DE60306328T2

DE60306328T2 - Verfahren zur integrierten Integritätsbewertung und Analyse von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60306328T2
Application number: DE60306328T
Authority: DE
Inventors: Colin c/o PamGene B.V. Ingham
Original assignee: PamGene BV
Current assignee: PamGene BV
Priority date: 2003-03-04
Filing date: 2003-11-06
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2023-11-07
Also published as: DE60306328D1; US7504209B2; EP1457573A1; ATE331044T1; WO2004079005A1; US20070259340A1; EP1457573B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Hybridisierungsarrays. Spezifischer betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Beurteilung der RNA-Integrität bei der Mikroarray-Analyse von biologischen Proben. Dieses neue Verfahren basiert auf der Verwendung eines kombinierten Arrays, der einen Satz von mindestens zwei immobilisierten Kontroll-Oligonukleotiden umfasst, wobei eine erste der Kontrollsonden zu der 23S- oder der 28S- oder einer funktionell äquivalenten rRNA komplementär ist und wobei eine zweite Kontrollsonde zu der 16S- oder der 18S- oder einer funktionell äquivalenten rRNA komplementär ist, sowie Detektorsonden, die zu den aus der mRNA abgeleiteten Amplikons komplementär sind.
Hintergrund
Die Beurteilung der RNA-Integrität als Proben-Qualitätskontrolle ist für eine gute Leistung und Analyse des M kroarrays entscheidend. Eine Degradation der RNA ist weit verbreitet, wie zum Beispiel in Proben aus Gewebebiopsien, wo es oft eine beträchtliche Verzögerung im Verlauf einer Operation gibt, bevor die Probe in geeigneter Weise gelagert werden kann. Bei der Qualitätskontrolle der RNA-Integrität wird üblicherweise das Verhältnis zwischen den beiden ribosomalen Haupt-RNAs (rRNA) verwendet, um die allgemeine Qualität der RNA-Integrität anzugeben (typischerweise der 18S und der 28S bei Eukaryonten und der 16S und der 23S bei Prokaryonten). Diese stellen in großen Mengen vorkommende Transkripte dar (über die Hälfte der Gesamt-Zell-RNA) und können leicht durch Agarosegel- oder Mikroflüssigkeits-Systeme aufgetrennt werden. In der Regel weist ein Verhältnis von 2:1 der Gesamtmenge der 28S rRNA verglichen zu der der 18S rRNA auf eine Probe mit hoher Integrität hin.
Die typischen Nachteile einer RNA-Qualitätskontrolle vor der Analyse wie z.B. durch Gelelektrophorese sind der Bedarf an großen Mengen der Gesamt-RNA (etwa 1 μg), und oft wird eine wesentliche Menge der Probe bei dieser Beurteilung verbraucht.
Bei den derzeitigen Praktiken besteht jedoch ein wachsender Bedarf an der Beurteilung der RNA-Qualität in kleinen (Picogramm bis Nanogramm) Proben – zum Beispiel bei solchen, die aus einer Laser Capture-mikro-dissection erhalten werden, und oft sind die derzeitigen Verfahren, die erfordern, dass die gesamte Probe oder mehr bei der Qualitätskontrolle vor der Analyse verbraucht wird, daher nicht geeignet.
Es gibt zahlreiche Bemühungen, die Menge an Gesamt-RNA für die Qualitätsbeurteilung zu vermindern, einschließlich der RT-PCR der 18S- rRNA unter Verwendung von 25 ng oder weniger Ausgangsmaterial, aber dies ist ein bedeutender Aufwand. Alternativ wurde die Hybridisierung von Primern an die 28S-rRNA als Indikator für die RNA-Integrität bei in situ-Hybridisierungen verwendet.
Eine weitere Minimierung der Probenmenge wurde durch die Einführung der Labor-auf-einem-Cip ("Lab-on-a-Chip")-Technologie von Agilent erreicht, die eine Alternative zu der traditionellen, auf einem Gel basierenden Analyse darstellt, welche die Quantifizierung von RNA-Proben mit der Qualitätsbeurteilung in einem einzigen Testansatz integriert; für die Analyse wird nur 1 μl von 10 ng/μl benötigt.
Es bleibt jedoch die Herausforderung bestehen, eine integrierte Mikroarray-Analyse der aus der RNA abgeleiteten Proben einschließlich der Probenanalyse (z.B. der Erstellung eines Expressionsprofils ("expression profiling")) sowie eine Beurteilung der Probenqualität und -integrität durchzuführen.
Es existieren verschiedene Szenarien der Mikroarrayanalysen-Qualitätskontrolle; diese verwenden einen internen Standard, der endogen oder exogen sein kann. Die derzeitige Qualitätskontrolle konzentriert sich jedoch nur auf die Normalisierung der erhaltenen Ergebnisse, um Unterschiede bei der Markierung und bei Nachweis Wirksamkeiten sowie Unterschiede in der aufgetragenen Nukleinsäuremenge, Oberflächenanomalien und die Gesamtqualität des Objektträgers zu kompensieren. Die RNA-Integrität wird bei der derzeitigen Mikroarray-Analyse nicht angesprochen.
Die Durchführbarkeit der Verwendung von rRNA als endogenen Standard bei der Mikroarray-Analyse wurde in WO 02/05038 aufgezeigt, das ein Verfahren für die Bereitstellung eines internen rRNA-Standards offenbart.
rRNA als interner endogener Standard wird im Allgemeinen in einem großen experimentellen Gebiet als ideal angesehen, und zwar im Hinblick auf ihre Expression, die während des Zellzyklus, zwischen den Zellarten oder als Antwortreaktion auf experimentelle Behandlungen, die man zu untersuchen wünscht, nicht variiert. Damit jedoch ein solcher endogener Standard bei der Nukleinsäure-Mikroarray-Analyse zulässig ist, ist es entscheidend, dass er eine ähnliche relative Häufigkeit wie das Ziel-Transkript aufweist. Da die rRNA relativ zu anderen RNAs in riesigen Mengen vorliegt, muss ihr Spiegel vermindert werden, während er exakt bleibt.
In WO 02/05038 wird das übermäßige Signal, das von der markierten rRNA (oder von der cDNA, die aus der rRNA erzeugt wurde) stammt, heraus kompetitiert, und das für sie (die rRNA) nachgewiesene Signal wird auf ein Ausmaß vermindert, das mit dem der Signale für die anderen markierten RNAs kompatibel ist; dies erfolgt durch die posttranskriptionelle Zugabe einer Menge einer nicht markierten ribosomalen Nukleinsäure-Kompetitor-Sonde zu dem Hybridisierungspuffer, die mit der immobilisierten ribosomalen Einfang-Sonde kompetitiert. Die Verwendung eines solchen internen Standards bei den Test- und den Referenzproben erlaubt dann die Bereitstellung eines Normalisierungsfaktors, der die Korrektur des Hybridisierungssignals ermöglicht, das sich aus der Bindung der Ziel-cDNA an die entsprechende Einfang-Sonde ergibt.
Ein Problem bei dem vorstehenden Verfahren besteht jedoch darin, dass eine große Menge der überschüssigen, Fluoreszenz-markierten, amplifizierten rRNA in dem Hybridisierungsgemisch vorhanden ist, was zu hohen Hintergrundsignalen mit beiträgt.
Salowsky, R. et al.: „High sensitivity quality control of RNA Samples using RNA 6000 Pico LabChip kit", Agrient Technologies Anwendungen (2002) lehrt ein Verfahren für die Beurteilung der RNA-Integrität, das eine Elektrophorese beinhaltet.
In der derzeitigen Praxis hat sich jedoch keine Mikroarray-Hybridisierungsanalyse mit einer integrierten RNA-Integritätskontrolle als durchführbar erwiesen. Daher besteht ein Bedarf an der Beurteilung der RNA-Integrität, um sie mit der Leistung von Hybridisierungen der amplifizierten RNA (aRNA) mit dem Array in Beziehung setzen zu können.
Die vorliegende Erfindung hat die Aufgabe der Bereitstellung eines Verfahrens zur Beurteilung der RNA-Integrität für die Nukleinsäure-Hybridisierung bei Mikroarray-analyse-Testansätzen. Noch spezifischer hat die vorliegende Erfindung die Aufgabe der Bereitstellung eines Verfahrens für die Mikroarray-Analyse einer Nukleinsäure-Probe, wobei die Probe auf ihre ursprüngliche Integrität in Verbindung mit ihrer Analyse hinsichtlich einer bestimmten Anwendung wie z.B. der Erstellung eines Gen-Expressionsprofils, hin analysiert wird. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung hat daher die Aufgabe der Bereitstellung eines Nukleinsäure-Analyseverfahrens, in dem es nicht erforderlich ist, irgendwelches Probenmaterial bei einer Qualitätskontrolle vor der Analyse zu verbrauchen.
Zusammenfassung der Erfindung
In der Regel wird bei den Amplifikationen für die Zwecke eines Arrays die Gesamt-RNA einschließlich der rRNA verwendet. Der erste Schritt bei der Herstellung einer aRNA besteht in der Verlängerung eines Oligo-dT-Primers, der an den 3'-polyA-Trakt von Boten-RNAs (mRNAs) angelagert wird, um den ersten Strang der cDNA herzustellen. In der vorliegenden Erfindung werden zusätzliche Sequenzspezifische Primer zu gleichen Zeit bei der gleichen reverse Transkriptase-Reaktion verlängert; d. h. in der vorliegenden Erfindung werden die Amplifikationsreaktionen zusätzlich zu dem Oligo-dT-Primer mit einem Satz von mindestens zwei weiteren Primern angesetzt, die mit den 18S- und den 28S- rRNAs spezifisch hybridisieren. Diese Primer erlauben die Synthese eines markierten Produkts, das dazu verwendet wird, die Häufigkeit der rRNA durch die Hybridisierung mit dem Array zu beurteilen.
Des Weiteren ist bekannt, dass die prokaryontische mRNA polyadenyliert vorliegen kann, obwohl der PolyA-Trakt dazu tendiert, kürzer zu sein und nicht alle mRNAs einer bestimmten Art polyadenyliert vorliegen. Obwohl dies mit der mRNA-Stabilität oder sogar mit der Translation verbunden sein kann, bleibt die vollständige Bedeutung dieser Beobachtung jedoch unklar (N. Sarkar, Annual Reviews of Biochemistry, 1997, Bd. 66, S. 173–197). Es ist jedoch durchaus möglich, die polyadenylierte Subpopulation zu amplifizieren. Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung gleichermaßen für prokaryontische Systeme geeignet, wobei die Amplifikationsreaktionen zusätzlich zu dem Oligo-dT-Primer dann mit einem Satz von mindestens zwei weiteren Primern angesetzt werden, die mit der 16S- und der 23S-rRNA spezifisch hybridisieren.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Beurteilung und Analyse der integrierten Nukleinsäureintegrität bereit, das ein kombiniertes Array von Nukleinsäuremolekülen verwendet, die auf einem festen Träger immobilisiert sind, wobei das Array der Nukleinsäuremoleküle eine Kombination von zu der amplifizierten RNA komplementären Kontroll-Oligonukleotiden umfasst, die von der 16S-, der 18S- oder einer funktionell äquivalenten rRNA abgeleitet wurde, und zu der amplifizierten rRNA komplementäre Kontroll-Oligonukleotide umfasst, die von der 23S-, der 28S- oder einer funktionell äquivalenten-rRNA abgeleitet wurde, sowie Detektorsonden, die zu der mRNA komplementär sind.
Der Begriff „funktionell äquivalente rRNA", wie er in der vorliegenden Beschreibung durchgehend verwendet wird, bezieht sich auf ribosomale Nukleinsäuren, die eine geringfügig andere Größe aufweisen, aber die gleiche Funktion erfüllen. So ist zum Beispiel in der Hefe die 26S-rRNA das funktionelle Äquivalent der 28S-rRNA des Menschen.
In den Zellen können noch andere rRNA-Species vorliegen, die ebenfalls gute Indikatoren für die RNA-Qualität sein können. Diese umfassen die 5S-rRNA, die vom Menschen und von vielen prokaryontischen Arten sowie von Pflanzenarten bekannt ist. Die vorliegende Erfindung zieht die Verwendung dieser anderen rRNA-Species in Betracht, wenn an diese gleichzeitig mit der Anlagerung des Oligo-dT-Primers an die polyadenylierte mRNA ein Primer spezifisch angelagert werden kann.
Darüber hinaus zieht die vorliegende Erfindung die Verwendung von nichtpolyadenylierter RNA als Ziel für eine spezifische Primer-Anlagerung in Betracht, und zwar im Hinblick auf folgenden Kriterien, die beinhalten (1), dass die RNA ein Indikator für die Probenqualität sein sollte und (2), dass die RNA in einer Gesamt-RNA-Probe vorliegen sollte und (3) dass die RNA nicht polyadenyliert sein sollte, wie z.B. im Falle einiger regulatorischer rRNAs, einiger Histon-mRNAs und einiger viraler RNAs. Insbesondere ist dieses letzte Kriterium im Hinblick auf die Tatsache von Bedeutung, dass einige RNA-Species in polyadenylierter sowie in nichtpolyadenylierter Form vorliegen können.
Dementsprechend besitzt das Array, wie es in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, typischerweise einen oder mehrere Auftragspunkte (spots), die Oligos enthalten, die zu der amplifizierten 16S- oder 18S-rRNA oder einer funktionell äquivalenten rRNA komplementär sind, einen oder mehrere Auftragspunkte, die Oligos enthalten, die zu der amplifizierten 23S- oder 28S-rRNA oder einer funktionell äquivalenten rRNA komplementär sind, und einen oder mehrere Auftragspunkte, die Oligos enthalten, die zu der amplifizierten mRNA komplementär sind.
Im Allgemeinen besitzt jeder Auftragspunkt auf dem Array ein Oligonukleotid, d. h. eine Oligonukleotid-Species. Daher sind die Oligonukleotidmoleküle innerhalb eines Auftragspunktes gewöhnlich nahezu identisch, soweit es die Einschränkungen der Synthese erlauben. Alternativ kann ein Auftragspunkt mehr als eine Oligonukleotid-Species enthalten, die z.B. zu unterschiedlichen Teilen der z.B. 18S- oder 28S-Ziel-rRNA komplementär sein können; zum Beispiel können einige Teile eines RNA-Moleküls gegenüber einem Abbau empfindlicher sein als andere. Die Verwendung solcher Oligonukleotide erlaubt den Nachweis von teilweise degradierten RNAs; dies ist bei den im Fachgebiet bekannten Verfahren wie z.B. bei der Agarosegel-Analyse oder der Bioanalysator-Technologie von Agilent nicht der Fall.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Beurteilung und Analyse der integrierten Nukleinsäureintegrität bereit, umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen eines Trägers mit einem Satz immobilisierter Detektorsonden und einen Satz von mindestens zwei Kontrollsonden, wobei (i) eine erste der mindestens zwei Kontrollsonden zur 23S- oder ihrem funktionellen Äquivalent oder zur 28S-rRNA oder ihrem funktionellen Äquivalent komplementär ist, und (ii) eine zweite der mindestens zwei Kontrollsonden zur 16S- oder ihrem funktionellen Äquivalent oder zur 18S-rRNA oder ihrem funktionellen Äquivalent komplementär ist, wobei die erste und die zweite Kontrollsonde die beiden Haupt-rRNAs des Organismus darstellen, von dem eine Probe extrahiert wird, und die die Beurteilung der Integrität dieser Probe erlauben;
(b) In-Kontakt-Bringen des Trägers mit Analyt-Ribonukleinsäuren, die von einer Probe stammen, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung komplementärer Analyt-Ribonukleinsäuren und immobilisierter Sonden erlauben, um Analyt-Ribonukleinsäure/Sonden-Komplexe zu bilden; wobei die Hybridisierung ein nachweisbares Signal erzeugt;
(c) Nachweisen der durch die Komplexe erzeugten Signale;
(d) Bestimmen des Verhältnisses der Signale, die durch die 28S-rRNA/Kontrollsonde- und die 18S-rRNA/Kontrollsonde- oder durch die 23S-rRNA/Kontrollsonde- und die 16S-rRNA/Kontrollsonde- oder durch funktionell äquivalente rRNA/Kontrollsonde-Komplexe erzeugt wurden; und
(e) Beurteilen der Integrität der Probe; und
(f) Bewerten der Ergebnisse der Mikroarray-Analyse in Anbetracht der Beurteilung der Integrität.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt die Beurteilung der RNA-Integrität und ihrer Beziehung zur Leistung der Mikroarray-Analyse in einem integrierten Verfahren.
Darüber hinaus erlaubt das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Bestimmung von Niveaus der rRNA-Integrität. Ein Kriterium für eine gute Qualität der rRNA besteht im Allgemeinen darin, dass die Banden im Falle einer Agarosegel-Analyse nicht nur vorhanden sind, sondern auch schart definiert sind. Man nimmt an, dass ein begrenzter Abbau zu ausgefransten Enden sowie zur vollständigen Zerstörung führt. Ausgefranste Enden sind quantitativ schwer zu beurteilen; sie bilden „Schultern" der Peaks, die von den intakten rRNAs stammen.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt den Nachweis begrenzter Verluste an Oligoribonukleotiden von den 3'- oder den 5'-Enden fast intakter rRNAs durch die Identifizierung der Position der rRNA-Primer auf den immobilisierten Kontrollsonden. Dementsprechend stellt das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Beurteilung von Unterschieden in der Qualität zwischen guten und perfekten Gesamt-RNA-Proben mit einer deutlich höheren Auflösung bereit, als sie durch die Verfahren bereitgestellt wird, die gegenwärtig im Fachgebiet bekannt sind.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Bevor das vorliegende Verfahren und die Lösungen beschrieben werden, die bei dem Verfahren verwendet werden, sollte verstanden werden, dass diese Erfindung nicht auf bestimmte Verfahren, Bestandteile oder Lösungen, die beschrieben werden, beschränkt ist, da solche Verfahren, Bestandteile oder Lösungen natürlich variieren können.
In der vorliegenden Beschreibung und den angehängten Ansprüchen umfassen die Singular-Formen „ein/eine" und „der/die/das" auch Bezüge auf den Plural, sofern der Zusammenhang dies nicht offensichtlich anders diktiert.
Es sollte auch verstanden werden, dass die hierin verwendete Terminologie nicht beabsichtigt, einschränkend zu wirken, da der Rahmen der vorliegenden Erfindung nur durch die angehängten Ansprüche eingeschränkt wird.
Dementsprechend sollten die Definitionen nicht so verstanden werden, dass sie den Rahmen der Erfindung einschränken. Stattdessen sollten sie verwendet werden, um die Sprache der Beschreibung zu interpretieren und, wo passend, auch die Sprache der Ansprüche. Diese Begriffe können auch im Zusammenhang der Beschreibung der Erfindung besser verstanden werden. Wenn ein Begriff in der Beschreibung oder in den Ansprüchen enthalten ist, der in der vorliegenden Beschreibung nicht näher definiert wird oder der auf Grundlage seines Zusammenhanges nicht interpretiert werden kann, sollte er so angesehen werden, dass er die gleiche Bedeutung besitzt, wie sie durch Fachleute verstanden wird.
Der Gegenstand der Erfindung liegt auf dem Gebiet der Nukleinsäuren und richtet sich insbesondere auf Verfahren zur Bestimmung, ob eine spezifische Nukleinsäuresequenz in einer Probe vorhanden ist. Es ist wichtig, bestimmen zu können, ob die Sequenz, die nachgewiesen werden soll, in der Originalprobe tatsächlich nicht vorhanden ist oder ob sie während der Verfahrensschritte, denen die Probe ausgesetzt wurde, degradiert wurde, was zu einem falsch-negativen Ergebnis führen würde. Wie jeder Fachmann anerkennen wird, ist RNA gegenüber Degradation äußerst empfindlich. Insbesondere bei klinischen Diagnosen über den Nukleinsäurespiegel ist eine Qualitätskontrolle der Nukleinsäure, die aus einer solchen Probe extrahiert wird, ein wichtiger Punkt.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren für die Beurteilung und Analyse der integrierten Nukleinsäureintegrität, umfassend die Verwendung eines kombinierten Arrays von Nukleinsäuremolekülen, die auf einem festen Träger immobilisiert sind, wobei dieses Array mit Nukleinsäuremolekülen eine Kombination von Oligonukleotiden umfasst, die zu einer RNA komplementär sind, welche aus der 16S- oder der 18S- oder einer funktionell äquivalenten rRNA stammt, und von Oligonukleotiden umfasst, die zu einer RNA komplementär sind, welche aus der 23S- oder der 28S-rRNA oder einer funktionell äquivalenten rRNA stammt, sowie Detektor-Oligonukleotide, die zur mRNA komplementär sind.
Bei Genexpressionsstudien ist es eine derzeit übliche Praxis, die mRNA-Expressionsprofile zu messen. Die Zellen regulieren die Expression ihrer Gene als Antwort auf Veränderungen in ihrer Umgebung. Die spezifischen Muster der Genexpression, wie sie durch die Spiegel der mRNA-Produktion gemessen werden, können signifikante Einsichten in die normale Gewebeentwicklung, biologische Antwortreaktionen und die Pathogenese von Erkrankungen liefern. Die Erstellung von Genexpressionsprofilen spielt eine Rolle bei der Rationalisierung verschiedener kritischer Schritte bei der modernen pharmazeutischen Entwicklung, der Identifizierung von neuen Zielgenen, der Identifizierung und Optimierung von Leitarzneistoffen, der Erstellung des Toxizitätprofils von Arzneistoffen und der Überwachung von klinischen Studien.
Mit der auf dem neuesten Stand befindlichen DNA-Array- (DNA-Chip-) Technologie sind Wissenschafter in der Lage, Tausende bis Zehntausende von Genen auf einem sehr kleinen Bereich einer Oberfläche zu immobilisieren. Wenn diese mit den Proben von Interesse hybridisiert werden, sind die Wissenschafter in der Lage, die Expressionsspiegel dieser Tausende von Genen mit hoher Auflösung nachzuweisen und zu messen.
Gene, die Proteine codieren, werden im Zellkern in mRNAs transkribiert. Diese mRNAs werden wiederum durch die Ribosomen im Cytoplasma zu Proteinen translatiert. Der Transkriptionsspiegel eines Gens wird als die Menge seiner entsprechenden mRNA angesehen, die in der Zelle vorliegt. Bei vergleichenden Hybridisierungsexperimenten werden zum Beispiel die Mengen vieler verschiedener mRNAs von mindestens zwei Zellpopulationen miteinander verglichen.
Typischerweise werden bei den Mikroarray-Analyseverfahren die rRNA-Spiegel nicht gemessen, weil rRNAs nicht polyadenyliert sind und daher durch die reverse Transkriptase nicht von einem Oligo-dT-Primer (der z.B. auch einen T7-Promotor anfügt) in cDNA umgeschrieben werden. Daher werden die rRNAs bei den herkömmlichen RNA-Amplifikationsverfahren wie sie z.B. durch Van Gelder et al. in dem US-Patent Nr. 5,545,522 beschrieben werden, nicht amplifiziert oder markiert (z.B. durch einen Fluorophor).
Der erste Schritt bei der Herstellung einer aRNA besteht typischerweise in der Verlängerung eines Oligo-dT-Primers, der an den 3'-polyA-Trakt der mRNAs angelagert wird, um den ersten Strang der cDNA herzustellen. Die meisten Array-Amplifikationen verwenden die Gesamt-RNA, in der die rRNA immer noch vorhanden ist.
In den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird neben dem Oligo-dT-Primer, der mit der mRNA spezifisch hybridisiert, die reverse Transkriptase-Reaktion mit mindestens zwei zusätzlichen Primern angesetzt, die mit der 18S- oder der 16S-rRNA oder einer funktionell äquivalenten rRNA und mit der 23S- oder der 28S-rRNA oder einer funktionell äquivalenten rRNA spezifisch hybridisieren.
Eine Probe, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann aus biologischem Material bestehen oder aus irgendeinem Material, das biologisches Material enthält, aus dem die Ribonukleinsäuren oder die Gesamt-RNA hergestellt und auf die qualitative und quantitative Anwesenheit bestimmter Nukleinsäuresequenzen hin analysiert werden kann.
Die Geamt-RNA kann aus praktisch jeder beliebigen Probe isoliert werden. Die Probe ist jedoch in der Regel eine biologische oder eine biochemische Probe. Der Begriff „biologische Probe", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Probe, die aus einem Organismus oder aus Bestandteilen (z.B. Zellen) eines Organismus erhalten wird. Bei der Probe kann es sich um jedes) beliebige biologische Gewebe oder Flüssigkeit handeln. Häufig wird die Probe eine „klinische Probe" sein, die eine Probe darstellt, welche aus einem Patienten stammt, einschließlich des Menschen und Tieren. Solche Proben umfassen Knochenmark, Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit, Blut, Blutfraktionen wie z.B. Serum, einschließlich fötales Serum (z.B. SFC) und Plasma, Blutzellen (z.B. weiße Blutzellen), Gewebe oder Feinnadel-Biopsie-Proben, Urin, Bauchfellflüssigkeit und Flüssigkeit im Pleuraraum oder Zellen davon, sind aber nicht auf diese beschränkt. Biologische Proben können auch Pflanzenproben und Mikrobenproben einschließlich Schnitte von Geweben oder Zellen umfassen. Verfahren zur Isolierung der Gesamt-RNA aus einer Vielzahl von eukaryontischen Proben, einschließlich Proben menschlicher, tierischer und pflanzlicher Herkunft oder aus der Hefe, sind im Fachgebiet wohlbekannt.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, in dem die Probe eine Gesamtribonukleinsäure-Probe ist.
Die exakte Analyse der Genexpression erfordert die Analyse spezifischer Zelltypen ohne Interferenz von den umgebenden Zellen. Wenn diese reinen Zellpopulationen als Ausgangspunkt dienen, bedeutet dies oft die Arbeit mit kleinen Probenmengen. Es werden spezielle Technologien benötigt, um die Herausforderungen bei der Handhabung dieser wertvollen Proben zu überwinden. Die Kombination von RNA-Amplifikation und Mikroarray-Analyse enthüllt die differentielle Genexpression zwischen den Zelltypen. Im Fachgebiet sind verschiedene Gesamt-RNA-Amplifikationsverfahren bekannt, welche die molekulare Analyse von RNA-Proben erlauben, die für eine Mikroarray-Analyse zu klein sind, wie z.B. mikroskopische Proben.
Dementsprechend wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, in dem die Analyt-Ribonukleinsäuren amplifizierte Ribonukleinsäuren darstellen.
Wie vorstehend erwähnt, handelt es sich bei der RNA, die bei einer typischen vorgeschalteten reverse Transkriptase-Reaktion verwendet wird, um die Gesamt-RNA, von der 80% aus ribosomaler RNA bestehen. Der Bestandteil an mRNA in der gesamten zellulären RNA kann in Abhängigkeit von dem Gewebe von 2% bis zu 5% variieren, wobei der verbleibende Rest der RNA aus tRNA oder aus kleinen nukleären RNAs besteht.
Die Isolierung intakter RNA ist für viele Verfahren, die zur Analyse der Genexpression verwendet werden, wie z.B. der Mikroarray-Analyse, essentiell. Es ist eine RNA mit äußerst hoher Integrität erforderlich, und daher ist die Beurteilung der RNA-Integrität ein wesentlicher Teil der Genexpressionsanalyse. Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Beurteilung und Analyse der integrierten Nukleinsäureintegrität bereit, umfassend die Verwendung eines kombinierten Arrays von Nukleinsäuremolekülen, die auf einem festen Träger immobilisiert sind, wobei dieses Array von Nukleinsäuremolekülen eine Kombination von Kontroll-Oligonukleotiden, einerseits zu der amplifizierten RNA komplementäre sind umfasst, welche aus der 18S- oder der 16S-rRNA oder einer funktionell äquivalenten rRNA abgeleitet wurde, und andererseits von Kontroll-Oligonukleotiden umfasst, die zu der 23S- oder der 28S-rRNA oder einer funktionell äquivalenten rRNA komplementär sind, sowie Detektor-Oligonukleotide umfasst, die zur mRNA komplementär sind.
Dementsprechend wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, in dem die amplifizierten Ribonukleinsäuren aus amplifizierten ribosomalen und aus Boten-Ribonukleinsäuren bestehen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, in dem die amplifizierten ribosomalen Ribonukleinsäuren aus amplifizierten 28S- und 18S- oder aus 23S- und 16S- oder funktionell äquivalenten Ribonukleinsäuren bestehen.
Man wird verstehen, dass die amplifizierten Analyt-Ribonukleinsäuren, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, markiert sein können, um den Nachweis von Analyt-Ribonukleinsäure/Sonde-Komplexen auf dem Mikroarray zu erlauben.
Dementsprechend werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Verfahren bereitgestellt, in denen die amplifizierten Analyt-Ribonukleinsäuren markiert sind.
Der Begriff Markierung, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das ein Signal verbreitet, das beim Nachweis und bei der Quantifizierung behilflich ist. Dieses Signal kann entweder visuell nachgewiesen werden (z.B. weil es ein gefärbtes Produkt liefert oder weil es Fluoreszenz abstrahlt) oder mittels eines Detektors, der Eigenschaften des Reportermoleküls nachweist (z.B. Radioaktivität, Magnetfeld usw.). In der vorliegenden Beschreibung erlauben die Marker den Nachweis der Identität und die Quantifizierung von Analyt-Sequenzen innerhalb einer Probe. Nachweisbare Markierungen, die für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen jede beliebige Zusammensetzung, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische, elektrische, optische oder chemische Mittel nachgewiesen werden kann, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Dementsprechend kann praktisch jede beliebige Markierung, die ein nachweisbares und quantifizierbares Signal produziert und die in der Lage ist, an ein Nukleotid angeheftet zu werden und/oder in das erzeugte Amplikon oder in die RNA-Kopie eingebaut zu werden, in Verbindung mit den Verfahren der Erfindung verwendet werden. Geeignete Markierungen umfassen zum Beispiel und nicht als Einschränkung Radioisotope, Fluorophore, Chromophore, chemolumineszente Einheiten, chemische Markierungen wie z.B. die ULS-Markierung (Universal Linkage System; Kreate-ch) und ASAP (Accurate, Sensitive and Precise; Perkin Elmer) usw. Geeignete Markierungen können eine Farbreaktion induzieren und/oder können in der Lage zur Bio-, Chemo- oder Photolumineszenz sein.
Nützliche Markierungen in der vorliegenden Erfindung umfassen zum Beispiel Biotin für die Färbung mit einem markierten Streptavidin-Konjugat, Digoxigenin, anti-Digoxigenin, Luciferase, P-Galactosidase, Antigene, Enzyme und Enzym-Konjugate (z.B. Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase und andere, die üblicherweise verwendet werden, wie z.B. bei einem ELISA).
Weitere nützliche Markierungen umfassen isotopische Markierungen einschließlich radioaktive Markierungen (z.B. ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, ³³P oder ³²P), kolorimetrische Markierungen wie z.B. kolloidales Gold (z.B. Goldpartikel mit einem Durchmesser von 40 nm bis 80 nm streuen grünes Licht mit hoher Effizienz); Zucker und Lektine können ebenfalls nützlich sein. Patente, die die Verwendung solcher Markierungen lehren, umfassen die US-Patente Nr. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,241. Moleküle, die ihre Fluoreszenz oder ihre Aktivität nach einer Veränderung der Bindung verändern, können ebenfalls nützlich sein.
Fluoreszenz-Markierungen sind besonders geeignet, weil sie sehr starke Signale mit niedrigem Hintergrund bereitstellen. Fluoreszenz-Markierungen sind auch mit hoher Auflösung und bei schnellen Durchmusterungs-Verfahren optisch nachweisbar. Fluoreszenz-Markierungen bieten den zusätzlichen Vorteil, dass die Bestrahlung einer Fluoreszenz-Markierung mit Licht eine Vielzahl von Emissionen produzieren kann. Daher kann eine einzelne Markierung eine Vielzahl von messbaren Ereignissen bereitstellen.
Fluoreszenz-Markierungen können im Verlauf einer in vitro-Transkriptions-Reaktion leicht hinzugefügt werden. So kann zu Beispiel mit Fluorescein markiertes UTP und CTP in die RNA eingebaut werden, die bei einer in vitro-Transkription hergestellt wird.
Dementsprechend werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Verfahren bereitgestellt, bei denen die amplifizierten Analyt-Ribonukleinsäuren fluoreszenzmarkiert sind.
Wünschenswerterweise sollten die Fluoreszenz-Markierungen Licht von über etwa 300 nm absorbieren, in der Regel von über etwa 350 nm und noch üblicher von über etwa 400 nm, wobei sie gewöhnlich bei Wellenlängen emittieren, die mehr als etwa 10 nm höher liegen, als die Wellenlänge des absorbierten Lichts.
Besonders nützliche Fluoreszenz-Markierungen umfassen als Beispiel und nicht als Einschränkung Fluorescein-isothiocyanat (FITC), Rhodamin, Malachitgrün, Oregongrün, Texasrot, Kongorot, SybrGreen, Phycoerythrin, Allophycocyanin, 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyfluorescein (JOE), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 6-Carboxy-2',4',7',4,7-hexachlorofluorescein (HEX), 5-Carboxyfluorescein (5-FAM), N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), Cyanin-Farbstoffe (z.B. Cy5 und Cy3, einschließlich z.B. Oyster^®-Farbstoffe von Flownamics^®, Madison), BODIPY-Farbstoffe (z.B. BODIPY 630/650, Alexa542 usw.), das grün fluoreszierende Protein (GFP), das blau fluoreszierende Protein (BFP), das gelb fluoreszierende Protein (YFP), das rot fluoreszierende Protein (RFP) und ähnliche (vergleiche z.B. mit Alexa-Farbstoffe von Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA; Dyomics, Deutschland).
In einer weiteren Ausführungsform werden Verfahren gemäß der Erfindung bereitgestellt, in denen die amplifizierten Analyt-Ribonukleinsäuren mit einem Fluoreszenz-Marker markiert sind, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die Fluorescein, Cy5 und Cy3 umfasst.
Vorzugsweise wird die Position der Markierung die Erzeugung, die Hybridisierung, den Nachweis oder andere nach der Hybridisierung erfolgende Modifizierungen des markierten Polynucleotids nicht beeinträchtigen. Es kann eine Vielzahl unterschiedlicher Protokolle verwendet werden, um die markierten Nukleinsäuren zu erzeugen, wie im Fachgebiet bekannt ist, wobei solche Verfahren typischerweise auf den markierten Primern oder der enzymatischen Erzeugung markierter Nukleinsäuren unter Verwendung eines markierten Nukleotids basieren. So kann zum Beispiel die Markierung in eine Nukleinsäure während den Transkriptions-/Amplifikations-Schritten eingebaut werden, um markierte Amplikons herzustellen. Daher wird man verstehen, dass die Nukleotide, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, markiert sein können.
Dementsprechend werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Verfahren bereitgestellt, in denen die Analyt-Ribonukleinsäuren mittels der Markierung-durch-Synthese markiert werden.
Nicht einschränkende Beispiele für Markierung-durch-Synthese-Verfahren sind z.B. die Verfahren, wie sie durch Van Gelder et al. in dem US-Patent Nr. 5,545,522 offenbart werden, und z.B. das „Tyras"-Verfahren, wie es durch Van Gemen in dem europäischen Patent Nr. 1 056 884 offenbart wird.
In den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen die RNA-Amplifikations- oder die reverse Transkriptase-Reaktions-Gemische neben einem Oligo-dT-Primer zwei zusätzliche Primer, die eine Sequenz besitzen, die für die 18S- oder die 16S-rRNA oder eine funktionell äquivalente rRNA einerseits und für die 28S- oder die 23S-rRNA oder eine funktionell äquivalente rRNA andererseits spezifisch ist. Besonders geeignete rRNA-spezifische Primer werden gegen nicht polymorphe Regionen der rRNAs entworfen; z.B. gegen menschliche RNAs, so dass die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung für alle menschlichen Gesamt-RNA-Proben oder für alle Gesamt-RNA-Proben aus anderen Organismen universell sind. Die Verlängerung der Primer durch eine RNA-Polymerase-Promotor-Sequenz erlaubt die Markierung multipler RNA-Kopien während der Synthese, die zu den Matrizen-rRNAs komplementär sind, die in dem Reaktionsgemisch vorliegen. Eine „Matrize" ist ein Nukleinsäuremolekül, das durch eine Nukleinsäure-Polymerase kopiert wird. Eine Matrize kann in Abhängigkeit von der Polymerase entweder einzelsträngig, doppelsträngig oder teilweise doppelsträngig sein. Die synthetisierte Kopie ist zu der Matrize komplementär oder zu mindestens einem Strang der doppelsträngigen oder der teilweise doppelsträngigen Matrize. Sowohl RNA als auch DNA werden immer in 5'-zu-3'-Richtung synthetisiert, und die beiden Stränge eines Nukleinsäure-Duplexmoleküls sind immer so angeordnet, dass die 5'-Enden der beiden Stränge sich an den entgegengesetzten Enden des Duplexmoleküls befinden (und notwendigerweise sind dies die 3'-Enden dann ebenfalls).
Eine „Promotor-Sequenz" ist eine spezifische Nukleinsäuresequenz, die durch eine DNA-abhängige-RNA-Polymerase („Transkriptase" oder „RNA-Polymerase") als Signal für die Bindung an die Nukleinsäure und für den Start der Transkription der RNA in der 5'->3'-Richtung an einer Position, die sich direkt stromabwärts des Promotors befindet, erkannt wird. Für die Bindung erfordern solche Transkriptasen im Allgemeinen DNA, die in dem Teil, der die Promotorsequenz und ihr Komplement umfasst, doppelsträngig ist; der Matrizen-Anteil (die Sequenz, die transkribiert werden soll) braucht nicht doppelsträngig zu sein. Individuelle DNA-abhängige-RNA-Polymerasen erkennen eine Vielzahl unterschiedlicher Promotor-Sequenzen, die in ihrer Effizienz, die Transkription zu fördern, deutlich variieren können. Wenn eine RNA-Polymerase an eine Promotor-Sequenz bindet um die Transkription zu initiieren, ist diese Promotor-Sequenz nicht Teil der transkribierten Sequenz. Daher werden die so hergestellten RNA-Transkripte diese Sequenz nicht enthalten. Bei dem Promotor kann es sich um den Promotor für eine beliebige geeignete RNA-Polymerase handeln. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt die Verwendung eines „Enzyms, das eine RNA-Polymerase-Aktivität besitzt", wie zum Beispiel die RNA-Polymerasen aus E. coli und aus den Bakteriophagen T7, T3 und SP6. Dementsprechend werden die Promotor-Sequenzen, die durch die RNA-Polymerasen aus E. coli und den Bakteriophagen T7, T3 und SP6 erkannt werden, in den Oligonukleotiden der Erfindung in Betracht gezogen. Die Prozessivität zum Beispiel der T7-RNA-Polymerase ist sehr groß und beträgt auf einer DNA-Matrize in der Regel mehr als 250 Nukleotide pro Sekunde. Dies bedeutet, dass die Amplifikationsrate durch die Anzahl an Initiationsereignissen pro Promotor pro Zeiteinheit bestimmt wird. Da der Promotor für jede Ziel-RNA identisch ist, besteht keine Selektivität für die Amplifikation. Durch die Anwendung der RNA-Polymerase werden neue RNA-Kopien der ursprünglichen Ziel-RNA hergestellt. Während des Transkriptionsschrittes werden in der Regel 10–1000 Kopien jeder RNA hergestellt.
Wie durch Van Gelder et al. in dem US-Patent 5,545,522 offenbart, können cDNA-Stränge aus einer Sammlung von RNA-Molekülen unter Verwendung eines Primers der mit einer Promotor-Region verbunden ist hergestellt werden. Diese Promotor-Region befindet sich stromaufwärts des Primers an seinem 5'-Terminus in einer Orientierung, die die Transkription im Hinblick auf die verwendete RNA-Population erlaubt. Wenn der zweite cDNA-Strang synthetisiert wird, wird sich die Promotor-Sequenz in der korrekten Orientierung in diesem Strang befinden, um die RNA-Synthese unter Verwendung dieses zweiten cDNA-Stranges als Matrize zu initiieren.
Alternativ benötigen besonders geeignete Verfahren für die Amplifikation von RNA die Herstellung der cDNA-Intermediate als Grundlage für die Amplifikation nicht, wie es in Van Gemmen in EP 1 056 884 B1 beschrieben wird. Bei diesem sogenannten „Tyras"-Verfahren wird die RNA durch eine RNA-Polymerase synthetisiert, und zwar direkt von der Ziel-RNA-Matrize, die in dem Untersuchungsmaterial vorliegt. Die Aktivität der RNA-Polymerase ist von all den Sekundärstrukturen unabhängig, die in der Ziel-RNA vorhanden sind, und daher gibt es keine Unterschiede in der Weise, wie die unterschiedlichen Ziel-RNAs in Abhängigkeit von den Strukturen in den Ziel-RNAs amplifiziert werden. Bei diesem Verfahren kann, um eine beliebige Verlängerung entlang der RNA-Matrize zu verhindern, das Oligonukleotid an seinem 3'-Ende blockiert werden. Auf diese Weise ist die reverse Transkriptase nicht in der Lage, eine Verlängerung des blockierten 3'-Endes des Oligonukleotids zu beginnen, und an dieser Stelle wird keine cDNA synthetisiert.
Der 3'-Terminus des Oligonukleotids kann auf verschiedene Weisen blockiert werden, einschließlich einer Modifizierung an seinem 3'-terminalen Ende. Die Modifizierung am 3'-terminalen Ende des Oligonukleotids kann zum Beispiel durchgeführt werden, indem man eine 3'-terminale Sequenz verwendet, die zu der Ziel-RNA nicht komplementär ist, oder indem man eine Biotin-Gruppe verwendet oder indem man ein modifiziertes Nukleotid verwendet, wie z.B. ein 3'-terminales Didesoxynukleotid, ein Rp-NTP-α-S-phosphorothioat-Nukleotid-Isomer und Nukleotide, die Alkandiol-Reste, Cordycepine oder Aminoalkyle umfassen, oder auf andere Weisen, die den Fachleuten wohlbekannt sind.
Dementsprechend werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Verfahren bereitgestellt, in denen die Markierung-während-der-Synthese folgende Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen der Gesamt-Ribonukleinsäure-Probe und In-Kontakt-Bringen der Probe mit: (i) einem Satz an Ribonukleinsäure-spezifischen Primern, umfassend eine Promotorsequenz, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird; (ii) einem Enzym mit RNA-Polymerase-Aktivität; (iii) ausreichenden Mengen an rNTPs; wobei entweder die Primer von (i) oder die NTPs von (ii) markiert sind; und
(b) Halten des resultierenden Reaktionsgemisches unter den geeigneten Bedingungen für eine ausreichende Menge an Zeit, damit die enzymatischen Prozesse stattfinden können.

Anders als die Oligo-dT-Primer können die rRNA-Primer endmarkiert werden, wobei eine Markierung entweder an das 3'- oder das 5'-Ende des Oligonukleotids angeheftet wird; z.B. kann die T4-Polynukleotidkinase verwendet werden, um die Übertragung eines markierten Phosphatrestes von einem Nukleosid-Donor auf die 5'-Hydroxygruppe eines Polynukleotids, Oligonukleotids oder Nukleosids zu katalysieren. Alternativ können die rRNA-Primer in gleicher Weise mit einem photostabilen Fluoreszenzfarbstoff endmarkiert werden. Diese Primer werden die Synthese einer einzelsträngigen cDNA proportional zu der Konzentration der rRNA erlauben. Diese Primer sind gewöhnlich blockiert, um die cDNA gegenüber einem Abbau durch DNase I resistent zu machen.
Dementsprechend werden in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Verfahren bereitgestellt, in denen die amplifizierten Analyt-Ribonukleinsäuren endmarkiert sind.
Eine Alternative zu der Koamplifikation der rRNA mit der mRNA wird durch das sogenannte Stacking (Stapelung/Speicherung) bereitgestellt, wobei die nicht amplifizierte rRNA, die in der Probe vorliegt, nach der Amplifikation der mRNA direkt eingefangen und dann durch ein oder mehrere fluoreszente Oligonukleotide in der Lösung, die an die eingefangene rRNA in einem Auftragspunkt binden, nachgewiesen wird.
Mittel für den Nachweis angehefteter und/oder eingebauter Markierungen sind den Fachleuten wohlbekannt. Daher können zum Beispiel radioaktive Markierungen unter Verwendung eines photographischen Films oder eines Szintillationszählers nachgewiesen werden; Fluoreszenz-Markierungen können unter Verwendung eines Photodetektors nachgewiesen werden, der die emittierte Strahlung nachweist. Enzymatische Markierungen werden typischerweise durch die Bereitstellung eines Enzymsubstrats für das Enzym und den Nachweis des Reaktionsprodukts nachgewiesen, das durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat produziert wird; kolorimetrische Markierungen werden durch eine einfache Beobachtung der gefärbten Markierung nachgewiesen und chemische Markierungen zum Beispiel durch eine Platin-Gruppe, die Koordinationsbindungen mit dem Markierungsziel bildet und die Markierung fest an das Ziel koppelt.
In den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Primersequenzen vorher bestimmt, so dass sie einerseits mit der 18S- oder der 16S-rRNA oder einer funktionell äquivalenten rRNA und andererseits mit der 28S- oder der 23S-rRNA oder einer funktionell äquivalenten rRNA spezifisch hybridisieren, und es werden die Primersequenzen vorher bestimmt, um mit der mRNA spezifisch zu hybridisieren.
Dementsprechend werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Verfahren bereitgestellt, in denen der Satz an Ribonukleinsäurespezifischen Primern ribosomale und Boten-Ribonukleinsäure-spezifische Primer umfasst.
Die rRNA-Spiegel können auf einem Array nach der Amplifikation durch die reverse Transkriptase gemessen werden, wobei rRNA-spezifische Primer verwendet werden. Die hergestellten Kopien repräsentieren die ursprüngliche Ziel-RNA-Population, wie sie in dem Ausgangsmaterial vorliegt. Ein Nachteil liegt darin, dass bei Amplifikationsreaktionen mit der Gesamt-RNA, die große Menge an rRNA oft zu einem Verlust der exponentiellen Amplifikation der mRNA-Matrize führt, die in viel geringerer Menge vorliegt, was zum Verlust der quantitativen Information führt; d. h. die Resourcen wie z.B. die NTPs und die RNA-Polymerase werden von der Amplifikation der mRNA abgezogen.
Die Verminderung des Signals der rRNA (oder der daraus abgeleiteten cDNA) wird daher bevorzugt auf der Ebene der Transkription durchgeführt. In der vorliegenden Erfindung besitzen die rRNA-Primer eine Verlängerung, und zwar durch einen RNA-Polymerase-Promotor. Dies ist jedoch kein Wildtyp-Promotor; die Initiation an einem solchen Promotor würde zu einem überwältigend starken Signal führen und würde die Resourcen (NTPs, RNA-Polymerase) von der Amplifikation der mRNA abziehen. Daher sind die Promotoren, die in den rRNA-Primern verwendet werden, mutiert, wodurch die RNA-Polymerase weniger effizient initiiert.
Dementsprechend werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Verfahren bereitgestellt, in denen die ribosomalen Ribonukleinsäurespezifischen Primer eine mutierte Promotorsequenz umfassen; diese mutierte Promotorsequenz führt dazu, dass die RNA-Polymerase die Polymerisierungsreaktion weniger effizient initiiert.
Die Verwendung von mutierten Promotoren bewirkt, dass die RNA-Polymerase weniger effizient initiiert. Daher ist die in vitro-Transkription der rRNA-Species ineffizient, verglichen zu dem effizienteren Wildtyp-Promotor, der die mRNAs amplifiziert. Im Grunde ist für die Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung der Promotor, der die Amplifikation der mRNA antreibt, effizienter als derjenige, der die Amplifikation der rRNA antreibt. Promotoren mit verminderter Effizienz umfassen zum Beispiel punktmutierte Promotoren und Promotoren mit Nukleotid-Hinzufügungen oder -Deletionen. Diese Mutationen können in Regionen vorliegen, die die RNA-Polymerase direkt binden, oder in der Region, in der die Transkription initiiert wird. Mutierte Promotoren, die die Promotoreffizienz negativ beeinflussen/herunterregulieren, sind im Fachgebiet wohlbekannt.
Von bestimmten Promotormutationen, wie sie in der Tabelle 1 gezeigt werden, ist bekannt, dass sie die Transkription entweder durch die Verminderung der Bindung der T7-RNA-Polymerase oder durch die Freilegung der Promotorregion und die Bildung eines produktiven Verlängerungskomplexes vermindern (Milligan, JF, Goebe JR, Witherell GW, und Uhlenbeck OC, 1987, „Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA template", Nucl. Acids Res. 15: 8783–8798; McGinnes KE, Joyce GF, 2002; „Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promotor element", J. Biol. Chem. 277: 2987–2991). Die Sequenz, wie sie in der SEQ ID NO. 1 (Tabelle 1) gezeigt wird, ist die minimale DNA-Sequenz eines Wildtyp-T7-Promotors, wie sie typischerweise bei der Van Gelder/Eberwine-Amplifikation verwendet wird, wie sie im US-Patent Nr. 5,545,522 offenbart wird. Der unterstrichene G-Rest ist das Nukleotid +1, d. h. der Punkt, an dem die Transkription initiiert. Der A-Rest links davon ist der Rest –1, das T links davon ist die Position –2 und so weiter, indem man von dem Initiationspunkt ab rückwärts zählt. Wenn die Initiationsregion deletiert oder mutiert wird (SEQ ID NO. 2 in der Tabelle 1; entscheidende Reste, die verändert werden können, sind unterstrichen), kann dies oft die Initiation der Transkription in unterschiedlichen Ausmaßen vermindern, die von der bestimmten Mutation abhängig sind. Alternativ können Mutationen (z.B. einzelne Veränderungen an entscheidenden Resten) innerhalb der stromaufwärts liegenden Initiationsregion (unterstrichen in der SEQ ID NO: 3, Tabelle 1) die Transkription ebenfalls herunterregulieren. Des Weiteren tendieren Mutationen, die T- oder A-Reste in der TA-reichen Region zu G- oder C-Resten verändern, dazu, die Transkription herunter zu regulieren (unterstrichen in der SEQ ID NO. 4, Tabelle 1). Andere Positionen sind gegenüber einer Mutation relativ tolerant (z.B. unterstrichen in SEQ ID NO. 5, Tabelle 1, wie z.B. die GA-Reste an –10 und –11). Die SEQ ID NO. 6 (Tabelle 1) zeigt die Reste von –7 bis –9 unterstrichen; Mutationen in dieser Region regulieren die Transkription stark herunter. Wie im Fachgebiet verstanden wird, können ähnliche Mutagenese-Strategien an anderen Promotoren vorgenommen werden (z.B. T3 oder SP6), obwohl die bestimmten Mutationen, die erforderlich sind, um diese Aufgabe zu erfüllen, sich individuell unterscheiden können.
Alternativ können Primer, die sich schlecht anlagern (aber sehr spezifisch), verwendet werden, um jegliche Kompetition um die reverse Transkriptase zu kompensieren. Beispiele für geeignete Primer können einen gewissen Grad an Sekundärstruktur aufweisen (z.B. moderat stabile Stamm-Schleifen-Strukturen enthalten), oder sie können mit einer Region in der rRNA hybridisieren, die eine Sekundärstruktur aufweist.
Wie durch Fachleute erkannt wird, sind die geeigneten RNA-Polymerasen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, im Fachgebiet wohlbekannt, und umfassen als Beispiel und nicht als Einschränkung Bakteriophagen- und bakterielle T7-, T3-, SP6-RNA-Polymerasen sowie aus mehreren Untereinheiten bestehende Polymerasen aus Bakterien oder aus Eukaryonten. Geeignete Polymerasen umfassen aus Bakterien stammende DNA-abhängige-RNA-Polymerasen. Es sind auch thermostabile RNA-Polymerasen geeignet, die entweder aus natürlich vorkommenden Organismen stammen (z.B. thermophilen Bakterien wie z.B. die Thermus-RNA-Polymerase von Epicentre) oder solche, die aus weniger thermostabilen, mutierten Polymerasen ausgewählt werden (z.B. hitzestabile Mutanten der T7-RNA-Polymerase). Ebenso sind andere RNA-Polymerasen, die in der Lage sind, Amplifikationsreaktionen unter extremen Bedingungen durchzuführen, sowie geeignete RNA-Polymerasen aus Eukaryonten oder eukaryontischen Viren für eine Verwendung in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet.
Dementsprechend werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Verfahren bereitgestellt, in denen die RNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe, umfassend aus einer einzigen Untereinheit bestehende Phagen- RNA-Polymerasen, DNA-abhängige bakterielle RNA-Polymerasen, thermostabile RNA-Polymerasen, eukaryontische RNA-Polymerasen und virale RNA-Polymerasen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt, in denen die RNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe, umfassend die T7-, SP6- und T3-RNA-Polymerases.
Für eine verbesserte Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Verfahren wird ein automatisiertes System für die Bestimmung der Genexpressionsprofile in Betracht gezogen. Insbesondere impliziert die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Sondenarrays, das mit den multiplen RNA-Kopien abgefragt werden kann, die durch die Verfahren der Erfindung bereitgestellt werden. Der Begriff „Sondenarray" bezieht sich auf einen Träger, der ein Matrixmuster von positionell definierten spezifischen Erkennungsreagenzien aufweist.
In einem Arrayformat kann eine große Zahl an unterschiedlichen Hybridisierungsreaktionen im Wesentlichen „parallel" ablaufen. Dies stellt eine schnelle, im Wesentlichen simultane Bewertung einer Zahl an Hybridisierungen in einem einzigen „Experiment" bereit. Verfahren zur Durchführung von Hybridisierungsreaktionen mit auf einem Array basierenden Formaten sind den Fachleuten wohlbekannt.
Die multiplen RNA-Kopien, die durch das Verfahren der Erfindung bereitgestellt werden, sind in der Lage, mit ihren spezifischen Gegenstücken, d. h. mit den spezifischen Erkennungsreagenzien, auf dem Array zu interagieren, z.B. zu hybridisieren. Da die spezifischen Erkennungsreagenzien über ihre Position definiert sind, werden die Orte der Wechselwirkung die Spezifität jeder Wechselwirkung definieren. Bei den spezifischen Erkennungsreagenzien wird es sich typischerweise um Oligonukleotidsonden handeln, wobei in diesem Fall das Sondenarray als Oligonukleotid-Array bekannt ist.
Der Begriff „Nukleinsäure", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein Polymer aus Nukleotiden, z.B. Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden. Die Begriffe „Ribonukleinsäure" und „RNA", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten ein Polymer, das aus Ribonukleotiden zusammengesetzt ist. Die Begriffe „Desoxyribonukleinsäure" und „DNA", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten ein Polymer, das aus Desoxyribonukleotiden zusammengesetzt ist. Der Begriff „Oligonukleotid", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einzelsträngige Nukleotid-Multimere mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 100 Nukleotiden. Der Begriff „Polynukleotid", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer, das aus Nukleotid-Monomeren zusammengesetzt ist, mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 100 Nukleotiden, in der Regel mit einer Länge von mehr als 100 Nukleotiden bis zu einer Länge von etwa 1000 Nukleotiden.
Die Arrays der vorliegenden Erfindung können jede beliebige Größe aufweisen, d. h. von zwei Auftragspunkten bis hin zu 10⁶ Auftragspunkten oder sogar noch mehr. Die obere und die untere Grenze der Größe des Trägers werden ausschließlich durch praktische Überlegungen über das Arbeiten mit extrem kleinen oder großen Trägern bestimmt.
Bei einer bestimmten Trägergröße wird die obere Grenze nur durch die Fähigkeit begrenzt, die Auftragspunkte in dem Array zu erzeugen und nachzuweisen. Die bevorzugte Zahl an Auftragspunkten in einem Array hängt im Allgemeinen von der bestimmten Verwendung ab, für die das Array verwendet werden soll. Zum Beispiel kann ein Mutationsnachweis nur ein kleines Array erfordern. Im Allgemeinen enthalten Arrays von 2 bis hin zu etwa 10⁶ Auftragspunkte oder von etwa 4 bis etwa 10⁵ Auftragspunkte oder von etwa 8 bis etwa 10⁴ Auftragspunkte oder zwischen etwa 10 und etwa 2000 Auftragspunkte oder von etwa 20 bis etwa 200 Auftragspunkte.
Die Länge der immobilisierten Polynukleotide kann so gering wie vier sein oder soviel wie Hunderte oder sogar noch mehr Nukleotide betragen. Gemäß der Erfindung werden als Polynukleotide Nukleinsäuren in Betracht gezogen, die im Fachgebiet typischerweise als Oligonukleotide bezeichnet werden, und auch solche, die als Nukleinsäuren bezeichnet werden. Daher sind die Arrays der vorliegenden Erfindung bei Anwendungen nützlich, in denen die erzeugten RNA-Kopien mit Arrays von relativ kurzen immobilisierten Sonden hybridisiert werden (wie zum Beispiel solchen, die eine Länge von etwa 6, 8, 10, 20, 40, 60, 80 oder 100 Nukleotiden aufweisen).
Die Oligonukleotide, die auf den Mikroarrays verwendet werden, werden typischerweise unter Verwendung zuvor genetisch oder physikalisch kartierter Sequenzen hergestellt. So können zum Beispiel Sequenz-markierte Stellen ("sequence tagged sites", STS) verwendet werden, die zur „Markierung" oder zur Identifizierung bestimmter DNA-Segmente in dem Genom verwendet werden. Um eine STS-Bestimmung zuzuordnen, wird jedes clonierte DNA-Segment über einen Bereich von etwa 200 bis 500 Basenpaaren sequenziert. Mit diesen Sequenzdaten werden PCR-Primer entworfen und ausgetestet, um abzusichern, dass sie verwendet werden können, um diese bestimmte Sequenz durch PCR-Amplifikation zu identifizieren, zu „markieren" oder zu synthetisieren. Die Einreichung der Segment- und Primersequenzen und der PCR-Testansatz-Bedingungen bei öffentlichen Datenbanken erlaubt jedermann rasch und bequem praktisch jeden beliebigen genomischen Clon oder jedes beliebige genomische Fragment zu identifizieren. Vergleiche zum Beispiel mit Olson, Science 245: 1434–1435 (1989). Alternativ können exprimierte Sequenz-Marker ("expressed sequence tags", EST) verwendet werden, um die Arrays der Erfindung herzustellen.
Die vorliegende Erfindung impliziert die Verwendung eines kombinierten Sonden- oder Oligonukleotid-Arrays. Insbesondere besteht der Satz an immobilisierten Polynukleotiden auf den Arrays, die bei den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, aus Detektorsonden und Kontrollsonden für die Hybridisierung der amplifizierten RNA, welche aus der mRNA beziehungsweise der rRNA in der Probe stammt.
In einem besonders nützlichen Arrayformat wird jede Hybridisierung getrennt gehalten, d. h. die Auftragspunkte innerhalb des Arrays umfassen Oligonucleotide, die entweder zu der 18S-rRNA, der 28S-rRNA oder zu der mRNA komplementär sind, und es werden unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe für Proben unterschiedlichen Ursprungs (z.B. aus verschieden Geweben) reserviert, die getrennt amplifiziert werden und auf das gleiche Array gleichzeitig aufgetragen werden. Alternativ kann unter bestimmten Umständen in Betracht gezogen werden, dass Auftragspunkte innerhalb des Arrays unterschiedliche Oligonukleotid-Species umfassen, die zu der amplifizierten rRNA als auch zu der amplifizierten mRNA komplementär sind, und es werden unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe reserviert, um die 18S-rRNA von der 28S-rRNA und von der mRNA innerhalb eines einzigen Auftragspunkts zu unterscheiden.
Die Detektorsonden können bestimmten Mutationen entsprechen, die in einer bekannten Sequenz identifiziert werden sollen. Wenn zum Beispiel von einer bestimmten Nukleinsäure bekannt ist, dass sie eine nicht identifizierte Mutation an einer bestimmten Position enthält, kann die mutierte Position mit einem Array von acht Polynukleotiden identifiziert werden, wobei drei den drei möglichen Austauschen an dieser Position entsprechen, eines der Deletion der Base an dieser Position entspricht und vier einer Insertion der vier möglichen Basen an dieser Position entsprechen. Alternativ kann für ein bekanntes Gen, welches mehrere mögliche identifizierte Mutationen enthalten kann, das Array Polynukleotide umfassen, die den unterschiedlichen möglichen Mutationen entsprechen. Dies ist zum Beispiel bei Genen wie Onkogenen und Tumor-Suppressorgenen nützlich, die häufig eine Vielzahl von bekannten Mutationen an unterschiedlichen Positionen besitzen. Die Verwendung von Arrays erleichtert die Bestimmung, ob diese Gene Mutationen enthalten oder nicht, indem sie die simultane Durchmusterung mit RNA-Kopien der vorliegenden Erfindung erlaubt, die allen diesen unterschiedlichen Positionen entsprechen.
Dementsprechend stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Verfahren bereit, in denen die immobilisierten Detektorsonden in der Lage sind, mit den amplifizierten Boten-Ribonukleinsäuren zu hybridisieren.
Kontrollproben, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind zu Nukleinsäuren komplementär, die von der Proben-rRNA amplifiziert wurden. Die vorliegende Erfindung impliziert insbesondere die Verwendung von Kontrollprobensequenzen, die für eine Hybridisierung entweder mit der 16S- oder der 18S- oder einer funktionell äquivalenten rRNA oder entweder mit der 23S-, der 28S- oder einer äquivalenten RNA spezifisch sind.
Als solches stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, in denen der Satz von mindestens zwei Kontrollsonden zumindest eine erste und eine zweite Kontrollsonde umfasst. Insbesondere ist die erste Kontrollsonde zur amplifizierten 23S- oder 28S- oder einer funktionell äquivalenten Ribonukleinsäure komplementär, und die zweite Kontrollsonde ist zur amplifizierten 16S- oder 18S- oder einer funktionell äquivalenten Ribonukleinsäure komplementär.
Arrays, insbesondere Nukleinsäure-Arrays, können gemäß einer großen Vielzahl an Verfahren hergestellt werden, die den Fachleuten bekannt sind. So können zum Beispiel Arrays „geringer Dichte" einfach durch das Auftragen/Auftupfen (z.B. mit der Hand unter Verwendung einer Pipette) unterschiedlicher Nukleinsäuren an unterschiedlichen Positionen auf einen festen Träger (z.B. einer Glasoberfläche, einer Membran usw.) hergestellt werden. Dieser einfache Auftupf-Ansatz kann automatisiert werden, um mit hoher Dichte betupfte Arrays herzustellen (vergleiche z.B. mit dem US-Patent Nr. 5,807,522). Dieses Patent beschreibt die Verwendung eines automatisierten Systems, das eine Mikrokapillare gegen eine Oberfläche klopft, um ein kleines Volumen einer biologischen Probe abzulagern. Der Vorgang wird wiederholt, um Arrays hoher Dichte zu erzeugen. Mikroarrays der Erfindung können auch unter Verwendung der Oligonukleotid-Synthese-Technologie gemäß Verfahren, die den Fachleuten wohlbekannt sind, hergestellt werden. Zum Beispiel lehren Fodor et al., Science 767–773 (1991) und das US-Patent Nr. 5,143,854 die Verwendung einer durch Licht gesteuerten kombinatorischen Synthese von Oligonukleotid-Arrays mit hoher Dichte.
Die Polynukleotide können auf dem Träger unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren immobilisiert werden. Zum Beispiel können die Polynukleotide adsorbiert oder auf andere Weise nicht kovalent mit dem Träger verbunden werden (zum Beispiel Immobilisierung auf Nylon- oder Nitrocellulose-Filter unter Verwendung von Standardverfahren); sie können kovalent an den Träger angeheftet werden, oder ihre Assoziation kann durch spezifische bindende Paare vermittelt werden, wie z.B. durch Biotin und Streptavidin.
Eine Reihe an Materialien, die für eine Verwendung als Träger in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind im Fachgebiet beschrieben worden. Besonders geeignete Materialien für eine Verwendung als Träger in der vorliegenden Erfindung umfassen jede beliebige Art eines festen Trägers, die im Fachgebiet bekannt ist. Diese festen Träger können poröse feste Träger sein, die im Fachgebiet bekannt sind.
Der Träger kann in der Form von Kügelchen, Partikeln, Platten, Filmen oder Membranen vorliegen und kann durchlässig sein. Zum Beispiel kann der Träger aus Kügelchen oder Partikeln bestehen (wie z.B. die üblichen Festphase-Synthese-Träger), sowie aus Fasern (wie z.B. Glaswolle oder andere Glas- oder Plastikfasern), aus Glas- oder Plastik-Kapillarröhrchen oder aus Metalloxid-Membranen. Die Träger können eben sein oder eine einfache oder komplexe Gestalt aufweisen. Im Falle von porösen Trägern kann die Oberfläche, an die die Moleküle angeheftet werden, eine externe Oberfläche oder eine interne Oberfläche sein. Insbesondere dann, wenn die Oberfläche porös ist, wird das Molekül wahrscheinlich an die innere Oberfläche angeheftet werden. Wenn die feste Oberfläche porös ist, können in Abhängigkeit von der Natur des Systems verschiedene Porengrößen verwendet werden.
Es sind eine Reihe von Materialien für die Verwendung als Träger in der vorliegenden Erfindung im Fachgebiet beschrieben worden. Beispielhafte, geeignete Materialien umfassen zum Beispiel Acryl-, Styrol-methyl-methacrylat-Kopolymere, Ethylen/Acrylsäure, Acrylnitril-butadienstyrol (ABS), ABS/Polycarbonat, ABS/Polysulfon, ABS/Polyvinylchlorid, Ethylenpropylen, Ethylenvinylacetat (EVA), Nitrocellulose, Nylon (einschließlich Nylon 6, Nylon 6/6, Nylon 6/6-6, Nylon 6/9, Nylon 6/10, Nylon 6/12, Nylon 11 und Nylon 12), Polyacrylnitril (PAN), Polyacrylat, Polycarbonat, Polybutylen-terephthalat (PBT), Polyethylen-terephthalat (PET), Polyethylen (einschließlich niedrige Dichte, linear niedrige Dichte, hohe Dichte, kreuzvernetztes und ultrahohe Molekulargewichtsgrade), Polypropylen-Homopolymer, Polypropylen-Kopolymere, Polystyrol (einschließlich Qualitätsgrade für allgemeine Zwecke und hohen Aufprall), Polytetrafluorethylen (PTFE), fluoriertes Ethylen-Propylen (FEP), Ethylen-tetrafluorethylen (ETFE), Perfluoralkoxyethylen (PFA), Polyvinylfluorid (PVF), Polyvinylidenfluorid (PVDF), Polychlortrifluorethylen (PCTFE), Polyethylen-chlortrifluor-ethylen (ECTFE), Polyvinylalkohol (PVA), Silikonstyrolacrylnitril (SAN), Styrol-maleinsäureanhydrid (SMA) und Glas.
Ein anderes Beispiel für geeignete Materialien für die Verwendung als Träger in den Arrays der vorliegenden Erfindung sind Metalloxide. Metalloxide stellen einen Träger bereit, der sowohl eine hohe Kanaldichte als auch eine hohe Porosität aufweist, was Arrays mit hoher Dichte ermöglicht, die unterschiedliche spezifische Erkennungsreagenzien pro Einheit auf der Oberfläche für das Auftragen der Probe enthalten. Darüber hinaus sind Metalloxide für sichtbares Licht hoch transparent. Metalloxide sind relativ billige Träger, die nicht die Verwendung irgendeiner der typischen Mikrofabrikationstechnologien erfordern und die eine verbesserte Kontrolle über die Verteilung der Flüssigkeit über die Oberfläche des Trägers ermöglichen, wie z.B. elektrochemisch hergestellte Metalloxidmembranen. Metalloxidmembranen, die durchgehende, orientierte Kanäle besitzen, können durch die elektrochemische Ätzung einer Metallplatte hergestellt werden. In Betracht kommende Metalloxide sind unter anderem Oxide von Tantal, Titan und Aluminium sowie Legierungen aus zwei oder mehreren Metalloxiden und dotierte Metalloxide und Legierungen, die Metalloxide enthalten. Die Metalloxidmembranen sind transparent, insbesondere wenn sie feucht sind, was die Verwendung verschiedener optischer Verfahren bei den Tests erlaubt. Solche Membranen besitzen orientierte, durchgehende Kanäle mit genau kontrolliertem Durchmesser und nützlichen chemischen Oberflächeneigenschaften. Das Europäische Patent EP-B1-0 975 427 kann in dieser Hinsicht als Beispiel dienen.
In den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Anwesenheit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz in einer Sammlung von markierten, amplifizierten Nukleinsäuresequenzen durch die Hybridisierung der amplifizierten Nukleinsäuresequenzen mit einem Oligonukleotid-Array bestimmt. Es werden die Intensität des Hybridisierungssignals und das Verhältnis der Intensitäten bestimmt, die durch die Hybridisierungsereignisse zwischen der ersten Kontrollsonde/amplifizierter 18S-rRNA und der zweiten Kontrollsonde/amplifizierter 28S-rRNA erzeugt werden. Diese Amplikon-Verhältnis-Analyse für die amplifizierte und hybridisierte 28S- und 18S-rRNA bestätigt die RNA-Integrität.
Dementsprechend stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Verfahren bereit, in denen das Verhältnis der Signale, das bestimmt wird, das Verhältnis der Signale, die durch die Komplexe erzeugt werden, die eine erste Kontrollsonde umfassen, zu den Signalen darstellt, die durch die Komplexe erzeugt werden, die eine zweite Kontrollsonde umfassen.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erlauben die Analyse von zwei oder mehr Proben auf einem einzelnen Array; jede Probe ist dabei unterschiedlich markiert. Im Falle von zwei Proben kann eine erste Probe amplifiziert werden (mRNA plus rRNA), wobei ein Farbstoff eingebaut wird, und in einem komplett getrennten Reaktionsgefäß kann eine zweite Probe (wieder sowohl mRNA als auch beide rRNAs) amplifiziert werden, die dieses Mal mit einem zweiten Farbstoff markiert wird. Zum Beispiel sind Cy3 und Cy5 geeignete Markierungen, obwohl es keinen Grund gibt, dies auf 2 Farbstoffe und 2 Proben einzuschränken. Nach der Amplifikation werden die beiden Proben gemischt und auf das Array aufgetragen, dann soll das Array bei unterschiedlichen Wellenlängen durchmustert werden, die für jeden Farbstoff spezifisch sind, so dass die Fraktion in jeder Probe, die an einen beliebigen vorgegebenen Oligonukleotid-Auftragspunkt bindet (z.B. einen 18S-rRNA-Auftragspunkt, einen mRNA-Auftragspunkt oder einen 28S-rRNA-Auftragspunkt), quantifiziert werden kann.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, die Verwendung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Beschreibung bereitzustellen, wie es hierin für die Mikroarray-Analyse einer Ribonukleinsäureprobe beschrieben wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Verwendung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, wie es hierin beschrieben wird, bereitgestellt für die gleichzeitige Beurteilung der Probenintegrität und der Analyse.
In einer noch weiteren Ausführungsform wird die Verwendung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, wie es hierin beschrieben wird, bereitgestellt für die Beurteilung der Qualität einer Probe von Ribonukleinsäuren.
In einer noch weiteren Ausführungsform wird die Verwendung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, wie es hierin beschrieben wird, bereitgestellt für eine Analyse der Genexpression.
Bei der Analyse der Mikroarray-Hybridisierungsergebnisse wäre die Abwesenheit der rRNA-Marker offensichtlich ein Anzeichen für einen Abbau, aber sie können immer noch vorhanden sein, obwohl ein Abbau der Nukleinsäuren in der Probe stattgefunden hat. Ein solcher Abbau kann jedoch bis zu einem unzureichendem Grad erfolgen, um sicher zu stellen, dass die vollständige Marker-rRNA ebenfalls abgebaut wurde. Im Falle einer Agarosegel-Analyse kann ein begrenzter Abbau zu ausgefransten Enden oder vermutlich zu anderen Fragmenten führen, sowie bis hin zur vollständigen Zerstörung. 1 zeigt Proben mit unterschiedlicher Integrität: (1) die Probe A ist stark degradiert und auf einem Gel oder bei der Analyse mit einem Bioanalysegerät ist die 18S-rRNA-Bande typischerweise kaum nachweisbar und die 28S-rRNA ist vollständig degradiert; die mRNA ist fast vollständig degradiert, gewöhnlich liegt keine deutlich auflösbare Bande im Gel oder in dem Bioanalysegerät vor, obwohl verkürzte Fragmente beider rRNAs vorhanden sein können, aber diese sind schwer nachzuweisen, da sie wahrscheinlich heterogene Größen aufweisen; (2) die Probe B ist gut aber nicht perfekt, sowohl die 18S- als auch die 28S-Bande sind vorhanden, aber es gibt einen begrenzten Abbau der rRNA und einige mRNAs sind teilweise degradiert, ein Teil der degradierten rRNA ist vollständig verloren gegangen und ein anderer Teil liegt in Form von Fragmenten vor; (3) die Probe C ist perfekt, das Verhältnis zwischen 18S und 28S ist ideal (1:2) und es gibt absolut keinen Abbau der mRNA.
Der Aspekt, dass ein Abbau in einem unzureichenden Ausmaß erfolgen kann, um sicher zu stellen, dass die gesamte Marker-rRNA ebenfalls degradiert wurde, ist natürlich lebenswichtig im Falle einer klinischen Diagnose, da dies zu einem falsch negativen Bericht über die Anwesenheit eines bestimmten Analyten in der Probe führen könnte.
Eine Beurteilung gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung über die Unterschiede in der Qualität zwischen guten und perfekten Gesamt-RNA-Proben ist in der 2 dargestellt. 2 zeigt eine Mikroarray-Analyse von 3 Proben, wobei jede Probe getrennt mit rRNA- und mit Oligo-dT-(für die mRNA) Primern amplifiziert wurde, die einen einzigen Fluoreszenzfarbstoff eingebaut haben, und die auf drei verschiedene, aber identische Arrays aufgetragen wurden. Alternativ können die Proben mit 3 unterschiedlichen und voneinander unterscheidbaren Farbstoffen markiert werden, dann gemischt und auf das gleiche Array aufgetragen werden, woraufhin dann die Bindung an einer für jeden Farbstoff einzigartigen Wellenlänge beurteilt wird. In der Darstellung der 2 besitzt jedes Array 6 Auftragspunkte, die mit Oligonukleotiden der folgenden Eigenschaften aufgedruckt wurden: Auftragspunkt 1, ein mRNA-spezifisches Oligonukleotid, das mit der aRNA einer extrem stabilen mRNA hybridisiert, die sogar eine schlechte Behandlung der Probe überlebt; Auftragspunkt 2, ein mRNA-spezifisches Oligo, das mit einer aRNA einer äußerst instabilen mRNA hybridisiert, die gegenüber einem Abbau in diesem Gewebetyp sehr empfindlich ist; Auftragspunkt 3, ein Oligo, das mit der amplifizierten 18S-rRNA hybridisiert und das für die Volllängen-18S-rRNA bei weitem spezifischer ist als für die teilweise degradierte Form; Auftragspunkt 4, ein Oligo, das mit der amplifizierten 18S-rRNA hybridisiert und das die Volllängen- und auch die teilweise degradierte rRNA bindet (d. h. es bindet an einen relativ stabilen Teil der rRNA); Auftragspunkt 5, ein Oligonukleotid, das die amplifizierte 28S-rRNA bindet und das dazu tendiert, die Volllängenform besser zu binden als die teilweise degradierte rRNA; Auftragspunkt 6, ein Oligonukleotid, das die amplifizierte 28S-rRNA bindet und das mit der Volllängenform oder mit der teilweise degradierten 28S-rRNA hybridisiert.
Obwohl die Probe A stark degradiert ist, erlauben die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis der stabileren mRNA und der degradierten rRNAs, was eine Quantifizierung erlaubt, wie schlecht die Probe A ist. Bei weitaus besseren Proben als den Proben B und C erlauben die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Nachweis stabiler und instabiler mRNAs und der Volllängen- sowie der Volllängen- plus der degradierten rRNAs. Aus einem Vergleich des Signalverhältnisses zwischen den 28S- und den 18S-spezifischen Oligonukleotiden wird deutlich, dass C eine intaktere Probe als B darstellt. Daher erlaubt ein Vergleich der Signalstärken der Hybridisierung zwischen den Oligonukleotiden 3 und 4 (für die 18S-rRNA) und 5 und 6 (für die 28S-rRNA) die Quantifizierung der teilweise degradierten rRNA.
Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung stellen eine weitere Feineinstellung in Bezug auf die ursprüngliche Probenqualität bereit.
Im Allgemeinen ist es schwierig, teilweise degradierte rRNA mittels eines Bioanalysegeräts oder eines Gels aufzulösen und zu quantifizieren. Ein begrenzter Abbau führt zu einem Verschmieren oder zu einer Schulter, da eine kleine Zahl an Nukleotiden von einem oder von beiden Enden entfernt werden; aber sogar nicht degradierte rRNA ist schwierig aufzulösen. Eine noch stärkerer Abbau führt zu (oft heterogenen) Fragmenten, die sich mit der mRNA vermischen, die ebenfalls eine breites Spektrum an Längen aufweist und dazu tendiert, einen Schmier zu bilden.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung erlauben jedoch durch einen geeigneten Entwurf der Oligonukleotidsonden (z.B. Oligonukleotide auf dem Mikroarray gegen die äußeren 5'- und 3'-Enden jeder rRNA und Oligonukleotide, die mit stabilen und instabilen internen Regionen hybridisieren), ein auf einem Array basierendes QC-Verfahren ("QC method" für "wuality control method" Qualitätskontrollverfahren durchzuführen, das verglichen mit den anderen im Fachgebiet bekannten Verfahren weitaus empfindlicher ist.
Des Weiteren sehen die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung unterschiedliche Arten einer falschen Probenbehandlung voraus, die diagnostiziert werden soll; so sind zum Beispiel die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung empfindlich gegenüber der Entfernung von z.B. 30 Nukleotiden von einem Ende einer rRNA. Dies erlaubt die Unterscheidung zwischen guten und perfekten Proben, in denen eine kleine Zahl an Nukleotiden durch eine begrenzte RNAse-Aktivität entfernt wurde. Des Weiteren können unterschiedliche Probleme der Probenbehandlung wie z.B. eine ungeeignete Probenaufbewahrung, eine Verzögerung vor der Aufbewahrung oder ein schlechtes RNA-Extraktionsverfahren zu unterschiedlichen Arten von Fingerabdrücken des rRNA-Abbaus führen. Daher kann eine „Fingerabdruck"-QC entwickelt werden, die dabei hilft, die Gründe dafür zu erkennen, weshalb eine Probe degradiert wurde.
In Abhängigkeit von der Position der immobilisierten Kontrollsonde und des Primers, der rRNA-spezifische und RNA-Polymerase-Promotor-Sequenzen enthält, erlauben die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Identifizierung/Bestimmung von Oligoribonukleotid-Verlusten von den 3'- und/oder den 5'-Enden fast intakter rRNAs.
Man wird verstehen, dass die Mikroarrays, die bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, integrierte Mikroarrays und Teil von Vorrichtungen für die Analyse von Proben-Nukleinsäuren sein können.
Die Handhabung von Mikroarrays wird mittels einer Vorrichtung für die Aufnahme von Mikroarrays, wie sie zum Beispiel in WO 02/072268 beschrieben wird, stark verbessert.
Eine simultane Analyse zahlreicher Proben mit hohem Durchsatz kann durch ein System verwirklicht werden, wie es zum Beispiel in WO 03/089136 beschrieben wird, wo ein System für die Durchführung von Biotestansätzen offenbart wird, das eine Trägerplatte mit einer Zahl an Vertiefungen umfasst, sowie eine Inkubationsvorrichtung zum Aufnehmen der Platte. Diese bekannte analytische Testvorrichtung besteht aus einem Plastikträger, in dem Öffnungen in dem Plastikträger Vertiefungen mit einem bestimmten Durchmesser definieren, wobei diese Vertiefungen an der oberen Seite für die Proben- oder die Sondenzugabe offen sind und einen Träger besitzen, der den Boden jeder Vertiefung definiert. Dieser Träger kann ein Mikroarray sein, wie es in der vorliegenden Beschreibung beschrieben wird.
Ein System, wie es vorstehend beschrieben wurde, erlaubt die parallele Bearbeitung einer großen Anzahl genomischer Nukleinsäureproben und kann in automatisierten Roboter-Plattformen angewendet werden. Ein solches System umfasst gewöhnlich eine Mikroplatte mit einem Array von Vertiefungen, die in Reihen und Säulen angeordnet sind, wobei der Boden jeder Vertiefung eine Matrix darstellt, die ein Durchfluss-Fasernetzwerk besitzt. Die Verwendung von zum Beispiel einer Mikroplatte mit einem Array von 96 Vertiefungen erlaubt die parallele Bearbeitung einer großen Zahl an Hybridisierungen, was zu einer sehr effizienten Analyse mit hohem Durchsatz führt. Man wird wohl verstehen, dass die Daten, die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, durch automatisierte oder integrierte Software-Programmpakete weiter bearbeitet werden können, die (automatisch) die rRNA-Daten für eine weitere Verwendung bei der Interpretation von mRNA-Expressionsmustern interpretieren.
Die Analyse von Mikroarrays, wie sie in den Verfahren und Systemen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kann durch ein Abtast-System durchgeführt werden, das unter der Steuerung eines in geeigneter Weise programmierten digitalen Computers operieren kann, wobei es sich um den gleichen Computer handeln kann wie der Computer, der bei der Analyse verwendet wurde, oder auch nicht. Der Scanner umfasst typischerweise eine Nachweisvorrichtung wie z.B. ein konfokales Mikroskop oder eine CCD (Ladungs-gekoppelte Vorrichtung), die verwendet wird, um die Orte auf dem Array nachzuweisen, an denen markierte Analyt-Nukleinsäuren an den Träger gebunden haben. Die Ausgabe des Scanners ist (sind) eine Bilddatei(en), die im Falle einer Markierung mit Fluorescein die Fluoreszenzintensität als Funktion der Position auf dem Träger anzeigt.
Die Bilddatei(en) wird (werden) als Eingabe einem Analysesystem bereitgestellt, das die Visualisierungs- und die Analyseverfahren der vorliegenden Erfindung enthält. Bei dem Analysesystem kann es sich um irgendeines aus einem breiten Spektrum von Computersystemen handeln.
Dementsprechend ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Computerprogramm-Produkts, das auf einem Computerlesbaren Medium gespeichert ist, das das Expressionsniveau einer Nukleinsäureprobe identifiziert, umfassend:

(a) einen Computer-Code, der eine Vielzahl von Signalen empfängt, die Analyt-Ribonukleinsäure-Intensitäten für eine Vielzahl an Analyt-Ribonukleinsäuren entsprechen, wobei jede Analyt-Ribonukleinsäure-Intensität einen Grad an Hybridisierung einer Analyt-Ribonukleinsäure mit einer immobilisierten Detektorsonde anzeigt;
(b) einen Computer-Code, der mindestens zwei Signale empfängt, die Analyt-Ribonukleinsäure-Intensitäten für die 16S oder ihrem funktionellen Äquivalent, die 18S oder ihrem funktionellen Äquivalent und beziehungsweise für die 23S oder ihrem funktionellen Äquivalent oder die 28S oder ihrem funktionellen Äquivalent von Analyt-Ribonukleinsäuren entsprechen, wobei jede Analyt-Ribonukleinsäure-Intensität einen Grad an Hybridisierung einer 16S oder ihrem funktionellen Äquivalent oder einer 18S oder ihrem funktionellen Äquivalent/Ribonukleinsäure und einen Grad an Hybridisierung einer 23S oder ihrem funktionellen Äquivalent oder einer 28S oder ihrem funktionellen Äquivalent Analyt-Ribonukleinsäuren mit einer komplementären immobilisierten Kontrollsonde anzeigt;
(c) einen Computer-Code, der einen Vergleich durchführt und das Verhältnis der mindestens zwei Signale aus Schritt (b) berechnet; und
(d) einen Computer-Code, der eine Berichtigung der Vielzahl an Analyt-Ribonukleinsäure-Intensitäten von Schritt (a) gemäß dem in Schritt (c) bestimmten Verhältnis durchführt.

Wie im Fachgebiet wohlbekannt ist, wird das Verhältnis der Signalintensitäten, die durch die Hybridisierungen zwischen der rRNA und den entsprechenden immobilisierten Kontrollsonden kommen, typischerweise als die Intensität der Hybridisierung der 28S-RNA mit ihrer entsprechenden Kontrollsonde zu der Intensität der Hybridisierung der 18S-RNA mit ihrer entsprechenden Kontrollsonde berechnet; d. h. das 28S:18S-Intensitätsverhältnis.
Die immobilisierten Detektor- und Kontrollsonden, wie sie in dem vorstehenden Computerprogramm erwähnt wurden, werden üblicherweise in einem Arrayformat angeordnet, wobei die Detektor- und Kontrollsonden an räumlich unterscheidbaren Adressen innerhalb des Arrays immobilisiert sind. In der Regel umfasst jede^® räumlich unterscheidbare Adresse oder Auftragspunkt innerhalb eines Arrays eine Oligonukleotid-Species, die entweder zur einer Analyt-mRNA, zur 18S-rRNA oder zur 28S-rRNA komplementär ist.
Die Intensitäten, die durch die Computer-Codes in den Computerprogramm-Produkten gemäß der vorliegenden Erfindung empfangen werden, sind üblicherweise Fluoreszenzintensitäten.
Geeignete Computer können eine in geeigneter Weise programmierte Sun Workstation oder ein Personalcomputer oder eine Workstation wie z.B. ein IBM-PC-Äquivalent sein, einschließlich des passenden Speichers und einer CPU. Das Computersystem kann Eingabeinformationen enthalten, die Charakteristika der Gene von Interesse betreffen, sowie andere Eingabeinformationen, die die gewünschten Eigenschaften des Arrays betreffen. Wahlweise kann das Computersystem Informationen über eine spezifische genetische Sequenz von Interesse von einer externen oder einer internen Datenbank wie z.B. von GenBank erhalten.
Die Ausgabeinformation des Computersystems ist ein Satz von Chipdesign-Computerdateien zum Beispiel in Form einer Schalt-Matrix.
Dementsprechend kann ein Computer-lesbares Medium, das mit einem Prozessor für die Speicherung eines Computerprogramms verbunden ist, umfassen:

(i) einen Computer-Code, der eine Vielzahl von Signalen empfängt, die Analyt-Ribonukleinsäure-Intensitäten für eine Vielzahl an Analyt-Ribonukleinsäuren entsprechen, wobei jede Analyt-Ribonukleinsäure-Intensität einen Grad an Hybridisierung einer Analyt-Ribonukleinsäure mit einer immobilisierten Detektorsonde anzeigt;
(ii) einen Computer-Code, der mindestens zwei Signale empfängt, die Analyt-Ribonukleinsäure-Intensitäten für die 18S- und die 28S-Analyt-Ribonukleinsäuren entsprechen, wobei jede Analyt-Ribonukleinsäure-Intensität einen Grad an Hybridisierung einer 18S- oder einer 28S-Analyt-Ribonukleinsäure mit einer komplementären, immobilisierten Kontrollsonde anzeigt;
(iii) einen Computer-Code, der einen Vergleich durchführt und das Verhältnis der mindestens zwei Signale aus Schritt (b) berechnet; und
(iv) einen Computer-Code, der eine Berichtigung der Vielzahl an Analyt-Ribonukleinsäure-Intensitäten von Schritt (a) gemäß dem in Schritt (c) bestimmten Verhältnis durchführt.

Das Vorstehende wird bereitgestellt, um die Erfindung zu erläutern, aber nicht um ihren Rahmen zu einzuschränken. Den Fachleuten werden ohne weiteres andere Varianten der Erfindung offensichtlich sein, und diese sind durch die angehängten Ansprüche mit eingeschlossen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine schematische Darstellung einer Agarosegel-Analyse der Proben A bis C, die unterschiedliche Integritäten aufweisen, welche von stark degradiert (Probe A) bis hin zu perfekt intakt (Probe C) reichen. Aus Gründen der Verdeutlichung wird die mRNA-Verschmierung in jeder Probe als ähnlich gezeigt; in der Realität besäße sie eine kleinere durchschnittliche Länge bei den stärker degradierten Proben. Der Pfeil gibt die Probenqualität an.
2 ist eine schematische Darstellung einer Mikroarray-Analyse, die das Ergebnis einer Hybridisierung der amplifizierten RNA (sowohl mRNA als auch rRNA) aus den Proben A bis C zeigt. Die Probe A ist sehr stark degradiert; die Probe B besitzt eine gute Integrität und die Probe C ist von perfekter Integrität. Je heller der Auftragspunkt, desto stärker ist das Signal (vergleiche auch mit der Beschreibung).
Bevor der Gegenstand der Erfindung weiter beschrieben wird, sollte verstanden werden, dass die Erfindung nicht auf die besonderen Ausführungsformen der Erfindung beschränkt ist, die hierin beschrieben werden, da Variationen der bestimmten Ausführungsformen vorgenommen werden können und immer noch in den Rahmen der angehängten Ansprüche fallen. Es sollte auch verstanden werden, dass die verwendete Terminologie dem Zwecke der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht einschränkend wirken soll. Stattdessen wird der Rahmen der vorliegenden Erfindung durch die angehängten Ansprüche errichtet.
Die folgenden Beispiele werden als Erläuterungen und nicht als Einschränkungen angeboten.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele der Erfindung sind beispielhaft und sollten in keiner Weise als einschränkend angesehen werden.
Beispiel 1: rRNA-Qualitäts-Beurteilung und Erstellung eines mRNA-Transkript-Profils auf dem gleichen Array
Im folgenden Beispiel wird die Beziehung zwischen der rRNA-Qualität auf einem Bioanalysegerät oder in einem Gel und durch ein Mikroarray untersucht; dies erfolgt simultan mit der Erstellung eines mRNA-Transkriptprofils auf dem gleichen Array.
Im folgenden Beispiel wird das relative Gleichgewicht der Amplifikation der mRNA und der rRNAs bestimmt, so dass beide Arten von amplifizierter RNA Hybridisierungssignale mit einer geeigneten Intensität ergeben.
Im folgenden Beispiel wird die Konstruktion des Oligos sowohl für die rRNA-Amplifikation als auch für die Sonden-Konstruktionen, die auf das Array aufgedruckt werden, optimiert.
1.1. Probenherstellung und Beurteilung der rRNA-Integrität
Mindestens 10 μg umfassende Proben der Gesamt-RNA werden aus einer Reihe von menschlichen Tumoren ähnlichem Stadiums und ähnlicher Größe aus dem gleichen Gewebe gereinigt, wobei aber die Zeit variiert wird, bis sie in einem stabilen Aufbewahrungsmedium aufgenommen werden. Die Qualität dieser RNA in Begriffen der mRNA- und rRNA-Integrität ist hoch variabel und ist hauptsächlich von der Zeit abhängig, die der Chirurg benötigt, um die Probe nach dem Ausschneiden in ein stabiles Aufbewahrungsmedium zu überführen, ist aber auch von anderen Faktoren abhängig. Die Gesamt-RNA wird gereinigt, und die Integrität der 28S- und der 18S-RNA wird mittels des Agilent-Bioanalysators beurteilt. Es werden Proben ausgewählt, die von perfekt (wie durch ein 2:1-Verhältnis der 28S- zu der 18S-RNA beurteilt wird) bis hin zu stark degradiert (Verlust von rRNA-Banden) variieren, und diese Proben werden bei den anschließenden Experimenten verwendet.
1.2. Ko-Amplifikation der mRNA und der rRNA
Es werden verschiedene Amplifikations- und Nachweisverfahren verwendet, um die mRNA und die rRNA zu amplifizieren oder zu markieren, um den parallelen Nachweis mittels eines Mikroarrays zu erleichtern.
1.2.1. Modifiziertes Eberwine-Verfahren
Die Gesamt-RNA-Proben, die aus Tumoren zusammen mit einer Probe Universal-RNA (Stratagene) erhalten wurden, werden durch das Van Gelder/Eberwine-Verfahren ( US 5,545,522 ) (unter Verwendung des Message Amp Kit von Ambion und der Zugabe von rRNA-spezifischen Primern) amplifiziert. In jedem Fall werden 5 μg einer Gesamt-RNA-Probe für die reverse Transkriptase mit einem Standard-oligo-dT-Primer geprimt, der einen T7-RNA-Polymerase-Promotor an die polyadenylierte mRNA anfügt (vergleiche mit dem Protokoll des Message Amp Kit). Zusätzlich werden ein Primer, der zu der 28S-rRNA komplementär ist, und ein anderer Primer, der zu der 18S-rRNA komplementär ist, hinzugefügt, um die Amplifikation dieser rRNAs neben der mRNA zu ermöglichen. Diese beiden Sequenz-spezifischen Primer besitzen einen modifizierten T7-Promotor, um die Amplifikation der in großen Mengen vorhandenen rRNA-Moleküle zu begrenzen, so dass der Grad der rRNA-Amplifikation angemessen ist, wenn man ihn mit dem der mRNA-Amplifikation vergleicht. Es werden unterschiedliche Kombinationen an Primern verwendet (wobei die Mutation in dem T7-Promotor variiert wird und wobei unterschiedliche Regionen sowohl in dem 18S- als auch in dem 28S-Primer verwendet werden, die so entworfen wurden, dass sie mit der rRNA hybridisieren), um ein geeignetes Gleichgewicht bei der Amplifikation zwischen den 18S- und 28S-rRNA-Primern und dem Oligo-dT-mRNA-Primer sicherzustellen. Die Ausbeute und die Qualität der amplifizierten rRNA werden spektrophotometrisch und mittels des Agilent-Bioanalysegeräts untersucht.
Primersequenzen, die für die rRNA-Amplifikation verwendet werden, werden in der Tabelle 2 gezeigt. Sequenzen, die zu der rRNA komplementär sind, sind unterstrichen. Die zusätzliche Sequenz, die erforderlich ist, um den T7-Promotor anzufügen, ist fettgedruckt. Man wird bemerken, dass im Falle der 18S-Primer der Primer 18T7 einen zusätzlichen G-Rest gegenüber dem Primer 18T7-G und zwei zusätzliche G-Reste gegenüber dem Primer 18T7-GG enthält. Diese Deletionen in 18T7-G und 18T7-GG sind eine Art einer Mutation, von der bekannt ist, dass sie die Transkription von diesem Promotor vermindert.
1.2.2. Andere Markierungsverfahren
Ähnlich wie in dem Vorstehenden werden andere Markierungs- und Amplifikationsverfahren durchgeführt.

(a) „Tyras", ein lineares T7-Amplifikationsverfahren, bei dem die Transkription direkt von einer einzelsträngigen RNA-Matrize statt über eine cDNA-Zwischenstufe erfolgt. Dieses Verfahren verwendet ebenfalls die gleichen grundlegenden Primerentwürfe wie das Eberwine-Verfahren, wobei die Primer aber gemäß des TYRAS-Protokolls (vergleiche mit Van Gemen, B., europäisches Patent 056 884 B1 und US 6,338,954 B1 ) am 3'-Ende blockiert sind. Die „Tyras"-Amplifikation wird sowohl für die mRNA als auch für die rRNA durchgeführt.
(b) Die Amplifikation der mRNA, wie sie durch Van Gelder/Eberwine in US 5,545,522 offenbart wurde, und der Nachweis der rRNA durch Hybridisierung unter Verwendung Fluoreszenz-endmarkierter Oligos (z.B. Cy-Farbstoffe) ohne Amplifikation. In diesem Fall besitzt der Oligo-dT-Primer, der zur Amplifikation der mRNA verwendet wird, immer noch den T7-Promotor, aber die rRNA-Primer besitzen keinen. Dies erfolgt entweder durch: i. die Verlängerung eines rRNA-spezifischen Primers durch die reverse Transkriptase während der cDNA-Synthese, gefolgt von der Hybridisierung dieser cDNA mit einem Sonden-Oligo auf dem Array; oder durch ii. eine direkte Hybridisierung der nicht amplifizierten rRNA mit dem Array, diese rRNA wird dann durch die Hybridisierung eines weiteren komplementären endmarkierten Oligos nachgewiesen. Letztlich ist dies ein 2-Schritt- Nachweisverfahren mit einer begrenzten Empfindlichkeit, aber es kann aufgrund der Menge an restlicher rRNA funktionieren, die in der amplifizierten mRNA-Probe verbleibt.

1.3. Mikroarray-Design
Ein Träger mit 144 Auftragspunkten (eine poröse Array-Oberfläche) wird mit Oligos unter Verwendung eines Packard-Tintenstrahldruckers betupft. Die aufgetragenen Oligos haben eine Länge zwischen 50 und 65 Nukleotiden und wurden gegen üblicherweise exprimierte menschliche Gene (z.B. beta-Aktin) unter Verwendung einer Array-Designer-Software entworfen. Die Oligos werden so entworfen, dass sie mit der amplifizierten 18S- und der 28S-rRNA sowie mit den üblicherweise verwendeten Spikes hybridisieren (Spikes sind Oligos, die so entworfen wurden, dass sie mit amplifizierten Transkripten von Genen hybridisieren, die in der menschlichen RNA nicht vorkommen). Oligo-Konstruktionen, die so entworfen wurden, dass sie mit der amplifizierten rRNA hybridisieren, und die auf den Träger gedruckt werden, sind in der Tabelle 3 (18S) und der Tabelle 4 (28S) angegeben.
1.4. Hybridisierung
Proben von 0,5 bis 5 μg der amplifizierten Gesamt-RNA werden auf PamChips aufgetragen, die dazu entworfen wurden, sowohl die ausgewählten amplifizierten mRNAs als auch die 18S- und die 28S-rRNA einzufangen, wie in Abschnitt 1.2. beschrieben wurde. Nach einer Vorwaschung des Chips und der Hybridisierung mit amplifizierter RNA über 30 Minuten bei einer geeigneten Temperatur (zwischen 37 bis 50°C) in einem Puffer, der SSPE, Formamid und SDS in geeigneten Konzentrationen enthält (z.B. 5 × SSPE, 50 % Vol./Vol. Formamid, 0,1 % SDS), werden die PamChips gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen, und die so erhaltenen Bilder werden mit einer CCD-Kamera für die anschließende Analyse aufgenommen.
1.5. Analyse
Die Hybridisierung wird mit Hilfe der Array Pro 2.0-Software aus den rohen 12 Bit-CCD-Bildern quantifiziert, die, wie vorstehend beschrieben, aufgenommenen werden. Nach einer geeigneten Weiterverarbeitung (Subtraktion des Hintergrundes, Normalisierung auf die (relativ zu den) Spikes), werden die Signale für jede Hybridisierungsreaktion berechnet. Das normalisierte Signal von den Array-Auftragspunkten wird mit den Daten über die rRNA-Integrität von dem Agilent-Bioanalysegerät verglichen, um die Beziehung zwischen den beiden zu beurteilen. Idealerweise werden Oligos verwendet, für die diese Beziehung linear ist, was es ermöglicht, diejenigen Oligos auszuwählen, die gute Sensoren für das Verhältnis zwischen der 18S- und der 28S-rRNA darstellen.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erlauben die spezifische Amplifikation oder den Nachweis sowohl der 18S- als auch der 28S-rRNA simultan mit der Amplifikation der mRNA und dem Nachweis durch einen Mikroarray. Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erlauben eine Korrelation der erhaltenen Analyseergebnisse mit der Qualität der verwendeten RNA-Proben und daher stellen sie brauchbare Verfahren der Qualitätskontrolle dar.
Beispiel 2: Feineinstellung der Amplifikationsverfahren
Es werden Experimente durchgeführt, um die Amplifikationsverfahren fein einzustellen (einschließlich der Punkte, die die Linearität, die Wahl der Mutationen in dem T7-Promotor und Punkte betreffen, welche mit der Hybridisierung mit der rRNA zusammenhängen), und um die Konstruktion der Sonden zu verfeinern. Darüber hinaus wird die Nützlichkeit der Beurteilung teilweise degradierter rRNA durch das Array untersucht.
Tabelle 1. Promotormutationen, von denen bekannt ist, dass sie die Transkription entweder durch eine Verminderung der Bindung der T7-RNA-Polymerase oder durch ihre Freisetzung von der Promotorregion und die Bildung eines produktiven Elongationskomplexes vermindern.
Tabelle 2. Primerdesign für die rRNA-Amplifikation
Tabelle 3. Sonden für die 18S-RNA
Tabelle 4. Sonden für die 28S RNA
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren für die Beurteilung und Analyse der integrierten Ribonukleinsäureintegrität umfassend die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit einem Satz immobilisierter Detektorsonden und einen Satz von mindestens zwei Kontrollsonden, wobei (i) eine erste der mindestens zwei Kontrollsonden komplementär zur 23S oder ihrem funktionalen Äquivalent, oder zur 28S rRNA oder ihrem funktionalen Äquivalent ist, und (ii) eine zweite der mindestens zwei Kontrollsonden komplementär zur 16S oder ihrem funktionalen Äquivalent, bzw. 18S rRNA oder ihrem funktionalen Äquivalent ist; wobei die ersten und zweiten Kontrollsonden die zwei Haupt-rRNAs des Organismus darstellen, von dem eine Probe entnommen wird, und die die Beurteilung der Integrität dieser Probe erlauben; (b) In-Kontakt-Bringen des Trägers mit Analyt-Ribonukleinsäuren, die von einer Probe stammen, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung komplementärer Analyt-Ribonukleinsäuren und immobilisierter Sonden erlauben, um Analyt-Ribonukleinsäure/Sonden-Komplexe zu bilden; wobei die Hybridisierung ein nachweisbares Signal erzeugt; (c) Nachweisen der durch die Komplexe erzeugten Signale; (d) Bestimmen des Verhältnisses der Signale, die durch die 28S rRNA/Kontrollsonde- und 18S rRNA/Kontrollsonde- oder die 23S rRNA/Kontrollsonde- und 16S rRNA/Kontroll-sonde- oder die funktionell äquivalenten rRNA/Kontrollsonde-Komplexe erzeugt wurden; (e) Beurteilen der Integrität der Probe; und (f) Bewerten der Ergebnisse der Mikroarray-Analyse in Anbetracht der Beurteilung der Integrität.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe eine Gesamtribonukleinsäureprobe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Analyt-Ribonukleinsäuren amplifizierte Ribonukleinsäuren sind.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die amplifizierten Ribonukleinsäuren amplifizierte ribosomale und Boten-Ribonukleinsäuren umfassen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die amplifizierten ribosomalen Ribonukleinsäuren amplifizierte 28S oder ihr funktionales Äquivalent und 18S oder ihr funktionales Äquivalent, oder 23S oder ihr funktionales Äquivalent und 16S oder ihr funktionales Äquivalent umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die amplifizierten Analyt-Ribonukleinsäuren markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Analyt-Ribonukleinsäuren mittels Markierungwährend-der-Synthese markiert werden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Markierung-während-der-Synthese die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen der Gesamtribonukleinsäureprobe und In-Kontakt-Bringen der Probe mit: (i) einem Satz an Ribonukleinsäure-spezifischen Primern umfassend eine Promotorsequenz, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird; (ii) ein Enzym mit RNA-Polymeraseaktivität; (iii) ausreichende Mengen an rNTPs; wobei entweder die Primer von (i) oder die NTPs von (ii) markiert sind; und (b) Halten des resultierenden Reaktionsgemischs unter den geeigneten Bedingungen für eine ausreichende Menge an Zeit, damit die enzymatischen Prozesse stattfinden können.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Satz Ribonukleinsäure-spezifischer Primer ribosomale und Boten-Ribonukleinsäure-spezifische Primer umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die ribosomalen Ribonukleinsäure-spezifischen Primer eine mutierte Promotorsequenz umfassen; wobei die mutierte Promotorsequenz die RNA-Polymerase dazu veranlasst, die Polymerisationsreaktion weniger effizient zu initiieren.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die RNA-Polymerase ausgewählt ist aus der Gruppe beinhaltend Einzel-Untereinheiten RNA-Polymerasen von Phagen, DNA-abhängige bakterielle RNA-Polymerasen, thermostabile RNA-Polymerasen, eukaryotische RNA-Polymerasen und virale RNA-Polymerasen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die RNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe beinhaltend T7, SP6 und T3 RNA-Polymerasen.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die amplifizierten Analyt-Ribonukleinsäuren endmarkiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 13, wobei die amplifizierten Analyt-Ribonukleinsäuren Fluoreszenz-markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die amplifizierten Analyt-Ribonukleinsäuren mit einer Fluoreszenzmarkierung markiert werden, die ausgewählt wird aus der Gruppe beinhaltend Fluorescein, Cy5, und Cy3.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die immobilisierten Detektorsonden an die amplifizierten Boten-Ribonukleinsäuren hybridisieren können.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 für die Mikroarray-Analyse einer Ribonukleinsäure-Probe.
Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 17 für die simultane Beurteilung der Integrität und Analyse einer Probe.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 17 oder 18 für die Beurteilung der Qualität einer Ribonukleinsäure-Probe.
Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 17 für die Analyse der Genexpression.
Ein Computerprogrammprodukt gespeichert auf einem Computer-lesbaren Medium, das das Expressionsniveau einer Nukleinsäureprobe identifiziert, umfassend: (a) Computer-Code, der eine Vielzahl von Signalen empfängt, die Analyt-Ribonukleinsäure-Intensitäten für eine Vielzahl an Analyt-Ribonukleinsäuren entsprechen, wobei jede Analyt-Ribonukleinsäure-Intensität einen Grad an Hybridisierung einer Analyt-Ribonukleinsäure mit einer immobilisierten Detektorsonde anzeigt; (b) Computer-Code, der mindestens zwei Signale, die Analyt-Ribonukleinsäureintensitäten für 165, oder ihrem funktionalen Äquivalent, 18S oder ihrem funktionalen Äquivalent bzw. 23 S oder ihrem funktionalen Äquivalent, oder 28S oder ihrem funktionalen Äquivalent Analyt-Ribonukleinsäuren entsprechen, wobei jede Analyt-Ribonukleinsäure-Intensität einen Grad an Hybridisierung einer 16S oder ihrem funktionalen Äquivalent, oder 18S oder ihrem funktionalen Äquivalent Ribonukleinsäure oder einen Grad an Hybridisierung einer 23S oder ihrem funktionalen Äquivalent oder 28S oder ihrem funktionalen Äquivalent Analyt-Ribonukleinsäure mit einer komplementären immobilisierten Kontroll-Sonde anzeigt; (c) Computer-Code, der einen Vergleich durchführt und das Verhältnis der mindestens zwei Signale aus Schritt (b) berechnet; und (d) Computer-Code, der eine Berichtigung der Vielzahl an Analyt-Ribonukleinsäure-Intensitäten von Schritt (a) gemäß dem in Schritt (c) bestimmten Verhältnis durchführt.