Besonders
wichtige und weit verbreitete Einsatzgebiete für synthetische Nukleinsäurepolymere
sind Primer für
die poymerase chain reaction (PCR) [Critical Reviews in Biochemistry
and Molecular Biology 26 (3/4), S. 301-334, 1991] und die Sequenziermethode
nach Sanger [Proc. Nat. Acad. Sci. 74, S. 5463-5467, 1977].
Synthetische
DNA spielt auch für
die Herstellung von synthetischen Genen eine Rolle [1. WO 00/13017
A2, 2. S. Rayner et al., PCR Methods and Applications 8 (7), S.
741-747, 1998, 3. WO 90/00626 A1, 4.
EP 385 410 A2 ,
5 .
WO 94/12632 A1, 6. WO 95/17413 A1, 7.
EP 316 018 A2 ,
8 .
EP 022 242 A2 ,
9. L. E. Sindelar and J. M. Jaklevic, Nucl. Acids Res. 23 (6), S.
982-987, 1995, 10. D. A. Lashkari, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92
(17), S. 7912-7915, 1995, 11. WO 99/14318 A1].
Zwei
neuere Anwendungsfelder mit steigendem Bedarf sind die Herstellung
von Mikroarrays aus Oligonukleotid-Sonden [1. Nature Genetics, Vol.
21, supplement (gesamt), Jan. 1999, 2. Nature Biotechnology, Vol.
16, S. 981-983,
Okt. 1998, 3. Trends in Biotechnology, Vol. 16, S. 301-306, Jul.
19989] und die Herstellung von interferrierender RNA (iRNA oder
RNAi) für
die Modulation der Genexpression in Zielzellen [PCT/EP01/13968].
Die
genannten Anwendungsgebiete der Molekularbiologie liefern wertvolle
Beiträge
in der Wirkstoff-Entwicklung, der Wirkstoff-Produktion, der kombinatorischen
Biosynthese (Antikörper,
Effektoren wie Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter etc.), in der
Biotechnologie (z.B. Enzymdesign, Pharming, biologische Herstellungsverfahren,
Bioreaktoren etc.), in der molekularen Medizin, in der Entwicklung
und Anwendung von Diagnostika (Mikroarrays, Rezeptoren und Antikörper, Enzymdesign
etc.) oder in der Umwelttechnik (spezialisierte oder maßgeschneiderte
Mikroorganismen, Produktionsverfahren, Sanierung, Sensoren etc.).
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann somit in allen diesen Bereichen erfolgen.
Die
am weitesten verbreitete Methode zur Herstellung von synthetischen
Nukleinsäuren
basiert auf Grundlagenarbeiten von Caruthers und wird als Phosphitamid-Methode
beschrieben (M. H. Caruthers, Methods in Enzymology 154, S. 287-313,
1987). Die Sequenz der entstehenden Moleküle kann dabei durch die Syntheseabfolge
gesteuert werden. Andere Verfahren, wie z.B. die H-Phosphonat-Methode,
dienen dem gleichen Zweck des sukzessiven Aufbaues eines Polymers
aus seinen Untereinheiten, haben sich aber nicht so weit durchsetzen
können
wie die Methode nach Caruthers.
Um
das chemische Verfahren der Polymersynthese aus Untereinheiten automatisieren
zu können, werden
meistens feste Phasen verwendet, an denen die wachsende Molekülkette verankert
ist. Sie wird erst nach Fertigstellung der Synthese abgespalten,
wozu ein geeigneter Linker zwischen dem eigentlichen Polymer und
der festen Phase erforderlich ist. Die Methode verwendet zur Automatisierung
in der Regel feste Phasen in Form aktivierter Partikel, die in eine
Säule gefüllt werden,
z.B. controled pore glass (CPG). Solche festen Phasen tragen in
der Regel nur eine definiert trenn- und entnehmbare Art von Sequenz.
Die Zugabe der einzelnen Synthesereagenzien erfolgt nun in einer
steuerbaren Art und Weise in einem Automaten, der vor allem die
automatisierte Zugabe der einzelnen Reagenzien zur festen Phase
sicherstellt. Die Menge an synthetisierten Molekülen ist durch die Menge des
Trägermaterials
und die Größe der Reaktionsansätze steuerbar.
Diese Mengen sind für
die oben genannten molekular-biologischen Verfahren entweder ausreichend
oder sogar zu hoch (z.B. bei PCR-Primern). Eine gewisse Parallelisierung
zur Erzeugung einer Vielzahl unterschiedlicher Sequenzen wird durch
Anordnung von mehreren Säulen
in einem apparativen Aufbau erreicht. So sind dem Fachmann Geräte mit 96
parallelen Säulen
bekannt.
Eine
Variante und Weiterentwicklung der Herstellung von synthetischen
Nukleinsäuren
ist die in situ Synthese von Mikroarrays (Array-Anordnung der Nukleinsäuren in
einer Matrix). Diese wird auf einem Substrat durchgeführt, das
durch die Synthese mit einer Vielzahl unterschiedlicher Sequenzen
beladen wird. Ein Ablösen
der Syntheseprodukte ist dabei nicht vorgesehen. Der große Vorteil
der in situ Syntheseverfahren für
Mikroarrays ist die Bereitstellung einer Vielzahl von Molekülen unterschiedlicher
und definierter Sequenz an adressierbaren Lokationen auf einem gemeinsamen
Träger.
Die Synthese greift dabei auf ein überschaubares Set aus Einsatzstoffen
zurück
(bei DNA-Mikroarrays in der Regel die 4 Basen A, G, T und C) und
baut aus diesen beliebige Sequenzen der Nukleinsäurepolymere auf.
Die
Abgrenzung der einzelnen Molekülspezies
kann zum einen durch getrennte fluidische Kompartimente bei der
Zugabe der Syntheseeinsatzstoffe erfolgen, wie es z.B. in der so
genannten in situ Spotting Methode oder Piezoelektrischen Techniken
der Fall ist, beruhend auf der Tintenstrahldrucktechnik (A. Blanchard, in
Genetic Engineering, Principles and Methods, Vol. 20, Ed. J. Sedlow,
S. 111-124, Plenum Press; A. P. Blanchard, R. J. Kaiser, L. E. Hood,
High-Density Oligonucleotide Arrays, Biosens. & Bioelectronics 11, S. 687, 1996).
Eine
alternative Methode ist die ortsaufgelöste Aktivierung von Syntheseplätzen, was
z.B. durch selektive Belichtung oder selektive Zugabe von Aktivierungsreagenzien
(Entschützungsreagenzien)
möglich
ist. Die Menge an synthetisierten Molekülen einer Spezies ist bei den
bisher bekannten Methoden verhältnismäßig gering,
da in einem Mikroarray definitionsgemäß nur jeweils kleine Reaktionsbereiche
für jeweils
eine Sequenz vorgesehen werden, um möglichst viele Sequenzen im
Array und damit für
den funktionellen Einsatz abbilden zu können.
Beispiele
für die
bisher bekannten Verfahren sind die photolithographische lichtgestützte Synthese [McGall,
G. et al; J. Amer. Chem. Soc. 119; 5081-5090; 1997], die projektorbasierte lichtgestützte Synthese [PCT/EP99/06317],
die fluidische Synthese mittels Trennung der Reaktionsräume, die
indirekte projektorbasierte lichtgesteuerte Synthese mittels Photosäuren und
geeigneter Reaktionskammern in einem mikrofluidischen Reaktionsträger, die
elektronisch induzierte Synthese mittels ortsaufgelöster Entschützung an
einzelnen Elektroden auf dem Träger
und die fluidische Synthese mittels ortsaufgelöster Deposition der aktivierten
Synthese-Monomere.
Die
Nutzung von trägergebundenen
Bibliotheken ist für
die Synthese von synthetischen Genen in PCT/EP00/01356 beschrieben.
Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Matrix der Moleküle durch
den Schritt des Herauslösens
zerstört
wird. Ein zweiter wichtiger Punkt ist die Menge an synthetischer
DNA, die pro Reaktionsplatz im Träger, also pro Sorte an Oligo,
hergestellt werden kann. Durch den kleinen Maßstab, der definitionsgemäß mit der
Synthese verbunden ist, ist zudem die Handhabung der herausgelösten Oligonukleotide
nicht einfach.
Eine
Nutzung von trägergebundenen
Nukleinsäuren,
die in einer Array-Anordnung
hergestellt werden, ist auf der Homepage der Arbeitsgruppe Dr. J.
Hoheisel vom Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKFZ)
angegeben. Hier wird z.B. die Nutzung der Nukleinsäuren als
PCR-Primer thematisiert. Allerdings ist auch hier die Ablösung der
Moleküle
direkt vom Träger
beschrieben. Eine Nutzung als Matrize ist nicht beschrieben.
Eine
weitere Nutzung von trägergebundenen
Nukleinsäuren,
die in einer Array-Anordnung hergestellt werden, ist in Bulyk et
al. [Bulyk, M. et al; Nat. Biotech. 17; 573-577; 1999] beschrieben.
In dieser Anwendung werden Mikroarrays mittels der photolithographischen
lichtgestützten
Synthese der Firma Affymetrix so aufgebaut, dass unterschiedliche
25mere mit freien 5'-Enden
auf der festen Phase dargestellt werden. Diese werden dann durch
proximal bindende Primer zu Doppelsträngen aufgefüllt. Die Anwendung dieser Doppelstrang-Arrays
ist dann die Analyse von Bindungsereignissen mit DNA-bindenden Proteinen.
Für Zwecke
der Analytik werden zudem enzymatische Verdaue mit Restriktions-Enzymen
beschrieben. Eine Nutzung der erzeugten Kopien nach Abtrennung von
den als Matrizen dienenden Oligonukleotiden wird nicht beschrieben.
Auch ein wiederholtes oder cyclisches Kopieren wird nicht beschrieben.
Da das verwendete Syntheseverfahren auf Photolithographie beruht,
ist es zudem für
den Fachmann ersichtlich, dass für
ein neues Array-Design bzw neue Nukleinsäure-Sequenzen erheblicher Aufwand
inklusive der Beschaffung entsprechender Masken notwendig ist.
Die
Anwendung der photolithographischen Technologie ist für die exakte
Belichtung von Mustern während
der Synthese sehr gut geeignet. Dadurch wird die routinemäßige parallele
Herstellung von high-density-Arrays ermöglicht. Dieser Ansatz ist jedoch
einigen Einschränkungen
unterworfen, da dieser physikalische anstatt digitale Konstruktionen
erfordert. Insbesondere ist die Herstellung von Masken-Sets ein
teurer und zeitaufwändiger
Prozess. Zusammenfassend unternehmen Bulyk et al. zwar erste Schritte
hin zum Ergänzen
des Nukleinsäure-Einzelstrangs
zum Doppelstrang, arbeiten dann aber nur die Richtung weiterer analytischer Anwendungen
dieser Doppelstrang-Arrays (Bindungsassays mit DNA-bindenden Proteinen)
und schlagen die anderweitige Nutzung der erzeugten Kopien nach
Trennung von der Matrize, deren wiederholte oder cyclische Herstellung
oder eine Kombination mit einer Proben-Amplifikation, wie sie als
Ausführungsformen
des erfindungsgemäßen Verfahrens
weiter unten beschrieben sind, weder vor, noch legen sie eine solche
Erfindung nahe.
Bekannt
ist ferner die festphasengestützte
Amplifikation von Ziel-Nukleinsäuren, z.B.
dem Pool der mRNA-Moleküle
eines biologischen Extraktes [Fa. Linden Bioscience, Veröffentlichung
zu „Solid
Phase Transkription Chain Reaction" oder „SP-TCR"]. Hierzu wurden zwei verschiedene Primer
an eine feste Phasen gekoppelt (eine in situ Synthese ist nicht
beschrieben und angesichts von zwei Primern für den Fachmann auch nicht naheliegend),
die Sequenzen für
die viralen RNA Polymerase-Promotoren
T3 und T7 enthalten, ferner Elemente für die Hybridisierung von Poly-T
RNA in Verbindung mit dem T7 Promoter-Primer. Nach Hybridisierung
einer mRNA über
den Poly-A Bereich wird der Strang zum Doppelstrang aufgefüllt. Anschließend wird eine
spezielle Kassette (TCR-Adapter) an den Doppelstrang ligiert, die
ihrerseits eine Erkennungsstelle mit dem T3 Promoter-Primer gemeinsam
hat. So entsteht eine Transkriptions-Kettenreaktion. Das Verfahren SP-TCR
funktioniert hocheffizient an der festen Phase. Die dem erfindungsgemäßen Verfahren
zugrunde liegende Herstellung einer Bibliothek aus Matrizen-Nukleinsäuren als
Startpunkt von Kopiervorgängen
wird nicht nahegelegt.
In
einem ebenfalls festphasengestützen
Ansatz zur Amplifikation durch Strand Displacement wurde von Westin
et al. [Westin L. et al.; Nat. Biotech 18; 199-204; 2000] gezeigt,
dass die parallele Nutzung von mehr als einem Primer an einer gemeinsamen
festen Phase mit hoher Effizienz möglich ist. Allerdings werden
bei Westin et al. die Primer-Nukleinsäuren getrennt vom Reaktionsträger und
nicht in situ hergestellt und dann erst dort platziert. Damit entfällt der
zentrale Aspekt der hocheffizienten in situ Synthese.
Außerdem ist
kein Hinweis darauf zu finden, dass erst die Kopien der Matrizen-Nukleinsäuren die
eigentlichen Reaktionsteilnehmer sind. Vielmehr werden auch die
anderen Primer mit der analytspezifischen Sequenz extern hergestellt
und dann der Reaktion zugegeben. Eine Kopie der Matrize wird nicht
durchgeführt.
Gegenstand der Erfindung
Bereitgestellt
werden soll ein Verfahren zur Herstellung einer Mehrzahl von unterschiedlichen
synthetischen Nukleinsäuren
wahlfreier Sequenz durch Herstellung geeigneter festphasengestützter synthetischer Bibliotheken
als Matrizen und eine matrizenabhängige biochemische Kopier-Reaktion.
Damit
können
Nukleinsäure-Stränge in hoher
Ausbeute und gleichzeitig mit sehr vielen unterschiedlichen Sequenzen
von einem Träger
mit einer Bibliothek darauf abgeschrieben und für weitere Prozessschritte zur
Verfügung
gestellt werden.
Gegenstand
der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur enzymbasierten Synthese
von Nukleinsäuren
durch Kopie einer als Array in einer Matrix synthetisierten Matrizen-Bibliothek,
durchgeführt
auf einem enzymbasierten Nukleinsäure-Matrix-Synthesizer als
Vorrichtung.
Bevorzugte
Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Ansprüchen 1 bis 29 wiedergegeben.
Grundzüge des Lösungsweges
Die
Matrizen für
die enzymbasierte Synthese mittels Kopiervorgang bestehen ihrerseits
aus kopierfähigen
Nukleinsäurepolymeren,
die in Form einer Array-Anordnung
auf einem gemeinsamen Träger
synthetisiert werden. Sie stehen nach ihrer eigentlichen Synthese
in kopierfähigem
Zustand zur Verfügung und
können in
einem enzymbasierten Verfahren unter Zugabe entsprechender Reagenzien
und Hilfsstoffe, wie Nukleotiden, vervielfältigt werden.
Durch
Einsatz bekannter Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays aus
Nukleinsäurepolymeren, z.B.
in Form eines so genannten Mikroarrays, können sehr viele (typischerweise
mehr als 10) unterschiedliche Nukleinsäurepolymere von mindestens
mehr als 2, typischerweise mehr als 10 Basen Länge, erzeugt werden.
Beispiele
für solche
Verfahren sind oben beschrieben. Alle diese Verfahren führen letztlich
zu einer Bibliothek oder einem Set von Oligonukleotiden oder Polynukleotiden
auf einem gemeinsamen Träger.
Dies soll unter dem oben genannten Begriff Nukleinsäurepolymere
in einer Matrix-Anordnung zusammengefasst werden. Alle diese Verfahren
dienen im Wesentlichen der Herstellung so genannter Mikroarrays
für die
Analyse von Nukleinsäuren
mittels Hybridisierung.
Der
nächste
Schritt im erfindungsgemäßen Verfahren
besteht nun darin, die an der festen Phase synthetisierten Moleküle mit Hilfe
entsprechender Enzyme zu kopieren. Dazu sind zahlreiche Enzym-Systeme
bekannt und kommerziell erhältlich.
Beispiele hierfür
sind DNA-Polymerasen, thermostabile DNA-Polymerasen, Reverse Transkriptasen
und RNA Polymerasen.
Die
Reaktionsprodukte zeichnen sich durch große Vielfalt der Sequenz aus,
die indirekt über
die Matrizen-Moleküle
während
des vorgeschalteten Synthesevorgangs frei wählbar programmiert werden kann.
Ein Mikroarray aus dem Geniom-System kann in einem Kanal als Reaktionsraum
6.000 frei wählbare
Oligonukleotide mit einer Sequenz von bis zu 30 Nukleotiden synthetisieren.
Nach dem Kopierschritt liegen entsprechend 6.000 frei programmierbare
30mere DNA oder RNA in Lösung
vor und können
als Reaktanden in einem nächsten
Verfahrensschritt oder als Endprodukt zur Verfügung gestellt werden.
Für den Start
des Kopierschritts wird es dabei in einigen Ausführungsformen notwendig sein,
so genannte Primer-Moleküle
zuzugeben, die als Initiationspunkt für Polymerasen dienen. Diese
Primer können
aus DNA, RNA, einem Hybrid der beiden oder aus modifizierten Basen
bestehen. Auch der Einsatz von Nukleinsäure-Analoga, wie PNA- oder
LNA-Molekülen
als Beispiel, ist in bestimmten Ausführungsformen vorgesehen. Zur
Schaffung einer Erkennungsstelle für den Primer kann es zweckmäßig sein,
am Ende eines jeden Nukleinsäurepolymeres
auf dem Träger
eine einheitliche Sequenz hinzuzufügen, entweder als Teil der
Synthese oder in einem zusätzlichen
Schritt mittels einer enzymatischen Reaktion, wie einer Ligation
einer vorgefertigten Nukleinsäure-Kassette.
In einer Variante ist das distale Ende der am Träger synthetisierten Sequenz
selbstkomplementär
und kann so einen hybriden Doppelstrang ausbilden, der von den Polymerasen
als Initiationspunkt erkannt wird.
Zweck
des Verfahrens ist die Bereitstellung von Nukleinsäuren mit
hoher und rationell programmierbarer Diversität der Sequenzen für in einem
nächsten
Schritt nachfolgende Verfahren. Beispiele für diese Verfahren sind:
- • die
Herstellung von Primern für
Primer Extension Methoden, Strand Displacment Amplifikation, Polymerase
Chain Reaction, Site Directed Mutagenesis oder Rolling Circle Amplifikation,
- • Genexpressions-Modulation
mittels RNAi oder Antisense-Methoden,
- • Herstellung
oder Vorbereitung von Analyten (sample preparation) für die logisch
nachgeordnete Analyse durch Mikroarrays, Sequenzierverfahren, Amplifikationsverfahren
(Strand Displacment Amplifikation, Polymerase Chain Reaction oder
Rolling Circle Amplifikation) oder Analyse in einer Gelelektrophorese,
- • RNA-Bibliotheken
für die
Translation in vitro oder in vivo,
- • Klonierung
von Sequenzen mittels Vektoren oder Plasmiden,
- • Ligation
der Nukleinsäuren
in Vektoren oder Plasmide,
- • Validierung
oder Test von Hybridisierungs-Assays und zugehörigen Reagenzien und Kits mittels
der erzeugten Nukleinsäurepolymeren
in den Bereichen Mikroarrays, Dot blots, Southern- oder Northern-Blots, Bead-Arrays, Serial Analysis
of Gene Expression [SAGE],
- • Referenz-
oder Kalibrier-Verfahren oder Verfahrensschritte innerhalb von Assays
aus den Bereichen Mikroarrays, Dot blots, Southern- oder Northern-Blots,
Bead-Arrays, Serial Analysis of Gene Expression [SAGE].
Allen
diesen Verfahren ist die Nutzung von Nukleinsäuren als hybridisierfähigem Reagenz
gemeinsam. Darüber
hinaus gibt es auch noch Verfahren, die Nukleinsäurepolymere nicht oder nicht
ausschließlich über eine
Hybridisierungsreaktion nutzen. Hierzu gehören Aptamere und Ribozyme.
Die
Herstellung der Nukleinsäurepolymere
bietet an mehreren Stellen des Verfahrens die Möglichkeit, mit bekannten Methoden
in die Reaktionsprodukte Modifikationen oder Markierungen einzuführen. Hierzu
zählen
markierte Nukleotide, die z.B. mit Haptenen oder optischen Markern,
wie Fluorophoren und Lumineszenz-Markern, modifiziert sind, markierte
Primer oder Nukleinsäure-Analoga
mit besonderen Eigenschaften, wie z.B. besondere Schmelztemperatur
oder Zugänglichkeit
für Enzyme.
Beispiel
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung und Ablauf des Verfahrens:
- 1.
Herstellung eines Mikroarrays aus 6.000 verschiedenen 30meren in
einem Gerät
geniom® one
mit distalem 3'-Ende.
- 2. Anfügen
einer generischen Primer-Sequenz von 15 Basen durch nasschemische
statt lichtgesteuerte Synthese an allen 6.000 Oligos abzüglich einer
Kontrolle. Die Primer-Sequenz ist so gewählt, dass eine PCR Reaktion
möglich
ist.
- 3. Prozessieren des Array bis zu einem hybridisierbereiten Zustand.
- 4. Zugabe von Primer und Nukleotiden sowie Taq DNA-Polymerase
und cyclische Durchführung
der PCR-Reaktion entweder direkt im Gerät geniom® one
oder in einer Halterung für
in situ Hybridisierung in einer anderen, kommerziell erhältlichen
PCR-Maschine, die allerdings nicht in die exponentielle Phase übergeht.
- 5. Durchfahren von 10 Zyklen und entsprechend 10faches Abschreiben
der festhängenden
Matrizen-Oligonukleotiden und finaler Heizschritt zwecks Ablösen des
letzten Zweitstrangs.
- 6. Elution der Kopien in ein Eppendorf-Gefäß. Das Gefäß enthält jetzt 6.000 unterschiedliche
programmierte 45mere aus DNA, die für beliebige Applikationen bereit
stehen.
Ausführungsformen, Varianten und
Anwendungen
Reaktionsträger und
feste Phasen
Generell
können
alle solche Reaktionsträger
und feste Phasen für
das erfindungsgemäße Verfahren genutzt
werden, für
die eine Synthese einer Matrix aus Nukleinsäurepolymeren als Matrize des
Kopiervorgangs etabliert ist.
Dazu
gehören
als beispielhafte Vertreter die folgenden, dem Fachmann bekannten
Reaktionsträger-Formate
und feste Phasen:
- • Flacher Reaktionsträger, auch „Chip" genannt,
- • Poröser Träger,
- • Reaktionsträger mit
Elektroden,
- • Reaktionsträger mit
temporär
oder permanent inmobilisierter fester Phase aus Partikeln oder Beads,
- • Mikrofluidischer
Reaktionsträger,
- • Oberflächen-Modifikation:
Gele, Linker, Spacer, Polymere, amorphe Schichten, 3D-Matrizes.
Einige
dieser Reaktionsträger
können
in Kombination verwendet werden, z.B. ein mikrofluidischer Reaktionsträger mit
porösen
Oberflächen.
Bevorzugte Ausführungsformen
für die
in situ Synthese des Arrays
Der
Aufbau der DNA-Sonden findet durch lichtgesteuerte in situ Synthese
in einem geniom® one
Instrument der Fa. febit unter Verwendung moderner Schutzgruppenchemie
in einer dreidimensionalen Mikrostruktur als Reaktionsträger statt.
In einem zyklischen Syntheseprozess wechseln sich Belichtungen und
Kondensationen der Nukleotide so lange ab, bis an jeder Position
des Arrays in den Mikrokanälen
die gewünschte DNA-Sequenz
vollständig
aufgebaut wurde. Auf diese Weise können bis zu 48.000 Oligonukleotide
mit einer Länge
von bis zu 60 Einzelbausteinen hergestellt werden. Die Oligonukleotide
binden dabei kovalent an ein Spacermolekül, einen chemischen Abstandhalter
auf der Glasoberfläche
des Reaktionsträgers.
Die Synthese verläuft
softwaregesteuert und ermöglicht
eine hohe Flexibilität
beim Aufbau des Arrays, den der Anwender damit seinen Bedürfnissen
entsprechend individuell konfigurieren kann. So können z.B.
die Länge
der Oligonukleotide, die Zahl der erzeugten Nukleinsäure-Sonden oder interne
Kontrollen optimal auf das jeweilige Experiment abgestimmt werden.
Die
Kopierreaktion beruht auf einer Primer-Sequenz distal an den Sonden,
die zu einem Primer von 15 Basen Länge passt, und durch eine auf
allen Oligonukleotiden gleich erfolgten einheitlichen Synthese mittels
Standard-DMT Schutzgruppenchemie
aufgebaut wurde. Der Reaktionsträger
enthält
8 getrennte Reaktionsräume,
die individuell genutzt werden können
und nicht den gleichen Array enthalten müssen, aber können. In
dieser Ausführungsform
werden 45mere an der Oberfläche
synthetisiert.
Nach
abgeschlossener Synthese der Matrizen-Oligonukleotide und finaler
Entfernung der Schutzgruppen an den Nukleobasen sind die Arrays
bereit für
eine Hybridisierung.
Der
Reaktionsträger
wird entnommen und in eine beheizbare (Peltier-Element) Einheit eingelegt, die einen
fluidischen Anschluss, Ventile und eine Pumpe (Kolbenpumpe) enthält. Diese
Einheit dient für
die Teilautomatisierung von Prozessschritten. Für die Kopierreaktion wird ein
Gemisch aus Primer, Biotin-markierten Nukleotiden, Restriktionsenzym
zur Einführung
von Einzelstrangbrüchen
am Primer und DNA-Polymerase hinzugefügt. Nach 4 Stunden Reaktion
bei 32 °C
wird die Reaktion durch einen einzelnen Heizschritt von 90 °C gestoppt
und eine Denaturierung aller vorhandenen Doppelstränge herbeigeführt. Da
von 45mer Oligonukleotiden abgeschrieben wurde, liegt nun ein Reaktionsgemisch
vor, das an Nukleinsäuren
in Lösung
einmal die restlichen Primer (15mere) und zum zweiten ein Set von
45meren enthält.
Die 45mere enthalten alle am 5'-Ende
die komplementäre
Sequenz des Primers, am 3'-Ende
jedoch 30 völlig
frei wählbare
Basen.
Diese
Basen-Sequenz wird so gewählt,
dass jeweils zwei 45mere ein Primer-Paar für eine nun nachfolgende Reaktion
bilden. Diese Primer liegen beide außerhalb eines zu analysierenden
SNP auf einer Zielsequenz und haben einen Abstand von 1-30 Basen.
Initiation des Kopiervorgangs
an den Matrizen-Nukleinsäuren
Die
Initiation an den Matrizen-Nukleinsäuren kann prinzipiell mit allen
Methoden erfolgen, die dem Fachmann für die Initiation eines enzymatischen Kopiervorgangs
von Nukleinsäuren
bekannt sind, also z.B. aus den Anwendungen Polymerase Chain Reaction,
Strand Displacement und Strand Displacement Amplification, in vitro
Replikation, Transkription, Reverse Transkription oder virale Transkription
(Vertreter hiervon sind T7 und SP6).
In
einer Ausführungsform
wird ein T7 oder ein SP6 Promoter in einen Teil oder alle Nukleinsäurepolymere
am Reaktionsträger
eingefügt.
In
einer anderen Ausführungsform
dient der Array aus Nukleinsäuren
der Initiation einer isothermalen Kopierreaktion. Ein Vertreter
dieser Verfahren ist die Strand Displacement Reaktion. Hiervon sind
in der Literatur zahlreiche Varianten bekannt. Dazu wird z.B. ein
Primer gewählt,
der an die Matrizen-Polymeren
an deren distalem Ende bindet und dann dort in 3'-Richtung verlängert werden kann. Alle oder
ein bestimmter Teil der Nukleinsäurepolymere
auf dem Träger
enthalten distal diese Primer-Sequenz.
Als nächstes
wird ein Enzym zugegeben, für
das der Primer eine Erkennungsstelle enthält, so dass ein Einzelstrangbruch
induziert wird. Die übliche
Vorgehensweise sieht dazu die Verwendung einer Restriktionsnuklease
vor, z.B. N.NBstNB I (erhältlich z.B.
von Fa. von New England Biolabs), das von Natur aus nur Einzelstrangbrüche (so
genannte Nicks) einführt,
da es keine Dimere bilden kann.
Variante mit Rolling Circle
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden doppelsträngige, ringförmige Nukleinsäurefragmente
bereitgestellt, wobei ein Strang an der Oberfläche des Trägers verankert wird und der
andere Strang ein selbstprimendes 3'-Ende umfasst, so dass eine Elongation
des 3'-Endes erfolgen
kann. Die enzymatische Synthese umfasst bei dieser Variante des
erfindungsgemäßen Verfahrens
eine Replikation analog des für
die Replikation von Bakteriophagen bekannten Rolling Circle-Mechanismus,
wobei ein Strang der ringförmigen
Nukleinsäurefragmente
an der Oberfläche des
Trägers
verankert ist und mehrfach kopiert werden kann. Wenn zunächst ein
doppelsträngiges
geschlossenes Nukleinsäure-Fragment
vorliegt, kann der zweite Strang zunächst durch einen Einzelstrangbruch
geöffnet
werden, wobei ein 3'-Ende
gebildet wird, von welchem ausgehend die Elongation stattfindet.
Die Abspaltung des elongierten Strangs kann z.B. enzymatisch erfolgen.
Durch Zugabe von Nukleotidbausteinen und eines geeigneten Enzyms
erfolgt dann eine Synthese der jeweils zu den Basensequenzen der
an der Oberfläche
des Trägers
verankerten Nukleinsäurestränge komplementären Teilsequenzen.
Label, Bindungsstellen
und Marker
Die
Produkte des Kopiervorgangs können
auf verschiedenen Wegen Label, Bindungsstellen oder Marker erhalten,
die für
eine weitere Prozessierung oder den Einsatz in weiteren Assays oder
Verfahren erwünscht sind.
Dazu
gehören
Marker und Label, die eine direkte Detektion der Kopien erlauben
und dem Fachmann aus anderen Verfahren zur Kopie von Nukleinsäuren bekannt
sind. Beispiel hierfür
sind Fluorophore. Des Weiteren können
Bindestellen für
indirekte Nachweisverfahren oder Reinigungsverfahren vorgesehen
werden. Dazu zählen
als Beispiele Haptene, wie Biotin oder Digoxigenin.
Die
Label, Bindungsstellen oder Marker können in einer Variante durch
modifizierte Nukleotide eingeführt
werden. Ein weiterer Weg eröffnet
sich bei Verwendung von Primern für die Initiation des Kopiervorgangs. Die
Primer können
bereits mit Label, Bindungsstellen oder Marker in die Reaktion eingebracht
werden.
Nachträglich können Label,
Bindungsstellen oder Marker eingebracht werden, indem die Reaktionsprodukte
einer nachfolgenden Markierungsreaktion mit generischen, mit den
Nukleinsäuren
reagierenden Agenzien behandelt werden. Ein Beispiel hierfür sind Cis-Platin-Reagenzien.
Alternativ hierzu lassen sich Label, Bindungsstellen oder Marker
auch durch eine weitere enzymatische Reaktion einführen, wie
z.B. durch eine terminate Transferase katalysiert.
Integration von Probenvorbereitung
und Amplifikation mit einem analytischen Mikroarray
In
den hier beschriebenen Ausführungsformen
der Erfindung ist das Ziel die Integration der Sample-Amplifikation
und der Sample-Analytik auf ein und demselben Festphasenträger (Biochip).
Bislang
erfordert die Analytik von DNA- und RNA-Proben in einem ersten Schritt – sowohl
bei Genexpressionprofil-Erstellung als auch bei Genotypisierung
(SNP-Typisierung, Resequenzierung etc.) – eine Amplifikation der zu
untersuchenden Probe. Erst in einem zweiten Schritt kann die zu
untersuchende Probe auf einem Biochip über eine Vielzahl von DNA-
oder RNA-Rezeptoren hochparallel untersucht werden. Dieses Vorgehen
ist zeitintensiv und kostspielig. Mit der hier beschriebenen Variante
des erfindungsgemäßen Verfahrens kann
dies gelöst
werden.
Ein
Beispiel für
den Stand der Technik ist in
EP
1 056 884 (Verfahren zur nicht-spezifischen Amplifikation
von Nukleinsäuren
(Van Gemen, PamGene B.V.); u.a. oligo-dT-Sequenz am 3'-Ende blockiert)
beschrieben. Ein weiteres findet sich in der Veröffentlichung zur „Solid
Phase Transkription Chain Reaction" oder „SP-TCR" der Fa. Linden Bioscience.
Variante 1: Untersuchung
von RNA Analyten unter Verwendung von RNA Polymerase und RnaseH
Beispielhafter
Ablauf einer integrierten Amplifikation einer Ausführungsform
der integrierten Probenvorbereitung und Analyse an einem Träger mit Mikroarray
aus Nukleinsäure-Sonden
- • An
der Festphase werden spezifische Sonden A1...n für die Amplifikation
des zu untersuchenden Targets und spezifische Sonden B1...x für die Analyse
des zu untersuchenden Targets aufgebaut.
- • Die
den Promotor beinhaltenden Sonden A1...n sind
an ihrem 3'-Ende
nicht verlängerbar
(entweder Blockierung oder Festphase am 3'-Ende).
- • Die
Sonden A1...n beinhalten eine Promotor-Sequenz
(z.B. T3, T7, SP6), die es erlaubt, bei einer spezifischen Hybridisierung
mit den zu untersuchenden Targetsequenzen, diese durch eine RNA-Polymerase
zu amplifizieren.
- • RNase-H
schneidet den RNA-Teil des DNA-RNA-Duplex am 3'-Ende ; es wird darauf folgend dort
ein doppelsträngiger
(dsDNA) Promotor (T7, Sp6, T3) aufgebaut.
- • Ausgehend
vom dsDNA-Promotor werden die zu den Targetsequenzen komplementären RNA-Sequenzen
C1...y in großer Zahl hergestellt (antisense-RNA).
- • Die
amplifizierten RNA-Targetsequenzen C1...y können nun
nach Hybridisierung an die spezifischen Sonden B1...x analysiert
werden.
Die
Analyse der Wechselwirkung der Targetsequenzen C1...y mit
den spezifischen Sonden B1...x kann über ein
Hybridisierung-vermitteltes Verfahren oder auch über ein Enzym-vermitteltes
Verfahren erfolgen.
Zur
Amplifikation wird eine RNA-Polymerase mit RNaseH-Aktivität eingesetzt
(z.B. AMV-RT, MLV-RT); Mix aus rNTPs, dNTPs.
Beispielhaftes Vorgehen:
- • Die
Spannweite der Umsetzung ist weit, das Design hat ein große Flexibilität hinsichtlich:
| • Orientierung
Sonden A1...n: | 5'-3' oder 3'-5' |
| • Orientierung
Sonden B1...x: | 3'-5' oder 5'-3' |
| • Art des
Targets: | RNA
(bei DNA müssten
RNA-Sonden aufgebaut werden) |
| • Analytisches
Wirkprinzip: | Enzym
(Einbau Signalgeber während
Enzymreaktion) oder Hybridisierung (Einbau Signalgeber während Amplifikationsschritt) |
Variante 2: Untersuchung
von RNA Analyten unter Verwendung von RNA Polymerase
Hierfür wird in
Analogie zu SP-TCR (siehe oben) eine Transcription Chain Reaction
gestartet. Dazu werden in den Matrizen-Nukleinsäuren in geeigneter Orientierung
und unter Berücksichtigung
von sense/antisense Erfordernissen sequenzspezifische Primer-Abschnitte
mit RNA-Polymerase-Promotoren
kombiniert. Gut etablierte Vertreter der viralen RNA-Polymerase-Promotoren sind T7,
T3 und SP6. Dabei liegt der RNA-Promoter jeweils proximal zur festen
Phase und der sequezspezifische Abschnitt, der der selektiven Erkennung
seines komplementären
Abschnittes in den Ziel-Nukleinsäuren dient,
distal vom Träger.
So kann als Beispiel in einem Experiment zur Analyse der mRNA-Population
einer untersuchten Probe in einem Array von 6.000 verschiedenen
DNA-Oligos (siehe geniom® one von Fa. febit) für bis zu
6.000 verschiedene Sequenz-Abschnitte ein geeigneter Primer-Oligo
bereitgestellt werden. Soll pro Gen eine Amplifikation initiiert werden,
lassen sich auf diese Weise Amplicons für 6.000 Gene parallel in einer
Reaktion herstellen. In einer weiteren Ausführungsform werden hingegen
2 Primer für
jedes Gen verwandt, die aber je einer von 2 zu verwendenden Promotoren
(z.B. T7 und T3) enthalten. So kann eine Genspezifische TCR induziert
werden, die in einer einzigen Reaktion exponentiell 3.000 Amplicons
für 3.000
Gene herstellt. Dieses Reaktionsprodukt kann nun in beliebigen weiteren
Verfahren analysiert werden. Eine bevorzugte Analyse ist eine Hybridisierungsreaktion
auf einem Mikroarray.
In
einer anderen Ausführungsform
werden lineare oder exponentielle Transkriptions-Amplifikation mit entsprechenden
analytischen Sonden (wie oben beschrieben) kombiniert.
Variante 3: Erzeugung
von sequenzspezifischen Primern in Lösung für die Verlängerung in Abhängigkeit
von Zielmolekülen
(Targetanalyt) in der Probe
In
dieser Ausführungsform
werden die Kopien der Matrizen-Nukleinsäuren ihrerseits zur Reaktion
mit den Ziel-Nukleinsäuren
verwendet. Dabei werden die Sequenzen so gewählt, dass die später in einer
Hybridisierreaktion zu analysierende Sequenz erst bei erfolgreicher
Verlängerung
der einzelnen kopierten in Lösung befindlichen
Nukleinsäurepolymere
entsteht. Diese Abschnitte können
dann ihrerseits mittels eines Arrays detektiert werden. In der bevorzugten
Ausführungsform
geschieht dies wie oben beschrieben auf mittels analytischer Sonden
im gleichen Mikroarray oder auf einem fluidisch verbundenen Array.
In
einer Variante zur Erzeugung des Signals kann es vorgesehen sein,
dass die Primer zur Initiation des Kopiervorgangs bereits eine Modifikation
tragen, die die Erzeugung des Signals unterstützt. Ein Beispiel für eine solche
Modifikation ist ein Primer, der in seinem 5'-Abschnitt in einem Bereich, der nicht
für die
Hybridisierung mit der Matrize notwendig ist, eine branched-DNA-Struktur trägt [Collins
M.L. et al.; Nucleic Acids Res. 25(15); 2979-2984; 1997).
Eine
andere Variante sieht vor, dass für jede Zielsequenz, also z.B.
ein einzelnes Gen oder Exon, zwei Primer mit gegenläufiger Spezifität bereitgestellt
werden, so dass in einer PCR oder isothermalen Amplifikation eine
effiziente exponentielle Vervielfältigung erfolgt.
Bei
gleichzeitiger Reaktion von Kopiervorgang, Amplifikation und Hybridisierung
an die analytischen Sonden kann in einem sehr kompakten und simplifizierten
Format die komplette Analyse eines Gemisches an Ziel-Nukleinsäuren durchgeführt werden.
Solch eine komplette Analyse kann z.B. die Detektion aller in einer Gesamt-RNA
Probe aus einem biologischen Untersuchungsobjekt wie einer Zellkulturpopulation
oder einer Tumorbiopsie enthaltenen exprimierten Gene aufklären – ohne vorherige
Proben-Amplifikation
und mit sehr einfacher Probenvorbereitung mit Standard-Kits, wie
sie von diversen Herstellern angeboten werden.
Eine
dazu gehörige
Vorrichtung besteht aus
- • einem Gerät für die in situ Synthese der
Arrays von Matrizen-Polymeren und analytischen Sonden,
- • einer
Detektionseinheit für
die Erfassung eines optischen oder elektrischen Signals,
- • einer
speicherprogrammierbaren Einheit für die Steuerung der Synthese,
einer speicherprogrammierbaren Einheit für die Steuerung der Detektion
und die Speicherung und Verwaltung der Messdaten,
- • optional:
Elemente für
die Abarbeitung fluidischer Schritte, wie der Probenzugabe oder/und
Probenableitung,
- • optional:
Elemente für
die Automatisierung der Probenaufbereitung aus möglichst unbehandeltem biologischen
Untersuchungsgut, also z.B Zelllyse und Reinigung der Nukleinsäuren,
- • optional:
Einrichtung für
die automatisierte Übertragung
der aufbereiteten Probe in oder auf den Reaktionsträger.
Signalerzeugung bei Integration
von Matrizen-gesteuerter Amplifikation mit einem analytischen Mikroarray
Beispiele
für Signale,
die bei der Analyse der Reaktionsergebnisse und der Hybridisierung
an die dafür vorgesehenen
Nukleinsäurepolymere
(analytische Sonden) auf dem Reaktionsträger bzw Array genutzt werden
können,
sind unter anderem die in der Fachwelt gut bekannten folgenden Signale:
- • Optische
Signale
Fluoreszenz (organische und anorganische Fluorophore),
Lichtstreuung
(z.B. Goldpartikel in nm-Dimensionen),
Chemilumineszenz,
Biolumineszenz;
- • Elektrische
Signale
Stromfluss,
Redoxreaktionen.
Die
Signale können
dabei durch Labels, Bindungsstellen oder Marker, ähnlich den
oben beschriebenen, in die Reaktionsprodukte eingeführt werden.
Dabei können
einerseits die Kopien der Matrizen-Nukleinsäuren entsprechend behandelt
werden. In einer alternativen Ausführungsform werden die Labels,
Bindungsstellen oder Marker während
einer weiteren Reaktion in die Ziel-Analyten eingebracht.
Ein
Beispiel hierfür
ist eine Verlängerung
von Primern, die selber Reaktionsprodukte des Kopiervorgangs sind,
in Abhängigkeit
von Ziel-Nukleinsäuren (Analyten)
in der Probe, an die sie für
diese Reaktion hybridisieren können,
so dass nur bei spezifischer Hybridisierung eine Verlängerung
zustande kommt. Während dieser
Verlängerung
werden dann die Labels, Bindungsstellen oder Marker in diese verlängerten
Polymere eingeführt,
so dass anschließend
deren Bindeverhalten auf dem Array in Zusammenhang mit den analytischen Sonden
beobachtet und ausgewertet werden kann.
In
einer weiteren Ausführungsform
werden die verlängerten
Polymere mit analytischen Nukleinsäure-Sonden in Kontakt gebracht,
die wiederum für
eine Verlängerung
in Form einer Primer-Extension nutzbar sind. Die Anordnung eines
Primer-Extension Experimentes ist aus der Fachliteratur bekannt.
Das Signal der Primer-Extension an diese Analyse-Sonden wird dann
zur Bestimmung des Analyse-Ergebnisses ausgewertet. Eine solche
Analyse kann z.B. die Bestimmung von Einzelnukleotid-Polymorphismen
(SNP's) in genomischer
DNA sein. Dazu werden erst verlängerbare
Primer an Matrizen-Nukleinsäuren
abkopiert. Die Sequenz ist so gewählt, dass im 3'-Bereich nach der
Primer-Sequenz auf der Ziel-Nukleinsäure die zu untersuchenden SNP's lokalisiert sind.
Im nächsten
Schritt werden diese Primer über
die Sequenz der zu detektierenden SNP's hinweg verlängert. Anschließend werden
die Reaktionsprodukte dieser Verlängerung durch Primer-Extension oder
direkt durch Hybridisierung untersucht und die Ergebnisse für die Bestimmung
der in der Analyse abgefragten SNP's registriert. In der speicherprogrammierbaren
Vorrichtung werden für
den Nutzer der erfindungsgemäßen Vorrichtung
die Daten so aufbereitet, dass er z.B. direkt einen Report mit den
Basen-Positionen und den gefundenen Basen erhält.
Der
große
Vorteil der Erfindung liegt dabei darin, dass für solche Genotypisierungs-
oder SNP-Analyse-Assays nur noch eine universelle, generische Probenvorbereitung
notwendig ist. Primer und Reagenzien, die für einzelne Genotypen oder SNP's spezifisch sind,
werden nicht benötigt,
da alle Sequenz-Spezifität
aus der in situ Synthese des zugrunde liegenden Matrizen-Arrays
und dem Analyse-Array stammt. In der Ausführungsform mit der Kombination
dieser beiden in einem Reaktionsträger wird die Genotypisierung
und SNP-Analyse damit maximal vereinfacht.
Validierung von Arrays
aus Nukleinsäuren
Die
eingangs beschriebene Anwendung von Nukleinsäuren und in bestimmten Ausführungsformen von
synthetischen Oligonukleotiden in Arrays, bei denen die Moleküle als Rezeptoren
oder Fängermoleküle in Reihen
und Spalten angeordnet sind, ist allgemein mit der sehr schwierigen
empirischen Validierung der hergestellten Arrays unter Zuhilfenahme
entsprechender Proben-Moleküle
konfrontiert. Dieses Problem ist dem Fachmann gut bekannt und wird
mit der Anordnung von mehreren tausend Fängermolekülen in einem Array zu einem
zunehmend schwierig lösbaren
Problem. Für
die Entwicklung von so genannten hochdichten Arrays mit über 100.000
einzelnen Reaktionsräumen
ist kein geeignetes rationelles Validierungsverfahren bekannt. Als
Notlösung
werden schlecht beschreibbare biologisch gewonnene Proben verwendet.
Synthetische Gene
In
einer Ausführungsform
werden qualitativ hochwertige und in der Sequenz frei programmierbare
Nukleinsäuren
in Form von Oligonukleotiden mit 10-200 Basen Länge kostengünstig und effizient in einer
Vielfalt von 10 oder mehr unterschiedlichen Sequenzen bereitgestellt,
um synthetische kodierende doppelsträngige DNA (synthetische Gene)
herzustellen.
Der
Aufbau von doppelsträngiger
DNA aus Oligonukleotiden ist seit den 60er Jahren des letzten Jahrhunderts
bekannt [Arbeiten von Khorana und anderen; siehe „Shabarova:
Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids", VCH Weinheim]. Er geschieht in der
Mehrzahl der Fälle
mit einem von zwei Verfahren [siehe Holowachuk et. al., PCR Methods
and Applications, Cold Spring Harbor Laboratory Press]:
Einmal
erfolgt die Synthese des gesamten Doppelstrangs durch Synthese von
einzelsträngigen
Nukleinsäuren (geeigneter
Sequenz), Aneinanderlagerung durch Hybridisieren komplementärer Bereiche
dieser Einzelstränge
und Verbinden des molekularen Rückgrats
durch Enzyme, meist Ligase.
Demgegenüber gibt
es auch die Möglichkeit
einer Synthese von an den Rändern überlappenden
Bereichen als einzelsträngige
Nukleinsäuren,
Aneinanderlagerung durch Hybridisieren, Auffüllen der einzelsträngigen Bereiche
durch Enzyme (Polymerasen) und dann Verbinden des Rückgrats
durch Enzyme, meist Ligase.
Ein
bevorzugter Ablauf einer Gensynthese gemäß der Erfindung ist wie folgt:
Allgemein wird im Rahmen eines modularen Systems eine Synthese vieler
einzelner Nukleinsäurestränge durch
Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur hochparallelen DNA-Synthese auf Matrizenbasis durchgeführt. Es
entstehen als Reaktionsprodukte Sets von Nukleinsäuren, die
als Bausteine in einem nachgeschalteten Prozess dienen. Damit wird
eine Sequenz-Matrix erzeugt, die über 100.000 unterschiedliche
Sequenzen enthalten kann. Die Nukleinsäuren liegen in einzelsträngiger Form
vor und können
aus dem Träger
eluiert werden oder direkt im Reaktionsträger zur Reaktion gebracht werden.
Durch wiederholtes Kopieren in einem oder mehreren Arbeitsgängen kann
die Matrize mehrfach abgeschrieben werden, ohne diese zu zerstören, und
gleichzeitig wird eine Vermehrung der jeweiligen in der Matrix kodierten
Sequenzen erreicht. Wie an anderer Stelle ausführlicher beschrieben, kann
durch Kopieren von distal nach proximal dabei auch der Anteil an
verkürzten
Nukleinsäurepolymeren
an der festen Phase ausgeblendet werden, wenn distal die Kopier-Initiationsstelle
liegt. Eine Beispiel hierfür
ist eine distal angefügte
Promoter-Sequenz.
Der
Träger
mit der Matrix an festphasengebundenen Molekülen kann für spätere erneute Verwendung aufbewahrt
werden. Somit wird in einer effizienten Weise die Vielfalt an Sequenzen,
die in einem Reaktionsträger
durch eine in situ Synthese erzeugt wurde, für weitere Prozessschritte zur
Verfügung
gestellt. Gleichzeitig kann durch das Design der Kopierreaktion
eine hohe Qualität
der abgeschriebenen Sequenzen erzielt werden.
Danach
werden geeignete Kombinationen der abgelösten DNA-Stränge gebildet.
Die Zusammenlagerung der einzelsträngigen Bausteine zu doppelsträngigen Bausteinen
erfolgt innerhalb eines Reaktionsraums, der in einem einfachen Ansatz
ein übliches
Reaktionsgefäß, z.B.
ein Plastikröhrchen,
sein kann. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Reaktionsraum
Teil des Reaktionsträgers,
der in einer Variante ein mikrofluidischer Reaktionsträger sein
kann, in dem die notwendigen Reaktionen ablaufen. Ein weiterer Vorteil eines
integrierten mikrofluidischen Reaktionsträgers ist die Möglichkeit
der Integration weiterer Prozessschritte, wie z.B. eine Qualitätskontrolle
durch optische Analytik. In einer Ausführungsform hat bereits die
Synthese der Matrix in einem mikrofluidischen Träger stattgefunden, der dann
gleichzeitig als Reaktionsraum für
die nachgeschaltete Zusammenlagerung nutzbar ist.
Die
Sequenz der einzelnen Bausteine wird dabei so gewählt, dass
beim Inkontaktbringen der einzelnen Bausteine zueinander komplementäre Bereiche
an den beiden zusammengebrachten Enden zur Verfügung stehen, um durch Hybridisierung
dieser Bereiche eine spezifische Aneinanderlagerung von DNA-Strängen zu
ermöglichen.
Damit entstehen längere
DNA-Hybride. Das Phosphodiester-Rückgrat des DNA-Moleküls wird
durch Ligasen geschlossen. Sollten die Sequenzen so gewählt werden,
dass in diesen Hybriden einzelsträngige Lücken bestehen, so werden diese
Lücken
in bekannter Vorgehensweise enzymatisch mittels Polymerasen aufgefüllt. (z.B.
Klenow-Fragment oder Sequenase). So entstehen längere doppelsträngige DNA-Moleküle. Sollte
es für
die weitere Verwendung notwendig sein, diese verlängerten
DNA-Stränge
als Einzelstränge vorzulegen,
so kann dies mit den dem Fachmann bekannten Verfahren zum Aufschmelzen
von DNA-Doppelsträngen
geschehen, wie z.B. Temperatur oder Alkali.
Durch
die Zusammenführung
von Clustern an derart synthetisierten DNA-Strängen
innerhalb von Reaktionsräumen
können
wiederum längere
Teilsequenzen des finalen DNA-Moleküls erzeugt werden. Dies kann stufenweise
geschehen, und die Teilsequenzen werden dabei zu immer längeren DNA-Molekülen zusammengesetzt.
Auf diese Weise lassen sich sehr lange DNA-Sequenzen als vollsynthetisches
Molekül
mit einer Länge
von über
100.000 Basenpaaren erzeugen. Dies entspricht bereits dem Größenbereich
eines Bacterial Artificial Chromosome BAC. Für den Aufbau einer Sequenz
von 100.000 Basenpaaren aus überlappenden
Bausteinen von 20 Nukleotiden Länge
werden 10.000 individuelle Bausteine benötigt.
Dies
kann mit den meisten der eingangs beschriebenen hochparallelen Synthese-Verfahren
geleistet werden. Besonders bevorzugt sind für das erfindungsgemäße Verfahren
dabei diejenigen Technologien, die den Array aus Nukleinsäurepolymeren
in einer weitgehend frei programmierbaren Weise erzeugen und nicht auf
das Einrichten von technischen Komponenten, wie z.B. photolithographischer
Masken, angewiesen sind. Demnach sind besonders bevorzugte Ausführungsformen
auf die projektorbasierte lichtgestützte Synthese, die indirekte
projektorbasierte lichtgesteuerte Synthese mittels Photosäuren und
Reaktionskammern in einem mikrofluidischen Reaktionsträger, die
elektronisch induzierte Synthese mittels ortsaufgelöster Deprotektion
an einzelnen Elektroden auf dem Träger und die fluidische Synthese
mittels ortsaufgelöster
Deposition der aktivierten Synthese-Monomere aufgebaut.
Für die rationelle
Bearbeitung genetischer Moleküle
und die systematische Erfassung aller möglichen Varianten müssen die
Bausteine in ihrer individuellen Sequenz flexibel und ökonomisch
hergestellt werden. Dies leistet das Verfahren durch den Einsatz
einer programmierbaren Lichtquellenmatrix für die lichtabhängige ortsaufgelöste in situ
Synthese der DNA-Stränge,
die als Bausteine Verwendung finden. Diese flexible Synthese erlaubt
die freie Programmierung der individuellen Sequenzen der Bausteine
und damit auch die Erzeugung von beliebigen Varianten der Teilsequenzen
oder der finalen Sequenz, ohne dass damit wesentliche Veränderungen
von Komponenten des Systems (Hardware) verbunden wären. Nur
durch diese programmierte Synthese der Bausteine und damit der finalen
Syntheseprodukte kann die Vielfalt genetischer Elemente systematisch bearbeitet
werden. Gleichzeitig erlaubt die Verwendung der computergesteuert
programmierbaren Synthese die Automatisierung des gesamten Prozesses
inklusive der Kommunikation mit entsprechenden Datenbanken.
Die
Auswahl der Sequenz der einzelnen Bausteine kann bei Vorgabe der
Zielsequenz rationell unter Berücksichtigung
von biochemischen und funktionellen Parametern erfolgen. Dabei sucht
ein Algorithmus nach Eingabe der Zielsequenz (z.B. aus einer Datenbank)
die geeigneten Überlappungsbereiche
heraus. Je nach der Aufgabenstellung können unterschiedlich viele
Teilsequenzen erstellt werden, und zwar innerhalb eines zu belichtenden
Reaktionsträgers
oder auf mehrere Reaktionsträger
verteilt. Die Anlagerungsbedingungen für die Bildung der Hybride,
wie z.B. Temperatur, Salzkonzentration etc., werden durch einen
entsprechenden Algorithmus auf die zur Verfügung stehenden Überlappungsbereiche
abgestimmt. So wird eine maximale Spezifität der Aneinanderlagerung gewährleistet.
Die Daten für
die Zielsequenz können
in einer vollautomatischen Version auch direkt aus öffentlichen
oder privaten Datenbanken entnommen und in entsprechende Zielsequenzen
umgewandelt werden. Die entstehenden Produkte können wiederum optional in entsprechend
automatisierte Abläufe
eingespeist werden, z.B. in die Klonierung in geeigneten Zielzellen.
Der
stufenweise Aufbau durch Synthese der einzelnen DNA-Stränge in Reaktionsbereichen
innerhalb umgrenzter Reaktionsräume
erlaubt auch den Aufbau schwieriger Sequenzen, z.B. solche mit internen
Wiederholungen von Sequenzabschnitten, wie sie z.B. bei Retroviren
und entsprechenden retroviralen Vektoren vorkommen. Durch die Ablösung der
Bausteine innerhalb der fluidischen Reaktionsräume kann eine Synthese beliebiger
Sequenz erfolgen, ohne dass Probleme durch die Zuordnung der überlappenden
Bereiche auf den einzelnen Bausteinen entstehen.
Die
hohen Qualitätsanforderungen,
die beim Aufbau sehr langer DNA-Moleküle notwendig
sind, werden u.a. durch die Verwendung einer Echtzeit-Qualitätskontrolle
erfüllt.
Dabei wird die ortsaufgelöste
Synthese der Bausteine überwacht,
ebenso die Ablösung
und die Zusammenlagerung bis hin zur Erstellung der finalen Sequenz.
Dann laufen alle Prozesse in einem lichtdurchlässigen Reaktionsträger ab.
Des Weiteren wird die Möglichkeit
geschaffen, im Durchlicht Reaktionen und fluidische Vorgänge durch
z.B. eine CCD-Detektion zu verfolgen.
Der
miniaturisierte Reaktionsträger
wird so ausgeführt,
dass ein Ablösevorgang
in den einzelnen Reaktionsräumen
möglich
ist, und somit die auf den innerhalb dieser Reaktionsräume liegenden
Reaktionsbereichen synthetisierten DNA-Stränge in Clustern abgelöst werden.
Bei geeigneter Ausführung
des Reaktionsträgers
ist die Zusammenlagerung der Bausteine in einem stufenweisen Prozess
in Reaktionsräumen
möglich, außerdem die
Entnahme von Bausteinen, Teilsequenzen oder des finalen Produktes,
oder auch die Sortierung bzw. Auftrennung der Moleküle.
Die
Zielsequenz kann nach ihrer Fertigstellung als integriertes genetisches
Element durch Transfer in Zellen eingebracht und dadurch kloniert
und im Zuge funktioneller Studien untersucht werden. Eine weitere Möglichkeit
ist es, das Syntheseprodukt zuerst weiter aufzureinigen oder zu
analysieren, wobei diese Analyse z.B. eine Sequenzierung sein kann.
Der Prozess der Sequenzierung kann auch durch direkte Kopplung mit einem
entsprechenden Gerät
beginnen, z.B. mit einer nach dem in der Patentanmeldung
DE 199 24 327 arbeitenden
Vorrichtung zur integrierten Synthese und Analyse von Polymeren.
Es ist ebenfalls denkbar, die erzeugten Zielsequenzen nach der Klonierung
zu isolieren und zu analysieren.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
stellt über
die damit erzeugten integrierten genetischen Elemente ein Werkzeug
zur Verfügung,
das für
die Weiterentwicklung der molekularen Biologie die biologische Vielfalt
in einem systematischen Prozess erfasst. Die Erzeugung von DNA-Molekülen mit
gewünschter
genetischer Information ist damit nicht mehr der Engpass molekularbiologischer
Arbeiten, da von kleinen Plasmiden über komplexe Vektoren bis zu
Mini-Chromosomen alle Moleküle
synthetisch erzeugt werden können
und für
weitere Arbeiten zur Verfügung
stehen.
Das
Herstellungsverfahren erlaubt die parallele Erzeugung von zahlreichen
Nukleinsäuremolekülen und
damit einen systematischen Ansatz für Fragestellungen betreffend
Regulationselemente, DNA-Bindestellen für Regulatoren, Signalkaskaden,
Rezeptoren, Wirkung und Interaktionen von Wachstumsfaktoren etc.
Durch
die Integration von genetischen Elementen in eine vollsynthetische
Gesamt-Nukleinsäure
können
die bekannten genetischen Werkzeuge, wie Plasmide und Vektoren,
weiter genutzt und es kann so auf die entsprechenden Erfahrungen
aufgebaut werden. Andererseits werden sich diese Erfahrungen durch
die angestrebte Optimierung der vorhandenen Vektoren etc. rasch
verändern.
Die Mechanismen, die z.B. ein Plasmid für die Propagation in einem
bestimmten Zelltyp geeignet machen, lassen sich auf der Grundlage
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erstmals rationell untersuchen.
Durch
diese rationelle Untersuchung großer Varianten-Zahlen lässt sich
der gesamte Kombinationsraum genetischer Elemente erschließen. Damit
wird neben die zur Zeit in rascher Entwicklung befindliche hochparallele
Analytik (u.a. auf DNA-Arrays oder DNA-Chips) als zweites wichtiges
Element die programmierte Synthese integrierter genetischer Elemente
geschaffen. Nur beide Elemente zusammen können das Fundament einer rationellen
molekularen Biologie bilden.
Bei
der programmierten Synthese von entsprechenden DNA-Molekülen ist
nicht nur die beliebige Zusammensetzung der kodierenden Sequenzen
und funktionellen Elemente möglich,
sondern auch die Anpassung der Zwischenbereiche. Dies sollte rasch
zu Minimal-Vektoren und Minimal-Genomen
führen,
womit wiederum Vorteile durch die geringere Größe entstehen. Übertragungsvehikel,
wie z.B. virale Vektoren, können dadurch
effizienter gemacht werden, z.B. bei Verwendung von retroviralen
oder adenoviralen Vektoren.
Über die
Kombination bekannter genetischer Sequenzen hinaus ist die Entwicklung
neuer genetischer Elemente möglich,
die auf der Funktion vorhandener aufbauen kann. Gerade für solche
Entwicklungsarbeiten ist die Flexibilität des Systems von enormem Wert.
Die
synthetischen DNA-Moleküle
sind dabei auf jeder Stufe der Entwicklung des hier beschriebenen Verfahrens
voll kompatibel mit der vorhandenen Rekombinationstechnologie. Auch
für „traditionelle" molekularbiologische
Anwendungen können
integrierte genetische Elemente bereitgestellt werden, z.B. durch
entsprechende Vektoren. Der Einbau entsprechender Schnittstellen
auch für
bisher wenig verwendete Enzyme ist bei integrierten genetischen
Elementen kein limitierender Faktor.
Ermöglicht wird
mit diesem Verfahren die Integration aller gewünschten funktionellen Elemente
als „genetische
Module", wie z.B.
Gene, Teile von Genen, Regulationselemente, virale Verpackungssignale
etc., in das synthetisierte Nukleinsäuremolekül als Träger genetischer Information.
Durch diese Integration ergeben sich u.a. folgende Vorteile:
Es
können
damit hochgradig funktionsintegrierte DNA-Moleküle entwickelt werden, wobei
unnötige
DNA-Bereiche wegfallen (Minimal-Gene, Minimal-Genome).
Die
freie Kombination der genetischen Elemente sowie die Veränderungen
der Sequenz, wie z.B. zur Anpassung an den exprimierenden Organismus/Zelltyp
(Codonnutzung), werden ebenso ermöglicht wie Veränderungen
der Sequenz zur Optimierung funktioneller genetischer Parameter,
wie beispielsweise Genregulation.
Ebenfalls
ermöglicht
werden Veränderungen
der Sequenz zur Optimierung funktioneller Parameter des Transkripts,
z.B. Spleißen,
Regulation auf mRNA-Ebene, Regulation auf Translationsebene, und
darüber hinaus
die Optimierung funktioneller Parameter des Genprodukts, wie z.B.
die Aminosäuresequenz
(z.B. Antikörper,
Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, Kanäle, Poren, Transporter etc.).
Darüber hinaus
ist es möglich,
Konstrukte zu erstellen, die über
den RNAi-Mechanismus
in die Genexpression eingreifen. Wenn solche Konstrukte für mehr als
eine RNAi-Spezies kodieren, können
in einem Multiplex-Ansatz mehrere Gene gleichzeitig inhibiert werden.
Insgesamt
ist das mit dem Verfahren realisierte System extrem flexibel und
erlaubt in bisher nicht vorhandener Weise die programmierte Erstellung
von genetischem Material mit stark verringertem Aufwand an Zeit,
Materialien und Arbeit.
Größere DNA-Moleküle, wie
z.B. Chromosomen von mehreren hundert kbp, waren mit den vorhandenen
Methoden nahezu nicht gezielt manipulierbar.
Bereits
komplexere (d.h. größere) virale
Genome von mehr als 30 kbp (z.B. Adenoviren) sind mit den klassischen
Methoden der Gentechnik schwierig zu handhaben und zu manipulieren.
Es
kommt zu einer erhebliche Verkürzung
bis zur letzten Stufe der Klonierung eines Gens: Das Gen oder die
Gene werden als DNA-Molekül
synthetisiert und dann (nach geeigneter Vorbereitung, wie Reinigung etc.)
direkt in Zielzellen eingebracht und das Ergebnis studiert. Der
mehrstufige, meist über
Mikroorganismen, wie E.coli, laufende Klonierungsprozess (z.B. DNA-Isolation,
Reinigung, Analyse, Rekombination, Klonierung in Bakterien, Isolation,
Analyse etc.) wird damit auf die letzte Übertragung des DNA-Moleküls in die
finalen Effektorzellen reduziert. Bei synthetisch hergestellten
Genen oder Genfragmenten ist eine klonale Vermehrung in einem Zwischenwirt
(zumeist E.coli) nicht mehr notwendig. Damit umgeht man die Gefahr,
dass das für
die Zielzelle bestimmte Genprodukt eine toxische Wirkung auf den
Zwischenwirt ausübt.
Damit hebt man sich deutlich ab von der Toxizität mancher Genprodukte, die
bei der Verwendung klassischer Plasmid-Vektoren häufig zu
erheblichen Problemen bei der Klonierung der entsprechenden Nukleinsäurefragmente
führt.
Eine
weitere erhebliche Verbesserung ist die Zeitverkürzung und die Reduktion der
Arbeitsschritte, bis nach dem Sequenzieren von genetischem Material
die dabei vorgefundenen potentiellen Gene als solche verifiziert
und kloniert werden. Normalerweise werden nach Auffinden interessierender
Muster, die als ORF in Frage kommen, mit Sonden (z.B. mittels PCR)
in cDNA-Bibliotheken entsprechende Klone gesucht, die allerdings
nicht die ganze Sequenz der ursprünglich bei ihrer Herstellung
verwendeten Boten-RNA
(messenger RNA, mRNA) enthalten müssen (Problem der „full lenght
clones"). Bei anderen
Verfahren wird mittels eines Antikörpers in einer Expressions-Genbibliothek
gesucht (Screening). Beide Verfahren lassen sich mit dem erfahrungsgemäßen Verfahren
extrem abkürzen:
bei Vorliegen einer „in
silico" bestimmten
Gen-Sequenz (d.h. nach der Erkennung eines entsprechenden Musters
in einer DNA Sequenz durch den Computer), oder nach Entschlüsselung
einer Proteinsequenz, kann ein entsprechender Vektor mit der Sequenz
oder Varianten davon direkt über
programmierte Synthese eines integrierten genetischen Elementes
erzeugt und in geeignete Zielzellen eingebracht werden.
Die
so erfolgende Synthese von DNA-Molekülen bis zu mehreren 100 kbp
erlaubt die direkte Komplett-Synthese von viralen Genomen, z.B.
Adenoviren. Diese sind ein wichtiges Werkzeug in der Grundlagenforschung
(u.a. Gentherapie), aber wegen der Größe ihres Genoms (ca. 40 kbp)
schwer mit klassischen Methoden der Gentechnik zu handhaben. Besonders
die rasche und ökonomische
Erzeugung von Varianten zur Optimierung ist dadurch stark limitiert.
Diese Limitierung wird durch das erfindungsgemäße Verfahren aufgehoben.
Durch
das Verfahren erfolgen die Integration der Synthese, die Ablösung der
Syntheseprodukte und die Zusammenlagerung zu einem DNA-Molekül in einem
System. Mit Herstellungsverfahren der Mikrosystemtechnik können alle
notwendigen Funktionen und Verfahrensschritte bis zur Aufreinigung
des finalen Produktes in einem miniaturisierten Reaktionsträger integriert
werden. Dies können
Synthesebereiche, Ablösungsbereiche
(Cluster), Reaktionsräume,
Zuführungskanäle, Ventile,
Pumpen, Konzentratoren, Auftrennungsbereiche etc. sein.
Plasmide
und Expressionsvektoren können
für sequenzierte
Proteine oder entsprechende Teilsequenzen direkt hergestellt und
die Produkte biochemisch und funktionell analysiert werden, z.B.
unter Verwendung geeigneter Regulationselemente. Damit fällt die
Suche nach Klonen in einer Gen-Bibliothek weg. Entsprechend können offene
Leseraster („open
reading frames" ORF)
aus Sequenzierarbeiten (z.B. Humangenomprojekt) direkt in entsprechende
Vektoren programmiert und mit gewünschten genetischen Elementen
kombiniert werden. Eine Identifikation von Klonen, z.B. in durch aufwendiges
Screening von cDNA Bibliotheken, entfällt. Damit ist der Informationsfluss
von der Sequenz-Analyse zur Funktions-Analyse stark verkürzt worden, denn
am selben Tag, an dem ein ORF durch Analyse von Primärdaten im
Computer vorliegt, kann ein entsprechender Vektor inklusive des
vermuteten Gens synthetisiert und zur Verfügung gestellt werden.
Gegenüber konventioneller
Festphasen-Synthese zur Gewinnung synthetischer DNA zeichnet sich das
Verfahren gemäß Erfindung
durch geringeren Materialaufwand aus. Zur Herstellung tausender
von unterschiedlichen Bausteinen für die Erzeugung von einem komplexen
integrierten genetischen Element mit mehreren 100.000 kbp Länge, in
entsprechend parallelisiertem Format und bei entsprechender Miniaturisierung (siehe
Ausführungsbeispiele),
braucht ein mikrofluidisches System deutlich weniger Einsatzstoffe
als ein konventioneller Festphasensynthese-Automat für einen
einzelnen DNA-Oligomer (bei Verwendung einer einzigen Säule). Hier
stehen Mikroliter dem Verbrauch von Millilitern gegenüber, d.h.
ein Faktor von 1000.
Unter
Berücksichtigung
neuester Erkenntnisse der Immunologie erlaubt das vorgestellte Verfahren
ein extrem rationelles und schnelles Impfstoff-Design (DNA-Vakzine).
Kompetitionsassays mit
Gemisch aus Nukleinsäure-Sonden
an fester Phase und Lösung
Es
kann eine Kompetition von festphasenimmobilisierten Sonden und kurzen
Nukleinsäuren
in Lösung um
Bindung an Target-Nukleinsäuren
durchgeführt
werden.
Starke Bevorzugung von
Volllängen-Nukleinsäuren auf
dem Array als Kopiermatrizen
Prinzipiell
kann der enzymatische Kopiervorgang distal, proximal oder entlang
der festphasenimmobilisierten Nukleinsäurepolymeren initiiert werden.
Sollte er distal gestartet werden, so ergibt sich ein Zusatzaspekt:
das Verfahren kopiert dann im Wesentlichen nur Volllängenprodukte
und umgeht so das potentielle Problem von Abbruchprodukten aus der
in situ Synthese auf dem Reaktionsträger, die dann keine Vervielfältigung erfahren
und somit nicht in der Population der Kopien in ihrer umgeschriebenen
Form enthalten sind.
Verbesserung des Anteils
an Volllängen-Nukleinsäuren auf
dem Array durch Rückreaktion
Durch
Auffüllen
verkürzter,
aber korrekter Sonden durch Rückreaktion
der Kopien von Volllängenprodukten
kann der Anteil an Volllängen-Nukleinsäuren erhöht werden.