweise wird ein Trägerkörper verwendet, der zumindest teilweise im Bereich der mit Rezeptoren zu bestückenden Positionen optisch transparent oder/und elektrisch leitfähig ist.
Diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet sich weiterhin besonders als integriertes Synthese-Analyse-Verfahren, d. h. der fertige Träger wird in situ für die Analytbestimmung und anschließend gegebenenfalls für weitere Synthese-Analyse-Zyklen eingesetzt wie in WO 00/13018 beschrieben.
Weiterhin betrifft diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens auch einen Träger für die Bestimmung von Analyten, der eine Vielzahl, vorzugsweise mindestens 100 und besonders bevorzugt mindestens 500, von unterschiedlichen immobilisierten Rezeptoren enthält, wobei die Rezeptoren aus jeweils mehreren unterschiedlichen, z. B. zwei oder noch mehreren Sätzen von Synthesebausteinen aufgebaut sind, und wobei die einzelnen Synthesebausteine in Bezug auf die Spezifität für komplementäre Nukleinsäurebausteine aus dem Analyten gleich sind, aber eine unterschiedliche Affinität für komplementäre Nukleinsäurebausteine aus dem Analyten aufweisen.
Weiterhin betrifft diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens einen Reagenzienkit, umfassend einen Trägerkörper und mindestens zwei unterschiedliche Sätze von Bausteinen für die Synthese von Rezeptoren auf dem Träger. Weiterhin kann der Reagenzienkit auch Reaktionsflüssigkeiten enthalten.
Gegenstand diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist auch eine Vorrichtung zur integrierten Synthese- und Analytbestimmung an einem Träger, umfassend eine programmierbare Lichtquellenmatrix, optional eine Detektormatrix, einen bei der Verwendung einer Detektormatrix vorzugsweise zwischen Lichtquellen- und Detektormatrix angeordneten Träger sowie Mittel zur Zufuhr von Fluids in den Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger und gegebenenfalls Reservoirs für Synthesereagenzien und Proben. Die programmierbare Lichtquellen- bzw. Belichtungsmatrix kann eine Reflexionsmatrix, eine Lichtventilmatrix, z. B. eine LCD-Matrix, oder eine selbstemittierende Belichtungsmatrix sein. Derartige Lichtmatrices sind z. B. in WO 00/13018 offenbart. Die Detektormatrix, z. B. eine elektronische CCD-Matrix, kann als Option im Trägerkörper integriert sein.
Der Aufbau der Rezeptoren auf dem Träger kann fluid-chemische Syntheseschritte, photochemische Syntheseschritte, elektrochemische Syntheseschritte oder Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Schritte umfassen. Ein Beispiel für die elektrochemische Synthese von Rezeptoren auf einen Träger ist in DE 101 20 663.1 beschrieben. Ein Beispiel für ein Hybridverfahren, umfassend die Kombination von fluidchemischen Schritten und photochemischen Schritten, ist in DE 101 22 357.9 beschrieben.
Weiterhin soll die Erfindung durch das nachfolgende Beispiel erläutert werden.
Es wird ein DNA-Mikroarray zu einer Länge der DNA-Sonden von 25 Bausteinen synthetisiert. Für den letzten Baustein wird statt eines natürlichen Nukleotids ein Analogon mit geeigneten Eigenschaften an die Sonde kondensiert. Dies kann ein LNA-(„locked nucleic acid")-Baustein sein, von dem bekannt ist, dass er zum einen für alle vier Basen der DNA hergestellt werden kann (und damit ein Satz passender Bausteine vorhanden ist), zum anderen für alle vier Basen mit deutlich höherer Schmelztemperatur an sein komplementäres Zielmolekül hybridisiert. Die Diskriminierung zwischen einer Hybridisierung oder Bindung an das Volllängenprodukt mit 25 Bausteinen Länge im Vergleich zu den Abbruchprodukten mit 24 oder weniger Nukleotiden wird dadurch verbessert. Das wirkt sich positiv auf das Analyseergebnis aus.
In einer weiteren Ausführungsform kommen DNA oder andere Nukleinsäure-Polymersonden zum Einsatz, die alle oder teilweise zur Bildung von erwünschten dreidimensionalen Strukturen befähigt sind. Diese dreidimensionalen Strukturen können Hairpin-Strukturen oder andere, dem Fachmann bekannte Strukturen sein. In dieser Ausführungsform umfasst die Erfindung Arrays von auf einem Träger immobilisierten Nukleinsäuren, die zumindest teilweise in Form von Sekundärstrukturen, wie etwa Hairpin-Strukturen, vorliegen. Weiterhin werden Verfahren zur Herstellung solcher Arrays und Anwendungen davon beansprucht.
Ein Bindungsereignis zwischen immobilisiertem Rezeptor und Analyt wird üblicherweise durch Detektion einer Markierungsgruppe nachgewiesen, die an den Analyten gebunden ist. Ein Träger und ein Verfahren zur Analytbestimmung, die eine integrierte Synthese von Rezeptoren und Analyse erlauben, sind z. B. in WO 00/13018 beschrieben.
Um mit Rezeptorarrays, z. B. DNA-Chips, komplexe biologische Fragestellungen (Genexpressions-Studien, Target-Validierung, Sequencing By Hybridisation, Re-Sequenzierung) bearbeiten zu können, ist es von grundlegender Bedeutung, dass die Hybridisierung zwischen Rezeptor und Target möglichst fehlerfrei durchgeführt werden kann. Das Nachweissystem muss daher in der Lage sein, zwischen einem sogenannten "full match", d. h. wenn Sonde und Target vollkommen komplementär sind, und einem "mismatch", wenn eine oder mehrere fehlerhafte Basenpaarungen vorliegen, zu unterscheiden. Besonders schwierig ist natürlicherweise die Unterscheidung zwischen einem "single mismatch", wenn lediglich 1 Basenpaarung fehlerhaft ist, und dem "full match". Des Weiteren sind aus thermodynamischen Gründen besonders endständige (terminale) Basen-Fehlpaarungen schwer bzw. nur unzureichend zu detektieren. Fehlpaarungen in der Mitte einer Sequenz sind dagegen aus denselben Gründen einfacher zu detektieren.
Auf bekannten DNA-Chips liegen Nukleinsäure-Rezeptoren möglichst in einzelsträngiger Form vor. Bei der Auswahl der Sequenzen für die Rezeptoren wird daher darauf geachtet, dass eine etwaige Ausbildung von Sekundärstrukturen vermieden wird. Die Detektion von Basen-Fehlpaarungen erfolgt nun dadurch, dass auf dem DNA-Chip nicht nur die eigentliche abzufragende Sequenz, sondern auch als Vergleich die entsprechende Sequenz mit einer Fehlpaarung in der Mitte der Basenabfolge als Negativ-Kontrolle aufgebracht ist. Ob es sich um einen "full match" oder "mismatch" handelt, wird durch die jeweils unterschiedlichen Signalintensitäten, die sich durch Hybridisierung der Probe (Target) auf die Sonde bzw. ihrer Negativ-Kontrollsequenz (Mismatch-Sequenz) ergeben, detektierbar. Da aber auch hier nicht immer eine eindeutige Entscheidung getroffen werden kann, müssen zur Detektion einer bestimmten DNA-Sequenz innerhalb des Targets nicht nur eine einzige Sequenz, sondern mehrere (z. B. 20 Sequenzen pro Gen) Sequenzen (R. Lipschutz et al., Nature Genetics, 1999, 21, 20 ff.), die sich jeweils als Bruchstücke der nachzuweisenden Probe ergeben, mit den jeweils zugehörigen Kontroll-Sequenzen (Mismatch-Sequenzen) verwendet werden. Dadurch wird zum Nachweis einer einzigen Probensequenz nicht nur eine einzige Nukleinsäuresequenz auf dem DNA-Chip benötigt, sondern es sind üblicherweise 20 Sequenzen zuzüglich der jeweiligen 20 Negativ-Kontrollsequenzen (Mismatch-Sequenzen) erforderlich. Dies resultiert in einem erheblichen Mehraufwand bei der Herstellung von DNA-Chips und verringert deren Informationsdichte signifikant.
Gegenwärtig gibt es noch keine Möglichkeiten, terminale Basen-Fehlpaarungen auf DNA-Chips zu detektieren.
Eine Aufgabe dieser Ausführungsform der Erfindung ist es daher, ein System bereitzustellen, das es erlaubt, Basen-Fehlpaarungen sehr genau detektieren zu können. Weiterhin soll das erfindungsgemäße System nicht nur Basen-Fehlpaarungen in der Mitte einer Sequenz, sondern auch am Ende (terminal) auf einem Array hochparallel erkennen.
Diese Aufgabe wird durch Bereitstellung von Rezeptorarrays gelöst, die Nukleinsäure-Rezeptoren enthalten, die mindestens teilweise in Form von Hairpins vorliegen.
Hairpins sind eine spezielle Form von Sekundärstrukturen bei Nukleinsäuren, die sich aus zwei komplementären Sequenz-Abschnitten im sogenannten Stem und einem weiteren Sequenzabschnitt im sogenannten Loop zusammensetzen (1a). Hierbei besteht ein Gleichgewicht zwischen der geschlossenen Form und der geöffneten Form (1b). Hairpin-Strukturen wurden bereits in Lösung zur markierungsfreien Detektion von Hybridisierungs-Ereignissen eingesetzt (Tyagi et al. Nature Biotechnology 1995, 14, 303–308). Diese Hairpin-Strukturen (2 Typ A) zeichnen sich dadurch aus, dass sich die Erkennungssequenz im Loop des Hairpins befindet (Marras et al. Genetic Analysis; Biomolecular Engineering, 1999, 14, 151–156). In einer besonderen Ausführungsform befinden sich ein Quencher- und ein Fluorophor-Molekül im geschlossenen Zustand in unmittelbarer räumlicher Nähe, so dass die Fluoreszenz gelöscht wird. Tritt nun ein Hybridisierungs-Ereignis mit der sich im Loop befindlichen Erkennungssequenz ein, öffnet sich der Hairpin, wobei Fluorophor und Quencher räumlich voneinander getrennt werden. Als Folge davon ist ein Fluoreszenzsignal zu beobachten. Als Quencher können neben bekannten Farbstoffen auch poly-Deoxyguanosinsequenzen fungieren (M. Sauer, BioTec, 2000, 1, 30 ff.). Dies hat den Vorteil, dass die Hairpin-Struktur nur mit einem Fluorophor markiert werden muss (M. Sauer et al., Anal. Chem. 1999, 71 (14), 2850 ff.), dass der Einbau eines Quencher-Moleküls entfällt.
Studien über das Verhalten von Hairpinstrukturen auf einer festen Phase – d. h. Arrays mit Hairpin-Strukturen – sind zwar bekannt ( US 5,770,772 ), nutzen jedoch lediglich das Vorhandensein der doppelsträngigen Struktur eines Hairpin als Erkennungsstelle für z. B. Proteine aus. Der Nachweis einer Analytbindung durch Auflösung der Hairpinstruktur wird nicht offenbart. Im Besonderen sind keine Hairpin-Strukturen bekannt, die die Sequenzinformation im Stem des Hairpins als Erkennungssequenz für eine Hybridisierung nutzen. Des Weiteren sind bislang noch keine Hairpinstrukturen bekannt, deren Anbindung an die feste Phase nicht über ein terminales Ende erfolgt.
Ein Gegenstand der Erfindung ist in dieser Ausführungsform ein Verfahren zur Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten Bereiche die Rezeptoren in Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen. Teilweise bezieht sich hierbei auf jeden einzelnen Rezeptor in der Weise, dass die Anwesenheit des jeweiligen damit spezifisch bindefähigen Analyten eine Änderung oder Aufhebung der Sekundärstruktur im Rezeptor verursacht.
b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe und
c) Bestimmen der Analyten über deren Bindung an die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren, wobei die Bindung eines Analyten an einem damit spezifisch bindefähigen Rezeptor den Nachweis der Auflösung der in Abwesenheit des Analyten vorliegenden Sekundärstruktur umfasst.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Bestimmung von Analyten, umfassend

a) eine Lichtquellenmatrix,
b) einen Träger mit mehreren vorbestimmten Positionen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren auf dem Träger immobilisiert sind,
c) Mittel zur Zufuhr von Fluids zum Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger und
d) eine Detektionsmatrix umfassend mehrere Detektoren, die den vorbestimmten Positionen auf dem Träger zugeordnet sind.

Die erfindungsgemäßen Hairpin-Strukturen lassen sich überraschenderweise für eine sehr genaue Diskriminierung von Basenfehlpaarungen auf einer Festphase, insbesondere auf einem Array, verwenden. Die erfindungsgemäßen Hairpin-Strukturen lassen sich hochparallel sowohl in situ auf der festen Phase erzeugen, können aber auch, wenn vorgefertigt, auf dieser immobilisiert werden.
Die Rezeptoren werden ausgewählt aus Nukleinsäure-Biopolymeren, z. B. Nukleinsäuren wie DNA und RNA oder Nukleinsäureanaloga wie Peptidnukleinsäuren (PNA) und Locked-Nukleinsäuren (LNA) sowie Kombinationen davon. Besonders bevorzugt werden als Analyten Nukleinsäuren bestimmt, wobei die Bindung der Analyten eine Hybridisierung umfasst. Das Verfahren ermöglicht jedoch auch den Nachweis anderer Rezeptor-Analyt-Wechselwirkungen, z. B. den Nachweis von Nukleinsäure-Protein-Wechselwirkungen.
Diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst vorzugsweise eine parallele Bestimmung von mehreren Analyten, d. h. es wird ein Träger bereitgestellt, der mehrere unterschiedliche Rezeptoren, die mit jeweils unterschiedlichen Analyten in einer einzigen Probe reagieren können, enthält. Die Zahl der unterschiedlichen Rezeptoren auf einem Träger beträgt vorzugsweise mindestens 50, mehr bevorzugt mindestens 100, noch mehr bevorzugt mindestens 200, noch mehr bevorzugt mindestens 500, noch mehr bevorzugt mindestens 1.000, noch mehr bevorzugt mindestens 5.000, noch mehr bevorzugt mindestens 10.000, noch mehr bevorzugt mindestens 50.000. Vorzugsweise werden mindestens 50, vorzugsweise mindestens 100 und besonders bevorzugt mindestens 200 Analyten parallel bestimmt.
Die Immobilisierung der Rezeptoren an den Träger kann durch kovalente Bindung, nicht-kovalente Selbstassemblierung, Ladungswechselwirkung oder Kombinationen davon erfolgen. Die kovalente Bindung umfasst vorzugsweise die Bereitstellung einer Trägeroberfläche mit einer chemisch reaktiven Gruppe, an die die Startbausteine zur Rezeptorsynthese, vorzugsweise über einen Spacer bzw. Linker gebunden werden können. Die nicht-kovalente Selbstassemblierung kann beispielsweise auf einer Edelmetalloberfläche, z. B. einer Goldoberfläche, mittels Thiolgruppen, vorzugsweise über einen Spacer bzw. Linker, erfolgen.
Die vorliegende Erfindung zeichnet sich vorzugsweise dadurch aus, dass das Detektionssystem zur Analytbestimmung, eine Lichtquellenmatrix, einen mikrofluidischen Träger und eine Detektionsmatrix in einem zumindest teilweise integrierten Aufbau kombiniert. Dieses Detektionssystem kann zur integrierten Synthese und Analyse eingesetzt werden, insbesondere zum Aufbau komplexer Träger, z. B. Biochips, und zur Analyse komplexer Proben, z. B. zur Genom-, Genexpressions- oder Proteomanalyse.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Synthese der Rezeptoren in situ auf dem Träger, beispielsweise indem Fluid mit Rezeptorsynthesebausteinen über den Träger geleitet wird, die Bausteine an jeweils vorbestimmten Bereichen auf dem Träger orts- oder/und zeitspezifisch immobilisiert werden und diese Schritte wiederholt werden, bis die gewünschten Rezeptoren an den jeweils vorbestimmten Bereichen auf dem Träger synthetisiert worden sind. Diese Rezeptorsynthese umfasst vorzugsweise mindestens einen fluidchemischen Schritt, einen photochemischen Schritt, einen elektrochemischen Schritt oder eine Kombination solcher Schritte sowie eine online-Prozessüberwachung, beispielsweise unter Verwendung der Detektionsmatrix.
Die Lichtquellenmatrix ist vorzugsweise eine programmierbare Lichtquellenmatrix, z. B. ausgewählt aus einer Lichtventilmatrix, einem Spiegelarray, einem UV-Laserarray und einem UV-LED(Dioden)-Array.
Der Träger ist vorzugsweise eine Flusszelle bzw. eine Mikroflusszelle, d. h. ein mikrofluidischer Träger mit Kanälen, vorzugsweise mit geschlossenen Kanälen, in denen sich die vorbestimmten Positionen mit den jeweils unterschiedlich immobilisierten Rezeptoren befinden. Die Kanäle haben vorzugsweise Durchmesser im Bereich von 10 bis 10.000 μm, besonders bevorzugt von 50 bis 250 μm und können grundsätzlich in beliebiger Form ausgestaltet sein, z. B. mit rundem, ovalem, quadratischem oder rechteckigem Querschnitt.
Wie bereits ausgeführt, umfassen die Sekundärstrukturen in dieser Ausführungsform der Erfindung vorzugsweise eine Hairpin-Struktur, die aus einem Stem und einem Loop zusammengesetzt ist. In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann sich die mit dem Analyten bindefähige Sequenz des Rezeptors im Bereich des Loops eines Hairpins befinden. Durch Bindung des Loops an den Rezeptor wird die Hairpin-Struktur geöffnet. Diese Hairpin-Öffnung kann wiederum durch geeignete Maßnahmen (z. B. siehe oben) nachgewiesen werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform befindet sich jedoch die mit dem Analyten spezifisch bindefähige Sequenz des Rezeptors im Stem der Hairpin-Struktur. Auch in dieser Ausführungsform bewirkt die Bindung des Analyten an den Rezeptor eine nachweisbare Auflösung der Hairpin-Struktur.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Hairpin-Strukturen mit einer Erkennungssequenz im Stem (38, 39A und 39B) komplementäre Sequenzen A und A* im Stem und eine Linker-Einheit L im Loop. Dabei befinden sich im Loop des Hairpins Bausteine, die keine Basenpaarungen eingehen können (z. B. Polyethylenglykol-, Alkyl-, Polyethylenglykolphosphat- oder Alkylphosphat-Einheiten) oder Bausteine, die nur schwache Basenpaarungen eingehen können (z. B. ein Tn-Loop mit n = 2–8). Als Erkennungssequenzen können beide Sequenzabschnitte A (39B) oder A* (39A) im Stem dienen. Wird ein Hybridisierungsexperiment durchgeführt, konkurriert z. B. eine in der zu untersuchenden Probe befindliche Sequenz A mit der Referenzsequenz A im Stem des Hairpins um die Sequenz A* (39A). Diese Konkurrenzsituation wird dazu verwendet, die Spezifität der Hybridisierung zu erhöhen. Ist z. B. die in der Probe befindliche Sequenz A nicht vollständig komplementär zu A* (d. h. es treten Fehlpaarungen auf), ist die Paarung zwischen den beiden Sequenzen A und A* im Hairpin stabiler, was zur Folge hat, dass das Hybridisierungsgleichgewicht auf die linke Seite zur geschlossenen Form des Hairpin verlagert ist (39A). Wird zur Hybridisierung also eine markierte Probe A verwendet, bedeutet dies, dass kein oder nur ein geringes Signal detektierbar ist, da das Gleichgewicht auf der Seite des geschlossenen Hairpins liegt. Signale werden nur detektierbar, wenn die Hairpinstruktur im geöffneten Zustand vorliegt, d. h. eine stabile Paarung zwischen A in der zu untersuchenden Probe und A* im Hairpin möglich ist, und das Gleichgewicht rechts, d. h. bei einem offenen Hairpin, liegt.
Somit wird neben gebräuchlichen Variablen der Stringenzbedingungen, wie z. B. Salzkonzentration, Temperatur, Sonden- und Target-Konzentration, eine weitere Variable eingeführt, mit der Einfluss auf die Stringenz eines Hybridisierungsexperimentes genommen werden kann. Des Weiteren kann das Hybridisierungsgleichgewicht (und damit die Stringenz) der Referenz- Sonde bzw. der Erkennungssequenz u. a. dadurch variiert werden, dass diese Sequenzen Bausteine von Nukleinsäure-Analoga enthalten, die sich dadurch auszeichnen, dass diese stärker mit DNA binden, als DNA mit DNA. Hierfür kommen u. a. PNA- oder LNA-Bausteine oder andere dem Fachmann bekannte Bausteine mit den beschriebenen Charakteristika in Frage.
Durch das beschriebene Vorgehen wird erreicht, dass im Gegensatz zum üblichen Vorgehen (Verwendung von 1 Perfect-Match- + 1 Single-Base-Mismatch-Sonde) für die Diskriminierung zwischen Perfect-Match und Single-Base-Mismatch nur eine einzige Sonde verwendet werden muss, und somit Stellplätze auf dem Array eingespart werden können bzw. mehr Informationen mit einer vorgegebenen Menge an Stellplätzen abgefragt werden kann. Des Weiteren können hierdurch auch terminale Mismatche abgefragt werden, da durch Anwesenheit der Referenzsequenz im gleichen Molekül höhere Stringenzbedingungen eingestellt werden können, als wenn für die Diskriminierung von Perfect-Match und Single-Base-Mismatch 2 separate Sonden verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Hairpin-Strukturen zwei komplementäre Sequenzen (A, A*) und zwei nicht komplementäre Einheiten (Z, X) im Stem und eine Linker-Einheit (L) im Loop (40). Als Erkennungssequenzen können sowohl die der Festphase nahe Sequenzabfolge A–Z (40A) als auch die der Festphase ferne Sequenzabfolge A*–Z (40B) dienen. Von entscheidender Bedeutung ist die Tatsache, dass X und Z nicht miteinander paaren. Hierzu wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, dass es sich bei X um einen oder mehrere paarungsfähige Nukleinsäure-Bausteine und bei Z um eine oder mehrere nicht-paarungsfähige Bausteine handelt. Z kann beispielsweise eine "Abasic site" (DNA- oder RNA-Baustein ohne Heterobase) oder ein dem Fachmann bekannter Baustein sein, der zwar keine Basenpaarung eingeht, aber die DNA-Struktur nicht stört. Unter L ist ein Linker zu verstehen, der vorzugsweise aus nicht paarungsfähigen Nukleinsäure-Bausteinen, so z. B. Polyethylenglykolphosphat-Einheiten (R. Micura, Angew. Chemie, 2000, 39(5), 922 ff.) oder Bausteinen, die nur schwache Basenpaarungen eingehen können (z. B. ein Tn Loop mit n = 2–8), besteht. Hierdurch wird erreicht, dass besonders terminale Mismatche besser detektierbar werden. Dies erfolgt dadurch, dass in dieser Ausführungsform (40A) dem Target A–X* weitere Basen zur Paarung zur Verfügung stehen, jedoch der Referenz A–Z nicht. Das bewirkt, dass das Gleichgewicht zwischen geschlossener Form des Hairpins (links) vorteilhaft auf die rechte Seite (offener Hairpin) verschoben wird, wenn eine zusätzliche Basenpaarung vom Target A–X* mit dem Sequenzbereich X im Hairpin erfolgen kann. Treten Fehlpaarungen zwischen Target A–X* und dem Sequenzbereich X im Hairpin auf, ist dies nicht der Fall, und das Gleichgewicht wird nicht verstärkt auf die rechte (offene) Seite verschoben.
Durch Vorhandensein zusätzlicher paarungsfähiger Abschnitte X in der Hairpinstruktur des Rezeptors, die mit dem nachzuweisenden Analyten komplementär sind, kann somit die Stringenz des Hybridisierungexperiments weiter erhöht werden (40A und 40B). Auch hier können Nukleinsäure-Analoga, wie zuvor beschrieben, Verwendung finden, die stärker mit DNA binden, als DNA mit DNA.
In einer weiteren Ausführungsform kann Z auch das Gemisch der 4 Basen Adenosin, Guanosin, Cytidin und Thymidin bzw. Uracil sein.
In noch einer weiteren Ausführungsform enthält die Hairpin-Struktur eine im geschlossenen Zustand zumindest teilweise gequenchte Markierungsgruppe, z. B. einen Fluorophor. Durch Auflösung der Hairpinstruktur nimmt das von der Markierungsgruppe stammende Signal zu und man weist diese Signalzunahme nach. So enthält eine erfindungsgemäße Hairpin-Struktur (41) beispielsweise einen Quencher (Q) und einen Fluorophor (F), die sich an entgegengesetzten Enden der Nukleinsäure-Sequenz des Hairpins befinden. Erfindungsgemäß ist die Fluoreszenz im geschlossenen Hairpin durch die räumliche Nähe von Q und F gelöscht. Im geöffneten Zustand ist Fluoreszenz detektierbar. Molekül-Kombinationen Q und F sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
In noch einer weiteren Ausführungform kann die Hybridisierung auch mit doppelsträngigen Targets erfolgen (42). Sind beide Stränge markiert, kann somit die für einen Stellplatz detektierbare Leuchtintensität verstärkt werden.
In einer weiteren Ausführungform kann die Trägeranbindung der Hairpinstrukturen sowohl vom Typ A (Erkennungssequenz im Loop) als auch vom Typ B (Erkennungssequenz im Stem) nicht nur terminal, sondern auch intern erfolgen (43). Es werden hiermit auch intern an den Träger gebundene Hairpinstrukturen vom Typ A offenbart. Auch Kombinationen von terminal und intern immobilisierten Rezeptoren auf einen Träger sind möglich.
Eine Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik wird in einer Ausführungsform besonders dadurch erzielt, dass die erfindungsgemäße Hairpinstruktur die Erkennungssequenz im Stem beinhaltet. Der zur Erkennungssequenz komplementäre Strang wird als Referenz-Sequenz zur Mismatch-Diskriminierung verwendet. Bei einem Hybridisierungsexperiment konkurriert eine in der Probenlösung vorhandene Target-Sequenz mit der Referenz-Sequenz (A*) um die Sondensequenz (A). Ist es erwünscht, kann die Stringenz durch Einbau von besonderen Nukleinsäure-Bausteinen (PNA, LNA) im Referenz-Strang weiter gesteigert werden. Das heißt, es wird nur eine Hybridisierung erfolgen – d. h. der Hairpin in die offene Form wechseln – wenn die in der Probenlösung vorhandene Targetsequenz exakt komplementär zur Sondensequenz ist. Ist dies nicht der Fall, sorgt die im Hairpin integrierte Referenzsequenz dafür, dass der Hairpin nicht in die offene Form wechselt, und somit keine Hybridisierung mit einer Targetsequenz erfolgen kann.
Des Weiteren erlaubt die erfindungsgemäße Hairpinstruktur die Diskriminierung von terminalen Basenfehlpaarungen. Diese werden über die Hybridisierung der Targetsequenz an die Position X möglich. Basenpaarungen komplementär zur terminalen Position X entscheiden darüber, ob der Hairpin verstärkt in die offene Form wechselt und daraus resultierend ein Hybridisierungs-Ereignis detektiert werden kann.
Dies hat zur Folge, dass im Gegensatz zu herkömmlichen DNA-Arrays für die Entscheidung, ob es sich um einen "full match" oder "mismatch" handelt, wesentlich weniger Sequenzen aufgebracht werden müssen. Daraus resultiert, dass mit der a priori gegebenen maximalen Stellplatzdichte eines Array mehr unterschiedliche Targetsequenzen bearbeitet werden können. Dies steigert die Informationsdichte des Arrays signifikant.
Durch Inkorporation von Fluoreszenz-(F)- oder/und Quencher-(Q)-Bausteinen in die erfindungsgemäße Hairpinstruktur lässt sich außerdem eine markierungsfreie Detektion von DNA-Arrays erreichen (41).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung mit Verwendung der oben beschriebenen Sonden mit Sekundärstrukturen und Hairpins wird ein integriertes System zur Bestimmung von Analyten bereitgestellt, welches eine hochparallele in-situ-Herstellung komplexer Populationen von Hairpin-Rezeptoren immobilisiert in Mikrostrukturen zum Nachweis von Analyten erlaubt.
Hierzu verwendet man günstigerweise eine Vorrichtung, umfassend:

a) eine Lichtquellenmatrix,
b) einen mikrofluidischen Träger mit mehreren vorbestimmten Positionen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga auf dem Träger immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten Bereiche die Rezeptoren in Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen,
c) Mittel zur Zufuhr von Fluids zum Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger und
d) eine Detektionsmatrix, umfassend mehrere Detektoren, die den vorbestimmten Bereichen auf dem Träger zugeordnet sind.

In der erfindungsgemäßen Vorrichtung liegen vorzugsweise zwei beliebige oder drei beliebige oder alle vier der Komponenten a), b), c) und d) in integrierter Form vor. Besonders bevorzugt ist der Träger zwischen Lichtquellenmatrix und Detektionsmatrix angeordnet. Die Detektoren der Detektionsmatrix sind vorzugsweise aus Photodetektoren oder/und elektronischen Detektoren, z. B. Elektroden, ausgewählt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann zur gesteuerten in-situ-Synthese von Nukleinsäuren, z. B. DNA/RNA-Oligomeren benutzt werden, wobei als temporäre Schutzgruppen photochemische, fluidchemische, oder/und elektronisch abspaltbare Schutzgruppen, verwendet werden können. Die orts- oder/und zeitaufgelöste Rezeptorsynthese kann durch gezielte Ansteuerung von Elektroden in der Detektionsmatrix, gezielte Fluidzufuhr in definierte Bereiche oder Bereichsgruppen auf dem Träger oder/und gezielte Belichtung über die Lichtquellenmatrix erfolgen.
Alle dreidimensionalen und ganz oder teilweise gesteuerten oder ganz oder teilweise ungesteuerten Sekundär- und dreidimensionalen Polymersonden-Strukturen können für Bindungsstudien und die erfindungsgemäßen mehrstufigen molekularbiologischen Prozesse in der Art eingesetzt werden, dass die Bindung von Proteinen, Peptiden, Zellen, Zellfragmenten, Organellen, Sacchariden, niedermolekularen Wirkstoffen, komplexen Molekülen, Nanopartikeln, synthetischen Organismen oder Molekülen oder Zellen aus der synthetischen Biologie analysiert und ggf. optimiert wird. Daraus kann in einer Ausführungsform die Untersuchung der Bindung von Proteinen aus Zellextrakten oder in-vitro-Herstellung abgeleitet werden, deren Bindungsmuster auf einem Set an Sequenzmotiven untersucht wird. Dieses Set an Sequenzmotiven kann aus einem Set an Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren bestehen. Des Weiteren kann dieses Set aus hypothetischen oder empirisch validierten Bindungsstellen bestehen. Auch eine Mischung aus hypothetischen oder empirisch validierten Bindungsstellen kann vorgesehen sein.
In einer weiteren Ausführungsform werden die dreidimensionalen und ganz oder teilweise gesteuerten oder ganz oder teilweise ungesteuerten Sekundär- und dreidimensionalen Polymersonden-Strukturen für Bindungsstudien und die erfindungsgemäßen mehrstufigen molekularbiologischen Prozesse in der Art eingesetzt, dass damit die Bindungsmuster von microRNA, anderen nicht proteinkodierenden RNA-Molekülen oder teilweise aus RNA, teilweise aus Proteinen oder Peptiden bestehenden Komplexen mit den doppelsträngigen Hairpin-Strukturen, anderen Strukturen oder aus den Hairpin-Strukturen abgeleiteten Doppelsträngen auf dem Reaktionsträger untersucht und ggf. durch Marker an den Analyten erfasst werden.
In einer anderen Ausführungsform kann als Teil des mehrstufigen molekularbiologischen Prozesses eine FRET-Reaktion erzeugt und für die weitere Analyse oder Informationserfassung genutzt werden. Der FRET-Effekt kann durch eine Polymersonde- und Target-Wechselwirkung hervorgerufen werden. Um eine lokale Anregung der Fluoreszenz zu ermöglichen, wird ein Akzeptor- oder Donor-Molekül an die aufgebauten Polymersonden gekoppelt. Dies kann während der Synthese geschehen (durch die Bausteine) oder nach der Synthese, z. B. mit Reagenzien wie Cis-Platin (siehe z. B. KREATECH ULS-Cy5). Das Probengut trägt die entsprechende andere Markierung, um den FRET zu ermöglichen, z. B. die Paarung Cy5/Cy3 oder Phycoerythrin, oder einen zum Donor passenden Quencher. Eine Energieübertragung kann nur in der Nähe der Oberfläche stattfinden, so dass Eigenfluoreszenz der Lösung oder nicht gebundenes, freies markiertes Probengut keine störende Hintergrundfluoreszenz verursacht. In einer Ausführungsform, die man z. B. in der Genotypisierung von Nukleinsäuren verwenden kann, kann die Sonde mit freiem 3'-Ende den Fluoreszenz-Akzeptor darstellen, und durch eine wie oben beschriebene Polymerase-Reaktion (z. B. eine Primer Extension) oder eine andere Enzymreaktion (z. B. eine Ligation) wird an dem gebundenen Komplex oder an der Polymersonde selber ein passender Donor (EX) angehängt, der den FRET ermöglicht. Das „Big Dye"-Prinzip für „four-color sequencing" kann auf diese Weise ermöglicht werden. Ein Donor-Excitermolekül (Fluorescein etc.) wird angeregt und überträgt seine Energie auf die durch Primer Extension angehängten ddNukleotid-Farbstoff-Moleküle. In einer anderen Ausführungsform mit FRET wird die FRET-Reaktion ermöglicht durch Einbau von Akzeptor- und Donor-Molekül-Paaren im Probengut nach oder während der Anlagerung an die Polymersonde, z. B. während bzw. durch eine Primer-Extension-Reaktion. Dies führt in dieser Variante zu hohen Markierungsdichten, so dass viele FRET-Übertragungen ablaufen können. Ein besonderer Vorteil liegt in einer Ausführungsform mit Kombination aus FRET und CCD-Detektion, denn diese ermöglicht die direkte Detektion des Reaktionsverlaufs.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden in oder auf einem Reaktionsträger Polymersonden immobilisiert. Dies kann kovalent oder nicht-kovalent erfolgen. Diese Polymersonden sind aus Nukleinsäuren oder deren Analoga aufgebaut. An diesen Polymersonden wird die zu untersuchende Probe, die aus mindestens 2 Nukleinsäure-Sequenzen besteht, durch Hybridisierung immobilisiert. Bei der erfindungsgemäßen gesteuerten Beladung einzelner Reaktionsfelder mit bestimmten unterschiedlichen Polymersonden kann die Spezifität der nachfolgenden Anlagerung von Nukleinsäuren aus der Probe durch die Sequenz beeinflusst werden. So kann ein Reaktionsträger beispielsweise die 3' oder 5' Sequenzmotive aller Exons einer Genfamilie oder eines ganzen Genoms adressieren. Im nächsten Schritt kann noch eine Amplifikation auf dem Reaktionsträger erfolgen. In dem dann folgenden Schritt wird durch eine enzymatische Reaktion die Abfolge der Bausteine entlang der gebundenen Nukleinsäuren aus der Probe ermittelt. Dies kann direkt an den Nukleinsäuresträngen aus der Probe oder durch deren Amplifikate oder durch die komplementäre Sequenz nach einer Primer Extension an den Polymersonden erfolgen. Verfahren für die Ermittlung der Bausteine entlang der Nukleinsäurestränge sind dem Fachmann u. a. unter dem Fachbegriff „sequencing by synthesis" bekannt. Dazu werden als Enzyme unter anderem Polymerasen, Kinasen und Ligasen verwendet. Technische Ausführungsformen sind von den Firmen Agencourt, 454 und Solexa vorgestellt worden. Allen diesen Verfahren ist ein Endpunkt der Entschlüsselungsreaktion gemein, bei dem die Reaktion keine ausreichend genaue Unterscheidung korrekter von anderen Signalen und damit keine eindeutige Zuordnung mehr erlaubt, z. B. verursacht durch unspezifische Nebenreaktionen. Damit ist eine erste Runde in dem Entschlüsselungsverfahren erfolgt.
Im weiteren Verfahren, eventuell nach einem Kalibrier-, Reinigungs- oder Initialisierungsschritt, wird ein Gemisch von mindestens 2 kurzen Nukleinsäuresträngen zugegeben. Diese kurzen Nukleinsäurestränge haben eine ähnliche Funktion wie ein Primer-Molekül in der PCR Reaktion. Sie dienen einer zweiten Runde der unterschiedlichen Ausführungsformen der Entschlüsselungsreaktion entlang der gebundenen Nukleinsäuren aus der Probe. Die Sequenz der kurzen Nukleinsäurestränge, die eine ähnliche Funktion wie ein Primer-Moleküle in der PCR Reaktion ausführen, kann schon vor der ersten Runde der Entschlüsselungsreaktion entlang der gebundenen Nukleinsäuren bestimmt worden sein. In einer bevorzugten alternativen Ausführungsform wird diese Sequenz abgestimmt auf die Ergebnisse der ersten Runde der Entschlüsselungsreaktion. Dem Fachmann ist in diesem Zusammenhang aus den konventionellen Sequenzierverfahren das „primer walking" bekannt. Bei dem hier beschriebenen Verfahren als eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein hochparalleles Primer Walking an 2 oder mehr Nukleinsäuren aus der Probe mittels 2 oder mehr kurzen Nukleinsäuren mit Sequenzen, die anhand der für die 2 oder mehr Nukleinsäuren aus der Probe ermittelten Sequenz gewählt werden. Es kann in einer Ausführungsform vorgesehen sein, dass die Sequenzermittlung der zweiten Runde zunächst noch ein kurzes Sequenzmotiv umfasst, das auch schon in der ersten Runde ermittelt wurde, um daraus ein Qualitätsmerkmal abzuleiten.
Es ist in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, dass die kurzen Nukleinsäuren aus einem parallelen Syntheseverfahren stammen. Solche parallelen Syntheseverfahren sind dem Fachmann aus dem Fachbereich der Biochips und Microarrays bekannt. Dort gibt es elektrochemische, optisch gesteuerte und fluidisch gesteuerte Verfahren zur Herstellung von 2 oder mehr Nukleinsäuresequenzen auf einem Träger. Beansprucht wird hier die erfindungsgemäße Verwendung von 2 oder mehr Nukleinsäuresequenzen aus einem parallelen Herstellverfahren, bei dem die 2 oder mehr Nukleinsäuresequenzen entweder auf einem gemeinsamen Träger hergestellt oder in einem Prozess hergestellt werden, bei dem mindestens in einem Schritt 2 oder mehr Reaktionsstellen für die Herstellung der 2 oder mehr Nukleinsäuresequenzen gleichzeitig mit einem Reagenz in Kontakt gebracht werden. Beispiele für solche parallelen Herstellverfahren für 2 oder mehr Nukleinsäuresequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind DNA Microarrays, die mittels Photolithographie, Projektortechnik, LED Technik, emittierenden Halbleiterbauelementen oder LCOS Projektion hergestellt werden. Außerdem sind Beispiele Herstellverfahren, die eine direkte Photochemie verwenden, sowie Herstellverfahren, die eine indirekte Photochemie, wie lichtinduzierte Basen oder Säuren verwenden. Weitere Beispiele sind elektrochemische Verfahren. Außerdem ist hier auf fluidische Verfahren verwiesen, die entweder die Bausteine geordnet auf einen Träger aufbringen (Printing Technologie, Druckertechnik) oder die die Reagenzien der Synthese selektiv aufbringen.
In einer Variante des „Parallelen Primer Walking" kann die Immobilisierung der Nukleinsäuren aus der Probe auch direkt an der festen Phase erfolgen, z. B. an Beads oder Partikeln, auf einem Reaktionsträger, einem Objektträger, oder in einer Gelschicht. Dann erfolgt die anschließend eine erste Runde der Entschlüsselungsreaktion, gefolgt von der oben beschriebenen zweiten Runde. Dazwischen können weitere Prozessschritte erfolgen.
6.16 Mehrere verschiedene Sonden werden pro Position des Reaktionsträgers synthetisiert
Durch Verwendung orthogonaler chemischer Methoden zur Herstellung der Moleküle im Reaktionsträger ist es möglich, pro für die Synthese adressierbarer Lokation mehr als nur eine Sequenz einer bestimmten Molekülart zu synthetisieren. So können zum Beispiel zwei zueinander passende, hybridisierfähige Moleküle auf einer Lokation hergestellt werden, die aneinander binden und ein Hybrid bilden. Dies können zum Beispiel ein DNA-Doppelstrang oder Doppelstränge aus Nukleinsäureanaloga oder -derivaten sein. Bevorzugt ist die Synthese von DNA Oligonukleotiden oder derivatisierten DNA Oligonukleotiden oder DNA Oligonukleotid-Analoga mit unterschiedlichen Sequenzen auf einer Lokation. Es können dabei 2, 3, 4, 5, oder 6 unterschiedliche Sequenzen pro für die Synthese adressierbarer Lokation synthetisiert werden. Die synthetisierten Moleküle können dabei mit unterschiedlicher Gesamt-Oberflächenkonzentration oder unterschiedlichen individuellen Oberflächenkonzentrationen synthetisiert werden. Das Stoffmengenverhältnis der unterschiedlichen Moleküle ist dabei variabel. Es können z. B. für die Herstellung solcher Lokationen, die DNA-Oligonukleotide oder derivatisierte DNA-Oligonukleotide oder DNA-Oligonukleotid-Analoga mit unterschiedlichen Sequenzen enthalten, zunächst unterschiedliche Bausteine mit zueinander orthogonalen chemischen Schutzgruppen aufgebracht werden, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Das Verhältnis dieser Bausteine ist frei wählbar und beträgt bevorzugt 10/1, 9/1, 8/1, 7/1, 6/1, 5/1, 4/1, 3/1, 2/1, 1/1 oder umgekehrt, kann aber auch zwischen diesen Werten (1/1–10/1) liegen. Es wird nun eine Art der an die Oberfläche aufgebrachten zueinander orthogonal geschützten Bausteine selektiv entschützt, also die Schutzgruppe abgespalten, wodurch nur diese eine Art von Baustein für eine Weiterreaktion zur Verfügung steht. Es wird nun an diesen entschützten Bausteinen eine Sequenz von DNA-Oligonukleotiden oder derivatisierten DNA-Oligonukleotiden oder DNA-Oligonukleotid-Analoga nach dem Fachmann bekannten Methoden der Nukleinsäure-Festphasensynthese aufgebaut und anschließend wiederum geschützt. Diese Schätzung ist dabei orthogonal zu den Entschützungsbedingungen der anderen zuvor an die Oberfläche des Reaktionsträgers zueinander orthogonal geschützten geknüpften Bausteine. Es wird nun eine andere Art dieser zuvor an die Oberfläche des Reaktionsträgers geknüpften Bausteine entschützt, wobei andere Schutzgruppen im Reaktionsträger bevorzugt nicht mit abgespalten werden. Es steht nun nur diese eine Art von Baustein für eine Weiterreaktion zur Verfügung. Es wird nun an diesen entschützten Bausteinen eine zweite Sequenz von DNA-Oligonukleotiden oder derivatisierten DNA-Oligonukleotiden oder DNA-Oligonukleotid- Analoga nach dem Fachmann bekannten Methoden der Nukleinsäure-Festphasensynthese aufgebaut. Dieser Prozess kann für jede einzelne Art von zuvor an die Oberfläche des Reaktionsträgers geknüpften, zueinander orthogonal geschützten Bausteine wiederholt werden und so mehrere unterschiedliche Sequenzen an einer Lokation hergestellt werden.
6.17 Sonden mit labilem Linker werden im Reaktionsträger synthetisiert
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Moleküle an der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisiert, die über eine unter bestimmten Bedingungen spaltbare Einheit (labiler Linker, labiler Spacer) an die Oberfläche des Reaktionsträgers gebunden sind. Es können durch bestimmte Methoden nun diese Einheiten gespalten werden und so die auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Moleküle von der Oberfläche abgelöst werden. Die Abspaltung kann dabei zum Beispiel ausgelöst werden durch Veränderungen der Temperatur, des pH-Wertes, durch Einstrahlen von Licht und/oder durch Zugabe von Chemikalien wie z. B. Säuren, Basen, Nukleophilen, Elektrophilen, Radikalen, Ionen oder Katalysatoren, Enzymen und anderen. Die Geschwindigkeit der Abspaltungsreaktion kann dabei gesteuert werden und der vollständige Umsatz der Spaltungsreaktion kann Stunden und/oder Tage dauern. Die Abspaltungsreaktion wird vorzugsweise so durchgeführt, dass sie simultan mit einem analytischen Verfahren im Reaktionsträger durchgeführt wird. So kann zum Beispiel eine enzymatische Reaktion im Reaktionsträger durchgeführt werden, während ein Teil der Moleküle langsam von der Oberfläche abgespalten wird und erst dann dem Enzym als Reaktions- oder Bindungspartner oder als Substrat zur Verfügung steht. Es kann so während der Reaktion die Zufuhr der Moleküle gesteuert werden. Dadurch ist es zum Beispiel möglich, die Geschwindigkeit der Reaktion oder die Menge an gebildetem Endprodukt zu steuern. Das abspaltbare Molekül kann vorzugsweise ein DNA-Oligonukleotid oder derivatisiertes DNA-Oligonukleotid oder DNA-Oligonukleotid-Analogon sein, das als Primer in einer Enzymreaktion im Reaktionsträger dann fungieren kann, wenn es abgespalten wird. Es können besonders bevorzugt auch Enzyme für eine Spaltung verwendet werden. Dem Fachmann sind mehrere Verfahren bekannt, die Enzyme wie Uracil-DNA-Glycosylase (UNG, UDG) nutzen, um DNA-Oligonukleotide oder derivatisierte Oligonukleotide oder Oligonukleotid-Analoga zu spalten.
6.18 PCR im Reaktionsträger: Steuerung der Bindungsereignisse über kovalente Verknüpfung teilnehmender Moleküle mit dem Reaktionsträger
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Reaktionen für eine Amplifikation im Reaktionsträger durchgeführt, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Insbesondere können dabei die unter 6.1, 6.5, 6.6, 6.9, 6.15, 6.16, 6.18, 6.19, 6.20 und 6.21 beschriebenen Verfahren verwendet werden. Bevorzugt ist dabei eine PCR, bei der auf der Oberfläche des Reaktionsträgers gebundene DNA Oligonukleotide oder derivatisierte DNA-Oligonukleotide oder DNA-Oligonukleotid-Analoga als Primer fungieren. 20–22 illustrieren diese Anwendungen und zeigen Daten von erfolgreich duchgeführten PCR-Reaktionen auf der Oberfläche des Reaktionsträgers. Es können dabei Primer verwendet werden, die wie unter 6.16 beschrieben, auf der gleichen für die Synthese adressierbaren Lokation vorliegen. Bevorzugt kommen dabei 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Primer pro Lokation zum Einsatz. Besonders bevorzugt sind dabei 2 Primer. Diese Primer können dabei kovalent mit der Oberfläche des Reaktionsträgers so verknüpft werden, dass sie gerade nicht mehr aneinander binden können. Es können somit keine dem Fachmann bekannten Primer-Dimere, weder Homodimere noch Heterodimere, während der PCR gebildet werden. Werden nun längere Moleküle in den Reaktionsträger zugegeben, die an die Primer binden können und als Templat in der PCR dienen können, werden die Primer von einer Polymerase verlängert und erreichen dabei eine Länge, die eine Bindung eines zweiten Primers in Gegenrichtung erlaubt. Ohne Zugabe längerer Moleküle findet diese Primerverlängerung nicht statt. Es ist nach einem zweiten Verlängerungsschritt eine PCR möglich, bei der alle Primer und alle bis auf die ursprünglich zugegebenen längeren, als Templat fungierenden Moleküle kovalent mit der Oberfläche des Reaktionsträgers verknüpft sind. Es können zwischen verschiedenen adressierbaren Lokationen somit keine Kreuzreaktionen oder Interaktionen zwischen Primern, Templatmolekülen, Substraten oder Produkten der PCR-Reaktion entstehen. Die einzigen diffusionsfähigen Bestandteile der Reaktionsmischung sind in diesem Fall Enzyme, Nukleotide und weitere dem Fachmann bekannte Pufferbestandteile, nicht aber Oligonukleotide oder andere Nukleinsäuren, die im Gemisch enthalten sind. In einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich zwei Primer mit unterschiedlichen Sequenzen auf einer Lokation, die jeweils spezifisch an bestimmte Sequenzen in komplexen Probengemischen binden. Als komplexe Probengemische werden dabei vorzugsweise teilweise oder vollständig aufgereinigte oder unaufgereinigte fragmentierte oder unfragmentierte genomische DNA oder teilweise oder vollständig aufgereinigte oder unaufgereinigte fragmentierte oder unfragmentierte RNA-Extrakte aus Probenmaterial verwendet. Die Primer sind wie bei einer dem Fachmann bekannten PCR dabei gegenläufig und befinden sich nach Bindung am gewünschten Probenmolekül nicht mehr als 20000 Nukleotide voneinander entfernt. Ein Primer bindet dabei an den dem Fachmann bekannten sense-Strang der Probenmoleküle, der andere an den antisense-Strang.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird durch Kombination von Hybridisierungs- und Waschschritten erreicht, dass die gewünschten Probenmoleküle an die Primer binden und im Reaktionsträger zurückgehalten werden, ungewünschte hingegen durch Waschen entfernt werden, so dass die Komplexität des Probengemisches durch diesen Prozess vermindert werden kann. Es kann dann eine sogenannte Primer Extension mittels der an die gewünschten Probenmoleküle gebundenen Primer durchgeführt werden. Dabei werden die Primer soweit verlängert, dass sie als Templat für weitere, gegenläufige Primer dienen können. Es wird nun in einer Weise stringent gewaschen, dass alle nicht kovalent an die Oberfläche des Reaktionsträgers gebundenen Bestandteile der Mischung aus dem Reaktionsträger entfernt werden. Anschließend werden dem Fachmann bekannte, für eine PCR notwendige Bestandteile in den Reaktionsträger eingebracht und eine PCR durchgeführt. 26 und 27 illustrieren diese Ausführungsform. Insgesamt stellt diese Strategie eine erhebliche Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik dar, da in der Regel unvermeidliche, unerwünschte Wechselwirkungen unterbunden werden, wie sie bei dem Fachmann bekannten Multiplex-PCRs auftreten. Hierzu zählen Fehlhybridisierungen von Primern an Probenmolekülen (d. h. an unerwünschten Stellen) und unter den Primern untereinander (Primer-Dimere). Ohne dass eine vorherige bioinformatische Berechnung von Primern (z. B. für das Ausschließen von Primer-Dimeren) notwendig ist, können in solchen Systemen Primer-Dimere faktisch nicht mehr auftreten, da die Primer durch ihre kovalente Bindung an die Oberfläche nicht mehr miteinander binden können. Während der PCR sind alle Primer, Templatmoleküle und durch die PCR gebildeten Produkte, die untereinander, mit Primern oder Templatmolekülen hybridisieren können, kovalent an die Oberfläche gebunden und dadurch voneinander isoliert. Es entstehen so auf den einzelnen Lokationen auf der Oberfläche des Reaktionsträgers einfache Systeme aus wenigen Primern und kovalent an die Oberfläche des Reaktionsträgers gebundenen Molekülen, die durch die Verlängerung dieser Primer entstanden sind und als Templat für weitere Primer der Lokation dienen können. Es ist so möglich, viele Tausend oder Hunderttausende einzelne, voneinander isolierte PCRs im Reaktionsträger durchzuführen, ohne dass unerwünschte Kreuzreaktionen zwischen den einzelnen PCRs auftreten können. Als einzige lösliche und frei diffundierende Komponenten befinden sich im Reaktionsträger die dem Fachmann bekannten Bestandteile einer PCR Reaktion wie Pufferbestandteile, Enzyme, Bausteine wie Triphosphate usw., nicht aber spezifische Nukleinsäuren oder Derivate.
6.19 Quantitative (allelspezifische) Echtzeit-PCR
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden PCR-Reaktionen im Reaktionsträger unter Beteiligung von auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten, als Primer fungierenden Molekülen durchgeführt. Der Fortschritt der Reaktion, d. h. die Menge an während der PCR Reaktion synthetisierten Nukleinsäure wird während der Reaktion durch bestimmte Methoden beobachtet. Hierzu werden z. B. dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet, wie der Einsatz von Molecular Beacons, Scorpion Primer, Intercalatoren, Minor-Groove-Bindern, Sunrise Primer und ähnlichem. Es wird dabei an verschiedenen Zeitpunkten während der PCR-Reaktion ein Signal ausgelesen, z. B. ein Fluoreszenzsignal.
Dieses Signal kann dann zur Quantifizierung der bestimmten, im eingesetzten Probengemisch enthaltenen Moleküle herangezogen werden. Alternativ können die Signale verwendet werden, um Aussagen über die Sequenz der in der Probe enthaltenen Moleküle zu treffen. Es können dabei zum Beispiel Mutationen aufgeklärt werden wie dem Fachmann bekannte SNPs, Deletionen oder Insertionen. Dieses Verfahren wird besonders bevorzugt in Kombination mit der unter 6.18 beschriebenen PCR-Methode eingesetzt.
6.20 Ultra-Longmers
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierte Moleküle als Primer verwendet. Diese werden nach spezifischer Bindung an bestimmte Templatmoleküle durch eine Primer Extension verlängert, so dass sehr lange, an die Oberfläche des Reaktionsträgers kovalent gebundene Moleküle entstehen. Bevorzugt kann auch eine PCR mit einem dem Fachmann bekannten Gegenprimer oder Antisense Primer durchgeführt werden, so dass die Länge der verlängerten Primer nach einer PCR durch die Lage dieses Gegenprimers definierbar ist. Nach stringentem Waschen des Reaktionsträgers wird dann ein Reaktionsträger erhalten, der lange, einzelsträngige Sondenmoleküle mit bekannten Sequenzen und optional definierten Längen enthält. Pro adressierbarer Lokation auf der Oberfläche des Reaktionsträgers wird nur eine Sequenz in hoher Reinheit erhalten. Die so entstandenen Sondenmoleküle stehen dann zur Verfügung, um gewünschte Probenmoleküle aus komplexen Probengemischen zu binden. Die Länge der Sondenmoleküle ist dabei bevorzugt 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 oder 10000 Nukleotide oder Nukleotidderivate oder Nukleotidanaloga. Besonders bevorzugt ist die beschriebene Herstellung von solchen sehr langen Sondenmolekülen an der Oberfläche des Reaktionsträgers für Sondenmoleküle, die aus DNA bestehen. Diese werden bevorzugt dafür verwendet, Sequenzen von genomischer DNA zu binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können diese langen Fragmente genutzt werden, um z. B. synthetische Gene herzustellen. Ist eine Kopie eines Probenmaterials im Reaktionsträger durch die beschriebene Primer Extension und/oder PCR erstellt, kann der Reaktionsträger wiederum durch eine Primer Extension abgeschrieben werden und die entstandenen, nichtkovalent an den Reaktionsträger gebundenen Moleküle aus dem Reaktionsträger herausgelöst werden. Alternativ können Techniken mit einem labilen Linkermolekül wie in 6.17 beschrieben verwendet werden, die ein Ablösen der verlängerten Primermoleküle vom Reaktionsträger erlauben. Diese können verwendet werden, um längere Fragmente zu assemblieren und in der Sequenz der Moleküle kodierte RNAs oder Proteine in vitro oder in vivo zu exprimieren oder herzustellen oder ohne vorherige weitere Assemblierung in der Sequenz der Moleküle kodierte RNAs oder Proteine in vitro oder in vivo zu exprimieren oder herzustellen oder in Form von Klonen zu speichern. Durch die große Länge (100–10000 Nukleotide) der einzelnen Molekülkopien des Probenmaterials, die durch die Primer Extension generiert wurden sowie die große Zahl der individuellen Sequenzen können so Sequenzinformationen im Bereich von 1000000 bis 1000000000 Nukleotiden auf dem Reaktionsträger abgebildet werden. Solche Reaktionsträger können mehrmals verwendet werden und stellen eine Kopie des verwendeten Probenmaterials dar. Dies kann insbesondere verwendet werden, um z. B. Fingerprints auf der Basis der DNA oder RNA-Sequenzinformation von z. B. Pathogenen, Biokampfstoffen oder anderen Organismen zu erstellen.
Die an die Oberfläche des Reaktionsträgers kovalent gebundenen langen Moleküle können, da sie eine Abschrift des Probenmaterials sind, direkt im Reaktionsträger anstelle des Probenmaterials sequenziert werden und liefern damit die gleiche Sequenzinformation wie eine Sequenzierung des Probenmaterials selbst. Hierfür können dem Fachmann bekannte Methoden sowie die unter 2.3 und 6.5 beschriebenen Sequenzierungsverfahren verwendet werden. Eine Sequenzierung stellt gleichzeitig eine Qualitätssicherung des durch das Kopieren des Probenmaterials generierten Reaktionsträgers dar, die für eine weitere Nutzung des Reaktionsträgers herangezogen werden kann.
6.21 Vermehrung von Molekülen durch Zusammenwirken von Polymerasen und Nukleasen im Reaktionsträger
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierte Moleküle als Primer verwendet. Es können dabei sogenannte Hairpin-strukturen verwendet werden, die intramolekulare Hybridisierungsbereiche besitzen, die ganz oder teilweise doppelsträngig vorliegen und ein freies 3'-Ende aufweisen, das von einer Polymerase verlängert werden kann. Alternativ können Primermoleküle an die auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Moleküle hybridisiert werden und durch eine Polymerase verlängert werden. Die Primer können zuvor durch bestimmte Methoden kovalent mit den auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Molekülen verknüpft (crosslink) werden. Dabei kann zum Beispiel Psoralen zum Einsatz kommen.
Die auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Sondenmoleküle enthalten außerdem eine Erkennungssequenz für dem Fachmann bekannte Nicking Endonukleasen. Durch sequenzielle oder simultane Prozessierung des so präparierten Reaktionsträgers mit Polymerasen und Nicking Endonukleasen kann dadurch eine Amplifikation von Molekülen entstehen. Es kann nach Verlängerung des Primers oder des Hairpins durch die Nicking Endonuklease der neusynthetisierte Strang, der durch die Polymerase an den Primer geknüpft wurde, an einer Stelle zerschnitten werden. Durch den Schnitt steht der vorher verlängerte Primer wieder als Substrat für eine Polymerase zur Verfügung. Dieser wird wieder verlängert, wobei die Polymerase den vom Primer abgetrennten, vorher synthetisierten Strang verdrängt, wie es dem Fachmann als Strand Displacement bekannt ist. Alternativ kann der Strang auch durch eine Temperaturveränderung verdrängt werden. Dieser Prozess kann wiederholt ablaufen, wodurch eine Vermehrung der von der Polymerase synthetisierten und von der Nicking Endonuklease abgeschnittenen Moleküle stattfindet. 24 und 25 illustrieren diese bevorzugte Ausführungsform. Bevorzugt können Gemische von Polymerasen und Nicking Endonukleasen verwendet werden, wodurch Neusynthese und Abschneiden der zu vermehrenden Stränge in einer Mischung in einem Reaktionsträger ablaufen können, ohne dass Mischungen ausgetauscht werden müssen. Es können dabei auch thermostabile Enzyme eingesetzt werden. Zu verwendende Enzyme sind zum Beispiel das Klenow-Fragment der E. coli DNA Polymerase I und Mutanten, wie 3'–5'-Exonuklease defiziente Mutanten, Bacillus stearothermophilus (Bst) DNA Polymerase, Phi29 DNA Polymerase, die Endonukleasen N.Alwl, N.BstNBI und andere. Die neu entstandenen Moleküle sind bevorzugt DNA-Oligonukleotide oder derivatisiertes DNA-Oligonukleotide oder DNA-Oligonukleotid-Analoga. Diese besitzen eine Länge von bevorzugt 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, oder 200 Nukleotiden.
6.22 Crosslinking von hybridisierten Molekülen mit den im Reaktionsträger synthetisierten Sondenmolekülen
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden an die auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Moleküle andere Moleküle gebunden und kovalent mit diesen verknüpft. Es kommen dabei unterschiedliche, dem Fachmann bekannte Methoden für das Crosslinking von Biomolekülen zum Einsatz. Bevorzugt werden dabei Nukleinsäuren miteinander verknüpft, d. h. die auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Moleküle sind Oligonukleotide oder Derivate oder Analoga von DNA oder RNA. Diese werden mit in den Reaktionsträger eingebrachten Oligonukleotiden oder Derivaten oder Analoga von DNA oder RNA sequenzspezifisch hybridisiert und miteinander verknüpft. Es können dafür zum Beispiel dem Fachmann bekannte Verknüpfungsmethoden verwendet werden, die auf z. B. einer Psoralen-Einheit beruhen, oder auf Aldehyden oder Ketonen oder Radikal- oder Carben- oder Nitren-bildenden chemischen Gruppen.
6.23 Assemblierung von kurzen Sondenmolekülen zu längeren Molekülen direkt im Reaktionsträger
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden im Reaktionsträger synthetisierte Moleküle direkt im Reaktionsträger zu längeren Molekülen spezifisch miteinander verknüpft. Die zu verknüpfenden Moleküle können dabei chemisch auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisiert worden sein oder durch bestimmte enzymatische Methoden hergestellt worden sein. Bevorzugt liegen diese direkt nach der Synthese oder durch eine Abspaltung in löslicher Form vor und sind nicht mehr an die Oberfläche gebunden. Bevorzugt kommen dabei Methoden wie PCR, Primer Extension oder die unter 6.21 beschriebenen Methoden zum Einsatz. Es können dabei verschiedene Moleküle in definierter Reihenfolge miteinander verknüpft werden. Dies kann zum Beispiel durch zueinander komplementäre, in den Molekülen enthaltene, spezifische Bindungsstellen erfolgen. Diese Bindungsstellen bewirken eine spezifische, zunächst nichtkovalente Zusammenlagerung der Moleküle. Durch Einsatz bestimmter Enzyme wie zum Beispiel Ligasen oder Polymerasen können nun diese Moleküle kovalent miteinander verknüpft werden. Die Länge der zu verknüpfenden Moleküle kann dabei 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, oder 200 Nukleotide betragen. Bevorzugt werden dabei Oligonukleotide oder Derivate oder Analoga von DNA oder RNA verknüpft. Es entstehen dabei lange Fragmente im Bereich von hunderten bis tausenden Nukleotiden.
6.24 Steuerung der Assemblierung von kurzen Sondenmolekülen zu längeren Molekülen direkt im Reaktionsträger über die Stoffmengenanteile bestimmter Sondenmoleküle und ihres Standortes im Reaktionsträger
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden im Reaktionsträger synthetisierte Moleküle direkt im Reaktionsträger zu längeren Molekülen spezifisch miteinander verknüpft. Die wie unter 6.23 stattfindende Verknüpfung wird dabei durch bestimmte Eigenschaften des Reaktionsträgers gesteuert. Bevorzugt kann dabei die Stoffmenge einzelner Molekülarten relativ zu der Stoffmenge anderer Moleküle in einer Weise verändert sein, die eine bestimmte Positionierung an bestimmten Stellen im späteren, kovalent verknüpften Zielmolekül begünstigt. Besonders bevorzugt kann auch die Reihenfolge der Verknüpfung und die Position der einzelnen Moleküle im späteren, kovalent verknüpften Zielmolekül gesteuert werden, indem die einzelnen Moleküle an adressierbaren Lokationen auf der Oberfläche des Reaktionsträgers in einer Weise synthetisiert werden, dass ihre räumliche Lage auf der Oberfläche zueinander eine gerichtete, spezifische Verknüpfung begünstigt. Es können z. B. Moleküle, die im späteren, kovalent verknüpften Zielmolekül direkt miteinander verknüpft werden sollen und dadurch nebeneinander liegen sollen, auch an benachbarten Lokationen des Reaktionsträgers synthetisiert werden. Durch physikalische Effekte wie unterschiedlich schnelle Diffusion der einzelnen Moleküle zueinander, z. B. gesteuert durch unterschiedliche Weglängen, kann auch der Zeitpunkt der Zusammenstöße und dadurch der Verknüpfung einzelner Moleküle gesteuert werden. Es können zum Beispiel einzelne Populationen sehr nah nebeneinander in inselähnlichen Gruppen synthetisiert werden und nach Ablösen oder nach dem Erstellen von löslichen, nicht mehr mit der Oberfläche verknüpften Kopien bevorzugt miteinander dadurch verknüpft werden, dass die Diffusionswege kurz sind und die Moleküle schnell zusammenstoßen. Es entstehen innerhalb der Inseln dann längere, verknüpfte Moleküle die aus relativ wenigen Einzelmolekülen zusammengesetzt sind, wodurch die Komplexität der Zusammenlagerung und Verknüpfung gering bleibt. Liegen mehrere solcher Inseln weiter voneinander entfernt als die Moleküle innerhalb einer Insel und ist z. B. die Verknüpfung vollständig und schneller als die Diffusion der unverknüpften Einzelmoleküle von Insel zu Insel, können die innerhalb einer Insel vorverknüpften Moleküle zur jeweils nächsten Insel diffundieren und auf die dortigen vorverknüpften Moleküle treffen, wonach sie mit diesen verknüpft werden. Dadurch bleibt die Zahl der Moleküle und die Komplexität während der einzelnen Verknüpfungen klein und es können stufenweise immer größere Fragmente aufgebaut werden. Durch Verwendung viskoser Lösungsmittel kann die Stärke dieses Regulationsmechanismus weiter gesteuert werden.
6.25 Verwendung des Reaktionsträgers für den Nachweis von microRNAs und anderen kleinen RNAs
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Moleküle verwendet, um microRNAs und andere kleine RNAs in Probengemischen nachzuweisen. 28 bis 36 illustrieren diese bevorzugte Ausführungsform. Die auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Moleküle enthalten dabei eine oder mehrere Bindungsstellen, die spezifisch bestimmte microRNAs oder andere kleine RNAs binden. Bevorzugt sind dabei 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Bindungsstellen, besonders bevorzugt 1, 2 und 3 Bindungsstellen. Die Bindungsstellen können dabei direkt aneinander grenzen oder durch kleine Zwischenbereiche bestimmter Länge getrennt sein. Die auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Moleküle sind dabei vorzugsweise Oligonukleotide oder Derivate oder Analoga von DNA oder RNA mit einer Länge von vorzugsweise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, oder 200 Einzelbausteinen wie Nukleotiden oder Derivaten oder Analoga von Nukleotiden. Die microRNAs oder andere kleinen RNAs können somit spezifisch gebunden werden und dadurch in komplexen Probengemischen durch Detektionsverfahren, wie sie dem Fachmann aus der Mikroarray Technologie bekannt sind, nachgewiesen werden. Die nachzuweisenden Moleküle können dabei vor Einbringung in den Reaktionsträger oder auch direkt im Reaktionsträger vor, während oder nach Bindung an die auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Moleküle mit signalgebenden Gruppen oder Haptenen verknüpft werden, die ihre Detektion, vorzugsweise durch ein optisches Signal, ermöglichen. Es stehen dafür eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Methoden für die Markierung (Labeling) zur Verfügung, z. B. durch direktes Labeling mit Biotin oder Fluorophoren oder indirekt während cDNA-Synthese oder Amplifikation. Sowohl chemische als auch enzymatische Verfahren sind hierfür bekannt, z. B. basierend auf cis-Platin-Verbindungen, Periodat-Hydrazin-Labeling, T4 RNA Ligase, Poly-A-Polymerase oder Kopplung an aminomodifizierte RNAs. Die signalgebenden Gruppen können dabei insbesondere fluoreszenzaktive Gruppen sein oder Fluorophore oder dem Fachmann bekannte FRET-Quencher oder FRET-Akzeptorgruppen oder lumineszierende Gruppen. Diese können direkt eingeführt werden oder als Gruppen mit anderen chemischen Einheiten wie z. B. Dendrimeren verknüpft sein oder mit Liganden, die zuvor an die RNA angeknüpfte Haptengruppen binden. Die 28–36 illustrieren diese bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Bevorzugt kann auch eine Signalverstärkung verwendet werden, wie zum Beispiel die Einführung von einem Hapten wie Biotin, der darauffolgenden Bindung eines Konjugates aus Streptavidin und einem Fluorophor oder mehreren Fluorophoren. Optional kann daraufhin ein weiterer Ligand gebunden werden, der seinerseits mit einem oder mehreren Haptenen oder Fluorophoren verknüpft ist, so dass eine größere Zahl von Haptenen oder Fluorophoren bindet. Es kann daraufhin ein weiterer Ligand binden, der seinerseits mit einem oder mehreren Haptenen oder Fluorophoren verknüpft ist, so dass eine größere Zahl von Haptenen oder Fluorophoren bindet. Dieser Prozess kann mehrfach erfolgen, vorzugsweise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 mal. Als Liganden werden dabei vorzugsweise Antikörper verwendet; als Hapten vorzugsweise Biotin oder Digoxigenin. Bevorzugt können auch Oligonukleotide als Primer in einer dem Fachmann bekannten Rolling-circle-Amplifikation verwendet werden, die mit Streptavidin verknüpft sind. Das Streptavidin-Biotin-Konjugat kann zuvor an Biotineinheiten gebunden haben, die zuvor an Hybride von Sondenmolekülen und Probenmolekülen angeknüpft wurden.
Die 16 und 17 zeigen Daten von erfolgreichen Experimenten für diese bevorzugte Ausführungsform.
In ebenfalls bevorzugten Ausführungsformen werden microRNAs oder andere Analyten auf der Oberfläche des Reaktionsträgers amplifiziert. Diese Amplifikation kann eine Einzelstrangamplifikation oder eine Doppelstrangamplifikation sein. In weiter bevorzugten Ausführungsformen wird die microRNA oder ein anderer Analyt vor, während oder nach der Amplifikatiön wie oben beschrieben durch den Einbau markierter Bausteine nachgewiesen. In weiter bevorzugten Ausführungsformen wird die microRNA oder ein anderer Analyt durch DNA-Intercalatoren, Molecular Beacons, Taqman-Sonden und andere dem Fachmann bekannte Verfahren nachgewiesen.
Die für die Bindung bestimmter miRNAs oder anderer kleiner RNAs verwendeten auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Moleküle können dabei bezüglich ihrer gewünschten Bindungsstelle oder Bindungsstellen vollständig oder nur teilweise komplementär zur Sequenz der zu bindenden RNA sein. Es können dabei zum Beispiel 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 einzelne Basen nichtkomplementär zur Sequenz der zu bindenden RNA sein. 14 zeigt Daten von erfolgreichen Experimenten, in denen in der beschriebenen Weise microRNAs in komplexen Probengemischen aus unterschiedlichen Geweben nachgewiesen wurden. Es wurden dabei Moleküle mit 1 oder 2 Bindungsstellen für die Bindung der microRNAs verwendet, die direkt aneinandergrenzten oder durch Zwischenbereiche voneinander getrennt waren und entweder vollständig komplementär zur Sequenz der zu bindenden RNA waren oder an 1, 2, oder 3 Niukleotidpositionen nichtkomplementär zur Sequenz der zu bindenden RNA. 15 illustriert detaillierte Optimierungsergebnisse bezüglich der Temperatur und Pufferbedingungen für den spezifischen Nachweis einer Vielzahl von microRNAs aus einem komplexen Probengemisch.
Die Art des Probengemisches kann dabei unterschiedlich sein, es können ungereinigte oder ganz oder teilweise gereinigte Extrakte aus Zellen oder Geweben verwendet werden. Dies können zum Beispiel totale Nukleinsäureaufreinigungen, totale RNA-Aufreinigungen oder spezielle Aufreinigungen sein, die eine Anreicherung von kleinen RNAs wie z. B. microRNAs ermöglichen. Dem Fachmann sind hierfür zahlreiche Verfahren bekannnt. 18 zeigt Daten von erfolgreichen Experimenten, in denen in der beschriebenen Weise microRNAs aus unterschiedlichen Geweben nachgewiesen wurden. Die Komplexität der Probengemische war dabei unterschiedlich, es wurden totale RNA-Extrakte verwendet oder kleine RNAs mithilfe eines speziellen Reinigungsverfahrens zuvor angereichert.
Die nachzuweisenden RNAs können auch vor einer Detektion in bestimmter Weise direkt im Reaktionsträger enzymatisch prozessiert werden. Besonders bevorzugt ist dabei eine Verlängerung der gebundenen RNAs durch eine Polymerase wie in einer dem Fachmann bekannten Primer Extension, wobei gleichzeitig eine oder mehrere signalgebende Gruppen oder Haptene mit der RNA verknüpft werden können. Dies kann bevorzugt durch den Einbau von mit signalgebenden Gruppen oder mit Haptenen modifizierten Nukleotiden durch eine Polymerase erfolgen. Die Art und Zahl der mit signalgebenden Gruppen oder Haptenen modifizierten Nukleotide kann durch die Zusammensetzung des Sondenmoleküls bestimmt werden. Dies kann bevorzugt durch eine Templatsequenz geschehen, die über die Anwesenheit bestimmter Nukleotide Art und Zahl der eingebauten Bausteine genetisch kodiert. Bevorzugt können auch Nukleasen im Reaktionsträger verwendet werden, die selektiv die auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Moleküle spalten oder hydrolysieren oder verdauen, die nicht an eine RNA gebunden sind, oder selektiv die auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Moleküle spalten oder hydrolysieren oder verdauen, die an eine RNA gebunden haben. 28 illustriert diese bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden gewünschte, im zu untersuchenden Probengemisch vorhandene microRNAs und andere kleine RNAs spezifisch amplifiziert. Durch die Fähigkeit, eine große Zahl unterschiedlicher Sequenzen im Reaktionsträger zu erzeugen und diese als Primer zu verwenden, kann eine Vielzahl von an die jeweiligen zu amplifizierenden RNAs individuell angepassten Amplifikationsreaktionen parallel durchgeführt werden. Es steht dabei die gesamte Bandbreite der Amplifikationsreaktionen, die dem Fachmann bekannt sind, zur Verfügung. Insbesondere können dabei die unter 6.1, 6.5, 6.6, 6.9, 6.15, 6.16, 6.18, 6.19, 6.20 und 6.21 beschriebenen Verfahren verwendet werden. Die zu untersuchenden RNAs können dabei entweder als Templat oder als Primer oder beides fungieren und/oder vor der Amplifikation mit universellen Sequenzen verknüpft werden.
Insgesamt stellt die Ausnutzung der beschriebenen molekularbiologischen Prozessanlage für die Detektion, Quantifizierung und Charakterisierung von microRNAs und anderen kleinen RNAs eine erhebliche Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik dar. Da die Zahl der in der Natur vorkommenden kleinen RNAs wie microRNAs noch unbekannt ist und in sehr kurzen Zeiträumen immer neue RNAs entdeckt werden, ist eine Anpassung von Analyseverfahren an die jeweils vorgefundenen Bedingungen, d. h. Zahl und Art zu untersuchender RNAs zwingend notwendig. Durch die Möglichkeit, eine große Zahl unterschiedlicher Sondenmoleküle auf der Oberfläche des Reaktionsträgers in sehr kurzer Zeit zu synthetisieren und zu testen, ist es mit der beschriebenen Prozessanlage möglich, sehr schnell auf Veränderungen der zu untersuchenden Molekülarten zu reagieren und die Analyseverfahren anzupassen.
6.26 Verwendung des Reaktionsträgers für den Nachweis und die Typisierung von Pathogenen
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Moleküle verwendet, um Mikroorganismen und/oder Pathogene nachzuweisen und zu charakterisieren. Es werden dabei bevorzugt bestimmte, für ein bestimmtes Pathogen oder einen Mikroorganismus charakteristische Nukleinsäuren selektiv von den auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Molekülen gebunden. Als Nukleinsäuren werden dabei bevorzugt Gene, mRNAs, genomische RNA oder DNA oder andere RNAs des Pathogens verwendet. Es werden außerdem auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierte Moleküle verwendet, um die Identität einzelner Nukleotide in diesen Nukleinsäuren zu analysieren. Somit können Mutationen wie Nukleotidsubstitutionen, Deletionen oder Insertionen aufgeklärt werden. Hierfür werden Verfahren verwendet, die auf der selektiven Hybridisierung von auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Molekülen beruhen. Dem Fachmann sind zahlreiche Methoden bekannt, um solche Mutationen zu detektieren. Neben der Hybridisierung, die selektiv für bestimmte Mutationen verläuft, werden noch zahlreiche weitere dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet, die auf Enzymen beruhen. Besonders bevorzugt ist dabei die Verwendung von Polymerasen, Nukleasen und Ligasen. In allen diesen Fällen werden die zu untersuchenden Nukleinsäuren gebunden und/oder als Substrat verwendet, wobei sich die Effizienz der vom jeweiligen Enzym katalysierten Reaktion dann verändert, wenn eine Mutation in der zu untersuchenden Nukleinsäure vorliegt. Alternativ kann sich diese Effizienz auch verändern, wenn durch Bindung der zu untersuchenden Nukleinsäure an die auf der Oberfläche des Reaktionsträgers synthetisierten Molekülen bestimmte Nukleotidpaare entstehen, die sich zum Beispiel darin unterscheiden, dass sie dem Fachmann als Watson-Crick-Basenpaaren bekannte Paare bilden oder andere Paare. Dem Fachmann sind zahlreiche Methoden für solche Nachweisverfahren bekannt, wie APEX, allelspezifische Hybridisierung, allelspezifische Primer Extension, allelspezifische PCR, ASA, Taqman assays, Molecular Beacons, Minisequencing, SSCP-PCR, Mismatch cleavage, OLA, Branch migration assay (BMI), Pyrosequencing, Dynamic allele specific Hybridization (DASH), Multiplex Automated Primer Extension Assay, (MAPA) und viele mehr. Es können auch die unter 6.1, 6.5, 6.6, 6.9, 6.15, 6.16, 6.18, 6.19, 6.20 und 6.21 beschriebenen Verfahren verwendet werden. 19 illustriert einen solchen Assay und zeigt Daten von erfolgreichen Identifizierungen einzelner Nukleotidpositionen in einer DNA-Probe. Diese Methoden werden besonders bevorzugt eingesetzt, um Pathogenstämme voneinander zu unterscheiden und Typisierung von Pathogenen zu ermöglichen. Alle Pathogen-Spezies kommen in der Natur mit unterschiedlichen Genotypen vor, die sich häufig nur durch wenige Mutationen voneinander unterscheiden, aber unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, wie Infektionspotential, Resistenzen gegenüber bestimmten Medikamenten und viele mehr. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden gewünschte, im zu untersuchenden Probengemisch vorhandene, aus Pathogenen stammende oder selbst Pathogene darstellende Nukleinsäuren spezifisch amplifiziert. Durch die Fähigkeit, eine große Zahl unterschiedlicher Sequenzen im Reaktionsträger zu erzeugen und diese als Primer zu verwenden, kann eine Vielzahl von an die jeweiligen zu amplifizierenden RNAs individuell angepassten Amplifikationsreaktionen parallel durchgeführt werden. Es steht dabei die gesamte Bandbreite der Amplifikationsreaktionen, die dem Fachmann bekannt sind, zur Verfügung. Insbesondere können dabei die unter 6.1, 6.5, 6.6, 6.9, 6.15, 6.16, 6.18, 6.19, 6.20 und 6.21 beschriebenen Verfahren verwendet werden. Die zu untersuchenden Nukleinsäuren können dabei entweder als Templat oder als Primer oder beides fungieren und vor der Amplifikation mit universellen Sequenzen verknüpft werden.
Die Molekulare Diagnostik wird heute in vielen Bereichen verwendet, um Mikroorganismen und Viren nachzuweisen und in Proben zu quantifizieren. Hierbei kommt insbesondere die quantitative Echtzeit-PCR zum Einsatz. In gängigen Arbeitsabläufen werden zum Beispiel Proben in einzelnen PCRs oder Multiplex-PCRs auf den Gehalt eines bestimmten Pathogens hin untersucht. Fällt der Test positiv aus, schließt sich eine Vielzahl von weiteren, auf quantitativer Echtzeit-PCR beruhenden Untersuchungen an, um den genauen Genotyp der Pathogenspezies aufzuklären. Dies kann zum Beispiel notwendig sein, um über die Art einer Chemotherapie zu entscheiden oder um epidemiologische Untersuchungen anzustellen oder die Populationen bestimmter Stämme zu überwachen oder das Auftreten neuer Stämme zu entdecken. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Produkte der ersten Echtzeit-PCR, die zur Detektion eines Pathogens genutzt werden, direkt verwendet, um im Reaktionsträger eine Aufklärung des genauen Genotyps der Pathogen-Spezies aufzuklären. Der Reaktionsträger kann dabei in der Weise gestaltet werden, dass sowohl bereits bekannte als auch neue Genotypen detektiert werden können. 37 illustriert diese bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Insgesamt stellt die Ausnutzung der beschriebenen molekularbiologischen Prozessanlage für die Detektion, Quantifizierung und Genotypisierung von Pathogenen eine erhebliche Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik dar. Da die Genotypen von Pathogenen hochvariabel sind, ist eine schnelle Anpassung von Analyseverfahren an die jeweils vorgefundenen Bedingungen zwingend notwendig. Durch die Möglichkeit, eine große Zahl unterschiedlicher Sondenmoleküle auf der Oberfläche des Reaktionsträgers in sehr kurzer Zeit zu synthetisieren und zu testen, ist es mit der beschriebenen Prozessanlage möglich, sehr schnell auf Veränderungen der zu untersuchenden Proben wie Pathogenen zu reagieren und die Analyseverfahren anzupassen.
6.27 Rapid Prototyping in der beschriebenen molekularbiologischen Prozessanlage
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die beschriebene Prozessanlage genutzt, um Sondenmoleküle empirisch zu testen und damit für bestimmte Anwendungen schnell eine große Zahl geeigneter Sondenmoleküle bereitzustellen. Es ist bekannt, dass die Bindungseigenschaften von Sondenmolekülen wie z. B. Oligonukleotiden oder Derivaten oder Analoga von DNA oder RNA nicht sehr genau vorausgesagt werden können. Es existieren keine bioinformatischen Verfahren, um die Bindungsstärke und/oder Spezifität solcher Sondenmoleküle in Bezug auf gewünschte Probenmoleküle vorherzusagen. Daraus resultiert eine Notwendigkeit zum empirischen Testen von Sondenmolekülen. Es können nach einem solchen Testexperiment dann in einem „Rapid Prototyping Prozess" nach bestimmten Qualitätskriterien Sonden ausgewählt werden, die die gewünschten Bedingungen erfüllen und in späteren Experimenten weiterverwendet werden. Ist es gewünscht, eine Probe zu untersuchen, für die noch keine geeigneten oder nur begrenzt geeignete Sondenmoleküle bekannt sind, kann so in Modellexperimenten sehr schnell eine Zahl von Sonden generiert, getestet und/oder optimiert werden, die dann in späteren Experimenten für diese Art von Probe weiterverwendet werden kann. In dieser Weise bietet die hohe Flexibilität der beschriebenen molekularbiologischen Prozessanlage einen erheblichen Vorteil gegenüber dem Stand der Technik. Die meisten dem Fachmann bekannten Methoden zur Erzeugung einer Vielzahl unterschiedlicher Sondenmoleküle sind entweder sehr langsam oder können dies nicht zu einem wirtschaftlich akzeptablen Preis leisten. Die hohe Flexibilität der beschriebenen Prozessanlage bietet im Gegensatz dazu die Möglichkeit, in sehr kurzer Zeit eine sehr große Zahl von Sondenmolekülen zu einem geringen Preis zu generieren, zu testen und/oder zu optimieren, so dass schnell auf Veränderungen in der Art der zu untersuchenden Probenmoleküle reagiert werden kann, d. h. das Analyseverfahren individuell angepasst werden kann.
7 Experimente
Die Erfindung wird im Folgenden durch die nachfolgenden Experimente veranschaulicht:
Für die in 4 und 5 gezeigten Daten wurden DNA-Sonden mit einer Länge zwischen 21–23 Nukleotiden analog zu publizierten Methoden in einem mikrofluidischen Reaktionsträger synthetisiert (Baum, M. et. al., Nucleic Acids Research, 2003, 31, e151 und darin zitierte Referenzen). Es wurde dabei eine inverse Synthesechemie verwendet, so dass die Sonden mit dem 5'-Ende an die Oberflache des Reaktionsträgers gebunden waren und ein freies 3'-Ende aufwiesen. Für die Experimente wurde eine externe Reaktionseinheit eingesetzt, die das Befüllen und Temperieren des Reaktionsträgers ermöglicht.
Der Reaktionsträger wurde mit einer Mischung aus 200 nM PCR-Produkt und 33 bis 200 μM jedes der vier dNTP (wovon 33% des TTP durch Biotin-16-dUTP (Roche) ersetzt war) im für die jeweilige DNA-Polymerase vom Hersteller bereitgestellten Reaktionspuffer befüllt, 5 min auf 80°C erhitzt und über 20 min auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Reaktionsträger wurde für mesophile DNA-Polymerasen auf 37°C und für thermostabile DNA-Polymerasen auf 72°C temperiert, die Mischung wurde entfernt und der Reaktionsträger mit der gleichen Mischung, die 1 μL Enzym pro 15 μL enthielt, befüllt. Nach einer Reaktionszeit von 10 min wurde der Reaktionsträger mit 500 μL Wasser gewaschen. Der Reaktionsträger wurde innerhalb der molekularbiologischen Prozessanlage mit einer Streptavidin-Phycoerythrin enthaltenden Pufferlösung inkubiert, gewaschen und durch Fluoreszenzmessung analysiert.
Für die in 6A–D gezeigten Daten wurden DNA-Sonden wie oben hergestellt, die eine selbstkomplementäre Sequenz enthalten und dadurch eine Haarnadelstruktur ausbilden, die ein gepaartes 3'-Ende besitzt, das von einer DNA-Polymerase als Primer verwendet werden kann. Die Sonden hatten dabei eine Länge von 27 und 30 Nukleotiden, die Länge des selbstkomplementären Bereichs variierte zwischen 4–7 Nukleotiden, der Schlaufenbereich zwischen den selbstkomplementären Bereichen war jeweils eine TTTT Sequenz. Die Experimente wurden analog zu den oben beschriebenen Experimenten bzgl. 4 und 5 durchgeführt.
Für die in 7–9 gezeigten Daten wurden Sonden einer Länge zwischen 30 und 50 Nukleotiden synthetisiert, die verschiedene Bindungsstellen für Primer aufwiesen, so dass sich durch Hybridisierung ein Primer-Templat-Komplex mit einem von einer DNA Polymerase kopierbaren Einzelstrangbereich bildet. Die Experimente wurden analog zu den oben beschriebenen Experimenten bzgl. 4 und 5 durchgeführt, mit der Änderung, dass statt des PCR-Produktes entsprechende Primer in einer Konzentration von 13 μM im Reaktionsgemisch vorhanden waren.
Für die in 8 gezeigten Daten wurde nach der Analyse des Reaktionsträgers durch die Fluoreszenzmessung mit Wasser bei 80°C gewaschen und unter gleichen Bedingungen erneut analysiert.
Für die in 14–18 gezeigten Experimente wurden 1–5 μg Gesamt-RNA mittels des dem Fachmann bekannten flashPAGE-Kits fraktioniert und aufgereinigt; oder fragmentiert und direkt weiterverwendet; oder direkt verwendet; und mittels des dem Fachmann bekannten mirVana-Kits nach Protokoll des Herstellers markiert. Die aufgereinigten, markierten RNA-Proben wurden in den Reaktionsträger eingebracht und bei bestimmten Temperaturen unter Pufferbedingungen wie in 15 beschrieben inkubiert.
Nach Ablauf der Inkubation wurde die Lösung aus dem Reaktionsträger entfernt. Der Reaktionsträger wurde innerhalb der molekularbiologischen Prozessanlage mit einer Streptavidin-Phycoerythrin enthaltenden Pufferlösung inkubiert, gewaschen und durch Fluoreszenzmessung analysiert. Optional wurde eine Signalamplifikation wie in der Figurenbeschreibung von 16 und 17 beschrieben durchgeführt (16 und 17).
Für die in 19 und 23 gezeigten Daten wurden DNA-Sonden mit einer Länge zwischen 21–50 Nukleotiden analog zu publizierten Methoden in einem mikrofluidischen Reaktionsträger synthetisiert (Baum, M. et. al., Nucleic Acids Research, 2003, 31, e151 und darin zitierte Referenzen). Es wurde dabei für die in 19 gezeigten Daten eine inverse Synthesechemie verwendet, so dass die Sonden mit dem 5'-Ende an die Oberfläche des Reaktionsträgers gebunden waren und ein freies 3'-Ende aufwiesen. Für die in 23 gezeigten Daten wurde dabei eine reguläre Synthesechemie verwendet, so dass die Sonden mit dem 3'-Ende an die Oberfläche des Reaktionsträgers gebunden waren und ein freies 5'-Ende aufwiesen. Für die Experimente wurde eine externe Reaktionseinheit eingesetzt, die das Befüllen und Temperieren des Reaktionsträgers ermöglicht.
19: Der Reaktionsträger wurde mit einer Mischung aus 200 nM PCR-Produkt und 200 μM jedes der vier dNTP (wovon 33% des TTP durch Biotin-16-dUTP (Roche) ersetzt war) im für die jeweilige DNA-Polymerase vom Hersteller bereitgestellten Reaktionspuffer befüllt, 5 min auf 80°C erhitzt und über 20 min auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Reaktionsträger wurde auf 68°C temperiert, die Mischung wurde entfernt und der Reaktionsträger mit der gleichen Mischung, die 1 μL einer Taq Polymerase pro 15 μL enthielt, befüllt. Nach einer Reaktionszeit von 15 min wurde der Reaktionsträger mit 500 μL Wasser gewaschen. Der Reaktionsträger wurde innerhalb der molekularbiologischen Prozessanlage mit einer Streptavidin-Phycoerythrin enthaltenden Pufferlösung inkubiert, gewaschen und durch Fluoreszenzmessung analysiert.
23: Der Reaktionsträger wurde mit einer Mischung aus 13 μM eines Primers und 33 μM jedes der vier dNTP (wovon 33% des TTP durch Biotin-16-dUTP (Roche) ersetzt war) im Reaktionspuffer „2" der Firma NEB befüllt, 5 min auf 80°C erhitzt und über 20 min auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Reaktionsträger wurde auf 37°C temperiert, die Mischung wurde entfernt und der Reaktionsträger mit der gleichen Mischung, die 1 μL Klenow Fragment (3'–5'-exo-) enthielt, befüllt. Nach einer Reaktionszeit von 30 min wurde der Reaktionsträger mit 500 μL Wasser gewaschen. Der Reaktionsträger wurde innerhalb der molekularbiologischen Prozessanlage mit einer Streptavidin-Phycoerythrin enthaltenden Pufferlösung inkubiert, gewaschen und durch Fluoreszenzmessung analysiert. Der Reaktionsträger wurde mit 80°C heißem Wasser gewaschen, und es wurde die gleiche Reaktion noch einmal durchgeführt, diesmal ohne Biotin-16-dUTP. Der Reaktionsträger wurde mit 25%iger Ammoniaklösung gewaschen, das Eluat eingetrocknet, in einer PCR-Reaktion als Templat eingesetzt, und gelelektrophoretisch untersucht.
Für die in 20–22 gezeigten Daten wurden DNA-Sonden wie für die in 19 gezeigten Daten synthetisiert. Für die Experimente wurde eine externe Reaktionseinheit eingesetzt, die das Befüllen und Temperieren des Reaktionsträgers ermöglicht.
Der Reaktionsträger wurde mit einer Mischung aus 5 μM Primer, ~214 pM PCR-Produkt, 200 μM jedes der vier dNTP (wovon 33% des TTP durch Biotin-16-dUTP (Roche) ersetzt war) und 0,1 U/μL Taq DNA Polymerase (NEB) in 20 mM Tris-HCl pH = 8,8, 10 mM KCl, 10 mM Ammoniumsulfat und 2 mM Magnesiumsulfat befüllt. Der Reaktionsträger wurde daraufhin einem Temperaturprofil ausgesetzt wie in 20 aufgeführt (s = Sekunden). Nach Ablauf des Temperaturprogramms wurde die Lösung aus dem Reaktionsträger entfernt. Der Reaktionsträger wurde innerhalb der molekularbiologischen Prozessanlage mit einer Streptavidin-Phycoerythrin enthaltenden Pufferlösung inkubiert, gewaschen und durch Fluoreszenzmessung analysiert.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Molekularbiologische Prozessanlage umfassend (a) ein Gerät für die in-situ-Synthese von Arrays von Rezeptoren, (b) ein oder mehrere Elemente für die Abarbeitung fluidischer Schritte, wie der Probenzugabe, Reagenzien-Zugabe, Waschschritte oder/und Probenableitung, (c) eine Detektionseinheit für die Erfassung eines optischen oder elektrischen Signals, (d) eine speicherprogrammierbare Einheit für die Steuerung der Synthese, und (e) eine speicherprogrammierbare Einheit für die Steuerung der Fluidik, der Detektion und der Speicherung und Verwaltung der Messdaten.
Molekularbiologische Prozessanlage nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Prozessanlage eine oder mehrere miniaturisierte Flusszellen aufweist und dass ein fluidischer Schritt in dieser einen oder diesen mehreren miniaturisierten Flusszellen 1 min oder weniger dauert.
Molekularbiologische Prozessanlage nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Prozessanlage eine oder mehrere miniaturisierte Flusszellen aufweist und dass das Fluidvolumen in dieser einen oder diesen mehreren miniaturisierten Flusszellen 40% oder weniger des Volumens der Zuleitung zum Fluidreservoir beträgt.
Molekularbiologische Prozessanlage nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Prozessanlage eine oder mehrere miniaturisierte Flusszellen aufweist und dass bei der Abarbeitung der fluidischen Schritte mindestens 2 unterschiedliche Reagenzien in diese eine oder diese mehreren miniaturisierten Flusszellen eingebracht werden.
Molekularbiologische Prozessanlage nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Abarbeitung der fluidischen Schritte diese unterschiedlichen Reagenzien in 10 min oder weniger in diese eine oder diese mehreren miniaturisierten Flusszellen eingebracht werden.
Molekularbiologische Prozessanlage nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Rezeptoren ausgewählt sind aus Oligopeptiden, Polypeptiden, Oligonukleotiden und Polynukleotiden.
Molekularbiologische Prozessanlage nach einem der Ansprüche 1 bis 6, zusätzlich umfassend eine Lichtquellenmatrix, die optional programmierbar ist.
Molekularbiologische Prozessanlage nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Gerät gemäß Absatz (a) einen Reaktionsträger mit mehreren vorbestimmten Positionen umfasst, an welchen die Rezeptoren immobilisiert werden können oder bereits immobilisiert sind.
Molekularbiologische Prozessanlage nach Anspruch 8, wobei unterschiedliche Rezeptoren an jeweils andere vorbestimmte Positionen immobilisiert werden können oder bereits immobilisiert sind.
Molekularbiologische Prozessanlage nach einem der Ansprüche 8 bis 9, wobei das Gerät gemäß Absatz (a) Mittel zur Zufuhr von Fluids in den Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger umfasst.
Molekularbiologische Prozessanlage nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Detektionseinheit in Form einer Detektionsmatrix ausgebildet ist, die mehrere Detektoren umfasst, die den vorbestimmten Positionen auf dem Träger zugeordnet sind.
Molekularbiologische Prozessanlage nach Anspruch 11, wobei der mikrofluidische Träger zwischen Lichtquellenmatrix und Detektionsmatrix angeordnet ist.
Molekularbiologische Prozessanlage nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Rezeptoren ausgewählt sind aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga, und wobei in einer oder mehreren der vorbestimmten Positionen die Rezeptoren in Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise eine Sekundärstruktur ausbilden.
Molekularbiologische Prozessanlage nach Anspruch 13, wobei die Sekundärstruktur eine Hairpin-Struktur ist.
Molekularbiologische Prozessanlage nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Rezeptoren ausgewählt sind aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga, und wobei die Rezeptoren aus mehreren unterschiedlichen Arten von Rezeptorbausteinen bestehen.
Verfahren zur Analyse der Nukleinsäuresequenz eines Nukleinsäureanalyten umfassend die Schritte: (a) in-situ-Synthese wenigstens einer Oligonukleotidsonde in wenigstens einem Synthesebereich in einer miniaturisierten Flusszelle; (b) Zugabe wenigstens eines einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäureanalyten zu den miniaturisierten Flusszellen; (c) Ligation oder sequenzspezifische Hybridisierung des Nukleinsäureanalyten an die Oligonukleotidsonde; und (d) wenigstens ein templat-abhängiger Nukleinsäuresyntheseschritt, der mit einer Änderung in einem optischen oder elektrischen Signal einhergeht.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Innenvolumen der Flusszelle aus Schritt (a) 40% oder weniger des Volumens der Zuleitung zum Fluidreservoir beträgt.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Flusszelle aus Schritt (a) dadurch gekennzeichnet ist, dass ein fluidischer Schritt 1 min oder weniger dauert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, zusätzlich wenigstens einen Schritt der Nukleinsäureamplifikation vor Schritt (d) umfassend.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei der Nukleinsäureanalyt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: – eine microRNA, – eine zu einer microRNA korrespondierende cDNA, – eine pathogen wirkende Nukleinsäure, und – eine aus einem Pathogen stammende Nukleinsäure.
Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure umfassend die Schritte: (a) in-situ-Synthese wenigstens einer Oligonukleotidsonde in wenigstens einem Synthesebereich in einer miniaturisierten Flusszelle; (b) Zugabe wenigstens eines einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäureanalyten zu den miniaturisierten Flusszellen; (c) Ligation oder sequenzspezifische Hybridisierung des Nukleinsäureanalyten an die Oligonukleotidsonde; und (d) wenigstens eine Runde Nukleinsäureamplifikation.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Nukleinsäureanalyt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: – eine microRNA, – eine zu einer microRNA korrespondierende cDNA, – eine pathogen wirkende Nukleinsäure, und – eine aus einem Pathogen stammende Nukleinsäure.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers für die Bestimmung von Nukleinsäure-Analyten durch Hybridisierung, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägerkörpers und (b) schrittweises Aufbauen eines Arrays von mehreren verschiedenen Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga auf dem Träger durch orts- oder/und zeitspezifisches Immobilisieren von Rezeptorbausteinen an jeweils vorbestimmten Positionen auf dem oder im Trägerkörper, wobei man für die Synthese der Rezeptoren mehrere unterschiedliche Sätze von Synthesebausteinen verwendet, um asymmetrische, d. h. aus mehreren unterschiedlichen Arten von Rezeptorbausteinen bestehende Rezeptoren zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers für die Bestimmung von Nukleinsäure-Analyten durch Hybridisierung, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägerkörpers und (b) schrittweises Aufbauen eines Arrays von mehreren verschiedenen Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga auf dem Träger durch orts- oder/und zeitspezifisches Immobilisieren von Rezeptorbausteinen an jeweils vorbestimmten Positionen auf dem oder im Trägerkörper, wobei in einer oder mehreren der vorbestimmten Positionen die Nukleotidsequenzen der Rezeptoren derart ausgewählt sind, dass die Rezeptoren in Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen.
Verfahren zur Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten Bereiche die Rezeptoren aus mehreren unterschiedlichen Arten von Rezeptorbausteinen bestehen, (b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe und (c) Bestimmen der Analyten über deren Bindung an die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren, wobei die Bindung eines Analyten an einem damit spezifisch bindefähigen Rezeptor zu einer detektierbaren Signaländerung führt.
Verfahren zur Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten Bereiche die Rezeptoren in Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen, (b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe und (c) Bestimmen der Analyten über deren Bindung an die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren, wobei die Bindung eines Analyten an einem damit spezifisch bindefähigen Rezeptor den Nachweis der Auflösung der in Abwesenheit des Analyten vorliegenden Sekundärstruktur umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 oder 26, wobei der Analyt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: – eine microRNA, – eine zu einer microRNA korrespondierende cDNA, – eine pathogen wirkende Nukleinsäure, und – eine aus einem Pathogen stammende Nukleinsäure.
Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure umfassend die Schritte: (a) in-situ-Synthese wenigstens einer Oligonukleotidsonde in wenigstens einem Synthesebereich in einer miniaturisierten Flusszelle; wobei die Oligonukleotidsonde intramolekulare Hybridisierungsbereiche aufweist; wobei einer der intramolekularen Hybridisierungsbereiche am 3'-Ende der Oligonukleotidsonde positioniert ist; und wobei eine Erkennungssequenz für eine Nicking-Endonuklease (i) in dem Hybridisierungsbereich am 3'-Ende der Oligonukleotidsonde vorhanden ist, oder (ii) durch eine sequenzabhängige Verlängerung des Hybridisierungsbereich am 3'-Ende der Oligonukleotidsonde generiert werden kann, oder (iii) in dem Hybridisierungsbereich am 3'-Ende der Oligonukleotidsonde partiell vorhanden ist und durch eine sequenzabhängige Verlängerung des Hybridisierungsbereichs am 3'-Ende der Oligonukleotidsonde vervollständigt werden kann; (b) sequenzspezifische Hybridisierung der intramolekularen Hybridisierungsbereiche der Oligonukleotidsonde miteinander; (c) Zugabe einer DNA-Polymerase; (d) sequenzabhängige Synthese eines komplementären DNA-Strangs durch die DNA-Polymerase ausgehend vom 3'-Ende der Oligonukleotidsonde; (e) Zugabe einer Nicking-Endonuclease; (f) Erzeugung eines erkennungssequenzspezifischen Einzelstrangbruchs durch die Nicking-Endonuclease; (g) sequenzabhängige Synthese eines neuen komplementären DNA-Strangs durch die DNA-Polymerase ausgehend vom in (f) erzeugten Einzelstrangbruch unter Verdrängung des zuvor synthetisierten komplementären DNA-Strangs; und (h) optional einmalige oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (f) und (g); wobei Schritt (c) vor, während oder nach Schritt (b) erfolgend kann; und wobei Schritt (e) vor, während oder nach einem der Schritte (b), (c) oder (d) erfolgen kann.
Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure umfassend die Schritte: (a) in-situ-Synthese wenigstens einer Oligonukleotidsonde in wenigstens einem Synthesebereich in einer miniaturisierten Flusszelle; (b) Zugabe eines Primermoleküls; wobei der Primer so gestaltet ist, dass er zumindest an seinem 3'-Ende einen zur Oligonukleotidsonde komplementären Bereich aufweist; und wobei eine Erkennungssequenz für eine Nicking-Endonuklease (i) in dem zur Oligonukleotidsonde komplementären Bereich des Primers vorhanden ist, oder (ii) durch eine sequenzabhängige Verlängerung des zur Oligonukleotidsonde komplementären Bereichs generiert werden kann, oder (iii) in dem zur Oligonukleotidsonde komplementären Bereich des Primers partiell vorhanden ist und durch eine sequenzabhängige Verlängerung des zur Oligonukleotidsonde komplementären Bereichs des Primers vervollständigt werden kann; (c) sequenzspezifische Hybridisierung des Primermoleküls an die Oligonukleotidsonde; (d) Zugabe einer DNA-Polymerase; (e) sequenzabhängige Synthese eines komplementären DNA-Strangs durch die DNA-Polymerase ausgehend vom 3'-Ende des Primermoleküls; (f) Zugabe einer Nicking-Endonuclease; (g) Erzeugung eines erkennungssequenzspezifischen Einzelstrangbruchs durch die Nicking-Endonuclease; (h) sequenzabhängige Synthese eines neuen komplementären DNA-Strangs durch die DNA-Polymerase ausgehend vom in (g) erzeugten Einzelstrangbruch unter Verdrängung des zuvor synthetisierten komplementären DNA-Strangs; und (i) optional einmalige oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (g) und (h); wobei Schritt (d) vor, während oder nach einem der Schritt (b) oder (c) erfolgen kann; und wobei Schritt (f) vor, während oder nach einem der Schritte (b), (c), (d) oder (e) erfolgen kann.
Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure umfassend die Schritte: (a) in-situ-Synthese einer Vielzahl wenigstens einer ersten Oligonukleotidsonde in wenigstens einem Synthesebereich in einer miniaturisierten Flusszelle; (b) in-situ-Synthese einer Vielzahl wenigstens einer zweiten Oligonukleotidsonde in wenigstens einem Synthesebereich in einer miniaturisierten Flusszelle; wobei der Abstand zwischen zwei beliebigen Oligonukleotidsonden jeweils so gewählt ist, dass sie nicht aneinander binden können; wobei jeweils zugehörige erste und zweite Oligonukleotidsonden im selben Synthesebereich synthetisiert werden. (c) Zugabe wenigstens eines einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäureanalyten zu den miniaturisierten Flusszellen; (d) Ligation oder sequenzspezifische Hybridisierung des Nukleinsäureanalyten an eine erste Oligonukleotidsonde; (e) Zugabe einer DNA-Polymerase; (f) sequenzabhängige Synthese eines komplementären DNA-Strangs durch die DNA-Polymerase ausgehend vom 3'-Ende der ersten Oligonukleotidsonde; (g) Ligation oder sequenzspezifische Hybridisierung des in (f) neu synthetisierten DNA-Strangs an eine zweite Oligonukleotidsonde; (h) sequenzabhängige Synthese eines komplementären DNA-Strangs durch die DNA-Polymerase ausgehend vom 3'-Ende der zweiten Oligonukleotidsonde; (i) optional Ligation oder sequenzspezifische Hybridisierung des in (h) neu synthetisierten DNA-Strangs an eine erste Oligonukleotidsonde; und (j) optional einmalige oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (f) bis (i); wobei Schritt (e) vor, während oder nach einem der Schritte (b), (c) oder (d) erfolgen kann.
Verfahren nach Anspruch 30, zusätzlich enthaltend einen oder mehrere der folgenden Verfahrensschritte: (A) ein stringenter Waschschritt nach Schritt (d); oder (B) ein stringenter Waschschritt nach Schritt (f).
Verfahren nach einem der Ansprüche 21, 22, 28, 29, 30 oder 31, wobei die Menge der neu synthetisierten Nukleinsäuren in Echtzeit bestimmt wird.
Verfahren zur Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind; wobei jeder einzelne Rezeptor mindestens einen Hybridisierungsbereich umfasst, an den ein Analyt spezifisch hybridisieren kann; (b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe; (c) Durchführen einer Primerverlängerungsreaktion; wobei der Analyt als Primer fungiert; wobei in der Primerverlängerungsreaktion Bausteine eingebaut werden, die eine oder mehrere signalgebende Gruppen und/oder ein oder mehrere Haptene tragen; und (d) Bestimmung des Analyten über den Einbau signalgruppenhaltiger oder haptenhaltiger Bausteine.
Verfahren nach Anspruch 33, zusätzlich enthaltend folgenden Verfahrenschritt: – eine Inkubation mit einer ssDNA-spezifischen Nuklease zwischen Schritt (b) und (c).
Verfahren zur Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind; wobei jeder einzelne Rezeptor mindestens einen Hybridisierungsbereich umfasst, an den ein Analyt spezifisch hybridisieren kann; (b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe; wobei die Analyten in der Probe vor, während oder nach dem Inkontaktbringen mit einer oder mehreren signalgebenden Gruppen und/oder mit einem oder mehreren Haptenen verknüpft worden sind; (c) Bestimmung des Analyten über die Detektion der signalgebenden Gruppe(n) oder des Haptens/der Haptene im Analyten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei der Analyt eine Nukleinsäure ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: – eine microRNA, – eine zu einer microRNA korrespondierende cDNA, – eine pathogen wirkende Nukleinsäure, und – eine aus einem Pathogen stammende Nukleinsäure.
Verfahren zur Amplifikation von Analyten, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind; wobei jeder einzelne Rezeptor an seinem 3'-Ende einen Hybridisierungsbereich aufweist, an den ein Analyt spezifisch hybridisieren kann; (b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe; und (c) Durchführen einer Primerverlängerungsreaktion; wobei die unterschiedlichen Rezeptoren als Primer fungieren, wodurch eine doppelsträngige Nukleinsäure erhalten wird, die aus Analyt und verlängertem Rezeptor besteht.
Verfahren nach Anspruch 37, zusätzlich enthaltend folgende Verfahrenschritte, die sich an Schritt (c) anschließen: (d) Thermische Denaturierung der in Schritt (c) erhaltenen doppelsträngigen Nukleinsäure; (e) Einstellung von Reaktionsbedingungen, die eine Hybridisierung von Analyt und nicht-verlängerten Rezeptoren erlauben; (f) Durchführen einer Primerverlängerungsreaktion, wobei die unterschiedlichen nicht-verlängerten Rezeptoren als Primer fungieren; und (g) optional Wiederholung der Schritte (d) bis (f).
Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, wobei in der Primerverlängerungsreaktion (c) gemäß Anspruch 37 und/oder in der Primerverlängerungsreaktion (f) gemäß Anspruch 38 Bausteine eingebaut werden, die eine oder mehrere signalgebende Gruppen und/oder ein oder mehrere Haptene tragen.
Verfahren nach Anspruch 39, zusätzlich enthaltend folgenden Verfahrensschritt, der während eines der Schritte (c) bis (g) oder nach einem der Schritte (c) bis (g) durchgeführt wird: – Bestimmung des Analyten über den Einbau der signalgruppenhaltigen und/oder haptenhaltigen Bausteine.
Verfahren nach Anspruch 37; wobei der Analyt eine RNA ist; wobei die unterschiedlichen Rezeptoren zusätzlich einen Bereich mit einer Primersequenz 1 aufweisen, die 5' zum Hybridisierungsbereich positioniert ist, und wobei das Verfahren zusätzlich folgende Verfahrenschritte aufweist, die sich an Schritt (c) anschließen: (d) Ligation einer Nukleinsäurekassette, die einen Bereich mit einer Primersequenz 2 aufweist, an die in Schritt (c) erhaltene doppelsträngige Nukleinsäure; (e) Durchführen einer Zweitstrangsynthese; (f) Durchführen mindestens eines Zyklus einer Amplifikationsreaktion unter Zugabe eines Primers mit der Primersequenz 1 und eines Primers mit der Primersequenz 2.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei in Schritt (e) und/oder Schritt (f) Bausteine eingebaut werden, die eine oder mehrere signalgebende Gruppen und/oder ein oder mehrere Haptene tragen.
Verfahren nach Anspruch 42, zusätzlich enthaltend folgenden Verfahrensschritt, der während eines der Schritte (e) bis (f) oder nach einem der Schritte (e) bis (f) durchgeführt wird: – Bestimmung des Analyten über den Einbau der signalgruppenhaltigen und/oder haptenhaltigen Bausteine.
Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 43, wobei der Analyt eine Nukleinsäure ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: – eine microRNA, – eine zu einer microRNA korrespondierende cDNA, – eine pathogen wirkende Nukleinsäure, und – eine aus einem Pathogen stammende Nukleinsäure.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers für die Nukleinsäureanalytik und/oder -synthese, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägerkörpers und (b) schrittweises Aufbauen eines Arrays von mehreren verschiedenen Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga auf dem Träger durch orts- oder/und zeitspezifisches Immobilisieren von Rezeptorbausteinen an jeweils vorbestimmten Positionen auf dem oder im Trägerkörper, wobei in mindestens einem Synthesebereich durch orthogonale chemische Verfahren mindestens 2 unterschiedliche Rezeptoren synthetisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 45, wobei die molekularbiologische Prozessanlage gemäß Ansprüchen 1 bis 15 verwendet wird.
Reagenzienkit, umfassend einen Trägerkörper und mindestens zwei unterschiedliche Sätze von Bausteinen für die Synthese von Rezeptoren auf dem Trägerkörper.
Reagenzienkit nach Anspruch 47 zusätzlich umfassend Reaktionsflüssigkeiten.
Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 47 oder 48, wobei die Bausteine für die Synthese von Rezeptoren ausgewählt sind aus Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden, N3'-P5'-Phosphoramidat-(NP)-Bausteinen, Locked-Nukleinsäure-(LNA)-Bausteinen, Morpholinophosphordiamidat-(MF)-Bausteinen, 2'-O-Methoxyethyl-(MOE)-Bausteinen, 2'-Fluor-arabino-Nukleinsäure-(FANA)-Bausteinen, Phosphorthioat-(PS)-Bausteinen, 2'-O-Methyl-(OMe)-Bausteinen und/oder Peptidnukleinsäure-(PNA)-Bausteinen.
Verwendung der molekularbiologische Prozessanlage gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15 – zum Nachweis oder/und zur Isolierung von Nukleinsäuren; – zur Sequenzierung; – zur Punktmutationsanalyse; – zur Analyse von Genomen, Genomvariationen, Genominstabilitäten und/oder Chromosomen; – zur Typisierung von Pathogenen; – zur Genexpressions- oder Transkriptomanalyse; – zur Analyse von cDNA-Bibliotheken; – zur Herstellung substratgebundener cDNA-Bibliotheken oder cRNA-Bibliotheken; – zur Erzeugung von Arrays für die Herstellung synthetischer Nukleinsäuren; Nukleinsäuredoppelstränge und/oder synthetischer Gene; – zur Herstellung von Arrays von Primern, Sonden für homogene Assays, Molecular Beacons und/oder Haarnadel-Sonden; – zur Erzeugung von Arrays für die Herstellung, Optimierung und/oder Entwicklung von Antisense-Molekülen; – zur weiteren Prozessierung der Analyten oder Zielmoleküle für die logisch nachgeordnete Analyse auf dem Mikroarray, in einem Sequenzierverfahren, in einem Amplifikationsverfahren oder für die Analyse in einer Gelelektrophorese; – zur Herstellung von prozessierten RNA-Bibliotheken für nachfolgende Schritte, ausgewählt aus: Translation in vitro oder in vivo oder Modulation der Genexpression durch iRNA oder RNAi; – zur Herstellung von Sequenzen, die anschließend mittels Vektoren oder in Plasmiden oder direkt kloniert werden; und/oder – zur Ligation von Nukleinsäuren in Vektoren oder Plasmide.
Verwendung nach Anspruch 50, wobei die Sequenzierung ein Sequencing-by-synthesis-Verfahren ist.
Verwendung nach Anspruch 50, wobei die Punktmutationsanalyse eine SNP-Analyse oder ein Nachweis neuer SNPs ist.
Verwendung nach Anspruch 50, wobei die hergestellten Arrays an Primern für Primer-Extension-Methoden, Strand-Displacement-Amplifikation, Polymerase Chain Reaction (PCR), Site Directed Mutagenesis oder Rolling Circle Amplifikation verwendet werden können.
Verwendung nach Anspruch 50, wobei die logisch nachgeordnete Analyse auf dem Mikroarray ein Amplifikationsverfahren ist, ausgewählt aus Strand Displacement Amplifikation, Polymerase Chain Reaction und Rolling Circle Amplifikation.
Verwendung nach Anspruch 50, wobei die nachzuweisende und/oder zu isolierende Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: – eine microRNA, – eine zu einer microRNA korrespondierende cDNA, – eine pathogen wirkende Nukleinsäure, und – eine aus einem Pathogen stammende Nukleinsäure.