JP5660464B2 - 濃度測定方法、および濃度測定システム - Google Patents
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Description
この濃度測定方法によれば、校正用チップによって求められた校正液のターゲット分子の濃度と校正用の計測光量との関係を用いて、測定用チップにより計測光量を求めるステップで求められた測定時の計測光量に基づいて測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出するので、定量的な濃度測定を行うことができる。
この濃度測定用チップによれば、特定のハイブリダイゼーション条件における校正液のターゲット分子の濃度と、計測光量との関係が、濃度測定用チップにおける校正情報として得られるので、定量的な濃度測定を行うことができる。
横軸は、ターゲットDNAの濃度[nM]であり、縦軸は後述する絶対光量値[nW/m2]である。図でわかるように、ターゲットDNA濃度が0.001[nM]までは光量は1[nW/m2]以下であるが、この濃度を超えると直線的に濃度と光量が比例して上昇する。さらに濃度が上昇すると光量は飽和し、一定値となる。すなわち、溶液濃度の範囲を特定範囲に限定すれば、溶液濃度と光量値は比例関係が得られる。この特定範囲を校正し、その係数を求めることにより光量値から濃度を逆算することが可能となる。この係数を以降、プローブ係数と呼ぶこととする。なお、図でわかるように、この特定の比例領域において、ハイブリダイゼーションの時間を長くすることは、同一のターゲットDNA濃度でも、より明るい光量が得られることを示している。すなわち、同一のチップであっても、ハイブリダイゼーションの条件を変えた場合は、そのプローブ係数を変える必要がある。
以上の2つの知見が本案の重要な基盤となっている。
次に、DNAチップ10の具体的な使用方法について説明する。
kpi=(Bi−Ci)/Ai [(W/m2)/M]または[(W/m2)/分子]など
(ただし、i=1〜N)
により定義される。プローブ係数kp1〜kpNは、各ターゲットDNAについての濃度と、対応するサイトの光量との比に相当する値として定義され、ターゲットDNAの種類に応じて異なる値をとる。
以上の流れを図10に示す。
Ai=(yi−Zi)/kpi
(ただし、i=1〜N,)
により算出される。Ziはバックグラウンド値である。
以上の流れを図11に示す。
光量から濃度を逆算する場合は、必ず最初の校正を行った光学系と同等の特性を持つ光学系を使用する必要がある。通常のバイオ・化学系計測器は、光量の読取値に対する精度の保証がない。すなわち、複数台の装置の光量の読取値が異なるため、校正した光学系と同一の測定用の光学系が同一である保証はない。従って、常に校正した装置そのもので測定も同時期に行う必要がある。しかし、絶対光量系を使用することで、複数の測定器を用いても、互いに光量の精度保証が可能となり、また経年変化に対しても保証されるため、チップメーカが校正に用いた装置と、エンドユーザが測定に使用する装置が異なっても良い。また時間的に経過していても問題がない。
蛍光色素によって吸収される光のパワーΔIは、次式で与えられる。
ΔI=2.3×103×α×Io×n/(Na×S) [W] …(1)
ただし、
α : モル吸光係数 8×104[M-1 cm-1]
Io : 入射光量[W]
n : 分子数[個]
Na : アボガドロ数 6×1023
S : 面積[cm2]
である。
10A 標的分子検出用チップ(校正用チップ、測定用チップ)
Claims (10)
- 基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備えた測定用チップを用いてターゲット分子の濃度を測定する濃度測定方法において、
同一性能の複数のチップを作成するステップと、
作成された前記複数のチップのうちの一部のチップである校正用チップを用いて特定のハイブリダイゼーション条件においてハイブリダイゼーションを行うことにより、当該校正用チップについて校正液のターゲット分子の特定の範囲の濃度と、計測光量との比例関係を求めるステップと、
作成された前記複数のチップのうちの前記校正用チップ以外のチップである測定用チップを用い、前記特定のハイブリダイゼーション条件において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションした時の計測光量を求めるステップと、
前記校正用チップについて求められた前記比例関係を用いて、前記測定用チップによる前記計測光量を求めるステップで求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液におけるターゲット分子の前記校正液と同一範囲の濃度を算出するステップと、
を備え、
前記校正液には、複数のターゲット分子が含まれ、前記校正用チップを用いたハイブリダイゼーションによりこの複数のターゲット分子のそれぞれについて前記比例関係が同時に求められ、
前記比例関係を定める係数は、ターゲット分子のそれぞれに対し、前記特定の範囲の濃度の全体について共通の値であることを特徴とする濃度測定方法。 - 前記ハイブリダイゼーション条件は、前記ハイブリダイゼーション温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいることを特徴とする請求項1に記載の濃度測定方法。
- 基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備え、前記プローブ分子にハイブリダイズしたターゲット分子の濃度を測定可能な濃度測定用チップであって、
前記濃度測定用チップと同一性能の校正用チップについて、特定のハイブリダイゼーション条件における校正液のターゲット分子の特定の範囲の濃度と、計測光量との比例関係が、前記濃度測定用チップにおける前記校正液と同一範囲の濃度と光量の校正情報として得られ、
作成された同一性能の複数のチップのうちの一部が前記校正用チップであり、前記複数のチップのうちの前記校正用チップ以外のチップが前記濃度測定用チップであり、
前記校正液には、複数のターゲット分子が含まれ、前記校正用チップを用いたハイブリダイゼーションによりこの複数のターゲット分子のそれぞれについて前記比例関係が同時に求められ、
前記比例関係を定める前記校正情報としての係数は、ターゲット分子のそれぞれに対し、前記特定の範囲の濃度の全体について共通の値であることを特徴とする濃度測定用チップ。 - 前記濃度測定用チップを用い、前記特定のハイブリダイゼーション条件において測定対象溶液に対してハイブリダイゼーションした時の計測光量を求めるとともに、前記校正用チップについて求められた前記関係を用いて、求められた前記計測光量に基づいて前記測定対象溶液におけるターゲット分子の濃度を算出することを特徴とする請求項3に記載の濃度測定用チップ。
- 前記ハイブリダイゼーション条件は、前記ハイブリダイゼーション温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいることを特徴とする請求項3または4に記載の濃度測定用チップ。
- 基材と、前記基材上に固定されたプローブ分子とを備え、前記プローブ分子に結合したターゲット分子の濃度を測定可能な濃度測定用チップであって、
前記濃度測定用チップと同一性能の校正用チップについて特定結合条件における校正液のターゲット分子の特定の範囲の濃度と、計測光量との比例関係が、前記濃度測定用チップにおける前記校正液と同一範囲の濃度と光量の校正情報として得られ、
作成された同一性能の複数のチップのうちの一部が前記校正用チップであり、前記複数のチップのうちの前記校正用チップ以外のチップが前記濃度測定用チップであり、
前記校正液には、複数のターゲット分子が含まれ、前記校正用チップを用いたハイブリダイゼーションによりこの複数のターゲット分子のそれぞれについて前記比例関係が同時に求められ、
前記比例関係を定める前記校正情報としての係数は、ターゲット分子のそれぞれに対し、前記特定の範囲の濃度の全体について共通の値であることを特徴とする濃度測定用チップ。 - 前記プローブ分子とターゲット分子が結合反応する条件は、前記プローブ分子とターゲット分子が結合反応する温度またはターゲット分子のラベル化法を含んでいることを特徴とする請求項6に記載の濃度測定用チップ。
- 前記測定用チップを用いて計測光量を求めるステップでは、蛍光光量の絶対値光量計測系で前記計測光量を計測することを特徴とする請求項6または7に記載の濃度測定用チップ。
- 前記プローブ分子とターゲット分子との結合反応は、たんぱく質どうしの反応、またはたんぱく質と抗体との抗原抗体反応であることを特徴とする請求項6〜8のいずれか1項に記載の濃度測定用チップ。
- 前記計測光量を求めるステップでは、蛍光光量の絶対値光量計測系で前記計測光量を計測することを特徴とする前記請求項1または2に記載の濃度測定方法。
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