DE60320244T2

DE60320244T2 - Detektion von humanem papillomavirus mit hilfe eines dna-mikroarrays

Info

Publication number: DE60320244T2
Application number: DE60320244T
Authority: DE
Inventors: Fredericus Bernardus Thunnissen; Cornelis Hendrikus Klaassen; Clemens Franciscus Prinsen
Original assignee: Autogenomics Inc
Current assignee: Autogenomics Inc
Priority date: 2002-04-16
Filing date: 2003-04-16
Publication date: 2009-06-25
Anticipated expiration: 2023-04-17
Also published as: EP1499749B1; US7531305B2; AU2003232477A8; EP1499749A2; DE60320244D1; WO2003087829A3; AU2003232477A1; US20080153081A1; ES2305483T3; WO2003087829A2; ATE391794T1; CA2484681A1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und der Diagnostik und bezieht sich insbesondere auf eine verbesserte Diagnosemethode zur Detektion von humanen Papilloma-Virus-(HPV)-Typen, indem DNS-Mikroarray-Techniken verwendet werden. Die Diagnosemethode ist verwendbar zur Detektion aller bekannter HPV-Typen, zum Beispiel in der frühen Detektion von (prä)neoplastischen epithelialen Läsionen im Gebärmutterhals und von Haut-, Kopf- und Nackentumoren, sowie Tumoren anderer Stellen.
Hintergrund der Erfindung
Krebs ist nach der ischämischen Herzkrankheit die zweithäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten und Westeuropa und obwohl kürzlich Fortschritte in der Behandlung erzielt wurden, ist für die meisten Krebsarten kein Wundermittel in Sicht. Krebs verursacht etwa 25% aller Todesfälle. Die Inzidenz steigt weiter an, was wahrscheinlich das steigende durchschnittliche Lebensalter der Bevölkerung widerspiegelt. Der Schlüssel zum Überleben ist die frühe Diagnose und Behandlung.
Vor etwa zwei Jahrzehnten wurde HPV in Verbindung mit menschlichen Tumoren gebracht. Seit damals wurde es in Tumoren und (prä)neoplastischen Läsionen an verschiedenen Stellen entdeckt, wie dem Gebärmutterhals, dem Penis, der Haut, dem Mittelohr, dem Anus, den Plattenepitheltumoren des Kopf- und Nackenbereichs (orale Mucosa, Mandel, Kehlkopf, Rachen), Lunge, Harnblase.
Mehr als 70 verschiedenen HPV-Typen mit unterschiedlichen Beziehungen in Bezug auf das Fortschreiten einer Läsion wurden beschrieben. Einige der Typen haben eine stärkere Verbindung mit der Progression zu malignen Tumoren als andere, z. B. sind Typ 16 und 18 mit der hochgradigen intraepithelialen Dysplasie des Gebärmutterhalses assoziiert. Diese werden „High-Risk"-HPV-Typen genannt. Die Anzahl von HR-HPV hat sich in den letzten Jahren auf z. B. 16, 18, 45, 31, 33 erweitert. Andere Typen wer den hauptsächlich mit gutartigen Tumoren in Verbindung gebracht wie Typ 1, 2, 4, 5 und 6 mit gutartigen Hautwarzen. HPV-Typ 11 ist häufig präsent im jugendlichen wiederkehrenden respiratorischen Papillom. Häufig wurden in einer Reihe von Fällen eines histologischen Läsionstyps verschiedene HPV-Typen detektiert. Gelegentlich wurden multiple HPV-Typen innerhalb einer Läsion gefunden (Co-Infektion). In Erythroplasien von Querat wurde HPV-Typ 8 in Kombination mit anderen HPV-Typen gefunden [Wieland 2000]. Bei Empfängern von Nierentransplantationen stieg die Anzahl von keratotischen Läsionen nach einigen Jahren. Auch in diesen Läsionen wurde ein weiter Bereich an HPV-Typen festgestellt [De Jong-Tieben 2000]. In Epidermodysplasia Verruciformis wurde HPV-Typ 47 nachgewiesen [Adachi 1996]. Bei der allgemeinen Nageldystrophie wurde eine Typ-57-Infektion gefunden [McCown 1999].
Obwohl einige unterschiedliche Typen beschrieben wurden, wurden kürzlich innerhalb eines Typs geringe Variationen in der DNS-Zusammensetzung gefunden. Aufgrund der genetischen Diversität von HPV ist die Verwendung der typenspezifischen Amplifikation für epidemiologische Studien, für die eine akkurate Typisierung essentiell ist, unpraktikabel.
Innerhalb der HPV-Region wurden viele Gensequenzen sowohl auf DNS- als auch auf Protein-Ebene beschrieben. Dazu gehören E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, L1 und L2. Einige Methoden nutzen ein oder mehrere der obigen Gene wie eine PGMY, LBA, SPF₁₀ LiPA GP5+/6+ Kombination. Nur eines benutzt eine andere E1-Region als unsere Erfindung.
Es existieren einige Methoden zur Detektion von HPV im Allgemeinen ebenso wie für die Typisierung. Viele machen sich die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für die Amplifikation von Teilen des HPV-Genoms zu Nutze. Für die PCR können typspezifische Primer verwendet werden. Als Alternative werden Primer verwendet, die die Amplifikation von mehr als einem Typ erlauben. In einigen HPV-Tests werden Primer mit der Absicht eingesetzt, alle Typen zu amplifizieren (generelle Primer). Diese Primer können bis zu einem bestimmten Grade degeneriert sein. Mit diesem Ansatz soll(en) eine oder mehrere Primer-Kombinationen alle HPV-Typen abdecken (Jacobs et al., J. Clin. Microbiol. 1997, 35: 791–795; Bauer et al., JAMA 1991, 265: 472–477). Nach der PCR kann die Sequenzierung für die HPV-Typisierung durchgeführt werden. Ein alternatives Vorgehen ist die DNS-Fragmente auf einem Filter zu hybridisieren, der verschiedene Areale mit verschiedenen DNS-Fragmenten enthält. Jedes Areal enthält dabei DNS, die mit einem bestimmten Typ korrespondiert. Jedoch können Kreuz-Hybridisierungen auftreten. Theoretisch können alle unterschiedlichen HPV-Typen individuell amplifiziert und sequenziert werden, jedoch steigt der Arbeitsaufwand in Abhängigkeit von der Menge der Typen und Variationen, die bekannt sind.
Andere Ansätze zur Detektion von HPV-Typen sind die Verwendung einer Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismusanalyse kombiniert mit einer Amplifikationstechnik. Eine andere Alternative zur Detektion von HPV ist die Verwendung einer Amplifikationstechnik in Kombination mit einem einzelsträngigen Konformations-Polymorphismus (Mayrand, J. Clin. Microbiol. 2000, 38: 3388–3393). Noch weitere Ansätze sind die „Hybrid Capture II" und Ligase-Kettenreaktion (Yamazaki et al., Int. J. Cancer 2001, 94: 222–227).
Noch ein anderer Ansatz ist es, HPV-Typen mittels in situ-Hybridisierung (Amor Tegui et al. 1990, 23: 301–306; Unger et al., J. Histo. chem. Cytochem. 1998, 46: 535–540; Lizard et al., J. Virol. Methods 1998, 72: 15–25) oder mittels in situ-PCR (Jean-Shiunn Shyu, J. Surg. Oncol. 2001, 78: 101–109) zu detektieren. Auf einem histologischen Schnitt oder einer zytologischen Probe sind HPV-typspezifische DNS-Fragmente notwendig, um ein Signal zu erhalten. Daher wird für die Erkennung irgendeines HPV-Typs theoretisch mindestens eine ähnliche Anzahl von Schnitten/Proben benötigt, um eine Art einer biologischen Probe zu untersuchen. Dies ist eine sehr arbeitsaufwändige Vorgehensweise.
Neuerliche Entwicklungen zeigen nach einer PCR den Nutzen einer Liniensonde oder eines Linien-Blot-Assays um verschiedene Typen zu detektieren. Der Vergleich ver schiedener Liniensonden-Assays (PGMY LBA und SPF₁₀ LiPA) legt einen Unterschied in der Sensitivität für einen Assay offen: Mit PGMY LBA wurden mehr HPV-Typen 42, 56 und 59 und mit SPF₁₀ LiPA mehr HPV-Typen 31 und 52 detektiert [Van Doorn 2002]. Auch für die GP5+/6+-Primer wurde kürzlich ein reverser Linien-Blot-Assay beschrieben, der 37 Schleimhaut-Typen detektiert (Van den Brule 2002, J. Clin. Microbiol. 2002, 40: 779–787). Die Übereinstimmung zwischen verschiedenen Methoden ist moderat (Meyer et al., Dermatology 2000, 201: 204–211; Vernon, J. Clin. Microbiol. 2000, 38: 651–655).
Kürzlich wurde die „Chip"-Technologie entwickelt (siehe z. B. US 5,445,934 ). Die Begriffe „Micro-Array" oder „Chip"-Technologie, so wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Analyse von vielen kleinen Spots zur Vereinfachung der Analyse von Nukleinsäuren in großem Maßstab, wodurch die simultane Analyse von Tausenden von DNS-Sequenzen ermöglicht wird. Diese Technik wird als eine Verbesserung gegenüber bestehenden Methoden gesehen, die weitestgehend auf Gelelektrophorese basieren. Zur Übersicht, siehe Nature Gen. (1999) 21, Suppl. 1. Linien-Blot-Assay und Micro-Array-Methoden verwenden beide abgegrenzte Areale, die spezifische DNS-Fragmente beinhalten. Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass Linien-Blotting üblicherweise auf Membranen durchgeführt wird [Gravitt et al., J. Clin. Microbiol., 1998, 36: 3020–3027), wohingegen Micro-Arrays üblicherweise auf einer festen Unterlage auch in kleinerem Maßstab durchgeführt werden können.
Der Nutzen von DNS-Arrays für die genetische Analyse wurde in vielen Applikationen inklusive der Detektion von Mutationen, der Bestimmung des Genotyps, dem „Physical Mapping" und der Überwachung der Genexpression gezeigt. Der zugrunde liegende Mechanismus ist die Hybridisierung zwischen Nukleotid-Arrays und „Target"-Nukleinsäure.
Kürzlich wurde die „Point-EXACCT-Methode" auf das DNS-Micro-Array-Format transferiert, bei dem eine Glasoberfläche homogen mit Streptavidin beschichtet ist. Die Beschichtung dient zum punktförmigen Aufbringen („spotten") der biotinylierten Sonde auf den Glasobjektträger und zur Hybridisierung einer einzelsträngigen „Target"-DNS an diese Nukleinsäuresonde. Zur Detektion wird eine zweite Sonde hinzugefügt oder die einzelsträngige DNS ist bereits markiert. Die Verwendung von Streptavidinbeschichteten Objektträgern für Micro-Array-Analysen ist in WO 02/44713 offenbart, dessen Inhalt hier in Form einer Referenz Rechnung getragen wird.
Zusammenfassend können HPV-Typen durch verschiedene aufwändige Techniken unterschieden werden. Die vorliegende Erfindung stellt eine weitere Verbesserung der Micro-Array-Technik dar, wobei jeder bekannte HPV-Typ auf dem Array abgedeckt ist.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt der Erfindung wird eine Kombination aus Oligonukleotiden verwendet, die die Amplifikation eines Teils des E1-HPV-Gens erlaubt. Dieser Teil der Sequenz wurde bisher für die HPV-Typisierung nicht verwendet. Insbesondere bevorzugt ist das 3'-Ende des E1-HPV-Gens, insbesondere die Region zwischen etwa 29 bis etwa 188 Nukleotide vom 3'-Terminus des E1-Gens. Die Größe des gesamten Gens variiert von 1820 bis 1964 Nukleotiden.
Daher bietet die vorliegende Erfindung eine Methode zur Detektion der Gegenwart von HPV, umfassend die folgenden Schritte:

a. Amplifikation und Markierung eines Teils des E1-HPV-Gens, insbesondere dessen 3'-Endes;
b. Hybridisierung des markierten Fragments an einer festen Unterlage, die Micro-Arrays mit verschiedenen HPV-spezifischen Fang-Sonden enthält;
c. Entfernen der nicht-gefangenen markierten Fragmente;
d. Detektieren der gefangenen detektierbaren Reste zum Anzeigen der Gegenwart einer HPV-Sequenz-DNS in der Probe.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die Untersuchung der Integration von HPV in menschliche DNS mittels einer Kombination der E1-Region mit einer anderen HPV-Region wie E6 oder L1 geeignet.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird der Micro-Array für die Detektion des/der spezifischen HPV-Typs/Typen nach der Amplifikation verwendet.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung erlaubt das System ein schnelles Auslesen mittels Absorption in einem gewöhnlichen Lichtmikroskop, das für die Detektion und Typisierung von HPV in einem Vorgang geeignet ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Kit zur Verfügung umfassend:

a. Ein Gerät zur Durchführung der Detektionsmethode gemäß der vorliegenden Erfindung, wie hierin beansprucht;
b. Eine Anzahl von Primer-Sets für die Amplifikation der HPV-E1-Region;
c. Eine Anzahl fester Unterlagen, die die HPV-Fang-Proben enthalten.

Diese und andere Aspekte der Erfindung werden detailliert in der folgenden Beschreibung umrissen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt eine schematische Darstellung von HPV-Sequenzen enthaltenden Regionen mit allgemeinen Primer-Sets dar. Die schematische Darstellung ist eine modifizierte Bildvorlage aus Kleter, Utrecht vom 24. Januar 2002. Die Position der CWZ-Primer in der E1-Region ist unterscheidbar unterschiedlich von der anderer Stellen.
2 veranschaulicht schematisch die Micro-Array-Prozedur. Aus einer klinischen Probe oder einer anderen Probe wird DNS extrahiert (A), amplifiziert und markiert (B). Parallel wurde ein Micro-Array vorbereitet, der alle HPV-Subtypen (C) enthält. Die markierte DNS wird an den Array hybridisiert (D). DNS und andere Komponenten die nicht gebunden sind, werden weggewaschen. Verbleibende Fragmente werden hybridisiert, basierend auf korrespondierenden HPV-Sequenzen und auf der Basis der Gegenwart einer Markierung visualisiert. Daraufhin können die Spots mit Markierung von denen ohne Markierung unterschieden und für die HPV-Typ-Detektion verwendet werden (E, F).
3 zeigt ein Beispiel einer HPV-16-Detektion im Fluoreszenz- und Absorptions-Modus.
Detektion ct1 >= Positiv-Kontrolle als Triplikat.
HPV 16 > = Spots mit Fang-Sonden für HPV 16 als Triplikat visualisiert wie in der Vorgehensweise beschrieben.
Sensitivität >= Signal aus drei verschiedenen Konzentrationen von HPV-Fang-Sonden als Triplikat.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine signifikante Verbesserung der Methode zur Detektion von HPV dar. Eine neue Kombination von Oligonukleotiden zur HPV-Detektion wird für die Amplifikation und die Detektion verwendet.
Der Begriff Amplifikationsprodukt bedeutet ein spezifisches Fragment von doppelsträngiger DNS, die in einem Prozess auftritt, der auf die Multiplikation dieses Fragmentes abzielt. Alle bekannten Methoden zur Amplifikation sind eingeschlossen.
Der Begriff HPV-spezifisch wird hierin für die Kombination aus Primer-Sets und Detektions-Sonde verwendet. Die Länge der Detektions-Sonde kann zu kurz sein, um spezifisch für HPV selbst zu sein, wenn sie gegen alle Informationen in Gen-Banken untersucht wird. Jedoch ist nach der Amplifikation mit HPV-spezifischen Sonden die Chance andere als HPV-markierte DNS zu detektieren, vernachlässigbar. Die Fangoligonukleotide müssen daher nicht einzigartigartig sein.
Die Begriffe Primer und Sonde wie hierin verwendet, bezeichnen Oligonukleotide. Primer wird für das einzelsträngige DNS-Fragment verwendet, das zur Amplifikation verwendet wird. Sonde wird für das einzelsträngige DNS-Fragment verwendet, das Fangfunktion auf der festen Unterlage hat. Der Begriff „Detektionssonde" wie hierin verwendet unterstreicht die Fang-Funktion.
Der Begriff degenerierte(r) Primer oder Sonde bezeichnet ein Oligonukleotid mit entweder einem Gemisch verschied ener Nukleotide oder einem Basenanalogon an bestimmten Positionen.
Die Begriffe Inkubation von Proteinen und Hybridisierung von Nukleinsäuren haben ähnliche Komponenten, d. h. Diffusion und Bindung von Molekülen an ihre spezifischen „Targets". Mit Diffusion, wie hierin verwendet, ist derselbe Prozess für Nukleinsäuren, Proteine und andere Moleküle gemeint, die mit dem „Target" auf der festen Unterlage interagieren.
Der Begriff Visualisierung bezeichnet jede Möglichkeit, mittels derer in einer nichtradioaktiven Weise ein Hybridisierungsprodukt mit Hapten in Hilfe irgendeines mikroskopischen Systems visualisiert werden kann.
Das „Target" auf der festen Unterlage besteht aus einem festen Teil mit angehefteten, d. h. immobilisierten Molekülen einer oder mehrer verschiedener Arten wie Nukleinsäuren, Proteinen, ganze Zellen, Zell- oder Gewebeschnitte.
Die Begriffe Inkubationskammer und Hybridisierungskammer, so wie sie hierin verwendet werden, sind Synonyme und bedeuten den dreidimensionalen Raum, der sich über dem „Target" auf der festen Unterlage befindet, wo die feste Unterlage ein integraler Bestandteil der Inkubations-/Hybridisierungskammer darstellt.
Die Begriffe „Micro-Array" oder „Chip"-Technik oder -Technologie wie hierin benutzt, sind Synonyme und bedeuten, die Analyse einer Vielzahl kleiner Spots von Nukleinsäu ren, die auf einer kleinen Oberfläche verteilt sind, um eine Nukleinsäureanalyse von Tausenden DNS und/oder RNS-Sequenzen auf simultane Weise zu ermöglichen. Die Begriffe sind gleichermaßen anwendbar auf die Analyse von Peptiden oder Proteinen.
Der Begriff Inkubationsflüssigkeit bezeichnet die Flüssigkeit, die das an die Oberfläche zu bindende Substrat enthält.
Der Begriff Test-Flüssigkeit bezeichnet das Volumen irgendeiner flüssigen Komponente, die für das Experiment notwendig ist oder für den Test notwendig ist, damit dieser mit einem Durchfluss-System durchgeführt werden kann.
Die Begriffe Immunhistochemie und Immuncytochemie werden als Synonyme benutzt und bedeuten die Bindung von Antikörpern an Haptene, üblicherweise Teile von Geweben oder Zellen, die an der festen Unterlage vorkommen, aber ebenfalls bezeichnen sie, wie hierin verwendet, die Visualisierungsprozedur nach der Bindung an das Hapten.
Die Begriffe „Low"- und „High"-Risk-HPV bezeichnen einen Unterschied in Bezug auf die Möglichkeit einen böswilligen Tumor zu entwickeln. Dies wurde insbesondere für den Gebärmutterhals beschrieben. Für „High-Risk" ist die Möglichkeit zur Entwicklung eines böswilligen Tumors höher als für „Low-Risk"-HPV-Typen.
Alle im Oktober 2000 beschriebenen HPV-Gen-Sequenzen (E1, E2, E4, E5, E6, E7, L1 und L2) (sowohl auf DNS- als auch auf Protein-Ebene) wurden einzeln und systematisch analysiert, um eine Region des HPV-Genoms auszuwählen, die die Unterteilung aller HPV-Typen in Gruppen von HPV-Typen erlaubt. Basierend auf der Sequenz- Homologie auf Protein- und/oder DNS-Ebene können zuvor unbestimmte HPV-Typen vermeintlich entweder als „Low-Risk"- oder „High-Risk"-HPV eingestuft werden. Die Unterteilung aller HPV-Typen beabsichtigt, eine möglichst große Unterscheidung zwischen „Low"- und „High-Risk" Schleimhauttypen von HPV zu ermöglichen.
Die folgenden Kriterien wurden angewendet. Jede Gruppe musste mindestens zwei Regionen mit einem relativ hohen Grad an DNS-Sequenz-Homologie zwischen den verschiedenen HPV-Typen enthalten, um die Erstellung von „gemeinsamen" PCR-Primern zu ermöglichen. Zusätzlich sollten diese potentiellen PCR-Primerstellen zwischen verschiedenen Gruppen so unterschiedlich wie möglich sein, um die Amplifizierung von Gruppen-spezifischen und/oder „Risk"-spezifischen HPV-Typen zu ermöglichen. Ein anderes Kriterium war, dass zwischen den potentiellen PCR-Primer-Stellen ausreichend viel Heterogenität zwischen den DNS-Sequenzen vorhanden ist, um die DNS-Sequenzen auszuwählen, die die Unterscheidung zwischen verschiedenen HPV-Typen ermöglichen. Basierend auf diesen Kriterien wurde das HPV-E1-Gen für den Entwurf des Assays ausgewählt. Im Folgenden wurden drei größere Gruppen von HPV-Typen unterschieden: (i) „High-Risk" Schleimhaut-HPV-Typen, (ii) „Low-Risk"-Schleimhaut-HPV-Typen und (iii) die verbleibenden HPV-Typen. Sechs Gruppen wurden aufgestellt. Gruppe A enthält alle bekannten „Low-Risk"-HPV-Typen. Gruppe E und F enthalten fast alle „High-Risk"-HPV-Typen, Gruppe B und C enthalten die verbleibenden HPV-Typen und Gruppe D enthält sowohl „High-Risk"-HPV-Typen als auch einige von den verbleibenden HPV-Typen. Beispiele für die Primer einer jeden Gruppe sind in Tabelle 1 dargestellt. (SEQ ID No.: 1 etc.) mit und ohne „Tag".
Die Amplifikation von HPV-E1-Produkten wird in geeigneter Weise mit PCR oder einer anderen Methode, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, durchgeführt. Die Primer können markiert („Label"), mit einem Anhang („Tag") versehen oder unmarkiert sein. In den letzten beiden Fällen ist ein zweiter Schritt notwendig, um eine Markierung („Label") zum Amplifikationsprodukt zu geben. Diese Techniken sind einem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass die Micro-Array-Technik erfolgreich zur Detektion eines oder mehrer HPV-Typen innerhalb einer Probe angewendet werden kann, so dass nun die Analyse klinischer Proben bei einem sehr viel höheren Maßstab ermöglicht wird. Die Gegenwart eines oder mehrer HPV-Typs/HPV-Typen innerhalb einer Probe ist gewöhnlich innerhalb eines Tages nachzuweisen. Die Oligonukleotid-DNS-Array-Technik gemäß der Erfindung arbeitet mit hohen Konzentrationen aller Produkte. Unterschiedliche Spots werden durch HPV-spezifische Sonden charakterisiert. Sobald das Prinzip etabliert ist, werden die Konzentrationen Schritt für Schritt optimiert, um eine höhere Effizienz der HPV-Array-Analyse zu erreichen.
Die Zusammensetzung der Primer und der Verwendung der Reagenzien werden durch Routineexperimente bestimmt und optimiert. Der Detektionsmodus kann variieren, aber die Erfindung wird bequem mittels Absorptionsmikroskopie und anderen Modi wie der Fluoreszenz und Laser-Scanning-Mikroskopie durchgeführt. Bevorzugterweise wird der Fluoreszenz-Modus statt des Absorptions-Modus aufgrund der Quantifizierbarkeit, der höheren Sensitivität und der größeren dynamischen Breite verwendet. Der letztgenannte hat den Vorteil, dass das Ergebnis mittels gewöhnlicher Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden kann.
Generelle Anwendungen, die die HPV-Array-Detektionsmethode der Erfindung verwenden:

– Detektion von HPV-Infektion
– Detektion von einfachen oder vielfachen Infektionen in derselben Analyse

Spezifische Applikationen

– Zur Detektion des Wiederauftretens von Gebärmutterhalskrebs oder Dysplasie nach der Behandlung
– zur Detektion einer HPV-Infektion während des zervikalen Screenings
– zur Detektion von HPV im Falle einer zervikalen Zytologie mit atypischen Zellen von unbestimmter Signifikanz (ASCUS-Zellen)
– zur Detektion von „High-Risk"-Typ-HPV in zervikalen epithelialen Abnormalitäten
– zur Detektion der Gegenwart oder der Abwesenheit von HPV bei der Differenzialdiagnose eines Karzinoms unbekannter Herkunft.

Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung werden im Folgenden weiter detailliert beschrieben und illustriert.
Erzeugung von HPV-„Targets”
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die „Target"-HPV-Sequenzen in einer asymmetrischen PCR-Reaktion nach einer regulären HPV-Typ-spezifischen PCR-Amplifikation markiert. Als „Tags" existieren mehrere Optionen, die einem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind. 5'-Digoxigenin-modifizierte Oligonukleotid-Rückwärts-Primer, die einen „Tag" erkennen, werden in der asymmetrischen PCR verwendet. Die Primer-Konzentration kann variieren. Angemessene Konzentration sind 0,05 und 1 μM für Vorwärts- bzw. Rückwärts-Primer. Variationen dieser Bedingungen sind einem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt.
In einer anderen Ausführungsform können auch andere Amplifikationsformen verwendet werden. Beispiele sind „Rolling Circle PCR", „Nukleinsäure-Sequenz-basierte Amplifikation", Transkription-basiert-vermittelte Amplifikation. Diese sind einem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt.
In einer alternativen Ausführungsform existieren für die Markierung andere Optionen wie Biotin. Die Auswahl kann von der Methode abhängen, wie die Fang-Oligonukleotide an der festen Unterlage befestigt sind (siehe unten).
In einer alternativen Ausführungsform können die Amplifikationsprodukte intern mittels Digoxigenin-11-dUTP statt dTTP (oder einer Mischung aus den letzteren beiden Nukleotiden) in der Amplifikationsmischung der PCR markiert werden oder mittels anderer Markierungen, die einem Fachmann auf dem Gebiet sehr wohl bekannt sind.
In noch einer anderen Ausführungsform können die Amplifikationsprodukte in der PCR direkt mit einer Fluoreszenz-Gruppe (z. B. Cy-Farbstoffen, Fluorescein, Rhodamin, Texas Rot) markiert werden, indem veränderte Rückwärtsprimer (end-markiert) oder modifizierte Nukleotide (intern-markiert) für die PCR verwendet werden.
In anderen Ausführungsformen zur Markierung können Quantum-Dots, Analoga, die eine Silber- oder Gold-typische Färbung ermöglichen, nukleare Analoga, die Infrarot oder Interferenz-basierte Detektion erlauben, verwendet werden. Diese sind einem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt.
In einer anderen Ausführungsform zur Herstellung von einzelsträngiger DNS können Amplifikationsprodukte in einer der oben genannten Möglichkeiten markiert werden, indem gleiche Primer-Konzentrationen in der PCR-Reaktion verwendet werden. In diesem Fall müssen die doppelsträngigen DNS-Amplfikations-Produkte denaturiert werden (z. B. durch Hitze), schnell auf Eis gekühlt werden, und in der Hybridisierungsmischung verwendet werden. Andere Möglichkeiten zur Herstellung von einzelsträngiger DNS nach der Amplifikation können ebenfalls verwendet werden. Diese sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Amplifikations-Produkte vor einer zweiten Amplifikation und nach der ersten Amplifikations-Prozedur aufgereinigt werden. Dieser Ansatz kann nach einer anfänglichen Amplifikation ohne Markierung verwendet werden, um darauffolgend das Amplifikations-Produkt zu markieren.
Herstellung von Micro-Arrays
Generell können Fang-Oligonukleotide an einer festen Unterlage auf verschiedenen Wegen befestigt werden oder sie können direkt auf dem festen Träger durch Lichtgesteuerte Synthese hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Streptavidin-beschichtete Träger benutzt und als feste Unterlage für die Micro-Array-Analyse wie in WO 02/44713 verwendet, das hierin als Referenz aufgenommen ist. Streptavidin-beschichtete Mikroskop-Objektträger aus Glas werden als fester Träger in dieser Micro-Array-Prozedur benutzt.
In einer anderen Ausführungsform können andere Methoden, die Fang-Sonden auf der festen Oberfläche zu befestigen, benutzt werden. Beispiele sind: Kreuz-Verlinkung der DNS an die aminierten (silanierten) Träger indem der Array bei 80°C für 2 bis 4 Stunden gebacken wird. UV-Kreuzvernetzung kann als zusätzlicher Schritt verwendet werden (ebenso für: Poly-L-Lysin-beschichtete Träger); andere feste Träger wie Amino-Silan-beschichtete Träger, Acrylamid-beschichtete Träger, Epoxy-aktivierte Träger, Aldehyd-aktivierte Träger, NHS-Ester-aktivierte Träger, Hydrogel-Epoxy-aktivierte Träger, Isothiocyanat-aktivierte Träger, Mercaptosilan-aktivierte Träger, Nitrocellulosebeschichtete Glas-Träger sind einem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt.
Die Konzentration von 5'-Biotin-modifizierten Oligonukleotiden kann variieren, aber in einer bevorzugten Ausführungsform kann die Konzentration (12 μM, in 3 × SSC/1,5 M Betain) [SSC; 1 × (8,76 g/L NaCl, 4,41 g/L Natriumcitrat, pH-Wert 7,0] sein.
Es existieren einige Roboter für das Positionieren von schon synthetisierten Oligonukleotiden auf der festen Unterlage. Diese sind einem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt. Wir benutzen einen SDDC-2-Array-„Spotting"-Roboter von Engineering Services Inc. (ESI, Toronto, ON, Kanada) und „Stealth micro spotting eins" (SMP3, Arraylt). Von diesen Pins wird angenommen, dass sie ein Volumen von ~0,6 nl an jeder „Spottingstelle” applizieren, was zu „Spots" von ~100 μm in Durchmesser führt (Angaben des Herstellers).
In einer bevorzugten Ausführungsform wurden die „Spots" auf den Trägern zum Zwecke der Qualitätskontrolle in Triplikaten appliziert, aber das kann von 1, 10 oder mehr variieren. Der Zwischenraum zwischen den „Spots" kann in Abhängigkeit von der Software variieren, kann aber 10 Mikron klein und 400 μm bis mehr als 1 Millimeter groß sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform benutzen wir eine relative Feuchtigkeit von 45 bis 60% und eine Temperatur, die bei 22°C gehalten wurde, aber diese Bedingungen können variieren.
Auftragspunkte, die eine Suspension von 5' Biotin-modifizierte DNS-Oligonukleotiden enthalten, werden auf Streptavidin-Glasträgern aufgebracht, in dem ein kommerziell erhältlicher Micro-Array-Roboter (SDDC-2, ESI/Virtek) verwendet wurde. Wir benutzen 12 μM-Lösungen der biotinylierten Oligonukleotide für das Auftragen, aber haben gezeigt, dass 6 bis 20 μM Oligonukleotide in den Auftragslösungen ähnliche Resultate ergaben.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der „Spotting"-Puffer mit Betain versetzt sein. Die Betain-Konzentration kann variieren, aber eine Konzentration von 1,5 M bis zum 3 × SSC ist geeignet. Mit DNS-„Spotting"-Lösungen erhalten wir (mit bloßem Auge und durch Licht-Mikroskopie) deutlich sichtbare „Spots", was dies zu einem Kontrollpunkt in Bezug auf die Qualität des Arrays macht. Nach der Qualitätskontrolle des Arrays durch diesen visuellen Check, kann das Betain weggewaschen werden, um die Träger ohne einen negativen Einfluss auf die gebundenen Oligonukleotide, eine folgende Hybridisierung oder einen Hintergrund nach der Visualisierung langzeit zu lagern.
In einer anderen Ausführungsform können „Spotting"-Puffer ohne Betain benutzt werden. Diese sind einem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurden 5' Biotin-modifizierte Oligonukleotide verwendet, um den Array aufzutragen. Ein 16-Atom-„Spacer”-Arm wurde verwendet, um die Biotin-Gruppe an die Oligonukleotide zu binden, wohingegen ein 12-Atom-„Spacer"-Arm zur Bindung zwischen dem Digoxigenin (DIG) und dem vorletzten 5'-terminalen Nukleotid verwendet wurde. Die „Spacer"-Länge kann zwischen einem und 16 C-Atomen variieren.
Basierend auf früheren Erfahrungen mit K-ras wurden die Sonden für HPV ähnlich zu K-ras gestaltet, d. h. das Biotin-„Label” wurde direkt mit einem „Spacer" an ein 20-mer HPV-spezifisches Fragment gekoppelt. Anfängliche Experimente waren nicht erfolgreich. Darauf folgend wurde das HPV-spezifische Fragment zu einer Länge von 40 Nukleotiden verlängert. Dies führte zu stärkeren Signalen, erhöhte jedoch auch die Kreuz-Reaktivität. Daher war ein zusätzlicher „Spacer" zwischen den Oligonukleotiden mit dem Biotin-„Spacer” und dem HPV-spezifischen Fragment notwendig. Zusätzlich kann das 40-mer HPV in der Größe reduziert sein, was zu einer Steigerung der Qualität führt, da die Kreuz-Reaktivität vermindert wird. Primer und Sonden sind in Tabelle 1 gezeigt (siehe unten). Tabelle 1 Oligonukleotid-Sequenzen in Bezug auf die Amplifikation (Gruppe a–F) und Fang-HPV 1–85
In einer bevorzugten Ausführungsform haben die 5'-Biotin-modifizierten Fang-Oligonukleotide eine Länge von 35 Nukleotiden. Das 5'-Ende der Oligonukleotid-Sequenz beginnt mit einem 15-mer, das eine dreifache Wiederholung [TTTTC] enthält, worauf ein Abschnitt von HPV-Typ-spezifischen Nukleotiden folgt. Die Länge des ersten Teils mit den Wiederholungen kann variieren von keiner Wiederholung (d. h. 0 Nukleotiden) bis zu mehr als 10 Wiederholungen. Dieser Teil hat eine zweite „Spacer"-Funktion und optimiert die Hybridisierung. In unseren Händen sind die Wiederholungen ausreichend für ein angemessenes Signal. Zusätzlich können Nukleotid-Zusammensetzungen anders sein als TTTTC, müssen aber derart ausgewählt sein, dass keine Kreuz-Hybridisierung mit anderen relevanten DNS-Fragmenten im Assay auftritt. Für eine HPV-spezifische Fang-Sonde muss die „Spacer"-Länge nicht konstant sein, sondern kann ebenfalls variieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform haben die HPV-spezifischen Sequenzen eine Länge von 20 Nukleotiden. Diese wurden aus „Multisequenz-Vergleichen" nach dem Sortieren und Gruppieren aller HPV-E1-Gen-Sequenzen und mit Hilfe einer „Blast"-Suche gegen alle zusammenwirkenden NCBI-Nukleotid-Datenbanken ausgewählt, um sie in Bezug auf ihre Einzigartigkeit unter den HPV-Stämmen zu überprüfen (NCBI: National Center for Biotechnology Information). Innerhalb der HPV-spezifischen Sequenz der Fang-Oligonukleotide von zwei eng verwandten Typen ist mindestens eine, sind aber bevorzugterweise zwei Positionen für einen HPV-Typ einzigartig.
In einer anderen Ausführungsform kann die Länge der HPV-spezifischen 20 Nukleotide variieren. Diese kann kürzer oder länger sein, oder es können Kombinationen von verschiedenen Längen verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform bestehen die Fang-Sonden aus 5'-modifizierten Peptid-Nukleinsäuren (PNA). Diese können wegen ihrer Hochaffinitäts-Bindung verwendet werden. Ebenso kann eine Kombination von 5'-modifizierten Oligonukleotiden und PNA auf dem Array vorhanden sein.
Zum Zwecke der Wiedererkennung, wo auf dem Träger die „Spots" lokalisiert sind, haben wir Marker-Oligonukleotide mit 5'-Biotin-modifizierten Oligonukleotiden von 40 Nukleotiden-Länge mit einer Digoxigenin-Modifikation an dem vorletzten 3'-terminalen Nukleotid verwendet. Jedoch kann die Länge dieses Marker-Oligonukleotids variieren und länger oder kürzer sein.
In einer anderen Ausführungsform kann die Oligonukleotid-Sequenz komplimentär zu denen in der Tabelle definierten sein. Dies gilt für Primer und Sonden.
Beladene Arrays wurden an einem trockenen und kühlen Ort (gekühlt) bis zur Verwendung gelagert. Die Arrays wurden über 3 Monate lang gelagert und ergaben ähnliche Resultate wie neue Arrays.
Hybridisierung
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die gedruckten Arrays vor der Hybridisierung in Phosphat-gepufferter Salzlösung [PBS; 1 × (0,21 g/L KH₂PO₄, 9 g/L NaCl, 0,73 g/L Na₂HPO₄·7H₂O, pH-Wert 7,4)], die 0,5 ml/L Tween 20 enthält 10 Minuten lang gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. Andere Waschpuffer sind ebenso geeignet, wie ein Fachmann auf diesem Gebiet weiß.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurden Einwegdeckplatten (Shandon) für alle Hybridisierungen, Inkubationen, Wasch- und immunchemische Detektionsschritte be nutzt. Glasobjektträger für Mikroskope passen in diese Deckplatten und werden während des ganzen Vorgangs in einer vertikalen Position gehalten. Wenn der Objektträger in die Abdeckplatte eingebracht ist, befindet sich an der Oberseite des Objekt-Trägers eine 80 Mikron große Lücke (ungefähres Volumen von 80 μl) und die Inkubationsmischung wird durch Kapillarkräfte zurückgehalten. Das Waschen der Objekt-Träger ist einfach dadurch zu bewerkstelligen, dass PBS-T in das obere Pufferreservoir (ungefähr 3 ml) gegeben und den Array entlanglaufen gelassen wird.
In einer anderen Ausführungsform können andere Objektträgerhalter verwendet werden oder die Objektträger können auf eine horizontale Weise inkubiert werden. In diesen Fällen kann die Menge der Hybridisierungsflüssigkeit variieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Micro-Arrays in einem Puffer, der 3,3 × SSC/1,7 mM EDTA/17 mM Hepes/0,12% Tween 20 pH-Wert 7,3 enthält für 5 Minuten bei RT prä-hybridisiert und in derselben Lösung mit der Sonde für 1 Stunde bei 22°C hybridisiert. Die Sonden-Hybridisierungslösung enthielt 40% v/v der ungereinigten gesamten PCR-Produkte der asymmetrischen PCR pro Hybridisierung in demselben Puffer, jedoch kann dieses 40%-Verhältnis variieren. Hybridisierungs-Inkubationen wurden für eine Stunde bei RT (um 22°C) durchgeführt, jedoch können Zeit und Temperatur variieren. Die Hybridisierungsmischung kann eine Zusammensetzung verschiedener PCR-Reaktionen und des Hybridisierungs-Puffers sein. Oder für verschiedene PCR-Reaktionen kann eine serielle Hybridisierung durchgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform können andere Hybridisierungs-Puffer und Temperaturen verwendet werden. Diese sind einem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Waschen nach der Hybridisierung durchgeführt, um eine Abnahme der Kreuz-Hybridisierung des „Targets" an nicht passende Fang-Oligonukleotide zu verringern. Fünf aufeinander folgende Waschschritte von jeweils fünf Minuten werden bei Raumtemperatur durchgeführt PBS-Tween 20 (0,05%); 2 × SSC/0,1% SDS; 1 × SSC/0,1% SDS; 0,1 × SSC; 0,05 × SSC.
In einer anderen Ausführungsform kann der Waschvorgang nach der Hybridisierung bei einer anderen, üblicherweise höheren Temperaturen durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der HPV-Array mit einer visuellen Kontroll-Sonde (VCP) versehen, die ein Biotin-„Label” am 5'-Ende und ein Visualisierungs-Hapten am vorletzten 3'-Ende enthält. Dies ist eigentlich eine interne Positiv-Kontrolle für die Visualisierungs-Prozedur und kann darüber hinaus Informationen über die Position der HPV-spezifischen Sonden und anderer Negativ-Kontroll-Sonden liefern. Die VCP kann bei verschiedenen Konzentrationen aufgetragen werden und Informationen über die dynamische Breite der Visualisierungsvorgänge für jedes Experiment liefern.
In einer anderen Ausführungsform können auch andere Kontroll-Sonden verwendet werden. Diese sind einem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt.
Visualisierungs-Vorgang
In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein „Antisense"-Cy3-markiertes Oligonukleotid als Kontrolle für die Hybridisierung zu der Hybridisierungsmischung hinzugefügt werden, das den 15-Nukleotid-Abschnitt der vorangehenden HPV-spezifischen Sequenz der Fang-Oligonukleotide erkennt. Die Länge dieses Arrays kann länger sein in Abhängigkeit von der Länge des zweiten „Spacers" oder kürzer.
In einer anderen Ausführungsform kann dieses Antisense-Oligonukleotid dem Array nach der „Dig"-Detektion und Visualisierung hinzugefügt werden, gefolgt von einem kurzen PBS-T-Waschschritt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die nach der Hybridisierung und dem Waschen auf dem Array verbleibenden Digoxigenin-Gruppen der markierten PCR-Produkte mit einer 1:100 Verdünnung eines monoklonalen Maus-Antikörpers gegen die Digoxigenin (Anti-Digoxigenin-Klon 1.71.256 Roche Molecular Biochemicals, Almere, Niederlande) inkubiert, gemäß den Vorgaben des Herstellers, gefolgt von einer 45 minütigen Inkubation mit einer 1:20 Verdünnung von mit alkalischer Phosphatasekonjungierten Kaninchen-Anti-Maus-Immun-Globulinen (DAKO, Amsterdam, Niederlande). Das „Vector-Blue alkalische Phosphatase-Substrat-Kit" (SK-5300, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) wurde gemäß der Herstellervorgaben verwendet, um die alkalische Phopshatase-Aktivität zu detektieren. Vector Blue produziert ein blaues Reaktionsprodukt, das mittels Hellfeld- oder Fluoreszenz-Mikroskopie betrachtet werden kann. Objektträger, die mittels Lichtmikroskopie (Absorptions-Modus) untersucht wurden, wurden mit einem wässrig basierten Medium in Sol Mount (Klinipath, Duiven, Niederlande) fixiert. Objektträger, die mittels Laserscanner (Fluoreszenz-Modus) untersucht wurden, wurden zweimal für 5 Minuten in PBS, das 0,5 ml/L Tween 20 enthielt, gewaschen, mit Wasser gespült, 3 Minuten lang in 100%igem Ethanol gewaschen und in der Dunkelheit luftgetrocknet. Das „Vector Blue"-Reaktionsprodukt wird mittels roter Fluoreszenz detektiert, indem ein Laser verwendet wird, der mit einer Wellenlänge von 635 nm anregt. Die oben erwähnten chemischen Substanzen sind in keinem Sinne beschränkend, sondern stellen lediglich Beispiele für Komponenten dar, die für angemessene Ergebnisse verwendet werden können.
In einer anderen Ausführungsform können andere Visualisierungschemikalien verwendet werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind. Ein Beispiel ist das „Vector Rot"-alkalische Phosphatasesubstrat-Kit (SK-5100), das in der Hellfeld-Mikroskopie rote „Spots" und im Fluoreszenz-Detektionsmodus (bei 532 nm Anregung) grüne „Spots" liefert.
Abbildung und Datenanalyse
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Objektträger im Fluoreszenz-Modus mit einem Micro-Array Laserscanner Genepix 4000 A gescannt und die Datenanalyse mittels der Genepix Pro 3.0 Software von Axon Instruments Inc. (Foster City, CA) durchgeführt. Diese Scans zeigen ein Bild des gesamten Arrays, ohne das Gesamtbild zu verlieren. Dieser Scanner benutzt einen 532 nm-Laser um Cy3 und einen 635 nm-Laser, um Cy5 anzuregen. Das grüne Laserlicht des 532 nm-Lasers wurde ebenfalls verwendet, um das Reaktionsprodukt der alkalischen Phosphatase und „Vektor Rot" anzuregen und das Licht des 635 nm-Lasers wurde verwendet, um das Reaktionsprodukt von „Vektor Blue" und alkalische Phosphatase anzuregen. Von 16-Bit TIFF-Bildern von 10 um Auflösung wurde die lokale Hintergrund-Intensität abgezogen. Die Software normalisiert die Daten nicht. Der Mittelwert der Merkmal-Intensitäten von drei „Spots" wurde verwendet, um die mittleren Signalintensitäten für jede DNS-Konzentration zu ermitteln, die aufgetragen wurde. Objektträger im Absorptions-Modus wurden ebenfalls semi-quantitativ analysiert mittels gewöhnlicher Licht-Mikroskopie (indem eine 25-fache Gesamtvergrößerung verwendet wurde).
In einer anderen Ausführungsform können die Objektträger mit einer CCD-Kamera, die an ein Licht-Mikroskop angeschlossen ist, photographiert werden. Wenn spezifische Adaptoren oder Linsen mit geringerer Vergrößerung verwendet werden, kann der gesamte Array in einer Aufnahme betrachtet und dokumentiert werden. Andere kommerziell erhältliche Systeme können ebenso verwendet werden und leicht durch einen Fachmann auf diesem Gebiet ausgewählt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Array mit konventioneller Hellfeld-Mikroskopie visualisiert. Daher sind die oben genannten Scanner nicht zwingend für die Analyse erforderlich. Dieses Set-Up ermöglicht die Verwendung des HPV-Arrays in jeder modernen pathologischen Laboreinrichtung, die über PCR und immunhistochemische Ausstattungen verfügt.
In einer anderen Ausführungsform können Infrarot-, Phasenkontrast- oder Interferenzbasierte Methoden für die Abbildung verwendet werden. Diese sind einem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt.
Obwohl die vorliegende Erfindung hierin in typischen Ausführungsformen beschrieben ist, wird sie so verstanden, dass Veränderungen durchgeführt werden können, ohne sich von dem Erfindungsgehalt zu entfernen. Zum Beispiel wird der HPV-DNS-Array gemäß der Erfindung hierin typischerweise so beschrieben, dass die alkalische Phosphatase für die Detektion mittels Absorptions-Mikroskopie verwendet wird. Es ist offensicht lich, dass zum Zwecke der Visualisierung dieses Enzyms durch ein Fluoreszenz-Substrat oder eine andere bekannte detektierbare Gruppe ersetzt werden kann. Dies erfordert die Berücksichtigung, welches mikroskopische Detektions-System üblicherweise verwendet wird. Die Test-Eigenschaften des Systems können abhängig sein von der verwendeten Kombination. Solche Variationen sind für einen Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich und sind alle in dem Gebiet der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Die vorliegende Offenbarung ist in jeder Hinsicht als beschreibend und nicht als beschränkend zu sehen, der Umfang der Erfindung, der durch die anhängigen Ansprüche bezeichnet wird und alle Änderungen, die in den Bereich einer ähnlichen Bedeutung und Äquivalenz fallen, sollen ebenfalls hierin eingeschlossen sein. Sequenzliste

Claims

Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart von HPV, umfassend die folgenden Schritte: a) Amplifizieren und Markieren eines Teils des E1-HPV-Gens, insbesondere seines 3'-Endes; b) Hybridisieren des markierten Fragments an einen festen Träger, der Mikroarrays mit verschiedenen, für HPV spezifischen, Einfangsonden enthält; c) Entfernen von nicht eingefangenen, markierten Fragmenten; d) Nachweisen einer eingefangenen, nachweisbaren Einheit, die die Gegenwart einer HPV-Sequenz-DNS in einer Probe anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin erste Nukleinsäure-Sonden auf den Glas-Träger gedruckt werden oder auf dem Träger durch Licht-gerichtete Oligonukleotid-Synthese aufgebaut werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin eine Kombination des E1-Bereichs mit einer weiteren HPV-Sequenz verwendet wird.
Kit, umfassend: a) eine Vorrichtung, die geeignet ist zur Durchführung des Nachweisverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, wie es in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht ist; b) eine Anzahl von Primer-Sets für die Amplifikation des HPV-E1-Bereichs; c) einen oder mehrere feste Träger, die Einfangsonden enthalten.
Kit nach Anspruch 4, weiter umfassend: d) Reagenzien für eine Signal-Verstärkung.